專(zhuān)利名稱(chēng)：抑制由α的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可抑制白細(xì)胞粘附且尤其是由α4整合素介導(dǎo)的白細(xì)胞粘附的化合物，其中α4整合素較佳為VLA-4。
背景技術(shù)：
在本專(zhuān)利案中以上標(biāo)號(hào)形式來(lái)引用下列公開(kāi)物、專(zhuān)利案及專(zhuān)利申請(qǐng)案1Hemler和Takada，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)案第330,506號(hào)，1989年8月30日公開(kāi)。
2Elices，等人，Cell，60577-584(1990)3Springer，Nature，346425-434(1990)4Osborne，Cell，623-6(1990)5Vedder，等人，Surgery，106509(1989)6Pretolani，等人，J.Exp.Med.，180795(1994)7Abraham，等人，J.Clin.Invest，93776(1994)8Mulligan，等人，J.Immunology，1502407(1993)9Cybulsky，等人，Science，251788(1991)10Li，等人，Arteriosckr.Thromb.，13197(1993)11Sasseville，等人，Am.J.Path.，14427(1994)12Yang，等人，Proc.Nat.Acad.Science(USA)，9010494(1993)13Burkly，等人，Diabetes，43529(1994)14Baron，等人，J.Clin.Invest.，931700(1994)15Hamann，等人，J.Immunology，1523283(1994)16Yednock，等人，Nature，35663(1992)17Baron，等人，J.Exp.Med，17757(1993)18van Dinther-Janssen，等人，J.Immunology，1474207(1991)19van Dinther-Janssen，等人，Annals.Rheumatic Dis.，52672(1993)20Elices，等人，J.Clin.Invest，93405(1994)21Postigo，等人，J.Clin.Invest，891445(1991)22Paul，等人，Transpl.Proceed.，25813(1993)23Okarhara，等人，Can.Res.，543233(1994)24Paavonen，等人，Int.J.Can.，58298(1994)
25Schadendorf，等人，J.Path.，170429(1993)26Bao，等人，Diff.，52239(1993)27Lauri，等人，British J.Cancer，68862(1993)28Kawaguchi，等人，Japanese J.Cancer Res.，831304(1992)29Konradi，等人，PCT/US00/01686，2000年1月21日提出申請(qǐng)。
上述所有公開(kāi)物的全部?jī)?nèi)容均如同明確并單獨(dú)地指明每一單獨(dú)公開(kāi)物那樣以引用的方式并入本文中。
VLA-4(亦稱(chēng)為α4β1整合素及CD49d/CD29)最初由Hemler和Takada1識(shí)別，其為β1整合素類(lèi)細(xì)胞表面受體的一成員，β1整合素的每一成員均包含兩個(gè)亞單位，即一條α鏈及一條β鏈。VLA-4包含一條α4鏈和一條β1鏈。整合素至少有9種，其均共有相同的β1鏈但各具有不同的α鏈。這9種受體均可與多種細(xì)胞基質(zhì)分子的一種不同補(bǔ)體(例如，纖維連接蛋白、層粘聯(lián)蛋白、膠原)結(jié)合。例如，VLA-4可與纖維連接蛋白結(jié)合。VLA-4還可與內(nèi)皮細(xì)胞及其它細(xì)胞所表達(dá)的非基質(zhì)分子相結(jié)合。這些非基質(zhì)分子包括VCAM-1，其在培養(yǎng)基中的經(jīng)細(xì)胞因子激活的人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。使VLA-4具有纖維連接蛋白和VCAM-1結(jié)合活性的抗原決定部位不同，并且已證實(shí)每一活性均可獨(dú)立地加以抑制2。
通過(guò)VLA-4及其它細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附與許多炎癥反應(yīng)有關(guān)。在損傷或其它炎癥性刺激部位，激活的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)對(duì)白細(xì)胞具有粘附性的分子。白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞粘附的機(jī)制部分地與白細(xì)胞上的細(xì)胞表面受體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞上相應(yīng)的細(xì)胞表面分子的識(shí)別及結(jié)合有關(guān)。一旦結(jié)合，這些白細(xì)胞將移行越過(guò)血管壁進(jìn)入受損部位并釋放出化學(xué)介質(zhì)來(lái)與感染作斗爭(zhēng)。對(duì)于免疫系統(tǒng)的粘附受體的評(píng)論，參見(jiàn)(例如)Springer3和Osborn4。
炎癥性腦病，例如實(shí)驗(yàn)性自體免疫性腦脊髓炎(EAE)、多發(fā)性硬化癥(MS)及腦膜炎，均為其中內(nèi)皮/白細(xì)胞粘附機(jī)制導(dǎo)致對(duì)原本健康的腦組織造成破壞的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病實(shí)例。在這些炎癥性疾病中，大量白細(xì)胞移行越過(guò)血腦屏障(BBB)。白細(xì)胞釋放有毒介質(zhì)可引起廣泛組織損傷，從而導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)受損和癱瘓。
在其它器官系統(tǒng)中，粘附機(jī)制亦會(huì)造成組織損傷，從而導(dǎo)致白細(xì)胞遷移或激活。例如，已經(jīng)顯示，心肌局部缺血后對(duì)心臟造成的初始損傷會(huì)因白細(xì)胞進(jìn)入受損組織而進(jìn)一步惡化，從而引起更進(jìn)一步的損傷(Vedder等人)5。其它由粘附機(jī)制介導(dǎo)的炎癥性或需治療的病癥包括，(例如)哮喘病6-8、阿爾茨海默氏病、動(dòng)脈粥樣硬化9-10、AIDS癡呆癥11、糖尿病12-14(包括急性青少年糖尿病)、炎癥性腸病15(包括潰瘍性結(jié)腸炎和克隆氏病(Crohn’s disease))、多發(fā)性硬化癥16-17、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎18-21、組織移植22、腫瘤轉(zhuǎn)移23-28、腦膜炎、腦炎、中風(fēng)和其它大腦創(chuàng)傷、腎炎、視網(wǎng)膜炎、異位性皮膚炎、干癬、心肌局部缺血及白細(xì)胞介導(dǎo)的急性肺部損傷(例如在成人呼吸窘迫癥候群中發(fā)生的損傷)。
已揭示，經(jīng)取代的氨基嘧啶，作為一類(lèi)化合物，可抑制VLA-4與VCAM-1的結(jié)合，因此呈現(xiàn)抗炎癥的特性。29盡管這些化合物對(duì)此類(lèi)結(jié)合具有拮抗性，但這些化合物的生物利用率提高將會(huì)增強(qiáng)其效能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)與先前揭示的其它經(jīng)取代的氨基嘧啶化合物相比，當(dāng)通過(guò)其AUC測(cè)量時(shí)，某些N-[2-N′，N′-二乙氨基-5-氨基磺酰基苯基嘧啶-4-基]-p-甲酰氧基-苯丙氨酸化合物具有出乎意料高的生物利用率。
在其組合物的一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一式(I)化合物 其中每一X均獨(dú)立為氟、氯或溴；p為0或一從1到3的整數(shù)；R1選自由甲基和乙基組成的群組；R2選自由低碳烷基、低碳烯基和低碳亞烷基環(huán)烷基組成的群組；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
在一較佳實(shí)施例中，本發(fā)明提供若干式(II)化合物 其中每一X均獨(dú)立選自由氟和氯組成的群組；m為一等于1或2的整數(shù)；R2選自由低碳烷基、低碳烯基和低碳亞烷基環(huán)烷基組成的群組；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
在一尤其較佳實(shí)施例中，本發(fā)明提供式(III)化合物
其中每一X均獨(dú)立為氟或氯；n為0或1；R2為-CH2-R′，其中R′選自由氫、甲基或-CH＝CH2組成的群組；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
在另一尤其較佳實(shí)施例中，本發(fā)明提供式(IV)化合物 其中每一X均獨(dú)立為氟、氯或溴；p為0或一從1到3的整數(shù)；R1選自由甲基和乙基組成的群組；R2為低碳炔基；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
在再一尤其較佳實(shí)施例中，本發(fā)明提供式(V)化合物
其中每一X均獨(dú)立選自由氟和氯組成的群組；m為一等于1或2的整數(shù)；R2為低碳炔基；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
在另一尤其較佳實(shí)施例中，本發(fā)明提供式(VI)化合物 其中每一X均獨(dú)立為氟或氯；n為0或1；R2為低碳炔基；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
在式IV、V或VI中的任一式中R2較佳為炔丙基。
本發(fā)明所涵蓋的N-[2-N′，N′-二乙氨基-5-氨基磺?；交奏?4-基]-p-甲酰氧基-苯丙氨酸化合物包括下表I所列的那些表I

本發(fā)明所涵蓋的具體化合物包括以下化合物。下文所用的這些化合物是基于丙酸衍生物命名，但這些化合物也可基于N-[2-N′，N′-二乙氨基-5-氨基磺酰基苯基-嘧啶-4-基]-p-甲酰氧基-苯丙氨酸衍生物衍生物命名。
2-{2-二乙氨基-5-[(4-氯苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氯苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(2-氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲?；趸交?丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3-氟苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?異丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氟苯磺?；?異丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲?；趸交?丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氯苯磺?；?異丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氟苯磺?；?乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氯苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?環(huán)丙基甲基-氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氟苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(2，4-二氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(2，4-二氟苯磺?；?乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氯苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氯苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?-正丙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)烯丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)異丁氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)-正丁氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(2，6-二氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(2，3-二氟苯磺?；?乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?炔丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(2，4-二氟苯磺?；?炔丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?-(2-三氟乙基)-氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
另一方面，本發(fā)明提供若干包含一醫(yī)藥上可接受載劑及一治療有效量的本文所定義化合物的醫(yī)藥組合物。
在其一方法方面中，本發(fā)明涉及一種用于治療一患者至少部分由α4整合素(較佳VLA-4)介導(dǎo)的疾病的方法，該方法包括投予一包含一醫(yī)藥上可接受的載劑及一治療有效量的本發(fā)明化合物的醫(yī)藥組合物。
本發(fā)明的化合物及醫(yī)藥組合物可用于治療至少部分由α4整合素(較佳VLA-4)或白細(xì)胞粘附介導(dǎo)的疾病狀況。該類(lèi)疾病狀況包括，例如，哮喘病、阿爾茨海默氏病、動(dòng)脈粥樣硬化、AIDS癡呆癥、糖尿病(包括急性青少年糖尿病)、炎癥性腸病(包括潰瘍性結(jié)腸炎和克隆氏病)、多發(fā)性硬化癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、組織移植、腫瘤轉(zhuǎn)移、腦膜炎、腦炎、中風(fēng)和其它大腦創(chuàng)傷、腎炎、視網(wǎng)膜炎、異位性皮膚炎、干癬、心肌局部缺血及白細(xì)胞介導(dǎo)的急性肺部損傷(例如在成人呼吸窘迫癥候群中發(fā)生的損傷)。
其它病癥包括(但不限于)炎癥性疾病，例如，結(jié)節(jié)性紅斑、過(guò)敏性結(jié)膜炎、視神經(jīng)炎、葡萄膜炎、過(guò)敏性鼻炎、強(qiáng)直性脊椎炎、干癬性關(guān)節(jié)炎、血管炎、萊特爾綜合征(Reiter′s syndrome)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥、多肌炎、皮肌炎、韋格納氏肉牙腫病(Wegner′s granulomatosis)、主動(dòng)脈炎、類(lèi)肉瘤病(sarcoidosis)、淋巴細(xì)胞減少癥、顳動(dòng)脈炎、心包炎、心肌炎、充血性心臟衰竭、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、過(guò)敏綜合征、過(guò)敏癥、嗜酸細(xì)胞過(guò)多綜合征、Churg-Strauss綜合征、慢性阻塞性肺病、過(guò)敏性肺炎、慢性活動(dòng)性肝炎、間質(zhì)性膀胱炎、自體免疫性?xún)?nèi)分泌衰竭、原發(fā)性膽汁性肝硬化、自體免疫性再生障礙性貧血、慢性遷延性肝炎及甲狀腺炎。
在一較佳實(shí)施例中，該由α4整合素介導(dǎo)的病癥為一炎癥性疾病。
具體實(shí)施例方式
如上述，本發(fā)明涉及可抑制白細(xì)胞粘附并且尤其是至少部分由α4整合素(較佳VLA-4)介導(dǎo)的白細(xì)胞粘附的化合物。然而，在進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明之前，首先定義以下術(shù)語(yǔ)。
除非另有說(shuō)明，否則在說(shuō)明書(shū)及專(zhuān)利申請(qǐng)范圍中所用的以下術(shù)語(yǔ)具有以下涵義本文所用“低碳烷基”指具有1至5個(gè)碳原子的單價(jià)烷基基團(tuán)，其包括直鏈及具支鏈的烷基基團(tuán)。該術(shù)語(yǔ)可用(例如)甲基、乙基、異丙基、正丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基等基團(tuán)來(lái)舉例說(shuō)明?！暗吞纪榛笨梢暻闆r用一鹵素(例如氯、氟、溴等)取代。
本文所用“低碳亞烷基”指具有1至4個(gè)碳原子的二價(jià)亞烷基基團(tuán)，其包括直鏈及具支鏈的亞烷基基團(tuán)。該術(shù)語(yǔ)可用(例如)亞甲基、亞乙基、正亞丙基、異亞丙基、(-CH2CH(CH3)-及-CH(CH3)CH2-)等基團(tuán)來(lái)舉例說(shuō)明。
術(shù)語(yǔ)“低碳炔基”指一較佳具有2至6個(gè)碳原子且具有至少1個(gè)(較佳僅1個(gè))炔基不飽和位點(diǎn)(即，-C≡C-)的炔基基團(tuán)。該術(shù)語(yǔ)可通過(guò)(例如)乙炔基(-C≡CH)、炔丙基(-CH2-C≡CH)、3-丁炔基(-CH2CH2C≡CH3)等基團(tuán)來(lái)舉例說(shuō)明。
“低碳環(huán)烷基”指具有一單環(huán)的3至6個(gè)碳原子的環(huán)烷基基團(tuán)，其包括(例如)環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基及環(huán)己基。
術(shù)語(yǔ)“低碳亞烷基環(huán)烷基”指由如本文所定義的一低碳亞烷基-低碳環(huán)烷基組成的基團(tuán)。該類(lèi)基團(tuán)可用亞甲基環(huán)丙基(-CH2-環(huán)丙基)、亞乙基環(huán)丙基等來(lái)舉例說(shuō)明。
“醫(yī)藥上可接受的載劑”指一可用于制備一醫(yī)藥組合物的載劑，其通常安全、無(wú)毒并且在生物學(xué)上及其它方面皆無(wú)不良后果，包括一可滿(mǎn)足獸醫(yī)應(yīng)用以及人類(lèi)醫(yī)藥應(yīng)用要求的載劑。說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求書(shū)中所用的“一醫(yī)藥上可接受的載劑”包括一種或一種以上該載劑。
“治療”一疾病包括(1)預(yù)防該疾病，即，使一暴露于該疾病下或易感染該疾病但尚未患病或尚未表現(xiàn)出該疾病癥狀的哺乳動(dòng)物該疾病的臨床癥狀不再發(fā)展。
(2)抑制該疾病，即，阻止或減輕該疾病的發(fā)展或其臨床癥狀；或(3)減輕該疾病，即，使該疾病或其臨床癥狀消退。
一“治療有效量”指，當(dāng)投予一哺乳動(dòng)物用以治療一疾病時(shí)，一化合物足以實(shí)現(xiàn)該疾病的上述治療的量。該“治療有效量”將視該化合物、該疾病及其嚴(yán)重程度以及待治療的哺乳動(dòng)物的年齡、體重等情況而不同。
“醫(yī)藥上可接受的鹽”指一式I化合物的醫(yī)藥上可接受的鹽，該些鹽來(lái)源于多種在此項(xiàng)技術(shù)中習(xí)知的有機(jī)和無(wú)機(jī)抗衡離子，包括(僅舉例而言)鈉、鉀、鈣、鎂、銨、四烷基銨等；并且當(dāng)該分子包含一堿性官能團(tuán)時(shí)，指有機(jī)或無(wú)機(jī)酸的鹽，例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、馬來(lái)酸鹽、草酸鹽等。
整合素是一大類(lèi)同源跨膜聯(lián)接蛋白，其為動(dòng)物細(xì)胞上用于與大多數(shù)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(例如膠原、纖維連接蛋白、層粘聯(lián)蛋白)結(jié)合的主要受體。整合素為由一α鏈與一β鏈構(gòu)成的異源二聚體。迄今，人們已經(jīng)鑒別出20種不同的整合素異源二聚體，它們由9種不同的α亞單位及14種不同的β亞單位構(gòu)成。術(shù)語(yǔ)“α4整合素”指異源二聚體類(lèi)酶聯(lián)細(xì)胞表面受體，其包含與這些β亞單位中的任一個(gè)配對(duì)的α4亞單位。VLA-4是一α4整合素的實(shí)例，并且是α4和β1亞單位的異源二聚體，其亦稱(chēng)為α4β1整合素。
化合物制備本發(fā)明化合物可用以下實(shí)例中闡明的方法和程序由易獲得的起始材料制得。這些方法和程序概括說(shuō)明了制備N(xiāo)-(2-[N′，N′-二乙氨基-5-氨基磺酰基苯基嘧啶-4-基]-p-甲酰氧基-苯丙氨酸化合物的特定反應(yīng)方案。涵蓋于本發(fā)明但在這些實(shí)例和方法中未舉例說(shuō)明的化合物可通過(guò)購(gòu)得的或此項(xiàng)技術(shù)中習(xí)知的起始材料的適當(dāng)替換而容易地制得。
用于制備本發(fā)明化合物的其它程序和反應(yīng)條件將在以下述實(shí)例中加以闡述。另外，可用于制備在本發(fā)明某些方面中有用的化合物的其它程序揭示于美國(guó)專(zhuān)利第6,492,372號(hào)中；該專(zhuān)利案的揭示內(nèi)容以引用的方式并入本文中。
醫(yī)藥調(diào)配物當(dāng)作為藥物使用時(shí)，本發(fā)明的化合物通常以醫(yī)藥組合物的形式投與。這些組合物可通過(guò)包括經(jīng)口、經(jīng)直腸、經(jīng)皮膚、經(jīng)皮下、經(jīng)靜脈內(nèi)、經(jīng)肌內(nèi)及經(jīng)鼻內(nèi)在內(nèi)的多種途徑投與。這些組合物通過(guò)注射和口服二者均有效。該類(lèi)組合物可用制藥技術(shù)中熟知的一種方法制備且其包含至少一種活性化合物。
本發(fā)明亦涵蓋含有一或多種與醫(yī)藥上可接受載劑聯(lián)合的上述式I-VII化合物作為活性成分的醫(yī)藥組合物。在制備本發(fā)明組合物時(shí)，通常將該活性成分與一賦形劑混合，用一賦形劑稀釋或?qū)⑷胍豢蔀槟z囊、小袋、紙或其它容器形式的載劑中。所用賦形劑通常是一適合投予人類(lèi)受試者或其它哺乳動(dòng)物的賦形劑。當(dāng)該賦形劑用做一稀釋劑時(shí)，其可為一固體、半固體或液體材料，對(duì)活性成分起媒劑、載劑或媒介的作用。因此，這些組合物可呈片劑、九劑、散劑、含片、小袋、藥丸、酏劑、懸浮液、乳液、溶液、糖漿、氣溶膠(作為固體或在液體媒介中)、軟膏(包含例如多達(dá)10重量％的活性化合物)、軟質(zhì)明膠及硬質(zhì)明膠膠囊、栓劑、無(wú)菌可注射溶液、無(wú)菌包裝的粉末的形式。
在制備一調(diào)配物時(shí)，該活性化合物在與其它成分混合之前可能需磨細(xì)以提供適合的粒徑。如果該活性化合物實(shí)質(zhì)不溶，則通常將其磨細(xì)至粒徑小于200網(wǎng)目。如果該活性化合物實(shí)質(zhì)可溶于水，則一般通過(guò)磨細(xì)將粒徑調(diào)節(jié)至使得其在調(diào)配物中可實(shí)質(zhì)均勻分布，例如約40網(wǎng)目。
適宜賦形劑的一些實(shí)例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、磺蓍膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿及甲基纖維素。這些調(diào)配物可另外包括潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鎂及礦物油；潤(rùn)濕劑；乳化及懸浮劑；防腐劑，例如羥基苯甲酸甲酯及羥基苯甲酸丙酯；增甜劑；及調(diào)味劑。本發(fā)明的組合物可采用此項(xiàng)技術(shù)中熟知的方法調(diào)配成在投予患者后能實(shí)現(xiàn)活性成分的快速、持久或延遲釋放。
較佳將這些組合物調(diào)配成單位劑量形式，每一劑量含約5至約100mg且更通常約10至約30mg的活性成分。術(shù)語(yǔ)“單位劑量形式”指適宜作為單一劑量用于人類(lèi)受試者或其它哺乳動(dòng)物的物理分立單位，每一單位含一經(jīng)計(jì)算與一適宜醫(yī)藥賦形劑聯(lián)合可產(chǎn)生期望治療效果的預(yù)定量的活性材料。
該活性化合物的有效劑量范圍甚廣，并且通常以一在醫(yī)藥上有效的量投與。然而，應(yīng)了解，該化合物的實(shí)際投與量將由醫(yī)生根據(jù)包括下列的相關(guān)情況決定欲治療的病癥、所選投藥途徑、實(shí)際投與的化合物、個(gè)體患者的年齡、體重和反應(yīng)、患者癥狀的嚴(yán)重程度等。
對(duì)于制備例如片劑等固體組合物，可將主要活性成分與一醫(yī)藥賦形劑混合以形成一包含本發(fā)明一化合物的均勻混合物的固態(tài)預(yù)調(diào)配組合物。當(dāng)將這些預(yù)調(diào)配組合物稱(chēng)為均勻時(shí)，是指該活性成分均勻地?cái)U(kuò)散至該組合物各處，使得該組合物可容易地細(xì)分成等效單位劑型，例如，片劑、丸劑及膠囊。然后，將此固態(tài)預(yù)調(diào)配物細(xì)分成上述類(lèi)型的單位劑型，其包含(例如)0.1至約500mg的本發(fā)明活性成分。
本發(fā)明的片劑或丸劑可經(jīng)包覆或以另外的方式配制，以提供一具有持久作用的優(yōu)點(diǎn)的劑型。例如，該片劑或丸劑可包含一內(nèi)部劑量組份及一外部劑量組份，后者呈一包膜形式包覆于前者的表面上。這兩種組份可通過(guò)一腸溶性層分開(kāi)，該腸溶性層用以抵抗胃內(nèi)的分解作用，從而允許內(nèi)部組份完整地進(jìn)入十二指腸或延遲釋放。該類(lèi)腸溶性層或包衣可使用多種材料，包括大量聚合酸及聚合酸與蟲(chóng)膠、十六烷醇及乙酸纖維素等材料的混合物。
本發(fā)明新穎組合物可摻配成液體形式供經(jīng)口或注射投與，其形式包括水溶液、經(jīng)適當(dāng)調(diào)味的糖漿、水性或油性懸浮液及具有可食用油(例如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油)的經(jīng)調(diào)味乳劑以及酏劑及類(lèi)似的醫(yī)藥媒劑。
供吸入或噴入用的組合物包括在醫(yī)藥上可接受的水性或有機(jī)溶劑中的溶液和懸浮液或其混合物及粉末。這些液體或固體組合物可包含如上文所述的在醫(yī)藥上可接受的適當(dāng)賦形劑。這些組合物較佳通過(guò)口或鼻呼吸的途徑投與以獲得局部或全身效果。在較佳醫(yī)藥上可接受的溶劑中的組合物可通過(guò)使用惰性氣體霧化。經(jīng)霧化的溶液可從霧化裝置直接吸入或可將該霧化裝置附裝至一面罩帷罩或間歇式正壓呼吸機(jī)。溶液、懸浮液或粉末組合物可較佳從以恰當(dāng)方式遞送調(diào)配物的裝置以經(jīng)口或經(jīng)鼻方式投與。
以下調(diào)配物實(shí)例可說(shuō)明本發(fā)明的醫(yī)藥組合物。
調(diào)配物實(shí)例1制備包含以下成分的硬質(zhì)明膠膠囊數(shù)量成分(mg/膠囊)活性成分 30.0淀粉 305.0硬脂酸鎂 5.0將以上成分混合并按照340mg的量充入硬質(zhì)明膠膠囊。
調(diào)配物實(shí)例2用以下成分制備一片劑調(diào)配物數(shù)量成分(mg/片)活性成分 25.0微晶纖維素 200.0膠狀二氧化硅 10.0硬脂酸 5.0將該些組份混合并壓制成片劑，每片重240mg。
調(diào)配物實(shí)例3制備一包含以下組份的干燥粉末吸入器調(diào)配物成分重量％活性成分 5
乳糖 95將活性混合物與乳糖混合并添加入一干燥粉末吸入器具。
調(diào)配物實(shí)例4按下述制備每片含30mg活性成分的片劑數(shù)量成分(mg/片)活性成分 30.0mg淀粉 45.0mg微晶纖維素 35.0mg聚乙烯吡咯烷酮(10％水溶液) 4.0mg羧甲基淀粉鈉 4.5mg硬脂酸鎂 0.5mg滑石粉 1.0mg合計(jì) 120mg使活性成分、淀粉及纖維素通過(guò)20號(hào)網(wǎng)目美國(guó)篩并充分混合。將聚乙烯吡咯烷酮溶液與所得粉末混合，然后使其通過(guò)16網(wǎng)目美國(guó)篩。將這樣制得的顆粒在50℃至60℃下干燥并使其通過(guò)16網(wǎng)目美國(guó)篩。將預(yù)先通過(guò)30網(wǎng)目美國(guó)篩的羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂及滑石粉添加至該些顆粒中，混合后，在一制片機(jī)上將其壓制，得到每片重120mg的片劑。
調(diào)配物實(shí)例5按下述制成每粒含40mg藥物的膠囊成分?jǐn)?shù)量(mg/膠囊)活性成分 40.0mg淀粉 109.0mg硬脂酸鎂 1.0mg合計(jì) 150.0mg將活性成分、淀粉及硬脂酸鎂混合，使其通過(guò)一20號(hào)網(wǎng)目美國(guó)篩，再以150mg的量充入硬質(zhì)明膠膠囊中。
調(diào)配物實(shí)例6按下述制成每支包含25mg活性成分的栓劑成分?jǐn)?shù)量活性成分 25mg飽和脂肪酸甘油酯 2,000mg使活性成分通過(guò)一60網(wǎng)目美國(guó)篩，并懸浮于預(yù)先用最少所需熱量熔化的飽和脂肪酸甘油脂中。然后將該混合物注入一標(biāo)稱(chēng)容量為2.0g的栓劑模具中并使其冷卻。
調(diào)配物實(shí)例7按下述制成每5.0mL劑量包含50mg藥物的懸浮液成分?jǐn)?shù)量活性成分 50.0mg黃原膠 4.0mg羧甲基纖維素鈉(11％)微晶纖維素(89％) 50.0mg蔗糖 1.75g苯甲酸鈉 10.0mg調(diào)味劑及顏料 適量純水至 5.0ml將藥物、蔗糖及黃原膠混合，使其通過(guò)一10號(hào)網(wǎng)目美國(guó)篩，然后與一預(yù)先配制的微晶纖維素與羧甲基纖維素鈉的水溶液混合。將苯甲酸鈉、調(diào)味劑及染色劑用一些水稀釋?zhuān)吿砑舆厰嚢?。然后添加足量的水以得到所需體積。
調(diào)配物實(shí)例8數(shù)量成分(mg/膠囊)活性成分 15.0mg淀粉 407.0mg硬脂酸鎂 3.0mg合計(jì) 425.0mg將活性成分、淀粉及硬脂酸鎂混合，使其通過(guò)一20號(hào)網(wǎng)目美國(guó)篩，再以425mg的量充入硬質(zhì)明膠膠囊中。
調(diào)配物實(shí)例9按下述可制備一靜脈內(nèi)調(diào)配物成分?jǐn)?shù)量活性成分 250.0mg等滲鹽水 1000mL調(diào)配物實(shí)例10按下述可制備一局部用調(diào)配物成分?jǐn)?shù)量活性成分 1至10g乳化蠟 30g液體石蠟 20g白色軟石蠟 2至100g將白色軟石蠟加熱至熔化。納入液狀石蠟及乳化蠟并攪拌至溶解。向其中添加活性成分并繼續(xù)攪拌至散開(kāi)。然后將該混合物冷卻成固體。
本發(fā)明方法中采用的另一較佳調(diào)配物使用經(jīng)皮遞藥裝置(“貼片”)。該類(lèi)經(jīng)皮貼片可用來(lái)以經(jīng)控制數(shù)量連續(xù)或不連續(xù)輸注本發(fā)明化合物。遞送藥劑用的經(jīng)皮貼片的制造及使用方法在此項(xiàng)技術(shù)中為人熟知。參見(jiàn)(例如)1991年6月11日頒布的美國(guó)專(zhuān)利第5,023,252號(hào)，其以引用的方式并入本文中。該類(lèi)貼片可制造成用于持續(xù)地、間斷地或按需要遞送藥劑。
當(dāng)期望或需要將醫(yī)藥組合物導(dǎo)入大腦時(shí)，可使用直接或間接放置技術(shù)。直接技術(shù)通常涉及將一藥物遞送管置于受試者的腦室系統(tǒng)中來(lái)繞過(guò)血腦屏障。美國(guó)專(zhuān)利第5,011,472號(hào)揭示一用來(lái)將生物學(xué)因子輸送至身體的特定解剖學(xué)區(qū)域的此類(lèi)可植入遞藥系統(tǒng)，該專(zhuān)利案以引用的方式并入本文中。
通常較佳的間接技術(shù)一般涉及通過(guò)將親水性藥物轉(zhuǎn)變成脂溶性藥物而將該組合物調(diào)配成可提供藥物潛伏化作用。潛伏化作用通常通過(guò)阻斷藥物中的羥基、羰基、硫酸根及伯氨基基團(tuán)來(lái)實(shí)現(xiàn)以使藥物更易溶于脂質(zhì)中且更易穿過(guò)血腦屏障?；蛘撸H水性藥物的遞送可通過(guò)靜脈內(nèi)輸注能迅速打開(kāi)血腦屏障的高滲溶液來(lái)增強(qiáng)。
功用本發(fā)明化合物可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合α4整合素(較佳VLA-4)來(lái)抑制活體內(nèi)至少部分由α4整合素(其中該α4整合素較佳為VLA-4)介導(dǎo)的白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。因此，本發(fā)明化合物可用于治療哺乳動(dòng)物由α4整合素(其中該α4整合素較佳為VLA-4)或白細(xì)胞粘附介導(dǎo)的疾病。這些疾病包括哺乳動(dòng)物患者的炎癥性疾病，(例如)哮喘病、阿爾茨海默氏病、動(dòng)脈粥樣硬化、AIDS癡呆癥、糖尿病(包括急性青少年糖尿病)、炎癥性腸病(包括潰瘍性結(jié)腸炎及克隆氏病)、多發(fā)性硬化癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、組織移植、腫瘤轉(zhuǎn)移、腦膜炎、腦炎、中風(fēng)和其它大腦創(chuàng)傷、腎炎、視網(wǎng)膜炎、異位性皮膚炎、干癬、心肌局部缺血及急性白細(xì)胞介導(dǎo)的肺部損傷(例如在成人呼吸窘迫癥候群中發(fā)生的損傷)。
投予哺乳動(dòng)物患者的藥量將視所投與藥物、投藥目的(例如預(yù)防或治療)、患者狀況、投與方式等而有所不同。在治療應(yīng)用中，將組合物以一足以治愈或至少部分阻止該疾病及其并發(fā)癥的癥狀的量投予一已患病患者。一足以達(dá)成此目的的量定義為“治療有效劑量”。對(duì)此用途有效的藥量將取決于所治療疾病以及臨床主治醫(yī)師依照(例如)炎癥的嚴(yán)重程度、患者的年齡、體重及綜合情況等作出的判斷。
投予患者的組合物呈上述醫(yī)藥組合物的形式。這些組合物可通過(guò)常規(guī)的滅菌技術(shù)滅菌或可過(guò)濾滅菌。所得水性溶液可于包裝后按原樣使用或凍干，投藥前再將此凍干制劑與一無(wú)菌水性載劑組合。該化合物制劑的pH值通常介于3與11之間，較佳為5至9且最佳為7至8。應(yīng)了解，使用某些上述賦形劑、載劑或穩(wěn)定劑將會(huì)導(dǎo)致形成醫(yī)藥鹽。
本發(fā)明化合物的治療劑量將視(例如)所進(jìn)行的治療的特定用途、該化合物的投藥方式、患者的健康狀況和狀態(tài)及處方醫(yī)師的判斷而不同。例如，對(duì)于靜脈內(nèi)投藥，該劑量通常介于約20μg至約500μg/千克體重之間，較佳為約100μg至約300μg/千克體重。鼻內(nèi)投藥之適宜劑量范圍通常為約0.1pg至1mg/千克體重。有效劑量可從得自活體內(nèi)或動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線(xiàn)推知。
以下合成及生物學(xué)實(shí)例意欲舉例說(shuō)明本發(fā)明，而無(wú)論如何不能將其理解為限制本發(fā)明的范圍。除非另有說(shuō)明，否則所有溫度都是以攝氏溫度表示。
實(shí)例在下面實(shí)例中，下列縮寫(xiě)具有以下涵義。如果有的縮寫(xiě)未加以定義，則其具有公認(rèn)的涵義。
AUC＝曲線(xiàn)下面積BSA＝牛血清白蛋白DMAP＝4-N，N-二甲氨基吡啶DMSO＝二甲基亞砜EDC＝1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞氨鹽酸鹽EDTA＝乙二胺四乙酸EtOAc＝乙酸乙酯EtOH＝乙醇bd＝寬雙峰bs＝寬單峰d＝雙峰m＝多峰t＝三峰s＝單峰e(cuò)q or eq.＝當(dāng)量的FACS＝熒光激活細(xì)胞分選儀FITC＝異硫氰酸熒光素Fmoc＝N-(9-芴甲氧羰基)FmocONSu＝N-(-9-芴甲氧羰基)-琥珀酰亞胺g＝克i.p.＝腹膜內(nèi)的h＝小時(shí)HBSS＝翰克司平衡鹽溶液(Hank′s Balanced Saline Solution)HEPES＝4-(2-羥乙基)-1-哌嗪-乙磺酸HOBT＝1-羥基苯并三唑水合物hr＝小時(shí)IgG Fc＝免疫球蛋白的一結(jié)合域kg＝千克
LCMS＝液相色譜質(zhì)譜法L＝升m＝米M＝摩爾(Molar)Hct＝細(xì)胞比容或一定容積的血樣中通過(guò)離心獲得的迭集紅細(xì)胞的量度HB＝血紅蛋白MCH＝平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量；Hb/RBCMCHC＝以百分?jǐn)?shù)表示的平均紅細(xì)胞血紅蛋白計(jì)數(shù)；Hb/Hct.
MCV＝平均紅細(xì)胞體積；紅細(xì)胞的平均體積，通常每個(gè)紅細(xì)胞的立方微米數(shù)表示RBC＝紅細(xì)胞計(jì)數(shù)MeOH＝甲醇mg＝毫克mL＝毫升mm＝毫米mM＝毫摩爾(millimolar)mol＝摩爾mmol＝毫摩爾mp＝熔點(diǎn)mpk＝毫克/千克N＝當(dāng)量NaOEt＝乙醇鈉NMM＝N-甲基嗎啉OtBu＝叔丁氧基PBS++＝磷酸鹽緩沖鹽水Phe＝L-苯丙氨酸Pro＝L-脯氨酸psi＝磅/平方英寸q.s.＝補(bǔ)足體積Rf＝保持系數(shù)rpm＝每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)rt＝室溫sat＝飽和的t-BuOH＝叔丁醇TFA＝三氟乙酸
THF＝四氫呋喃TLC或tlc＝薄層色譜法TYR＝酪氨酸μL＝微升μM＝微摩爾(micromolar)μg＝微克Vt＝總體積WBC＝白細(xì)胞w/w＝重量/重量w/v＝重量/體積v/v＝體積/體積實(shí)例1制備2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸概要用一Biotage Flash 75L和800克KP-Sil二氧化硅管柱(32-63μM，60埃，500-550m2/g)進(jìn)行快速色譜法。記錄分析性薄層色譜的Rf，正向用EM Science SilicaGel F(254)250μM厚板，反相用Watman MKC18F 200μM厚板。
步驟1制備2，4-二氯-5-硝基嘧啶。
依照Whittaker(J.Chem.Soc.1951，1565)的程序?qū)?-硝基尿嘧啶用磷酰氯和N，N-二甲基苯胺處理，得到標(biāo)題化合物，其亦可從City Chemical(West Haven，CT)獲得。
步驟2制備2-(2-二乙氨基-5-硝基嘧啶-4-基氨基)-3-(4-羥基苯基)丙酸叔-丁基酯。在-10℃下向2-氨基-3-(4-羥基苯基)丙酸(30.6g，0.129mol)溶于THF(250mL)之溶液內(nèi)添加2，4-二氯-5-硝基嘧啶(25g，0.129mol)，在添加期間保持溫度低于5℃。添加結(jié)束后，隨即滴加N，N-二異丙基乙氨(33.7mL，0.194mol)。在-10℃下攪拌1小時(shí)后，緩慢添加入二乙氨(66.73mL，0.645mol)，然后將反應(yīng)混合物加熱至室溫過(guò)夜。將反應(yīng)混合物用二乙基醚(500mL)稀釋?zhuān)⒂?.2N檸檬酸(3×150mL)、水(1×150mL)及10％K2CO3(3×150mL)洗滌有機(jī)層。對(duì)有機(jī)層進(jìn)行干燥(Na2SO4)、過(guò)濾及真空濃縮，得到一黃色殘余物。將該殘余物通過(guò)快速色譜法(在硅膠上用20％EtOAc/己烷)純化生成37.39g(67％)黃色泡沫狀的標(biāo)題化合物。Rf＝0.21(在硅膠上用25％EtOAc/己烷)。
步驟3制備2-(2-二乙氨基-5-硝基嘧啶-4-基氨基)-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯。
向2-(2-二乙氨基-5-硝基嘧啶-4-基氨基)-3-(4-羥基苯基)丙酸叔-丁基酯(31.80g，0.074mol)溶于CH2Cl2(600mL)的溶液中添加DMAP(9.00g，0.074mol)。5分鐘后，滴加三乙氨(10.23mL，0.074mol)。滴加N，N-二甲基氨甲酰氯(13.83mL，0.110mol)并將反應(yīng)物回流加熱過(guò)夜。對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行真空濃縮并用EtOAc(1L)吸收。將有機(jī)相用0.5M檸檬酸(3×250ml)、飽和NaHCO3(3×250mL)、鹽水(1×250mL)洗滌，干燥(Na2SO4)，過(guò)濾并真空濃縮后生成37.0g(99％)的白色固體狀標(biāo)題化合物。
步驟4制備2-(2-二乙氨基-5-氨基嘧啶-4-基氨基)-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯。
將2-(2-二乙氨基-5-硝基嘧啶-4-基氨基)-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯(37.0g，0.073mol)和10％Pd/C(3.8g，10重量％Pd)溶于EtOH(250mL)中的混合物在60psi氫氣下?lián)u動(dòng)，直到TLC(在硅膠上用50％EtOAc/己烷)顯示100％轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物(48小時(shí))。然后將反應(yīng)混合物濾過(guò)一硅藻土塞并真空濃縮，生成32.0g(92％)紫色泡沫狀標(biāo)題化合物。
步驟5制備2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯。用干冰/CH3CN浴將2-(2-二乙氨基-5-氨基嘧啶-4-基氨基)-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯(32.0g，0.067mol)的吡啶(120mL)溶液冷卻至-20℃。將混合物攪拌30分鐘，然后緩慢添加p-氟苯磺酰氯(13.18g，0.067mol)。在-20℃下將反應(yīng)物攪拌4.5小時(shí)后，然后添加3-二甲基氨基丙氨(8.52mL，0.067mol)，然后將混合物加熱至室溫過(guò)夜。對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行真空濃縮。將殘余物用EtOAc(1L)吸收，并用0.5M檸檬酸(3×900mL)、水(1×900mL)、飽和NaHCO3(3×900mL)、鹽水(1×900mL)洗滌，干燥(MgSO4)、過(guò)濾并真空濃縮后，生成一褐色殘余物。將該殘余物通過(guò)快速色譜法(在硅膠上用50％EtOAc/己烷)純化生成33.04g(77％)黃色泡沫狀的標(biāo)題化合物。Rf＝0.54(在硅膠上用3∶2EtOAc/己烷)。
步驟6制備2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯。向2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基-氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯(33.04g，0.052mol)溶于丙酮(510mL)的溶液中添加K2CO3(8.69g，0.063mol)，并在室溫下攪拌該混合物10分鐘。緩慢添加硫酸二甲酯(5.95mL，0.063mol)，并在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過(guò)夜。對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行真空濃縮，殘余物用EtOAc(600mL)吸收。將有機(jī)相用水(2×400mL)、鹽水(2×400mL)洗滌，用Na2SO4干燥，過(guò)濾并真空濃縮。通過(guò)快速色譜法(在硅膠上使用2∶1己烷/EtOAc)純化殘余物，生成28.69g(85％)白色固體狀標(biāo)題化合物。
步驟7制備2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸鹽酸鹽。將2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)-甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯(28.69g，0.044mol)的甲酸(500mL)溶液加熱至70℃兩小時(shí)，然后進(jìn)行真空濃縮。將殘余物再次溶解至甲酸(500mL)中，然后再在70℃下加熱2小時(shí)，隨后再真空濃縮。將殘余物再次溶解于甲酸(500mL)中，并再在70℃下加熱1小時(shí)?；旌衔锏捏w積減少90％，然后將其用1.0M鹽酸(44mL，0.044mol)及蒸餾水(490mL)處理。將所得均質(zhì)溶液在真空下濃縮，然后添加入蒸餾水(100mL)，將此均質(zhì)溶液低壓凍干14天以上后生成26.76g(96％)白色固體狀標(biāo)題化合物。
1H NMR(CD3OD)δ7.96-7.92(m，2H)，7.45-7.25(m，4H)，7.06-6.95(m，3H)，5.00-4.93(m，1H)，3.55-3.40(m，5H)，3.34-3.20(m，，2H)，3.15-3.05(m，5H)，3.07-3.00(m，3H)，1.22(bs，6H)13C NMR(CD3OD)δ171.6，168.3，154.5，144.4，137.9，135.1，135.0，134.1，125.5，120.6，120.3，39.6，39.2，39.1，15.2MS m/z 589(MH+)實(shí)例2制備2-{2-二乙氨基-5-[(4-氯苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、6及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟5用4-氯苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實(shí)施。
1H NMR(CD3OD)δ7.88-7.85(m，2H)，7.72-7.69(m，2H)，7.39-7.25(m，2H)，7.14-6.92(m，3H)，5.00-4.85(m，1H)，3.60-3.50(m，1H)，3.37-3.28(m，6H)，3.15-3.07(m，6H)，3.01(bs，3H)，1.22(bs，6H)13C NMR(CD3OD)d 208.6，145.3，134.9，128.8，124.9，124.5，124.4，116.3，50.2，30.4，30.0，6.0 MS m/z 605(MH+)實(shí)例3制備2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氟苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；步驟1、2、3、4、6及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟5用3，4-二氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實(shí)施。
1H NMR(CD3OD)δ7.84-7.77(m，1H)，7.67(bs，1H)，7.58-7.53(m，1H)，7.37-7.34(m，1H)，7.22-7.18(m，1H)，7.08-7.02(m，3H)，4.83-4.76(m，1H)，3.55-3.54(m，4H)，3.35-3.33(m，1H)，3.23-3.12(m，6H)，3.03-2.99(m，3H)，1.19(bs，6H)13C NMR(CD3OD)δ178.3，177.8，163.2，162.6，159.3，159.1，155.9，155.7，154.3，153.0，152.5，152.4，138.4，138.1，134.0，129.5，125.3，122.4，122.2，121.7，121.4，115.3，59.3，46.0，42.4，41.9，40.4，39.9，39.2，39.1，15.76MS m/z 607.2(MH+)實(shí)例4制備2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氯苯磺?；?甲氨基]嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、6及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟5用3，4-二氯苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實(shí)施。
1H NMR(CD3OD)δ8.00-7.98(m，1H)，7.83-7.74(m，2H)，7.37-7.34(m，1H)，7.21-7.20(m，1H)，7.10-7.02(m，3H)，4.85-4.83(m，1H)，3.55-3.53(m，2H)，3.35-3.33(m，1H)，3.21-3.12(m，6H)，3.04-2.99(m，6H)，1.19(bs，6H)13C NMR(CD3OD)δ176.4，166.2，161.7，161.2，158.0，157.8，152.8，151.5，150.5，140.2，139.8，139.5，136.8，135.8，133.9，132.6，132.0，129.8，123.8，113.7，113.4，57.8，44.6，40.8，40.4，38.7，38.3，37.7，37.5，14.1MS m/z 639.1(MH+)實(shí)例5制備2-{2-二乙氨基-5-[(苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；步驟1、2、3、4、6及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟5用苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實(shí)施。
1H NMR(CD3OD)δ8.14(bs，1H)，(7.85-7.84(m，1H)，7.8-7.78(m，1H)，7.69-7.66(m，2H)，7.40-7.37(m，1H)，7.21-7.195(m，1H)，7.04-7.03(m，2H)，7.95-7.90(m，1H)，5.52(bs，1H)，3.54-3.53(m，2H)，3.36-3.33(m，6H)，3.13-3.12(m，3H)，3.01-3.00(m，3H)，1.20-1.17(m，6H)13C NMR(CD3OD)δ165.9，152.8，136.7，135.8，132.6，131.6，130.2，123.8，44.7，37.5，14.0MS m/z 571.2(MH+)實(shí)例6制備2-{2-二乙氨基-5-[(2-氟苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、6及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟5用2-氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實(shí)施。
1H NMR(CD3OD)δ8.31(bs，1H)，7.94-7.85(m，2H)，7.57-7.44(m，3H)，7.34-7.30(m，1H)，7.15-7.12(m，2H)，5.00-4.85(1H)，3.63-3.62(m，4H)，3.50-3.42(m，1H)，3.34-3.30(m，4H)，3.29-3.22(m，4H)，3.11-3.10(m，2H)，1.28(bs，6H)13C NMR(CD3OD)δ176.5，166.4，163.1，160.4，159.7，157.7，152.8，151.5，150.7，138.5，138.3，136.7，133.7，132.5，132.2，127.1，123.7，119.9，119.6，113.4，57.8，44.6，40.6，39.0，38.4，37.7，37.5，14.1實(shí)例7制備2-{2-二乙氨基-5-[(3-氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、6及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟5用3-氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實(shí)施。
1H NMR(CD3OD)δ8.15-8.12(bs，1H)，7.72-7.68(m，1H)，7.63-7.60(m，1H)，7.53-7.52(m，1H)，7.38-7.35(m，1H)，7.21-7.20(m，1H)，7.10-6.99(m，3H)，4.87-4.86(m，1H)，3.54-3.53(m，4H)，3.35-3.34(m，3H)，3.15-3.12(m，4H)，3.05-3.00(m，4H)，1.20(bs，6H)13C NMR(CD3OD)δ166.1，153.1，136.9，134.1，132.8，126.5，124.1，123.2，122.9，117.7，117.4，103.4，45.0，38.0，14.3MS m/z 589.2(MH+)實(shí)例8制備2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?異丙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2及3按照實(shí)例1實(shí)施。隨后按照以下程序在單罐內(nèi)完成步驟4及6。然后，按實(shí)例1實(shí)施步驟5及7。
1H NMR(CD3OD)δ8.20-8.16(m，1H)，7.95-7.84(m，2H)，7.36-7.25(m，3H)，7.24-7.15(m，3H)，7.07-6.98(m，3H)，5.07-5.05(m，1H)，4.90-4.86(m，1H)，4.65-4.62(m，1H)，4.49-4.41(m，1H)，3.63-3.56(m，3H)，3.38-3.31(m，2H)，3.27-3.11(m，2H)，3.00-2.99(m，3H)，1.27-1.21(m，6H)，1.05-0.99(m，6H)13C NMR(CD3OD)δ175.8，175.5，169.6，166.3，165.9，163.5，163.4，157.7，153.0，152.9，152.3，138.1，136.4，136.1，133.1，133.0，133.0，132.9，132.7，132.3，123.8，118.8，118.7，118.5，118.4，107.5，57.6，57.2，54.7，44.7，38.7，38.1，37.6，37.5，23.0，22.9，22.2，22.0，14.1，14.0制備2-(2-二乙氨基-5-異丙基氨基嘧啶-4-基)-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯的另一單罐程序。將2-(2-二乙氨基-5-硝基嘧啶-4-基氨基)-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯(5.0g，0.010mol)、冰醋酸(10滴)、丙酮(2.19mL，0.030mol)及鉑氧化物(0.250g，5wt％)溶于EtOH(15mL)的混合物在45psi氫氣下氫化，直到TLC(50％EtOAc/己烷)顯示100％轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物(20小時(shí))。然后使反應(yīng)混合物濾過(guò)一硅藻土塞并真空濃縮，生成一灰色殘余物。通過(guò)快速色譜法(4∶1EtOAc/己烷)純化殘余物，生成3.54g(70％)紫紅色泡沫狀9。
實(shí)例9制備2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、5及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟6用碘乙烷代替硫酸二甲酯實(shí)施。
1H NMR(CDCl3)δ0.89(t，J＝7.2，1.8H)，1.06(t，J＝7.1，1.2H)，1.10-1.30(m，6H)，2.97(s，3H)，3.05(s，3H)，3.10-3.90(m，8H)，4.82(q，J＝5.4，0.6H)，4.91(q，J＝6.1，0.4H)，6.80-7.45(m，8H)，7.77(m，2H)，12.44(bs，1H)MS m/z 603.3(MH+)實(shí)例10制備2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氟苯磺酰基)異丙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；步驟1、2、3、4、6及7按照實(shí)例8實(shí)施。步驟5用3，4-二氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實(shí)施。
1H NMR(CD3OD)δ8.20-8.19(m，1H)，7.84-7.78(m，1H)，7.70-7.64(m，1H)，7.54-7.48(m，1H)，7.39-7.31(m，1H)，7.20-7.17(m，1H)，7.05-6.96(m，2H)，4.91-4.89(m，1H)，4.70-4.68(m，1H)，4.48-4.41(m，2H)，3.60-3.58(m，3H)，3.34-3.33(m，1H)，3.27-3.20(m，1H)，3.09-3.08(m，2H)，2.98-2.97(m，2H)，1.28-1.19(m，6H)，1.06-0.98(m，6H)，0.83-0.81(m，1H)13C NMR(CD3OD)δ177.6，177.2，167.9，164.9，164.8，159.2，159.1，155.7，154.5，154.4，152.4，152.3，140.4，140.3，137.8，134.3，133.9，129.3，129.2，125.4，122.6，122.5，122.4，122.2，121.5，121.2，109.1，59.5，59.1，56.7，56.6，46.4，46.3，39.6，39.3，39.2，24.7，24.5，23.9，23.6，15.7，15.6實(shí)例11制備2-{2-二乙氨基-5-[(4-氯苯磺?；?異丙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、6及7按照實(shí)例8實(shí)施。步驟5用4-氯苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實(shí)施。
1H NMR(CD3OD)δ8.18-8.17(m，1H)，7.85-7.78(m，1H)，7.62-7.58(m，1H)，7.38-7.35(m，1H)，7.34-7.24(m，1H)，7.17-7.16(m，1H)，7.10-7.05(m，2H)，7.04-6.98(m，2H)，4.98-4.87(m，1H)，4.73-4.68(m，1H)，4.55-4.38(m，2H)，3.70-3.52(m，3H)，3.40-3.30(m，1H)，3.28-3.18(m，1H)，3.17-3.08(m，2H)，3.05-2.98(m，2H)，1.25-1.20(m，6H)，1.04-0.96(m，6H)，0.80-0.77(m，1H)13C NMR(CD3OD)δ175.7，175.5，166.2，165.8，169.6，163.5，163.4，157.6，152.9，152.8，138.0，136.3，136.1，133.1，133.0，132.9，132.7，132.2，123.8，118.8，118.6，118.5，118.5，118.3，107.5，57.6，57.2，54.7，44.6，38.6，38.1，37.6，37.5，22.9，22.8，22.2，21.9，14.1，13.9實(shí)例12制備2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氟苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、6及7按照實(shí)例9實(shí)施。步驟5用3，4-二氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實(shí)施。
1H NMR(CD3OD)δ8.15-8.14(m，1H)，7.80-7.75(m，1H)，7.73-7.62(m，1H)，7.60-7.49(m，1H)，7.30-7.18(m，1H)，7.16-7.00(in，2H)，5.58-5.50(m，1H)，4.90-4.83(m，1H)，5.78-5.70(m，1H)，3.85-3.75(m，1H)，3.65-3.54(m，3H)，3.40-3.23(m，5H)，3.18-3.10(m，3H)，3.05-2.98(m，3H)，1.25-1.15(m，3H)，1.18-1.05(t，1.5H)，1.02-1.00(t，1.5H)13C NMR(CD3OD)δ165.8，152.7，145.7，136.4，136.3，132.5，132.2，127.5，123.6，120.7，120.4，81.4，57.0，44.3，38.5，38.1，37.4，14.9，14.6，14.1，14.0MS m/z 621.5(MH+)
實(shí)例13制備2-{2-二乙氨基-5-[(4-氯苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、6及7按照實(shí)例9實(shí)施。步驟5用4-氯苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實(shí)施。
1H NMR(CD3OD)δ8.15-8.14(m，1H)，7.84-7.79(m，1H)，7.67-7.61(m，1H)，7.37-7.33(m，1H)，7.22-7.18(m，1H)，7.14-7.13(m，1H)，7.06-7.00(m，3H)，4.80-4.75(m，1H)，4.18-4.10(m，1H)，3.65-3.30(m，3H)，3.28-3.20(m，3H)，3.18-3.08(m，2H)，3.03-2.98(m，2H)，2.05-2.04(m，1H)，1.30-1.16(m，9H)，1.10-1.08(t，1.5H)，0.99-0.95(t，1.5H)13C NMR(CD3OD)δ176.2，176.1，166.7，162.7，162.3，157.6，152.9，142.0，138.8，136.5，132.8，132.5，132.0，131.8，123.8，111.7，111.4，57.9，57.8，44.9，38.9，38.3，37.8，37.7，15.1，14.9，14.3，14.2MS m/z 619.4(MH+)實(shí)例14制備2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?環(huán)丙基甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、5及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟6用溴甲基環(huán)丙烷及碳酸銫代替硫酸二甲酯及碳酸鉀實(shí)施。
1H NMR(CDCl3)δ-0.2-0.2(m，2.4H)，0.2-0.45(m，1.6H)，0.54(m，0.6H)，0.85(m，0.4H)，1.00-1.40(m，6H)，2.80-3.80(m，14H)，4.79(q，J＝5.5，0.6H)，4.91(q，J＝6.3，0.4H)，6.70-7.40(m，8H)，7.77(m，2H)，10.26(bs，1H)MS m/z 629.2(MH+)實(shí)例15制備2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氟苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、6及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟5用3，5-二氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實(shí)施。
1H NMR(CD3OD)δ7.68-7.67(m，1H)，7.67-7.56(m，2H)，7.42-7.40(m，2H)，7.31-7.30(m，1H)，7.26-7.23(m，2H)，5.20-4.90(m，1H)，4.35-4.33(m，1H)，3.78-3.74(m，4H)，3.57-3.54(2H)，3.38-3.33(m，2H)，3.26-3.21(m，2H)，2.41-2.39(m，2H)，2.26-2.25(m，2H)，1.50-1.38(m，6H)13C NMR(CD3OD)d 162.5，162.3，159.2，159.0，148.0，146.1，132.2，127.8，127.7，127.6，118.9，109.1，109.0，108.7，108.6，106.2，105.8，52.5，39.6，34.1，32.9，9.5實(shí)例16制備2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氟苯磺?；?乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、5及7按照實(shí)例15實(shí)施。步驟6用碘乙烷代替硫酸二甲酯實(shí)施。
1H NMR(CD3OD)δ7.45-7.43(m，1H)，7.42-7.18(m，2H)，7.21-7.16(m，2H)，7.07-7.06(m，1H)，7.04-6.97(m，2H)，5.51(bs，1H)，4.86-4.82(m，1H)，4.72-4.66(m，1H)，3.84-3.77(m，1H)，3.59-3.50(m，3H)，3.34-3.31(m，2H)，3.12-3.10(m，3H)，2.99-2.96(m，3H)，1.22-1.14(m，9H)，1.10-1.05(t，1.5H)，0.97-0.95(t，1.5H)13C NMR(CD3OD)δ159.9，150.9，150.1，134.0，130.0，129.7，121.2，107.9，86.7，42.0，41.9，36.3，35.2，35.1，12.8，12.5，11.9，11.8，實(shí)例17制備2-{2-二乙氨基-5-[(2，4-二氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、6及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟5用2，4-二氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實(shí)施。
1H NMR(CD3OD)δ8.16-8.11(m，1H)，7.59-7.56(m，2H)，7.48-7.45(m，2H)，7.26-7.24(m，3H)，5.21-5.16(m，1H)，3.79-3.77(m，4H)，3.57-3.54(m，3H)，3.48-3.46(m，2H)，3.44-3.34(m，3H)，3.22-3.21(m，3H)，1.45-1.44(m，6H)13C NMR(CDCl)δ180.2，170.3，166.6，150.3，129.0，128.9，128.7，125.9，125.4，117.5，117.4，116.5，114.8，107.7，107.4，95.5，90.8，68.0，65.1，55.7，50.8，37.6，36.4，31.9，31.7，31.6，13.2，9.4，8.3，7.8實(shí)例18制備2-{2-二乙氨基-5-[(2，4-二氟苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、5及7按照實(shí)例17實(shí)施。步驟6用碘乙烷代替硫酸二甲酯實(shí)施。
1H NMR(CD3OD)δ8.15(bs，1H)，7.91-7.76(m，1H)，7.32-7.30(m，2H)，7.20-7.19(m，2H)，7.04-7.00(m，2H)，4.84-4.83(m，1H)，4.74-4.67(m，1H)，4.14-4.07(m，1H)，3.92-3.82(m，1H)，3.51-3.49(m，3H)，3.34-3.31(m，3H)，3.12-2.99(m，2H)，2.98-2.97(m，2H)，2.03-2.02(m，1H)，1.26-1.17(m，6H)，1.10-1.06(t，1.5H)，1.03-0.98(t，1.5H)13C NMR(CD3OD)δ173.6，173.3，171.4，167.7，164.3，161.2，159.9，159.3，157.1，156.7，155.2，152.4，151.0，150.3，134.0，133.3，133.1，132.9，130.0，123.2，122.9，122.8，121.3，121.2，112.0，111.8，111.6，111.5，107.7，107.2，106.0，105.9，105.6，105.2，60.0，54.8，42.0，36.5，35.9，35.3，35.1，19.3，13.0，12.9，12.7，11.9，11.8實(shí)例19制備2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氯苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、6及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟5用3，5-二氯苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實(shí)施。
1H NMR(CD3OD)δ7.84-7.82(m，1H)，7.76-7.75(m，3H)，7.34-7.32(m，1H)，7.19-7.10(m，1H)，7.03-7.00(m，2H)，5.50(bs，1H)，4.83-4.82(m，1H)，4.74-7.73(m，1H)，3.55-3.38(m，4H)，3.34-3.32(m，2H)，3.15-3.11(m，4H)，3.02-2.99(m，3H)，1.18-1.15(m，6H)13C NMR(CD3OD)δ157.1，155.2，150.1，149.7，140.1，135.9，134.3，132.9，130.0，129.9，126.0，121.2，110.7，55.2，54.8，42.0，38.5，38.1，36.5，35.9，35.2，35.1，11.9MS m/z 639.1(MH+)實(shí)例20制備2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氯苯磺?；?乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、5及7按照實(shí)例19實(shí)施。步驟6用碘乙烷代替硫酸二甲酯實(shí)施。
1H NMR(CD3OD)δ8.15(bs，1H)，7.84-7.84-7.79(m，1H)，7.76-7.74(m，2H)，7.33-7.30(m，1H)，7.22-7.11(m，2H)，7.04-6.98(m，1H)，5.51(bs，1H)，4.86-4.82(m，1H)，4.72-4.67(m，1H)，3.77-3.75(m，1H)，3.60-3.50(m，3H)，3.34-3.29(m，2H)，3.27-3.22(m，2H)，3.12-3.11(m，2H)，2.99-2.98(m，2H)，1.23-1.14(m，6H)，1.10-1.05(t，1.5H)，0.99-0.94(t，1.5H)13C NMR(CD3OD)δ173.6，173.4，163.7，159.9，159.3，157.3，156.8，155.2，155.1，152.1，150.8，150.2，141.4，141.2，135.9，134.0，132.7，130.0，129.7，125.8，125.7，121.3，121.2，107.9，107.4，54.8，54.7，42.0，36.4，35.8，35.3，35.1，12.8，12.5，11.9，11.8MS m/z 653.2(MH+)實(shí)例21制備2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?-正丙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、5及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟6用1-碘丙烷代替硫酸二甲酯實(shí)施。
1H NMR(CDCl3)δ0.75(m，3H)，1.00-1.50(m，8H)，3.00(s，3H)，3.08(s，3H)，3.20-3.70(m，8H)，4.79(q，J＝6.3，0.6H)，4.91(q，J＝6.6，0.4H)，5.73(bs，0.6H)，5.92(bs，0.4H)，6.90-7.45(m，7H)，7.76(m，2H)MS m/z 617.2(MH+)實(shí)例22制備2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?烯丙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、5及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟6用烯丙基溴代替硫酸二甲酯實(shí)施。
1H NMR(CDCl3)δ1.20(m，6H)，2.98(s，3H)，3.06(s，3H)，3.10-4.30(m，8H)，4.75-4.95(m，1H)，5.07(m，2H)，5.48(m，0.6H)，5.67(m，0.4H)，6.90-7.45(m，8H)，7.76(m，2H)，11.07(bs，1H)MS m/z 615.2(MH+)實(shí)例23制備2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)異丁氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、5及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟6用異丁基碘代替硫酸二甲酯實(shí)施。
MS m/z 631.2(MH+)實(shí)例24制備2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)-正丁氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、5及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟6用1-碘丁烷代替硫酸二甲酯實(shí)施。
1H NMR(CDCl3)δ0.82(q，J＝7.1，3H)，1.05-1.40(m，10H)，3.01(s，3H)，3.10(s，3H)，3.15-3.80(m，8H)，4.75(q，J＝6.3，0.6H)，4.91(q，J＝5.9，0.4H)，5.79(d，J＝5.4，0.6H)，5.91(d，J＝6.6，0.4H)，7.00-7.40(m，7H)，7.77(m，2H)實(shí)例25制備2-{2-二乙氨基-5-[(2，5-二氟苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、6及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟5用2，6-二氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實(shí)施。
1H NMR(CD3OD)δ8.38-8.37(m，1H)，7.99-7.95(m，1H)，7.55-7.54(m，2H)，7.50-7.42(m，2H)，7.27-7.22(m，2H)，5.08-5.06(m，1H)，3.76-3.74(m，4H)，3.59-3.54(m，3H)，3.49-3.42(m，4H)，3.36-3.34(m，2H)，3.23-3.21(m，2H)，1.40(bs，6H)13C NMR(CD3OD)δ161.4，159.2，155.8，153.1，148.1，147.1，133.6，132.0，127.8，119.0，111.1，110.8，110.7，108.5，105.8，94.8，86.4，66.7，54.0，52.8，39.7，35.8，34.2，33.7，32..9，32.8，9.4實(shí)例26制備2-{2-二乙氨基-5-[(2，3-二氟苯磺?；?乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、6及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟5用2，3-二氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實(shí)施。用以下程序制備2，3-二氟苯磺酰氯。
1H NMR(CD3OD)δ8.32(bs，1H)，7.90-7.80(m，2H)，7.59-7.48(m，3H)，7.27-7.23(m，2H)，5.09-5.08(m，1H)，3.77-3.70(m，4H)，3.60-3.51(m，3H)，3.50-3.42(m，2H)，3.39-3.31n(m，3H)，3.32-3.18(m，2H)，1.43-1.41(m，6H)13C NMR(CD3OD)δ170.4，160.8，158.1，156.1，153.0，151.6，150.5，148.9，148.2，147.3，147.2，143.9，143.5，142.6，141.1，140.9，131.8，127.7，125.1，123.8，120.8，120.6，119.2，40.5，35.7，33.4，32.9，32.7，9.0制備2，3-二氟苯磺酰氯。用兩燒瓶實(shí)施以下程序。在第一燒瓶中，將2，3-二氟苯胺(2.0g，0.015mol)溶解于濃縮的HCl(15.9mL中)，用一冰/NaCl浴將所得溶液冷卻至-5℃。邊攪拌邊添加亞硝酸鈉(1.18g，0.017mol)溶于蒸餾水(13.6mL)中的溶液，同時(shí)保持溫度低于0℃，并攪拌混合物10分鐘。在第二燒瓶中，將亞硫酰氯(5.08mL，0.069mol)滴加至預(yù)先用冰/NaCl浴冷卻至-5℃的蒸餾水(30.6mL)中。將所得溶液加熱至室溫，然后添加Cu(I)Cl(0.08g，0.77mmol)，再將反應(yīng)混合物重新冷卻至-5℃。在持續(xù)冷卻攪拌的情況下，將第一燒瓶的內(nèi)容物以每次2mL分份添加至第二燒瓶的內(nèi)容物中，并攪拌混合物30分鐘，期間形成一沉淀物。用過(guò)濾法分離出沉淀物，用冷水沖洗，并儲(chǔ)存在真空下以得到3.25g(98％)白色固體10。
實(shí)例27制備2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)炔丙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、5及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟6用炔丙基溴代替硫酸二甲酯實(shí)施。
1H NMR(CDCl3)4δ1.15(m，6H)，2.27(d，J＝2.1，1H)，2.97(s，3H)，3.06(s，3H)，3.10-3.70(m，6H)，3.75(dd，J＝17.7，2.0，0.6H)，3.95(dd，J＝18.1，2.0，0.4H)，4.51(dd，J＝19.5，2.2，0.6H)，4.54(dd，J＝18.1，2.2，0.4H)，4.79(q，J＝5.9，0.6H)，4.88(q，J＝6.6，0.4H)，6.42(bd，0.4H)，6.65(bs，0.6H)，6.85-7.30(m，6H)，7.52(s，0.6H)，7.56(s，0.4H)，7.85(m，2H)，8.20(bs，1H)MS m/z 613.2(MH+)實(shí)例28制備2-{2-二乙氨基-5-[(2，4-二氟苯磺?；?炔丙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸步驟1、2、3、4、5及7按照實(shí)例17實(shí)施。步驟6用炔丙基溴代替硫酸二甲酯實(shí)施。
1H NMR(CDCl3)δ1.16(q，J＝7.5，6H)，2.27(m，1H)，2.99(s，3H)，3.09(s，3H)，3.10-3.70(m，6H)，4.04(dd，J＝17.7，2.4，0.6H)，4.24(dd，J＝17.9，2.2，0.4H)，4.47(m，1H)，4.81(q，J＝5.9，0.6H)，4.89(q，J＝6.3，0.4H)，6.27(d，J＝7.5，0.4H)，6.41(d，J＝5.7，0.6H)，6.90-7.10(m，4H)，7.16(d，J＝8.3，1H)，7.28(d，J＝8.3，1H)，7.55(bs，1H)，7.66(s，0.6H)，7.67(s，0.4H)，7.81(m，1H)實(shí)例29制備2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?-(2，2，2-三氟乙基)氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；步驟1、2、3、4、5及7按照實(shí)例1實(shí)施。步驟6用三氟甲磺酸2，2，2-三氟乙基酯及碳酸銫代替硫酸二甲酯及碳酸鉀實(shí)施。
1H NMR(CDCl3)δ1.14(m，6H)，2.98(s，3H)，3.06(s，3H)，3.10-4.20(m，8H)，4.80(q，J＝5.9，0.6H)，4.87(q，J＝6.2，0.4H)，6.09(d，J＝5.9，0.4H)，6.18(bd，0.6H)，6.80-7.50(m，7H)，7.55(bs，1H)，7.77(m，2H)；MS m/z 657.2(MH+)實(shí)例Aα4β1整合素粘附性分析JurkatTM細(xì)胞對(duì)人血漿纖維連接蛋白的粘附性在4℃下將96孔板(Costar 3590 EIA板)用濃度為10μg/mL的人類(lèi)纖維連接蛋白(Gibco/BRL，cat#33016-023)涂覆并過(guò)夜。
然后將板用牛血清白蛋白(BSA，0.3％)溶于鹽水的溶液封阻。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)用Calcein AM對(duì)JurkatTM細(xì)胞(保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)進(jìn)行標(biāo)記，并使其以2×106細(xì)胞/mL的濃度懸浮于Hepes/鹽水/BSA中。然后，在室溫下使細(xì)胞經(jīng)受測(cè)試化合物及對(duì)照化合物作用30分鐘，再轉(zhuǎn)移至經(jīng)纖維連接蛋白涂覆的板的單個(gè)加樣孔中。在37℃下使粘附進(jìn)行35分鐘。然后使用新鮮鹽水通過(guò)輕緩的抽吸和移液來(lái)洗滌這些加樣孔。用一熒光板讀數(shù)器在EX 485/EM 530處定量與剩余粘附細(xì)胞相關(guān)的熒光。
細(xì)胞培養(yǎng)物可通過(guò)以下方法來(lái)制備首先在第1天以1∶10、在第2天以1∶2對(duì)處于靜止期的JurkatTM細(xì)胞進(jìn)行分樣，并在第3天進(jìn)行分析。在第3天以1∶4對(duì)第1天以1∶10分樣的細(xì)胞進(jìn)行分樣以供第4天分析之用。
分析板可通過(guò)以下制備首先配制10μg/mL的Gibco/BRL人類(lèi)纖維連接蛋白(cat#33016-023)溶于PBS++的工作溶液。
然后在室溫下以50μL/加樣孔將一Costar 3590 EIA板浸漬2小時(shí)(認(rèn)為其亦可在4℃下過(guò)夜)。最后，在室溫下用Hepes/鹽水緩沖液以100μL/加樣孔的量對(duì)該板進(jìn)行抽吸并封阻1小時(shí)，隨后用150μL的PBS++洗滌3次?；衔锏南♂尶赏ㄟ^(guò)以如下方式制備化合物1∶3的連續(xù)稀釋液來(lái)完成。對(duì)于每一板(4種化合物/板)，將600μL添加至位于一滴定架上的4個(gè)Bio-Rad滴定管中。用此項(xiàng)技術(shù)中熟知的方法將足量化合物添加至每一適合的管內(nèi)，以得到2X濃度。用Falcon Flexiplate，將100μLHepes/鹽水緩沖液或人類(lèi)血清添加至B至G排。使用一設(shè)定至180μL且具有四個(gè)間隔均勻的吸頭的多道移液管。將每組四個(gè)管混合5次，并將180μL 2X化合物轉(zhuǎn)移至B行第1列的每一化合物稀釋液中，A行保持空白。將180μL添加至A行的其它加樣孔中。通過(guò)轉(zhuǎn)移50μL至下一稀釋液并混合5次來(lái)沿該板連續(xù)地進(jìn)行稀釋?zhuān)看位旌虾蠖几鼡Q吸頭。在F行處停止稀釋。G行不含有化合物。
20μg/mL的21/6抗體溶于Hepes/鹽水緩沖液或人類(lèi)血清的溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，其擱置于一試劑槽中以添加至細(xì)胞懸浮板。
細(xì)胞染色可通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)首先通過(guò)在50mL試管內(nèi)離心(1100rpm，5分鐘)來(lái)獲得對(duì)數(shù)期的JurkatTM細(xì)胞。將細(xì)胞重新懸浮于50mL PBS++中，旋轉(zhuǎn)并再次懸浮于20mL PBS++中。添加入20μL Calcein AM對(duì)細(xì)胞染色30分鐘。用Hepes/鹽水緩沖液將容積補(bǔ)足至50mL并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，旋轉(zhuǎn)并再次以2×106細(xì)胞/mL懸浮于Hepes/鹽水緩沖液或人類(lèi)血清中。
將化合物使用以下程序培養(yǎng)。在一新的撓性板中，將65μL已染色的細(xì)胞添加至B至H行。然后，按照板的布置將65μL 2X化合物添加至適宜的行中，并混合3次。將65μL 2X-21/6抗體添加至H行中并混合3次。最后將板在室溫下培養(yǎng)30分鐘。
纖維連接蛋白粘附性在以下加工程序后用一熒光板讀數(shù)器在EX 485/EM 530處測(cè)得。將培養(yǎng)后的細(xì)胞混合3次并將100μL轉(zhuǎn)移至經(jīng)纖維連接蛋白涂覆的板上，在37℃下培養(yǎng)35分鐘。通過(guò)沿加樣孔的側(cè)邊輕輕地吸取100μL室溫的PBS++并將板翻轉(zhuǎn)90度抽吸來(lái)逐行洗滌每一塊板。重復(fù)此程序，共洗滌3次。洗滌后通過(guò)沿加樣孔的側(cè)面移液將用100μL充填各加樣孔。
在含人類(lèi)血清和不含人類(lèi)血清兩種情況下計(jì)算每一化合物的IC50值。IC50為生長(zhǎng)或活性受到的抑制程度為50％時(shí)的濃度。數(shù)據(jù)列于下表中細(xì)胞對(duì)人類(lèi)血漿纖維連接蛋白的粘附性(不含人類(lèi)血清)


細(xì)胞對(duì)人類(lèi)血漿纖維連接蛋白的粘附性(含有人類(lèi)血清)


實(shí)例B用于測(cè)定候選化合物與α4β1的結(jié)合的活體外飽和分析下文闡述一活體外分析，該分析用來(lái)測(cè)定一化合物要在下一實(shí)例所闡述的實(shí)驗(yàn)性自體免疫性腦脊髓炎(“EAE”)模型中或在其它活體內(nèi)模型中具有活性所需的血漿濃度。
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的Jurkat細(xì)胞洗滌并重新懸浮于含20μg/mL 15/7抗體的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物血漿內(nèi)(Yednock，等人，J.Biol.Chem.，(1995)270(48)28740)。
將Jurkat細(xì)胞在含66μM至0.01μM不同濃度的已知候選化合物的標(biāo)準(zhǔn)血漿試樣中稀釋兩倍(使用一標(biāo)準(zhǔn)的12點(diǎn)連續(xù)稀釋?zhuān)缘玫揭粯?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn))或在從候選化合物處理過(guò)的動(dòng)物外周血液得到的血漿試樣中稀釋兩倍。
然后在室溫下將細(xì)胞培養(yǎng)30分鐘，用含2％胎牛血清及皆1mM的氯化鈣和氯化鎂的磷酸鹽緩沖鹽水(“PBS”)(分析介質(zhì))洗滌兩次以除去未結(jié)合的15/7抗體。
然后使細(xì)胞接觸與藻紅蛋白偶聯(lián)的1∶200山羊F(ab′)2抗小鼠IgG Fc(Immunotech，Westbrook，ME)(其已經(jīng)通過(guò)與5％所研究動(dòng)物物種的血清共同培養(yǎng)而被吸附用于提供任何非特異性交叉反應(yīng)性)，并于4℃下在黑暗中培養(yǎng)30分鐘。
用分析介質(zhì)將細(xì)胞洗滌兩次并重新懸浮于相同溶液中。然后用如Yednock等人在J.Biol.Chem(1995，27028740)所述的標(biāo)準(zhǔn)熒光激活細(xì)胞分選儀(“FACS”)分析對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行分析。
然后將數(shù)據(jù)繪制成熒光-劑量曲線(xiàn)圖，例如以一標(biāo)準(zhǔn)的劑量反應(yīng)形式。形成曲線(xiàn)上部平穩(wěn)段的劑量代表在活體內(nèi)模型中獲得功效所需的量。
此分析亦可用于確定使其它整合素(例如α9β1整合素，其為與α4β1整合素關(guān)系最密切的整合素)的結(jié)合位點(diǎn)飽和的血漿濃度(Palmer等人，1993，J.Cell Bio.，1231289)。此結(jié)合預(yù)示對(duì)于由整合素介導(dǎo)的炎癥疾病具有活體內(nèi)效用，這些疾病包括(例如)伴隨慢性哮喘病發(fā)生的阻塞及呼吸道過(guò)度反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化中的平滑肌細(xì)胞增生、血管成形術(shù)后的血管阻塞、腎病導(dǎo)致的纖維化癥及腎小球瘢痕化、主動(dòng)脈狹窄、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的滑液膜肥大、潰瘍性結(jié)腸炎及克隆氏病發(fā)展中發(fā)生的炎癥及瘢痕化。
因此，上述分析可用一轉(zhuǎn)染有編碼α9整合素的cDNA的人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞系即SW480(ATTC#CCL228)(Yokosaki等人，1994，J.Biol.Chem.，26926691)代替Jurkat細(xì)胞，來(lái)測(cè)量α9β1整合素的結(jié)合性。作為一對(duì)照，亦可使用表達(dá)其它α及β1亞單位的SW480細(xì)胞。
因此，本發(fā)明另一方面關(guān)于一種用來(lái)治療一哺乳動(dòng)物患者由α9β1介導(dǎo)的疾病的方法，該方法包括將一治療有效量的本發(fā)明化合物投予一該病人。該些化合物較佳以本文上述醫(yī)藥組合物的形式投與。有效日劑量將視患者的年齡、體重、狀態(tài)而定，這些因素可由主治臨床醫(yī)師容易查明。然而，在一較佳實(shí)施例中，該些化合物以每天約20到500μg/kg的量投與。
實(shí)例C用于測(cè)定生物利用率的卡匣式投藥及血清分析通過(guò)用一卡匣(即，每一投藥溶液中6種化合物的混合物)給大鼠服藥來(lái)篩選口服生物利用率。此卡匣包含5種測(cè)試對(duì)象及一標(biāo)準(zhǔn)化合物，總劑量為10mg/kg。用等摩爾的1N NaOH將每一化合物/測(cè)試對(duì)象轉(zhuǎn)換為鈉鹽并以2mg/mL溶于水中。通過(guò)等體積混合此六種溶液制成該卡匣藥。將此卡匣藥溶液充分混合，然后將pH值調(diào)節(jié)至7.5至9。該藥溶液在研究的前一天制備并在室溫下攪拌過(guò)夜。
該篩選中使用Charles River Laboratories的6至8周齡的雄性Sprague Dawley(SD)大鼠。將大鼠隔離至少1天并允許持續(xù)進(jìn)食及飲水。晚上在投與該卡匣藥之前，使大鼠禁食約16小時(shí)。
每一卡匣內(nèi)指配4只SD大鼠。將一單次劑量的投藥溶液經(jīng)口投予每一只大鼠。記錄投藥量(5mL/kg)及投藥時(shí)間并在投藥兩小時(shí)后給予大鼠食物。
在以下時(shí)間點(diǎn)通過(guò)心臟穿刺采集血樣4小時(shí)、8小時(shí)及12小時(shí)。將大鼠用CO2氣體在10至20秒內(nèi)麻醉以后立即采集血液。在采集完12小時(shí)的血樣后，通過(guò)CO2窒息法及隨后的頸部錯(cuò)位法將大鼠無(wú)痛致死。
在處理血樣之前將其在低溫(4℃)下保存于經(jīng)肝素化的微量采血管中。將血樣離心(10000rpm，5分鐘)，取出血漿并儲(chǔ)存于-20℃的冷藏箱中直至進(jìn)行藥物濃度分析。使用以下直接沉淀血漿的方案來(lái)分析血漿中的藥物濃度。
通過(guò)以下在一1.5mL 96孔板中制備活體內(nèi)血漿試樣按順序添加100μL的測(cè)試血漿、150μL的甲醇，隨后旋轉(zhuǎn)10至20秒。添加150μL 0.05ng/μL的一溶于乙腈中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，并旋轉(zhuǎn)30秒鐘。
通過(guò)以下在一1.5mL 96孔板中制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)試樣按順序添加100μL的對(duì)照小鼠血漿、150μL的甲醇，并旋轉(zhuǎn)10至20秒。添加150μL 0.05ng/μL的一溶于乙腈中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，并旋轉(zhuǎn)30秒鐘。將0至200ng(10種濃度)溶于50％甲醇中的相關(guān)化合物攙入試樣以獲得一0.5ng/mL至2,000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍。再次將試樣渦旋30秒。
然后將試樣在Eppendorf微量離心機(jī)中以3000rpm離心20至30分鐘，再將80至90％的上清液轉(zhuǎn)移至一干凈的96孔板中。然后將有機(jī)溶劑蒸發(fā)直至試樣干燥(在40℃及氮?dú)庀拢?0至60分鐘(ZymarkTurbovap))。
然后將殘余物溶解于200至600L流動(dòng)相(50％CH3OH/0.1％TFA)中。繼而使用一PE-Sciex API-3000三級(jí)四極質(zhì)譜儀，Perkin-Elmer，Series200自動(dòng)采樣器及shimadzu 10A泵，進(jìn)行LC/MS/MS。用PE-Sciex Analyst(vl.1)進(jìn)行采集并用PE-SciexAnalyst(vl.1)完成數(shù)據(jù)分析及定量。用25％CH3OH、0.1％TFA-100％CH3OH、0.1％TFA的流動(dòng)相將5至50μL量的試樣注射至一反相ThermoHypersil DASH-18柱上(Keystone 2.0×20mm，5μm，PN8823025-701)。以約300μL/分鐘的流速進(jìn)行約8分鐘。
用線(xiàn)性梯形法則計(jì)算t＝0至最后取樣時(shí)間tx的曲線(xiàn)下面積(AUC)(參見(jiàn)Handbookof Basic Pharmacokinetics，Wolfgang A.Ritschel and Gregory L.Kearns，5thed，1999)。
AUC0-tx＝S((Cn+Cn+1)/2))·(tn+1-tn)[(μg/mL)h]在卡匣投藥圖中，在血管外投藥后第4、8及12小時(shí)采樣，計(jì)算t＝0至t＝12h的AUC。
計(jì)算每一個(gè)體動(dòng)物的AUC0-12h值，在下表中報(bào)告平均AUC0-12h。


實(shí)例D哮喘病模型由α4β1整合素介導(dǎo)的炎癥性癥狀包括(例如)伴隨慢性哮喘病發(fā)生的阻塞、嗜酸性粒細(xì)胞匯聚、呼吸道過(guò)度反應(yīng)。以下內(nèi)容闡述用于研究本發(fā)明化合物治療哮喘的活體內(nèi)效應(yīng)的哮喘病動(dòng)物模型。
大鼠哮喘病模型此模型采用Chapman等人在Am J.Resp.Crit Care Med(1534，A219(1996))中及Chapman等人在Am.J.Resp.Crit Care Med(1554，A881(1997))中(兩者的全部?jī)?nèi)容均以引用的方式并入本文中)闡述的方案。在第7天及第14天再次注射OA及佐劑。在第21天，將已致敏的動(dòng)物箝制于塑料試管內(nèi)并使其在一僅鼻孔可暴露的裝置中暴露(60分鐘)于OA氣霧劑(10mg/kg)下。72小時(shí)后用戊巴比妥(pentobarbtial)(250mg/kg，i.p.)將動(dòng)物處死。通過(guò)一氣管插管用3等份(4mL)翰克司溶液(HBSS×10,100mL；EDTA 100mM，100mL；HEPES 1M，25mL；用水補(bǔ)足至1L)灌洗大鼠的肺；收集所獲得的細(xì)胞并通過(guò)添加翰克司溶液將所得液體的總體積調(diào)節(jié)至12mL。對(duì)全部細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(Sysmex微細(xì)胞計(jì)數(shù)器F-500，TOA Medical Electronics Otd.，Japan)，通過(guò)稀釋所得液體(至約106細(xì)胞/mL)并將1等份(100μL)用移液器轉(zhuǎn)移至一離心機(jī)(Cytospin，Shandon，U.K.)內(nèi)來(lái)制作涂片。將涂片風(fēng)干，用一溶于甲醇中的固綠溶液(2mg/mL)固定5秒鐘，并用伊紅G染色5秒鐘，用噻嗪染色5秒鐘(Diff-Quick，Browne有限公司U.K.)，以區(qū)分嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞。使用油浸(×100)光學(xué)顯微鏡檢查法每涂片共計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞。將本發(fā)明化合物用一0.5％羧甲基纖維素及2％土溫80(Tween 80)懸浮液調(diào)配并經(jīng)口投予已經(jīng)對(duì)過(guò)敏原即卵清蛋白過(guò)敏的大鼠。在該模型中，認(rèn)為可在被有效致敏的Brown Norway大鼠呼吸道中抑制由過(guò)敏原誘導(dǎo)的白細(xì)胞積聚的化合物具有活性。
小鼠哮喘病模型亦在一急性肺部炎癥的小鼠模型中對(duì)這些化合物進(jìn)行評(píng)價(jià)，該評(píng)價(jià)按照Kung等人在Am J.Respir.Cell Mol.Biol.13360-365，(1995)中及Schneider等人在Am J.Respir.Cell Mol.Biol.20448-457，(1999)中(兩者的全部?jī)?nèi)容均以引用的方式并入本文中)所述的程序進(jìn)行。在第1天通過(guò)注射(i.p.)0.2mL含20μg卵清蛋白(4級(jí)，Sigma)及2mg注射明礬(Pierce)的卵清蛋白/明礬混合物將6只雌性黑色小鼠(8至12周齡)致敏。在第14天時(shí)給予一強(qiáng)化注射。在第28天及第29天用霧化的1％卵清蛋白(溶于0.9％的鹽水中)對(duì)小鼠進(jìn)行20分鐘的免疫激發(fā)。在第30天，即首次激發(fā)后48小時(shí)，將小鼠無(wú)痛致死并收集支氣管肺泡灌洗試樣(3mL)。用FACs/FITC染色法定量嗜酸性粒細(xì)胞。將本發(fā)明化合物用一0.5％羧甲基纖維素及2％土溫80懸浮液調(diào)配并經(jīng)口投予已經(jīng)對(duì)過(guò)敏原即卵清蛋白過(guò)敏的小鼠。在該模型中，認(rèn)為可在被有效致敏的C57BL/6小鼠呼吸道中抑制由過(guò)敏原誘導(dǎo)的白細(xì)胞積聚的化合物具有活性。
綿羊哮喘病模型該模型采用Abraham等人在J.Clin，Invest，93776-787(1994)中及Abraham等人在Am J.Respir Crit Care Med 156696-703(1997)中闡述的程序，兩者的全部?jī)?nèi)容均以引用的方式并入本文中。通過(guò)靜脈注射(鹽水溶液)、經(jīng)口(2％吐溫80，0.5％羧甲基纖維素)及氣霧劑形式投與至對(duì)豬蛔蟲(chóng)(Ascaris suum)抗原過(guò)敏的綿羊來(lái)對(duì)本發(fā)明化合物進(jìn)行評(píng)價(jià)。在該模型中，如化合物可減少早期抗原誘導(dǎo)的支氣管反應(yīng)及/或阻斷晚期呼吸道反應(yīng)，例如，具有一抗抗原誘導(dǎo)的晚期反應(yīng)及呼吸道過(guò)度反應(yīng)(“AHR”)的保護(hù)性效應(yīng)，則認(rèn)為其具有活性。
使用對(duì)吸入的豬蛔蟲(chóng)抗原顯現(xiàn)出早期和晚期支氣管反應(yīng)兩者的過(guò)敏性綿羊來(lái)研究候選化合物的呼吸道效應(yīng)。用2％的利多卡因(lidocaine)對(duì)鼻孔進(jìn)行局部麻醉后，將一氣球?qū)Ч軓囊槐强撞迦胫料率车乐小Ｈ缓笠砸粨闲岳w維光學(xué)支氣管鏡引導(dǎo)，經(jīng)由另一鼻孔用一有囊氣管內(nèi)管來(lái)培養(yǎng)這些動(dòng)物。
按Abraham(1994)所述來(lái)估測(cè)胸膜壓力。用一次性醫(yī)藥?kù)F化器產(chǎn)生氣霧劑(見(jiàn)下面的調(diào)配物)，該霧化器可提供一質(zhì)量中位氣動(dòng)粒徑為3.2μm(用Andersen級(jí)聯(lián)沖擊器測(cè)得)的氣霧劑。將此霧化器連接至一劑量計(jì)系統(tǒng)上，該系統(tǒng)由一電磁閥與一壓縮空氣源(20psi)組成。霧化器的出口導(dǎo)入一塑性T形部件，該部件的一端連接至一活塞呼吸機(jī)的吸氣孔。在霧化器的吸氣循環(huán)開(kāi)始時(shí)將電磁閥啟動(dòng)1秒鐘。以500mL的VT遞送氣體，速率為每分鐘呼吸20次。僅用0.5％的碳酸氫鈉溶液作為對(duì)照。
根據(jù)Abraham(1994)所述產(chǎn)生對(duì)卡巴膽堿的累積濃度反應(yīng)曲線(xiàn)，來(lái)評(píng)價(jià)支氣管反應(yīng)性。在處理開(kāi)始之前及抗原激發(fā)后24小時(shí)均進(jìn)行支氣管活組織檢查，該檢查按照Abraham(1994)所述實(shí)施。
亦按Abraham(1994)所述實(shí)施肺泡巨噬細(xì)胞的一活體外粘附研究，并計(jì)算粘附細(xì)胞的百分比。
氣霧劑調(diào)配物用以下程序制備一候選化合物以30.0mg/mL的濃度溶于0.5％碳酸氫鈉/鹽水(w/v)中的溶液A.制備0.5％碳酸氫鈉/鹽水儲(chǔ)備溶液100.0mL

程序1.向一容積為100mL的燒瓶?jī)?nèi)添加0.5g碳酸氫鈉。
2.添加約90.0mL鹽水并經(jīng)聲波處理直至溶解。
3.用鹽水補(bǔ)足至100.0mL并充分混合。
B.制備30.0mg/L的候選化合物10.0mL

程序1.向一容積為10.0mL的燒瓶?jī)?nèi)添加0.300g待測(cè)化合物。
2.再添加約9.7mL 0.5％的碳酸氫鈉/鹽水儲(chǔ)備溶液。
3.進(jìn)行聲波處理直至候選化合物完全溶解。
4.用0.5％的碳酸氫鈉/鹽水儲(chǔ)備溶液補(bǔ)足至10.0mL并充分混合。
實(shí)例E對(duì)C57B6小鼠進(jìn)行為期10天的毒性研究進(jìn)行一為期10天的研究來(lái)評(píng)價(jià)本發(fā)明化合物對(duì)雌性C57B6小鼠的毒性。以5種劑量水平(0(媒劑對(duì)照)、10、30、100、300及1000mg/kg(mpk))通過(guò)管飼法投與該化合物，每一劑量水平投予5只小鼠。所有水平的劑量均為10mL/kg。劑量溶液在2％吐溫80溶于0.5％羧甲基纖維素(CMC)中的溶液中制備，并且每2至3天制備新的劑量溶液或懸浮液。處死前的觀察包括體重(第1、2、3、5、7、8及11天實(shí)施)，每日籠邊臨床觀察(1-2次/天)及周期性(第-1、2及9天實(shí)施)系列機(jī)能觀察。
在結(jié)束時(shí)，通過(guò)心臟穿刺采集血液試樣供臨床病理學(xué)(血液學(xué)及臨床化學(xué))及藥物水平研究艇。分析這些EDTA血樣的總白細(xì)胞數(shù)目、紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞指數(shù)(MCV、MCH、MCHC)、血小板及WBC五部分的差異(嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞)。分析經(jīng)肝素化的血漿試樣的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、總膽紅素、白蛋白、蛋白質(zhì)、鈣、葡萄糖、尿素氮、肌酸酐、膽固醇及甘油三酯。
采集完血液后，對(duì)小鼠尸體進(jìn)行剖檢并稱(chēng)重器官(肝、脾、腎、心臟及胸腺)。采集腦、涎腺、胸腺、心臟、肺、肝、腎、腎上腺、脾、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸及子宮/卵巢這些組織的試樣并用福爾馬林穩(wěn)定。處理從媒劑對(duì)照、300及400mpk組的動(dòng)物得到的組織并置于經(jīng)H&E染色的玻璃載玻片上，對(duì)組織病理學(xué)損傷進(jìn)行評(píng)價(jià)。
使用Prism軟件通過(guò)Dunnet′s多重比較測(cè)試對(duì)體重變化、絕對(duì)及相對(duì)器官體重及臨床病理學(xué)結(jié)果進(jìn)行分析，找出與載劑對(duì)照組相比的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。用Dunnet′s、Fisher′s精確檢驗(yàn)法對(duì)這些機(jī)能觀察系列結(jié)果進(jìn)行差別分析并通過(guò)Cochran-Mantel-Haenszel相關(guān)性檢驗(yàn)用SAS軟件進(jìn)行劑量變化趨勢(shì)效應(yīng)分析。
使用一常規(guī)的口服調(diào)配物，本發(fā)明化合物在此模型中將具有活性。
實(shí)例F大鼠中由佐劑引發(fā)的關(guān)節(jié)炎佐劑引發(fā)的關(guān)節(jié)炎(“AIA”)是一用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)研究的動(dòng)物模型，其通過(guò)在Lewis大鼠的尾根部注射結(jié)核桿菌引發(fā)。在注射后的第10天及第15天之間，動(dòng)物會(huì)患上嚴(yán)重的漸進(jìn)性關(guān)節(jié)炎。
通常，對(duì)化合物改變大鼠由佐劑引發(fā)的浮腫造成的后爪腫脹及骨損傷的能力進(jìn)行測(cè)試。為了定量對(duì)AIA所導(dǎo)致的后爪腫脹的抑制程度，已定義兩種炎癥期(1)原發(fā)性及繼發(fā)性注射后爪炎癥期，及(2)繼發(fā)性未注射后爪炎癥期，其通常在注射爪中引發(fā)炎癥后約11天開(kāi)始顯現(xiàn)。如果后一類(lèi)型炎癥減輕，則表明測(cè)試化合物具有免疫抑制活性。Cf.Chang，Arth.Rheum.，20，1135-1141(1977)。
使用一RA動(dòng)物模型(例如AIA)可研究與該疾病初期階段有關(guān)的細(xì)胞事件。在佐劑關(guān)節(jié)炎的早期，CD44在巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞上的表達(dá)上調(diào)，然而在該疾病的后期，LFA-1的表達(dá)上調(diào)。了解在佐劑關(guān)節(jié)炎的最早期粘附分子與內(nèi)皮組織之間的相互作用可在RA治療方法方面獲得顯著進(jìn)展。
權(quán)利要求
1.一種式(I)化合物 其中每一X均獨(dú)立為氟、氯或溴；p為0或一從1到3的整數(shù)；R1選自由甲基和乙基組成的群組；R2選自由低碳烷基、低碳烯基和低碳亞烷基環(huán)烷基組成的群組；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
2.一種式(II)化合物 其中每一X均獨(dú)立選自由氟和氯組成的群組；m為一等于1或2的整數(shù)；R2選自由低碳烷基、低碳烯基和低碳亞烷基環(huán)烷基組成的群組；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
3.一種式(III)化合物 其中每一X均獨(dú)立為氟或氯；n為0或1；R2為-CH2-R′，其中R′選自由氫、甲基或-CH＝CH2組成的群組；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
4.如權(quán)利要求1、2或3的化合物，其中R2為CH3。
5.如權(quán)利要求3的化合物，其中X為F或Cl，且n為0。
6.一種選自由下列組成的群組的化合物2-{2-二乙氨基-5-[(4-氯苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氟苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氯苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(2-氟苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3-氟苯磺?；?甲氨基]嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?異丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氟苯磺?；?異丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氯苯磺?；?異丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氟苯磺?；?乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氯苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)環(huán)丙基甲基-氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氟苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氟苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(2，4-二氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(2，4-二氟苯磺?；?乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氯苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氯苯磺?；?乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?-正丙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)烯丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲?；趸交?丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?異丁氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?-正丁氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(2，5-二氟苯磺?；?甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(2，3-二氟苯磺?；?乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?-(2-三氟乙基)-氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
7.一種醫(yī)藥組合物，其包含一醫(yī)藥上可接受的載劑及一治療有效量的如權(quán)利要求1至3、5或6的化合物。
8.一種治療一患者由α4整合素所介導(dǎo)的疾病的方法，該方法包括投與一醫(yī)藥組合物，該醫(yī)藥組合物包含一醫(yī)藥上可接受的載劑及一治療有效量的如權(quán)利要求1至3、5或6的化合物。
9.如權(quán)利要求8的方法，其中該由α4整合素所介導(dǎo)的疾病為一炎癥性疾病。
10.一種式(IV)化合物 其中每一X均獨(dú)立為氟、氯或溴；p為0或一從1到3的整數(shù)；R1選自由甲基和乙基組成的群組；R2為低碳炔基；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
11.一種式(V)化合物 其中每一X均獨(dú)立選自由氟和氯組成的群組；m為一等于1或2的整數(shù)；R2為低碳炔基；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
12.一種式(VI)化合物 其中每一X均獨(dú)立為氟或氯；n為0或1；R2為低碳炔基；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
13.如權(quán)利要求10、11或12的化合物，其中R2為炔丙基。
14.如權(quán)利要求12的化合物，其中X為F或Cl，且n為0。
15.一種選自由下列組成的群組的化合物2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺?；?炔丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；2-{2-二乙氨基-5-[(2，4-二氟苯磺?；?炔丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
16.一種醫(yī)藥組合物，其包含一醫(yī)藥上可接受的載劑及一治療有效量的如權(quán)利要求10至12、14或15的化合物。
17.一種治療一患者由α4整合素所介導(dǎo)的疾病的方法，該方法包括投予一醫(yī)藥組合物，該醫(yī)藥組合物包含一醫(yī)藥上可接受的載劑及一治療有效量的如權(quán)利要求10至12、14或15的化合物。
18.如權(quán)利要求17的方法，其中該由α4整合素所介導(dǎo)的疾病為一炎癥性疾病。
19.如權(quán)利要求17的方法，其中該疾病為類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明揭示與α
文檔編號(hào)C07D239/48GK1652789SQ03811258
公開(kāi)日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2003年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月24日
發(fā)明者安德烈·W·康拉迪, 克里斯托夫·M·塞姆科, 許英姿, 弗蘭克·斯塔潘貝克, 布賴(lài)恩·P·斯圖皮, 珍妮弗·史密斯, 尤金·D·托爾塞特, 邁克爾·A·普萊斯 申請(qǐng)人:伊蘭制藥公司