專利名稱：T細胞選擇性白細胞介素4促效劑的制作方法
背景1．發(fā)明領域概括地說，本發(fā)明涉及藥物學和免疫學領域。更具體地說，本發(fā)明涉及用于T-細胞的選擇性活化以及降低內皮細胞或成纖維細胞活化作用的物質的新組合物。這些新組合物包括細胞因子家族的變異型，特別是人體白細胞介素-4(IL-4)。
2．相關技術說明白細胞介素-4(IL-4)是一種多效性細胞因子，它對免疫系統(tǒng)、內皮、以及那些成纖維細胞性的細胞具有活性。現已報道的IL-4體外投藥效果包括，B細胞的增殖和B細胞中免疫球蛋白的類型轉變。T細胞中，IL-4在以促細胞分裂原預活化后激發(fā)T細胞的增殖并低向調節(jié)TFN-γ的生成。在單核細胞中，IL-4誘導Ⅱ型MHC分子的表達、由脂多糖誘導的tPA的釋放、以及CD23的表達。在內皮細胞(EC)中，IL-4誘導VCAM-1的表達和IL-6的釋放，并降低ICAM-1的表達(Maher,DW，等，人體白細胞介素-4一種具有治療應用潛力的免疫調節(jié)劑，生長因子研究進展，3:43-56(1991))。
鑒于其能夠激發(fā)經過與IL-2接觸而被活化的T細胞的增殖這一能力，IL-4治療法一直得以應用，譬如，IL-4在腎癌的動物模型中顯示出其抗瘤活性并誘導小鼠腫瘤消退(Bosco,M.等，經過外淋巴注射施于帶有腫瘤的小鼠的低劑量IL-4可抑制不健康、外觀上不產生免疫反應的腫瘤的生長并誘導一種腫瘤特異免疫記憶，免疫學雜志，145:3136-43(1990))。但是，它的毒性限制了人體使用的劑量(Margolin,K.等，晚期腎癌和惡性黑素瘤中人重組白細胞介素-4的Ⅱ期研究，免疫治療雜志，15:147-153(1994))。
鑒于其免疫調節(jié)活性，IL-4被推薦用于一系列臨床應用之中。這些臨床應用包括由于免疫系統(tǒng)失調引起的疾病，特別是那些由于T輔助(Th)細胞對抗原反應失調引起的疾病。這些疾病包括某些自身免疫疾病、風濕性疾病、皮膚病以及傳染性疾病。大量實驗結果已經表明，Th細胞分為兩大類型，即所謂Th1和Th2(Mosmann,T.R.,Cherwinski,H.,Bond,M.W.,Giedlin,M.A.和Coffman,R.L.，鼠輔助T細胞克隆的兩種類型。Ⅰ．基于淋巴因子活性和分泌蛋白特征的定義，免疫學雜志，136:2348-2357(1986)；Mosmann,T.R.，細胞因子，CD4和CD8T細胞亞型的分化與功能，Behring Inst.Mitt.,1-6(1995))。這些T細胞的類別通過它們所表達的細胞因子來定義Th1細胞產生IL-2、INF-γ和TNF-α，而Th2細胞產生IL-4和IL-5。Th1和Th2細胞由未成熟的CD4+T細胞形成。向Th1和Th2亞型的分化依賴于抗原激發(fā)過程中細胞因子的出現IFN-γ和IL-12將未成熟細胞的分化引向Th1表現型，而IL-4將分化引向Th2表現型。盡管Th1和Th2亞型可能代表了一系列Th細胞表現型中的兩個極端(例如，對表達INF-γ和IL-4低水平的Th0細胞已有描述)，這一分類法仍然還是一種在免疫學領域中用于描述免疫反應特征的主要范例。
現已觀察到某些器官特異性的自身免疫疾病與Th1 T細胞對自體抗原突出的反應相關聯(lián)(Liblau RS；Singer SM；McDevitt HO，器官特異的自身免疫疾病發(fā)病機制中的Th1和Th2CD4+T細胞，今日免疫學，16:34-38(1995))。這類自身免疫疾病中的一種是胰島素依賴性糖尿病(IDDM)，其特征為T細胞介導的胰腺β細胞的破壞。幾方面的證據顯示，Th1型細胞在胰腺β細胞的破壞中起主要作用(由Tisch,R.等提供的綜述，綜述胰島素依賴性糖尿病，細胞，85:291-297(1996))。給用作IDDM的動物模型的NOD小鼠施用IL-4，可低向調節(jié)Th1細胞群體并顯著延遲糖尿病的發(fā)病(Rapoport，等，IL-4使T細胞增殖的非反應性倒轉并阻止NOD小鼠糖尿病的發(fā)現，實驗方法雜志，178:87-99(1993))。這類自身免疫疾病中的另一種是多發(fā)性硬化癥(MS)，其特征為一種對神經細胞周圍髓鞘的自身免疫侵襲。對MS患者的研究表明，MS的惡化與自體抗原特異的Th1和Th0細胞的存在相關，病癥的緩解與自體抗原特異的Th2和Th0細胞的存在相關(Correale,J.等，多發(fā)性硬化癥發(fā)展過程中自體反應性脂蛋白特異性T細胞克隆的細胞因子分泌方式，免疫學雜志，154:2959-2968(1995))?；加袑嶒炐宰陨砻庖吣X脊髓炎(EAE)的小鼠-MS的動物模型，也顯示出Th1細胞的極性化(Cua,DJ,Hinton,DR，和Stohlman,SA，免疫學雜志，155:4052-4059(1995))。來自一項EAE模型研究的間接證據表明，IL-4在致耐受性肽治療引起的病癥消弱中起著關鍵的作用(Brocke,S.等，髓鞘堿基蛋白的肽類似物對實驗性腦脊髓炎的治療，自然，379:343-346(1996))。
諸如類風濕性關節(jié)炎(RA)的其它自身免疫疾病也是IL-4治療法的目標。RA的動物模型表現出細胞特征傾向于Th1細胞的不平衡現象，在小鼠中為TNF-α的過度表達，抗TNF-α抗體顯示了病癥的消弱，這些說明，引起Th1細胞群體低向調節(jié)的IL-4治療法可能也具有抗TNF-α的效果(參照Feidmann,M.，等綜述類風濕性關節(jié)炎，細胞，85:307-310(1996))。
普通牛皮癬是一種慢性皮膚病，其特征為單核細胞和T細胞對被感染皮膚的浸潤。一些報道指出，牛皮癬皮膚損傷的T細胞和PBL主要是Th1表現型(Uyemura K；Yamamura M；Fivenson DF；Modlin RL；Nickoloff BJ，牛皮癬損傷及無損傷皮膚中細胞因子綱的特征為類型1T輔助細胞介導的反應，調查皮膚病學雜志，101:701-705(1993)；Schlaak JF；Buslau M；Jochum W；HermannE；Girndt M；Gallati H；Meyer zum Buschenfelde KH；Fleischer B，普通牛皮癬中的T細胞屬于Th1亞型，調查皮膚病學雜志，102:145-149(1994))。此外，已經證明，單甲基延胡索酸-一種被報道對牛皮癬患者有臨床療效的藥物-有選擇性地激發(fā)PBMC分泌Th2細胞因子(de Jong R；Bezemer AC；ZomerdijkTP；van de Pouw-Kraan T；Ottenhoff TH；Nibbering PH，抗牛皮癬劑單甲基延胡索酸對T輔助細胞2細胞因子反應的選擇性激發(fā)，歐洲免疫學雜志，26:2067-2074(1996))。因此，IL-4被認為能夠消除Th極性化并對牛皮癬有臨床療效。
某些傳染性疾病與極性化Th細胞對感染劑的反應相關。在一些病例中，Th2反應與其對感染劑的抗性相關。博氏疏螺旋體(BorreliaBurgdorferi)-萊姆病的感染因子-就是一個例子。感染博氏疏螺旋體的人明顯顯示出類似Th1的細胞因子特征(Oksi J；Savolainen J；Pene J；Bousquet J；Laippala P；Viljanen MK，萊姆疏螺旋體病患者外周血液單核細胞引起的IL-4的生成的降低和γ-干擾素生成的增加，傳染免疫學，64:3620-3623(1996))。在一個博氏疏螺旋體誘發(fā)的關節(jié)炎小鼠模型中，抗病性與IL-4的生成相關聯(lián)，而敏感性則與INF-γ的生成相關(Matyniak JE；Reiner SL，實驗性萊姆中的T輔助細胞表現型與遺傳敏感性，實驗方法雜志，181(3):1251-1254(1995)；Keane-Myers A；Nickell SP,IL-4和INF-γ在小鼠對博氏疏螺旋體的免疫調節(jié)中的作用，免疫學雜志，155:2020-2028(1995))。用IL-4治療博氏疏螺旋體感染的小鼠可增強對感染的抗性(Keane-Myers A；MaliszewskiCR；Finkelman FD；Nickell SP，重組IL-4療法增強正常易感小鼠及抗體缺乏易感小鼠對博氏疏螺旋體感染的抗性，免疫學雜志，156:2488-2494(1996))。
據報道，IL-4對抑制淋巴瘤和白血病的生長具有直接效果(Akashi,K,IL-4在白血病細胞生長的負向調節(jié)中的作用，LeukLymphoma,9:205-9(1993))。例如，已有報道，IL-4可在急性成淋巴細胞白血病患者的細胞中誘導細胞程序死亡(Manabe,A,等，IL-4在高度危險急性成淋巴細胞白血病例中誘發(fā)編程性細胞死亡(細胞程序死亡，血液，83:1731-7(1994))，并抑制非何杰金B(yǎng)細胞淋巴瘤患者細胞的生長(Defrance,T，等，IL-4對新鮮分離非何杰金B(yǎng)細胞惡性B淋巴瘤細胞的抗增殖作用，血液，79:990-6(1992))。
也有報道指出，IL-4顯示出的一些活性表明它可能對骨關節(jié)炎有臨床療效。骨關節(jié)炎是一種以軟骨劣化為主要病理的疾病(Sack,KE，持續(xù)的挑戰(zhàn)-骨關節(jié)炎，西方醫(yī)學雜志，163:579-86(1995)；Oddis,CV，關于骨關節(jié)炎的新觀點，美國醫(yī)學雜志，100:10S-15S(1996))。IL-4抑制骨關節(jié)炎患者單核細胞和滑膜細胞中的TNF-α和IL-1β的生成(Bendrups,A,Hilton,A,Meager,A和Hamilton,JA，細胞因子-4和糖(腎上腺)皮質激素引起的腫瘤壞死α-因子及細胞因子-1β水平的降低，風濕病學Int,12:217-20(1993)；Seitz,M，等，由IFN-γ和IL-4進行的類風濕和骨關節(jié)炎滑膜細胞調節(jié)引起的細胞因子-1受體促效劑、炎癥趨化蛋白及前列腺素的生成，免疫學雜志，152:2060-5(1994))。此外，有報道指出，I-4直接阻斷活體外軟骨移植體中軟骨的降解(Yeh,LA,Augustine,AJ,Lee,P,Riviere,LR和Sheldon,A，細胞因子-4-一種牛關節(jié)軟骨移植體中的軟骨損壞抑制劑，風濕病學雜志，22:1740-6(1995))。這些活性表明IL-4可能對骨關節(jié)炎具有臨床療效。
然而，由于其劇烈的毒性，IL-4的臨床使用一直受到限制。這種毒性表現為血管滲漏綜合癥(Margolin,K，等，晚期腎癌和惡性黑素瘤中人重組白細胞介素-4的Ⅱ期研究，免疫治療雜志，15:147-153(1994))。沒有文獻說明IL-4劇烈毒性的作用機制，也沒有文獻報道既保持免疫調節(jié)活性又降低劇烈毒性的IL-4類似物或變異體。
對于IL-4的突變蛋白(“突變體”)已經有所知曉。IL-4突變體IL-4/Y124D是一種T細胞拮抗物(Kruse N,Tony HP,SebaldW，單一氨基酸取代引起的人類細胞因子IL-4向一種高親和性拮抗物的轉化，Embo J,11:3237-44(1992))。
專利和專利應用中得到的IL-4治療用途包括以下方面IL-4用于強化化學治療藥劑的抗癌作用，特別是用于何杰金病和非何杰金淋巴瘤(參見WO9607422)；IL-4的抗原性片段用于通過抑制或模仿IL-4結合活性產生抗體，以治療與IL-4相關的疾病(參見WO9524481)，并對IL-4進行檢出、測量和免疫純化(參見WO9317106)；用于誘導B細胞前體向免疫球蛋白分泌細胞的分化，成熟B細胞有益于恢復免疫遭受損害的患者的免疫功能(參見WO9404658)；與IL-10結合使用時，是一種治療白血病、淋巴瘤、發(fā)炎性腸道疾病和緩發(fā)型超敏反應(如潰瘍性結腸炎和節(jié)段型回腸炎)的療法(參見WO9404180)；通過施用IL-4治療HIV感染，從而抑制單核細胞和巨噬細胞中的病毒復制，并提高它們對某些腫瘤細胞的細胞毒性(參見WO9404179)；用于促進皮膚成纖維細胞的增殖，以治療糖尿病和免疫遭受損害的患者的創(chuàng)傷(參照WO9211861)；在施用細菌、類毒素和病毒疫苗、尤其是破傷風疫苗時，用于增強一級免疫反應(參見WO9211030)；用于抑制IL-2誘導的B細胞惡性腫瘤、特別是慢性淋巴細胞白血病、非何杰金惡性淋巴瘤的增殖(參見WO9210201)；IL-4用于治療黑素瘤、腎細胞和基細胞癌(參見WO9204044)。
專利文獻公開了IL-4蛋白和一些突變蛋白質，但是沒有任何一項涉及副作用降低的IL-4療法。Lee等的美國專利第5,017,691號(“691專利”)涉及了哺乳類蛋白和人體IL-4的突變蛋白質，該專利同時公開了B細胞生長因子活性和T細胞生長因子活性。該專利公開了編碼顯示IL-4活性的多肽的核酸，以及這些多肽本身和它們的生成方法。專利公開了野生型IL-4在氨基酸位置上的突變蛋白質，這些突變蛋白質保持了激發(fā)B細胞和T細胞活體外增殖的能力。然而，Lee的專利中未指出任何T細胞選擇性IL-4突變蛋白質，預期激活伴隨IL-4用藥而來的EC或上皮細胞接觸不嚴。因此，由于其毒性對劑量的限制，IL-4本身不能成為一種模式治療方法。
美國專利第5,013,824號描述了hIL-4肽衍生物，該肽衍生物含有6至40個天然hIL-4的氨基酸。同時公開的還有由肽和載體共軛物組成的免疫原。載體包括紅細胞、噬菌體、蛋白質、合成顆粒、或任何能夠誘導抗共軛肽抗體生成的物質。專利未公開任何IL-4突變蛋白質。
WO96/04306-A2公開了單突變蛋白質，它們hIL-2和hIL-13的拮抗劑和局部促效劑。專利未公開有關IL-4的任何資料。WO95/27052公開了含有外顯子1、2和4的IL-2和IL-4剪接變異體。
可見，一種具有較低毒性、更能被普遍接受的改良IL-4分子有待于發(fā)現。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及根據野生型IL-4編號、既具有T細胞活化活性、但又具有較低的內皮細胞活化活性的人體IL-4突變蛋白質。詳細地說，野生型IL-4D螺旋表面暴露殘基發(fā)生變異的人體IL-4突變蛋白質與野生型IL-4相比引起T細胞增殖，并引起HUVECs中IL-6的分泌減少。本發(fā)明獲得了毒性較輕、賦予該一白細胞介素更多治療用途的IL-4突變蛋白質。
另外，本發(fā)明涉及單、雙及三次突變的IL-4突變蛋白質，在根據野生型IL-4編號時(His=1)，這些突變蛋白質以指示標記R121A、R121D、R121E、R121F、R121H、R121I、R121K、R121N、R121P、R121T、R121W；Y124A、Y124Q、Y124R、Y124S、Y124T；Y124A/S125A、T13D/R121E；以及R121T/E122F/Y124Q表示。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明的突變蛋白質的多核苷酸、包含多核苷酸的載體、轉化的宿主細胞、含有突變蛋白質的藥用組合物、以及治療方法。
本發(fā)明還涉及含有編碼本發(fā)明的突變體的多核苷酸的載體，指導人體IL-4突變蛋白質表達，該突變蛋白質既具有T細胞活化活性、又具有較低的內皮細胞活化活性；涉及能夠幫助實現靶生物體的轉染以及上述人體IL-4突變蛋白質繼后在活體內表達的載體，該突變蛋白質以上述多核苷酸編碼。
本發(fā)明還涉及人體IL-4突變蛋白質的選擇方法，該突變蛋白質根據野生型IL-4編碼，既具有T細胞活化活性、又具有較低的內皮細胞活化活性。方法包括野生型IL-4D螺旋表面暴露殘基的變異，由此，與野生型IL-4相比，突變蛋白質引起T細胞增殖，并引起HUVECs中的IL-6的分泌減少。
本發(fā)明還涉及IL-4可治病癥患者的治療方法，該方法通過施用有效治療劑量的人體IL-4突變蛋白質進行。該突變蛋白質根據野生型IL-4編碼，既具有T細胞活化活性，又具有較低的內皮細胞活化活性。該方法適用于自身免疫疾病、癌癥、傳染性疾病、軟骨疾病以及牛皮癬疾病等IL-4可治病癥。
附圖的簡要說明

圖1為本研究所用成熟野生型人體IL-4的氨基酸序列(SEQ IDNO:1)。螺旋下劃線并以A、B、C和D按順序標記。突變時產生細胞選擇性IL-4促效劑的位置以黑體標記。圖2為T細胞選擇性促效劑概念的圖示。圖3為HUVEC IL-6分泌測定中選擇性促效突變蛋白質的復合劑量反應曲線。A組○，野生型IL-4；●，R121E；，R121P；，R121T/E122F/Y124Q。B組○，野生型IL-4；●，Y124Q；，Y124R；，Y124A/S125A。圖4為HUVEC IL-6分泌測定中選擇性促效突變蛋白質的單獨劑量反應曲線。A組○，野生型IL-4；●，R121E；B組○，野生型IL-4；●，R121P；C組○，野生型IL-4；●，Y124Q；D組○，野生型IL-4；●，Y124R；E組○，野生型IL-4；●，Y124A/S125A；F組○，野生型IL-4；●，R121T/E122F/Y124Q。圖5為1°T細胞增殖測定下IL-4突變蛋白質中選擇性促效突變蛋白質生物學反應的復合劑量反應曲線。A組○，野生型IL-4；●，R121E；，R121P；，R121T/E122F/Y124Q。B組○，野生型IL-4；●，Y124Q；，Y124R；，Y124A/S125A。圖6為1°T細胞增殖測定的單獨劑量反應曲線。A組○，野生型IL-4；●，R121E；B組○，野生型IL-4；●，R121P；C組○，野生型IL-4；●，Y124Q；D組○，野生型IL-4；●，Y124R；E組○，野生型IL-4；●，Y124A/S125A；F組○，野生型IL-4；●，R121T/E122F/Y124Q。圖7為單獨劑量反應曲線，該曲線顯示由IL-4誘導、通過T細胞選擇性促效IL-4突變蛋白質R121E(●)和Y124Q()實現的IL-6分泌對HUVEC的拮抗作用。其中IL-4拮抗劑R121D/Y124D(○)的劑量反應為對照。圖8A、8B為單獨劑量反應曲線。A組顯示1°T細胞增殖測定中R121D突變蛋白質的生物學反應(○=IL-4,●=R121D)；B組顯示R121D無能力在HUVEC中誘導IL-6分泌(○=IL-4,●=R121D)。圖9A為1°T細胞增殖測定下IL-4(○)和選擇性促效突變蛋白質R121E(△)及T13D/R121E測定下(▲)的單獨劑量反應曲線。圖9B為單獨劑量反應曲線，該曲線顯示由IL-4誘導，通過T細胞選擇性IL-4促效突變蛋白質R121E(△)和T13D/R121E(▲)實現的IL-6分泌對HUVEC的拮抗作用。
優(yōu)選實施方案的說明A．背景研究已表明IL-4可在活體外介導多種細胞反應，其中包括其對B細胞、T細胞、單核細胞以及內皮細胞的各種作用(Maher DW,Davis I,Boyd AW,Morstyn G人體白細胞介素-4一種具有治療應用潛力的免疫調節(jié)劑。生長因子研究進展3:43-56,1991；Powrie F,Coffman RL:T細胞功能的細胞因子調節(jié)治療性調節(jié)潛力。今日免疫學14:270-4,1993)。詳細地說，血管細胞附著分子-1(VCAM-1；(Swerlick RA,Lee KH,Li LJ,Sepp NT,Caughman SW,Lawley TJ人體真皮微血管內皮細胞的血管細胞附著分子-1的調節(jié)。免疫學雜志149:698-705,1992))和IL-6的誘導(Colotta F,Sironi M,Borre A,Luini W,Maddalena F,Mantovani A白細胞介素-4增強內皮細胞內單核細胞趨化蛋白和白細胞介素-6的生成。細胞因子4:24-8,1992)以及單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1；Colotta F,Sironi M,Borre A,Luini W,Maddalena F,Mantovani A白細胞介素-4增強內皮細胞內單核細胞趨化蛋白和白細胞介素-6的生成。細胞因子4:24-8,1992；Rollins BJ,Pober JS白細胞介素-4誘導人體內皮細胞內MCP-1/JE的合成與分泌。美國病理學雜志138:1315-9,1991)都是IL-4培養(yǎng)內皮細胞中產生的直接效果，其中VCAM-1的向上調節(jié)在體外(Carlos TM,Schwartz BR,Kovach NL,Yee E,Rosa M,Osborn L,CHi-Rosso G,Newman B,Lobb R,Rosso M等血管細胞附著分子-1介導的淋巴細胞附著于細胞因子活化的人體內皮細胞。血液75:965-70,1990；Thornhill MH,Wellicome SM,Mahiouz DL,LanchburyJS,Kyan-Aung U,Haskard DO腫瘤壞死因子與IL-4或IFN-γ結合，從而有選擇地增強內皮細胞對T細胞的附著。血管細胞附著分子-1依賴性及非依賴性結合機制。免疫學146:592-8,1991)和體內(Briscoe DM,Cotran RS,Pober JS腫瘤壞死因子、脂多糖和IL-4活體內對血管細胞附著分子-1的影響。與CD3+T細胞浸潤的相互關系。免疫學雜志149:2954-60,1992)都與淋巴細胞附著的增加相關系。
IL-4突變蛋白質IL-4/Y124D(位置124處酪氨酸被天冬氨酸取代)是-種T細胞拮抗物(Kruse N,Tony HP,Sebald W，單一氨基酸替換引起的人類細胞因子IL-4向一種高度近似拮抗物的轉化，Embo J,11:3237-44(1992))。本發(fā)明者進行的活體實驗表明，IL-4/Y124D在猴子中顯示出與野生型IL-4相似的劇烈毒性，此項觀察前所未有。同時與野生型IL-4和IL-4/Y124D介導毒性相關的細胞活動包括VCAM-1的向上調節(jié)、血清中MCP-1的向上調節(jié)、與循環(huán)淋巴細胞的減少伴隨出現的循環(huán)單核細胞的增加、以及血細胞比容的增加。在IL-4用于人體的臨床試驗中也觀察到類似細胞活動(Wong H1,Lotze Mt,Wah1 LM,Wah1 SM重組IL-4施用于人體可調節(jié)基因的表達、表現型、及其在循環(huán)單核細胞中的作用。免疫學雜志148:2118-25,1992)。鑒于其T細胞拮抗性質，這些結果表示IL-4/Y124D所顯示的毒性來自于對T細胞以外細胞的促效活動，并透過T細胞以外的細胞介導。使用IL-4/Y124D時觀察到的體外毒性和已知的IL-4對內皮細胞的作用與體外IL-4毒性透過IL-4對血管內皮的直接作用介導這一機制相符合。
發(fā)明者通過這些(及相關的)研究發(fā)現，內皮細胞(“EC”)中可能存在一種新的IL-4受體。這一可能性開始了合成有選擇地活化T細胞而不活化EC的IL-4突變蛋白質的努力。盡管T細胞表達一個由IL-4Rα和IL-2Rγ亞基組成的IL-4受體，發(fā)明者發(fā)現人體臍靜脈內皮細胞(HUVEC)表達IL-4Rα而非IL-2Rγ。交叉耦聯(lián)研究表明，兩個受體鏈在HUVEC的細胞表面得到表達一個鏈的分子量與IL-4Rα一致，和另一個分子量較小的鏈。這些結果顯示，一種功能上與IL-2Rγ相似，而序列上不同的新的IL-4受體組成在HUVEC上得到了表達。因此，這兩種受體在相對分子架構上的差異得以開發(fā)利用，以生產一種具有受體選擇性的IL-4變異型(如，一種T細胞選擇性促效劑)。
圖2以圖示法表示了細胞選擇性保效劑的概念。圖中示出了由IL-4Rα/Il-2Rγ亞基組成的T細胞IL-4受體和一個由類似IL-4Rα/γ的受體亞基組成的內皮細胞IL-4受體。雖然為了便于解釋，IL-4的兩種受體在此一起說明，它們卻是在不同細胞類型上得到表達的。T細胞受體由IL-4Rα和IL-2Rγ組成，IL-4的結合誘導受體親二聚體的形成，從而導致細胞內的信號傳輸。IL-4誘導的受體親二聚體形成以類似形式在EC中進行，不同的只是IL-4受體由IL-4Rα和一個類似γ的受體成份構成。該類似γ的受體成份與IL-2Rγ不同。T細胞選擇性IL-4促效劑是IL-4的變異型，它們保持著與T細胞受體IL-4Rα/IL-2Rγ相互作用的能力，但不能誘導非T細胞受體類似IL-4Rα/γ亞基的親二聚體形成及信號傳輸。這種T細胞選擇性IL-4促效劑保持其與IL-4Rα相互利用的能力，正是這種辨別IL-2Rγ和類似γ的亞基的能力使它們具有細胞選擇性活化性能。
T細胞受體的兩種組成成分IL-4Rα和IL-2Rγ與IL-4分子的不同區(qū)域接觸。因此，發(fā)明者集中針對IL-4的一個小區(qū)域進行修飾。發(fā)明者假定特殊的受體亞基會象IL-2Rγ那樣與IL-4的同一區(qū)域接觸，并在D螺旋，尤其是在殘基121、124和125上進行一系列取代。
D螺旋參與與HUVEC上IL-2Rγ和所推斷的新受體相互作用(按照特性，IL-4突變蛋白質R121D/Y124D是一種HUVEC拮抗劑)。IL-4D螺旋上帶有修飾的突變蛋白質(殘基110至126；His=1)經篩選確定其激發(fā)T細胞增殖或人體臍靜脈內皮細胞(HUVEC)IL-6分泌的能力。相對于HUVEC，從T細胞誘導出有差別反應的突變蛋白質進一步通過誘變得到鑒定。
初始檢測用以確定可能的相互作用區(qū)域。此外，由于AB環(huán)區(qū)域被認為參與細胞因子配位體與D螺旋作用受體亞基的相互作用，因此對AB環(huán)進行了丙氨酸檢測取代。詳細地說，表面暴露殘基Glu-110、Asn-111、Glu-114、Arg-115、Lys-117、Thr-118、Arg-121、Glu-122、Tyr-124、Ser-125和Lys-126為研究的目標，也是較好的突變分析目標。118-126位更為理想，121-125位最為理想。此區(qū)域中對IL-2、IL-4、IL-7和IL-15的比較確認了IL-4與IL-2、IL-7與IL-15間的差異，由此可能暗示出某些特定殘基負責HUVEC受體的相互作用。對IL-4引入了由IL-2和IL-4之間的序列對比衍生出來的特異性取代。它們包括Arg-115成為Phe；Lys-117成為Asn；Glu-122成為Phe；Lys-126成為Ile；以及三個同步變換，即Arg-121成為Thr；Glu-122成為Phe和Tyr-124成為Gln。
野生型人體IL-4cDNA的變異通過位點定向誘變引入。合適的克隆經亞克隆化成為適于異原系統(tǒng)(如，大腸桿菌、桿狀病毒或CHO細胞)中表達的表達載體。純化后的蛋白質通過T細胞增殖和HUVEC細胞因子分泌測定方式進行檢測(IL-6)。單獨的突變蛋白質的測定中-在EC50中或最大反應(穩(wěn)定狀態(tài))下-所引起的不同反應表示影響這些活性的突變。具體地講，與HUVEC中的反應相比(相對于野生型IL-4)，那些在T細胞測定中激發(fā)較高反應的突變蛋白質(相對于野生型IL-4)間接地表明了對于IL-4與IL-2Rγ相互作用比其與特殊HUVEC IL-4受體的相互作用更為重要的位置。對確定的位置所做的進一步分析和誘變(如，組合改變、以所有氨基酸進行取代)將為T細胞IL-4受體產生一種具有選擇促效性的IL-4突變蛋白質。這一蛋白也是一種對IL-4誘導的HUVEC反應的選擇性拮抗物。B．定義本文描述的是新的突變蛋白質和具有對T細胞選擇促效性質和較低毒性的特殊IL-4突變蛋白質的衍生機制?？衫妙愃品桨复_定T細胞選擇性拮抗物。
本文使用的“野生型IL-4”-無論是天然的還是重組的，均表示具有天然人體IL-4中129個正常氨基酸序列的IL-4。例如，如圖1所示。
本文使用的“IL-4突變體”表示人體成熟白細胞介素-4蛋白中特異取代發(fā)生區(qū)域的多肽。以下具體公開為根據野生型IL-4編號時，精氨酸殘基(R)在位置121(“Arg-121”)處被丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、賴氨酸(K)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、蘇氨酸(T)或色氨酸(W)取代；或谷氨酸(E)殘基在位置122處被苯丙氨酸(F)取代；或酪氨酸殘基在位置124處被丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、絲氨酸(S)、或蘇氨酸(T)取代；或絲氨酸(S)殘基在位置125處被丙氨酸(A)取代。我們最理想的IL-4突變蛋白質在其它未經取代殘基處具有與野生型IL-4相同的氨基酸序列。然而，本發(fā)明的突變蛋白質也可以以氨基酸在天然IL-4多肽鏈殘基中-個或多個位點上的插入、缺失、取代和修飾為特征。根據本發(fā)明，任何上述插入、缺失、取代和修飾都產生一個保持T細胞選擇活性、又同時具有較低內皮細胞活化能力的IL-4突變蛋白質。
我們在IL-4的其它位置(如那些對突變蛋白質二級和三級結構具有極微影響的位置)推薦采取保守修飾和取代。這種保守取代包括Dayhoff在蛋白質序列的結構圖冊5(1978)和Argos在EMBO J.,8:779-785(1989)中描述的那些。例如，屬于以下各組的氨基酸代表保守變化-ala、pro、gly、gln、asn、ser、thr；-cys、ser、tyr、thr；-val、ile、leu、met、ala、phe；-lys、arg、his；-phe、tyr、trp、his；和-asp、glu。
我們也推薦不給位點帶來額外分子間交叉耦聯(lián)或錯誤二硫鍵形成的修飾和取代。例如，已知IL-4在野生型位置3、24、46、65、99和127處有六個cys殘基。
我們使用“根據野生型IL-4編號”表示對于某選定氨基酸中位置的確定，野生型IL-4中該氨基酸通常出現在這一位置。在對野生型IL-4引入插入或缺失的地方，技術熟練者會認識到，當根據野生型IL-4編號時，通常出現在位置125的ser(S)在突變蛋白質中可能發(fā)生移位。然而，移動后ser(S)的位置可以很容易地通過檢查以及其側面氨基酸與野生型IL-4中側面ser的相互關系來確定。
本發(fā)明的IL-4突變蛋白質可通過已知的任何適當方法得到。這些方法包括構建一個為本發(fā)明中IL-4突變蛋白質編碼的DNA序列，并在適當轉化的宿主中表達這些DNA序列。這一方法將生成本發(fā)明的重組體突變蛋白質。然而，雖然不是最理想，本發(fā)明的突變蛋白質也可通過化學合成、或化學合成與重組DNA技術結合的方式生成。
在一個生成本發(fā)明突變蛋白質的重組法具體實施方案中，DNA序列的構建通過分離或合成一個為IL-4突變蛋白質編碼的DNA序列來完成，然后將arg121的密碼子通過位點特異性誘變改為丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、賴氨酸(K)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、蘇氨酸(T)或色氨酸(W)的密碼子。這一技術廣為知曉。例如，可參照Mark等，“人體成纖維細胞干擾素基因的位點特異性誘變”，美國科學院學報81,pp.5662-66(1984)；在此引入美國專利第4,588,585號作為參考。
構建為本發(fā)明中IL-4突變蛋白質編碼的DNA序列的另一個方法是化學合成例如，一個為所需IL-4突變蛋白質編碼的基因可以利用低聚核苷酸合成儀以化學方式合成。該低聚核苷酸根據所需IL-4突變蛋白質的氨基酸序列設計，同時，最好選擇適合用于重組突變蛋白質的宿主細胞的密碼子。在這方面，遺傳密碼經常被確認具有簡并性-即一個氨基酸可能編有多個密碼子，例如，phe(F)編有兩個密碼子、TTC或TTT；tyr(Y)以TAC或TAT編碼；his(H)以CAC或CAT編碼。Trp(W)以單一密碼子TGG編碼。相應地也可鑒別出，對于一個為特定IL-4突變蛋白質編碼的某個DNA序列，會有許多DNA變性序列為同一IL-4突變蛋白質編碼。例如，可以鑒別出，除了SEQ ID NO:3中表示的、相對突變蛋白質R121E的所需DNA序列以外，還有許多DNA簡并序列為所示的IL-突變蛋白質編碼。這些DNA簡并序列被認為在本發(fā)明范圍內。因此，本發(fā)明文字記述中的“其簡并變異型”表示所有為某一特定突變蛋白質編碼的DNA序列。
本發(fā)明中為IL-4突變蛋白質編碼的DNA序列，無論是通過位點定向誘變、合成，還是其它方法制備而成，都可能也包含或不包含一個為信號序列編碼的DNA序列。如果存在，這個信號序列應該是一個被選用進行IL-4突變蛋白質表達的細胞所能夠識別的序列。它可以是原核的、真核的、或是兩者的組合。它也可以是天然IL-4突變蛋白質的信號序列。信號序列的包含與否，取決于它是否需要從重組細胞中分泌出IL-4突變蛋白質，DNA序列來自該重組細胞。如果選定的細胞是原核的，DNA序列一般最好不編碼信號序列。如果選定的細胞是真核的，一般最好是一個信號序列被編碼，最理想的是使用野生型IL-4突變蛋白質的信號序列。
按照本發(fā)明合成一個為IL-4突變蛋白質編碼的基因時，可以利用標準方法。完整的氨基酸序列可以用于構建一個逆轉譯基因?？梢院铣梢粋€包含為IL-4突變蛋白質編碼的核苷酸序列的DNA低聚物。例如，可以合成幾個為所需多肽中特定部分編碼的小低聚核苷酸，然后將它們連接起來。每個獨立的低聚核苷酸一般包含5＇或3＇垂鏈，用于互補組裝。
本發(fā)明中為IL-4突變蛋白質編碼的DNA序列一旦組裝后(通過合成、位點定向誘變或其它方法)，即被插入一個表達載體，并在合適的轉化宿主中與適于IL-4突變蛋白質表達的表達控制序列有效地連接在一起。適當的組裝通過核苷酸測序、限制性圖譜、以及適當宿主中一個具生物活性的多肽的表達得以確認。眾所周知，要想在一個宿主中得到一個轉染基因的高表達水平，就必須將這個基因有效地連接到能夠在所選宿主中起作用的轉錄和翻譯表達控制序列上。
表達控制序列和表達載體的選擇取決于宿主的選擇?？梢圆捎枚喾N不同的表達宿主/載體組合。譬如，原核宿主的有效表達載體包括由來自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和細胞肥大病毒的表達控制序列組成的載體。細菌宿主的有效表達載體包括已知細菌質粒，如大腸桿菌(包括co1 E1、pCR1、pER32z、pMB9以及它們的衍生物)質粒、宿主范圍更廣的質粒，如RP4、噬菌體DNA(如噬茵體λ的多種衍生物、NM989)、以及其它DNA噬茵體，如M13和絲狀單線DNA噬菌體。酵母細胞的有效表達載體包括2μ質粒及其衍生物。昆蟲細胞的有效表達載體包括pVL941。我們推薦使用pFastBacTM1(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)。Cate等，“牛和人體繆勒氏抑制物質基因的分離以及人體基因在動物細胞中的表達”，細胞，45,pp.685-98(1986)。
此外，多種表達控制序列中的任何一種都可用于這些載體。這些有效表達控制序列包括與先行表達載體的結構基因相關的表達控制序列。例如，有效表達控制序列的例子包括，SV40或腺病毒、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)的早期和晚期啟動子、噬菌體λ的主要操縱子和啟動子區(qū)域，如PL、fd外殼蛋白的控制區(qū)域、3-磷酸甘油酸激酶及其它糖酵解酶的啟動子、酸性磷酸酶的啟動子，如phoA、酵母α-接合系統(tǒng)的啟動子、桿狀病毒的多面體啟動子、以及其它已知的、控制原核或真核細胞或它們的病毒及其各種組合體的基因表達的序列。
任何合適的宿主可用于產生本發(fā)明的IL-4突變蛋白質，包括細菌、真菌(包括酵母)、植物、昆蟲、哺乳動物或其它合適的動物細胞或細胞系，以及轉基因動物或植物。更具體地講，這些宿主可能包括通常的真核和原核宿主，如大腸桿菌、假單胞菌屬、桿菌、鏈霉菌屬、真菌、酵母、昆蟲細胞，如Spodoptera furgiperda(Sf9)、動物細胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)和小鼠細胞，如NS/O、非洲綠猴細胞，如COS1、COS7、BSC1、BSC40和BNT10、人體細胞、以及組織培養(yǎng)的植物細胞。對于動物細胞的表達，我們盡量在培養(yǎng)中使用CHO細胞和COS7細胞，尤其是CHO細胞系的CHO(DHFR-)。
當然，應該明白，在表達所述DNA序列時，并不是所有的載體和表達控制序列都起到同樣好的作用。也不是所有宿主都對同一表達系統(tǒng)起著同樣好的作用。但是，技術熟練的人能夠避免多余的試驗，在這些載體、表達控制序列和宿主中做出適當的選擇。例如，選擇載體時，必須同時考慮宿主，因為載體必須在宿主中復制。載體的拷貝數量、控制該數量的能力，以及被載體編碼的任何其它蛋白質，如抗生素標記的表達也應該考慮。譬如，本發(fā)明中希望使用的載體包括那些允許為IL-4突變蛋白質編碼的DNA在拷貝數量上得以擴增的載體。這些可擴增型載體在本技術領域中眾所周知，它們包括，譬如能夠通過DHFR擴增得到增加的載體(例如參照Kaufman，美國專利第4,470,461號，Kaufmanand Sharp，“構建可調型二氫葉酸還原酶cDNA基因用于有效表達的信號的分析”、分子細胞生物學，2,pp.1304-19(1982))，或谷氨酰胺合成酶(“GS”)(例如參照美國專利第5,122,464號和歐洲公開申請338,841)。
選擇表達控制序列時，應考慮一系列因素。它們包括，譬如序列的相對強度、它的可控制性、以及它與本發(fā)明中為IL-4突變蛋白質編碼的實際DNA兼容性等。特別考慮到潛在的二級結構時更是如此。宿主選擇應考慮它們與所選載體的兼容性、由本發(fā)明中DNA序列編碼的產物的毒性、它們的分泌特征、它們準確折疊多肽的能力、它們的發(fā)酵和培養(yǎng)要求、以及由DNA序列編碼的產物純化的便利性。
從這些參數中，技術熟練者能夠選出各種載體/表達控制序列/宿主的組合，這些組合將在發(fā)酵或大規(guī)模動物培養(yǎng)時表達所需DNA序列，譬如，利用CHO細胞或COS7細胞。
根據本發(fā)明得到的IL-4突變蛋白質，可根據用以產生突變蛋白質的宿主生物的不同而發(fā)生糖基化或去糖基化。如果細菌被選擇作為宿主，生成的IL-4突變蛋白質就會經過去糖基化作用。與此相反，真核細胞會使IL-4突變蛋白質糖基化，盡管也許與天然IL-4的糖基化方式不同。
由轉化宿主產生的IL-4突變蛋白質可根據任何適當方法得到純化?，F已知有各種方法可以純化IL-4突變蛋白質。例如參照美國專利第5,013,824號、第5,017,691號和WO9604306-A2。我們推薦使用免疫親和純化法。例如參照Okamura等，“人體成纖維細胞樣干擾素免疫吸附柱層析和N-終端氨基酸序列”，生物化學，19,pp.3831-35(1980)。
本發(fā)明的IL-4突變蛋白質的生物活性，可以通過本領域中任何已知合適方法進行測定。測定包括EP-B1-41313中所描述的抗病毒活性的抗體中和、蛋白激酶、寡腺苷酸2,5-A合成酶或磷酸二酯酶活性的誘導。測定還包括免疫調節(jié)測定(例如參照美國專利第4,753,795號)、生長抑制測定、T細胞增殖、EC中IL-6(MCP-1或VCAM-1)的誘導、以及測定與表達白細胞介素-4受體的細胞的結合。同時參照Spits H,Yssel H,Takebe Y，等，重組白細胞介素-4促進人體T細胞的生長，免疫學雜志139:1142-47(1987)。
本發(fā)明的IL-4突變蛋白質的用藥劑量大約與野生型天然或重組IL-4用于治療時的劑量相同或更大。我們推薦施用有效量的IL-4突變蛋白質?！坝行Я俊北硎灸軌蚍乐够驕p輕所治療病癥的嚴重程度或傳播的藥量。對于技術熟練者來說很明顯，IL-4突變蛋白質的有效量特別取決于病癥、劑量、IL-4突變蛋白質的用藥時間計劃、IL-4突變蛋白質單獨使用還是與其它治療藥劑結合使用、組合物在血清中的半衰期、以及患者的一般健康狀況。
我們推薦以包含藥用上可接受的載體的組合物形式施用IL-4突變蛋白質。“藥用上可接受的載體”表示在用藥的患者中不引起任何不適當作用的載體。這些藥用上可接受的載體在本領域中眾所周知。我們推薦在pH7.0下使用2％HSA/PBS。
本發(fā)明中的IL-4突變蛋白質可以通過已知方法配制成藥用組合物。例如，本文作為參考文獻引用的E.W.Martin的Remington’s藥物科學中描述了合適的配方。IL-4突變蛋白質的藥用組合物可配制成各種類型，如液體、凝膠體、凍干或其它合適形式。所推薦的形式取決于所治療的病癥，對技術熟練者是顯而易見的。
IL-4突變蛋白質的藥用組合物可通過口服、噴霧、靜脈、肌肉、腹膜內、皮內或皮下注射、或其它認可的方式用藥。所推薦的用藥方式取決于所治療的病癥，而且對技術熟練者是很顯然的。IL-4突變蛋白質的藥用組合物可以與其它治療藥劑結合使用。這些藥劑可以作為同一藥用組合物的一部分加入，也可以與IL-4突變蛋白質分開，同時或按照任何其它認可的時間計劃單獨用藥。此外，IL-4突變蛋白質的藥用組合物可作為其它療法的添加劑使用。
因此，本發(fā)明提供用于免疫性疾病、癌癥或腫瘤、異常細胞生成的治療、或任何合適動物優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人類的免疫調節(jié)的組合物和方法。如同前面背景一節(jié)中所述，IL-4具有多種作用。其中包括T細胞增殖和T輔助細胞分化的激發(fā)、人體B-細胞活化及增殖、以及淋巴因子引導的免疫球蛋白類型轉變的誘導。對淋巴系統(tǒng)的作用包括提高MHCⅡ型抗原的表達(Noelle,R.，等，靜止B細胞Ia抗原表達的提高B細胞生長因子的新作用，PNAS USA,81:6149-53(1984))，和提高B細胞的CD23(Kikutani,H.,等，人體淋巴細胞免疫球蛋白受體的分子結構，細胞47:657-61(1986))。T輔助細胞1型(Th1)和2型(Th2)參與免疫反應。受到激發(fā)的Th2細胞分泌IL-4并阻止Th1的進展。因此，任何與Th1關聯(lián)的疾病都可以用IL-4或其類似物加以控制。
另一個預想是將為本發(fā)明中IL-4突變蛋白質編碼的DNA序列用于基因療法應用。預想的基因療法應用包括對那些IL-4可能通過其免疫調節(jié)活性而提供有效療效的疾病的治療，例如多發(fā)性硬化癥(MS)、胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、類風濕性關節(jié)炎(RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、色素層炎、睪丸炎、原發(fā)膽汁性肝硬變、瘧疾、麻風、萊姆病、接觸性皮炎、牛皮癬、B細胞淋巴瘤、急性成淋巴細胞白血病、非何杰金淋巴瘤、癌癥、骨關節(jié)炎、以及其它對于IL-4或那些對IL-4介導的免疫反應敏感的感染劑有所反應的疾病。
通過基因療法局部施用IL-4突變蛋白質可以向靶區(qū)域提供治療性藥劑。體外和體內的基因治療方法都有所預想?，F已知有幾種用于將具有潛在療效的基因轉移到特定細胞群體的方法。例如參照Mulligan，“基因療法的基礎科學”，科學，260:926-31(1993)。這些方法包括1)直接基因轉移。例如參照Wolff等，“活體內向小鼠肌肉的直接基因轉移”，科學，247:1465-68(1990)；2)脂質體介導的DNA轉移。例如參照Caplen等，“向囊纖維變性患者鼻上皮的脂質體介導CFTR基因轉移”，自然醫(yī)學3:39-46(1995)；Crystal，“作為藥物的基因”，自然醫(yī)學1:15-17(1995)；Gao和Huang，“用于哺乳動物細胞有效轉染的特殊陽離子脂質體試劑”，生物化學生物物理研究交流，179:280-85(1991)。
3)逆病毒介導的DNA轉移。例如參照Kay等，“血友病B的體內基因療法IX-因子缺乏犬中的持久局部修正”，科學，262:117-19(1993)；Anderson，“人體基因療法”，科學，256:808-13(1992)。
4)DNA病毒介導的DNA轉移。這些DNA病毒包括腺病毒(Ad-2或Ad-5載體為佳)、皰疹病毒(單純皰疹病毒載體為佳)、以及細小病毒(“缺陷性”或非自發(fā)性細小病毒載體為佳，腺病毒群載體更為理想，AAV-2載體最為理想)。例如參照Ali等，“DNA病毒作為基因療法載體的利用”，基因療法，1:367-84(1994)；本文作為參考文獻引用的美國專利第4,797,368號；和本文作為參考文獻收入的美國專利第5,139,941號。
對用于有益基因轉移的一個特定載體系統(tǒng)的選擇取決于多種因素。一個重要的因素是靶細胞群的性質。盡管逆轉錄病毒已有深入研究并用于多種基因療法的應用，但是這些載體不適合用于非分裂性細胞的感染。此外，逆轉錄病毒似乎具有潛在的致腫瘤性。
腺病毒具有優(yōu)點，他們擁有廣泛的宿主范圍，能夠感染靜止或極端分化的細胞，如神經元或肝細胞，基本顯示出非致腫瘤性。例如參照Ali等，出處同上，p.367。腺病毒似乎不與宿主基因整合。因為它們存在于染色體外，所以發(fā)生插入誘變的危險得到大幅度降低。Ali等，出處同上，p.373。
腺病毒群顯示出與腺病毒載體相似的優(yōu)點。然而，AAVs顯示了對人體染色體19的位點特異性整合。Ali等，出處同上，p.377。
在所推薦的一項具體實施方案中，本發(fā)明IL-4-編碼DNA用于自身免疫疾病，如MS、IDDM和RA、傳染性疾病、如萊姆病和麻風、癌癥，如非何杰金淋巴瘤和ALL、軟骨性疾病，如骨關節(jié)炎、以及牛皮癬病癥，如牛皮癬的基因療法。
根據這一具體實施方案，在診斷時或診斷后向需要的患者提供了本發(fā)明IL-4突變蛋白質編碼DNA的基因療法。
這一方法利用本發(fā)明IL-4突變蛋白質具有選擇活性的優(yōu)點，從而防止了不利的自身免疫的激發(fā)。技術熟練者會認識到，任何適當的、包含IL-4突變蛋白質的基因治療載體都可以按照這一具體實施方案使用。構建所述載體的技術方法已有所知。例如參照Ohno等，出處同上，p.784；Chang等，出處同上，p.522。包含IL-4突變蛋白質DNA的載體向靶位的引入可通過已知技術，譬如，Ohno等，出處同上，p.784中描述的技術完成。
為了使本發(fā)明更容易理解，以下舉出一些實施例。這些實施例僅用于解釋目的，而不應以任何方式被認為是對本發(fā)明范圍的限制。
實施例概況用于本研究的成熟人體IL-4的氨基酸序列如以下所示。經取代作用產生T細胞選擇性促效劑的氨基酸用黑體字表示His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn1 5 10 15Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr20 25 30Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe35 40 45Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu50 55 60Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gin Gln Phe His Arg65 70 75His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu80 85 90Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn95 100 105Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met110 115 120Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser (SEQ ID NO:1)125突變蛋白質在桿菌系統(tǒng)中表達、純化至同質、并利用反映不同IL-4受體用途的生物測定進行評價。兩項測定用于檢驗選擇性促效活性(IL-4誘導的HUVEC IL-6分泌測定)和陽性IL-4活性(1°T細胞增殖測定)。既有誘導T細胞增殖能力，又有較低誘導IL-6分泌能力的化合物為T細胞選擇性IL-4促效劑，并屬于本發(fā)明范圍。更具體地講，人體臍靜脈內皮細胞(HUVEC)通過另一種IL-4受體(IL-4Rα/γ-類似受體成分)用于活性鑒定。
實施例1．突變蛋白質的生成?；救鏚unkel TA、Roberts JD和Zakour RA所述(“無需表現型選擇的快速和有效的位點特異性誘變”，(1987)，酶學方法154:367-382)，突變蛋白質通過使用包含與所需變異體相應的密碼子的引物進行位點特異性誘變而生成。簡單地說，包含限制性酶位點Bam HⅠ和XbaⅠ的人體IL-4cDNA，利用同一位點，經亞克隆化成為M13噬茵體載體M13mp19(NewEngland Biolabs,Beverly,MA)。野生型IL-4cDNA通過聚合酶鏈式反應(“PCR”)從一個來自mRNA的cDNA庫中獲得，該mRNA是從經過24小時佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸鹽(10ng/毫升)誘導的人體外周血液淋巴細胞中分離出來的。用于IL-4開放閱讀框5＇端的PCR引物為5′-CGC GGA TCC ATG GGT CTC ACC TCC-3＇(SEQ IDNO:22)用于IL-4開放閱讀框3＇端的PCR引物為5′- CGC TCT AGA CTA GCT CGA ACA CTT TGA AT-3＇(SEQID NO:23)。
限制性酶位點Bam HⅠ(5＇端)和XbaⅠ(3＇端)被摻入每一低聚核苷酸并以斜體字表示。使用的PCR條件為94℃下1分鐘、58.7℃下1分鐘及72℃下1分鐘，共進行25個循環(huán)。如此得到的正確的IL-4cDNA序列按照生產廠的說明，使用Sequenase測序試劑盒(AmershamLife Sciences,Arlington Heights,IL)進行測序加以確認。包含尿苷的單鏈DNA(U-DNA)通過利用包含IL-4cDNA的M13mp19轉化大腸桿菌菌株CJ236(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)而獲得。位點定向誘變一般使用的引物包含15個與誘變對象密碼子的模板U-DNA5＇同源的核苷酸，摻入所需改變的核苷酸、以及另外10個與最后改變的核苷酸模板U-DNA3＇同源的核苷酸。采用的特殊引物是R121A: CTAAAGACGA TCATGGCTGA GAAATATT(SEQ ID NO:24)R121D: GCTAAAGACG ATCATGGACG AGAAATATTC (SEQ ID NO:25)R121E: GCTAAAGACG ATCATGGAAG AGAAATATTC (SEQ ID NO:26)R121F: CTAAAGACGA TCATGTTTGA GAAATATT(SEQ ID NO:27)R121H: CTAAAGACGA TCATGCACGA GAAATATT(SEQ ID NO:28)R121I: CTAAAGACGA TCATGATAGA GAAATATT(SEQ ID NO:29)R121K: CTAAAGACGA TCATGAAAGA GAAATATT(SEQ ID NO:30)R121N: CTAAAGACGA TCATGAACGA GAAATATT(SEQ ID NO:31)R121P: GCTAAAGACG ATCATGCCAG AGAAATATTC (SEQ ID NO:32)R121T: CTAAAGACGA TCATGACTGA GAAATATT(SEQ ID NO:33)R121W: CTAAAGACGA TCATGTGGGA GAAATATT(SEQ ID NO:34)Y124A: ATCATGAGAG AGAAAGCATC AAAGTGTT(SEQ ID NO:35)Y124Q: ATCATGAGAG AGAAACAATC AAAGTGTT(SEQ ID NO:36)Y124R: ATCATGAGAG AGAAACGATC AAAGTGTT(SEQ ID NO:37)Y124S: ATCATGAGAG AGAAATCATC AAAGTGTT(SEQ ID NO:38)Y124T: ATCATGAGAG AGAAAACATC AAAGTGTT(SEQ ID NO:39)Y124A/SI25A: CGATCATGAG AGAGAAAGCT GCTAAGTGTT CGA (SEQ ID NO:40)T13D: CAGGAGATCA TCAAAGATTT GAACAGCC(SEQ ID NO:41)R121T/EI22F/Y124Q:GCTAAAGACG ATCATGACCT TCAAACAGTC AAAG (SEQ ID NO:42)變異核苷酸區(qū)域劃下線表示。引物按生產廠規(guī)定步驟用T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs,Beverly,MA)進行磷酸化。引物退火成為U-DNA模板并用T7DNA聚合酶(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)延長后，將大腸桿菌菌株DH5αTM(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)的細胞用5微升反應混合劑進行轉變，并置于含有0.7％瓊脂糖的LB溶液中。37℃下溫育后，取單一噬菌斑轉入2毫升LB培養(yǎng)基中將其展平，并在37℃下生長一夜。單鏈DNA按生產廠規(guī)定用M13純化試劑盒(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)進行分離，包含所需變異的克隆按產生廠規(guī)定步驟，使用Sequenase測序試劑盒(Amersham Life Sciences,Arlington Heights,IL)進行單鏈DNA測序來加以確認。來自可復制DNA的IL-4突變蛋白質cDNA用BamHⅠ和XbaⅠ進行分離并經亞克隆化成為質粒載體pFastBacTMl(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)，該可復制DNA與包含正確變異序列的噬茵斑相對應。亞克隆化之后，重組桿狀病毒DNA(以下稱Bacmid)按照生產廠說明，通過將包含突變蛋白質cDNA的pFastBacTMl轉化進大腸桿菌菌株DH10BacTM(GibcobRL,Gaithersburg,MD)生成。突變蛋白質在Spodoptera frugiperda(Sf)9細胞中通過Bac-to-Bac(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)桿狀病毒表達系統(tǒng)進行表達。所有昆蟲細胞的培養(yǎng)都在28℃下進行。簡單地說，2毫升Sf9細胞培養(yǎng)物通過使用CellFECTIN(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)被5微升重組Bacmid轉染。轉染60小時后收集上清液，該上清液在Grace溶液中用于感染100-200毫升的1×106Sf9細胞/毫升培養(yǎng)物(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)。按照生產廠規(guī)定步驟，感染48-60小時后，使用帶GSA轉子的SorvallRC-5B離心機(DupontInstrument Co.,Wilmington,DE)在5000rpm下離心10分鐘，收集上清液并測定病毒效價(通常測定值＞1×108噬茵斑形成單位/毫升)。蛋白質的生成是使2-3×106Sf9細胞/毫升在500毫升SF900Ⅱ培養(yǎng)基(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)中感染，感染復數為4-10。感染60-72小時后，使用帶GSA轉子的SorvallRC-5B離心機(Dupont Instrument Co.,Wilmington,DE)在5000rpm下離心10分鐘，收集上清液并用0.2μM無菌過濾裝置過濾。
實施例2．突變蛋白質的純化?？谷梭wIL-4單克隆抗體C400.1和C400.17以重組人體IL-4(Genzyme Diagnostics,Cambridge,MA)為免疫原，按照標準方法從小鼠中生成，該單克隆抗體作為腹水生成、純化并按生產廠規(guī)定步驟偶聯(lián)到被CNBr活化的瓊脂糖上(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。將由Sf9細胞經含有各自IL-4突變蛋白質的重組桿狀病毒感染產生的Sf9細胞上清液裝入1毫升IL-4親和基質柱，用pH8.3的100mM NaHCO3和500mM NaCl沖洗，之后水洗除去鹽分。然后用8個柱體積的100mM甘氨酸，pH3.0進行洗脫。餾份用裝有0.1體積1M三羥甲基氨基甲烷(Tris),pH8.0的硅化小瓶收集。突變蛋白質使用Dynamax-300A C18柱(RaininInstrument Co.,Woburn,MA)和梯度為0-100％的緩沖液A到B(緩沖液A水；緩沖液B乙酸腈、0.1％三氟乙酸)，經反相層析、進一步提純。餾份用SDS-PAGE評定，包含突變蛋白質的餾份冷凍干燥、儲藏、并重新懸浮于無菌磷酸緩沖鹽水中進行測定。如同SDS-PAGE(銀染色)中所觀察到的，如此提純的突變蛋白質通常為單帶，并利用氨基酸分析進行定量(通常精度＞90％)。
實施例3.1°T細胞增殖測定。原始T細胞來自正常捐獻者的新鮮血液，并使用Ficoll-PaquePlus(Pharmacia,Uppsala,Sweden)離心提純，提純方法基本按照Kruse,N.,Tony,H.P.和Sebald,W.所述，“單一氨基酸取代引起的人類細胞因子IL-4向一種高度近似拮抗物的轉化”，Embo J.,11:3237-44(1992)。提純的外周血液單核細胞于10微克/毫升植物凝血素(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)中培養(yǎng)7天，離心收集，并用RPMI1640溶液(GibcobRL,Gaithersburg,MD)清洗。5×104活化T細胞/井(PHA-胚細胞)在96井平板中與不同量的IL-4或突變蛋白質一起放于RPMI溶液中培養(yǎng)72小時，溫度為37℃。該RPMI溶液包含10％胎牛血清、10mMHEPES,pH7.5、2mML-谷氨酰胺、100單位/毫升青霉素G、以及100微克/毫升硫酸鏈霉素。然后以1μCi3H-胸苷(Dupont NEN,Boston,MA)/井進行6小時脈沖處理并收集。放射活性用TopCountTM閃爍計數器測定(Packard Instrument Co.,Meriden,CT)。
實施例4．HUVEC IL-6分泌測定。人體臍靜脈內皮細胞(HUVEC)來自CloneticsCorp.(San Diego,CA)并按提供者規(guī)定的方法保存。細胞(3至6代)經過與胰蛋白酶/EDTA一起溫育來收集、清洗，然后在EGM溶液(CloneticsCorp.,San Diego,CA)中以亞匯合密度置于48井平板內，該EGM溶液包含牛腦提取物(BBE；CloneticsCorp.,San Diego,CA)。匯合后(37℃下3-4天)，除去培養(yǎng)基，用不含BBE的EGM培養(yǎng)基代替。24小時后，向不含BBE的新鮮EGM中的細胞加入各種濃度的IL-4或突變蛋白質，再繼續(xù)溫育24小時。然后收集上清液，用人體IL-6ELISA分析IL-6濃度。除拮抗測定時是在恒定濃度100pM IL-4內加入不同濃度的突變蛋白質以外，條件全部一致。簡單地說，96井Immunolon兩平板(Dynatech Laboratories,Inc.,Chantilly,VA)用5μg/毫升抗人體IL-6 MAb Cat#1618-01(Genzyme Diagnostics,Cambridge,MA)覆蓋，4℃下放置一夜。重復滴定兩組人體IL-6標準液或樣品，然后與覆蓋平板一起溫育。清洗后，以1∶1000的稀釋度加入第二抗體兔抗人體IL-6PAb(Caltag Laboratories,South San Francisco,CA,Cat#PS-37)。用稀釋(1∶2000)的堿性磷酸酶偶聯(lián)的驢抗兔Ig PAb(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA,Cat#711-055-l52)檢測結合的兔抗IL-6PAb的存在，用pNPP(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,Cat#N2770或N1891)使其顯現出來。吸收量用VmaxTM動態(tài)微量培養(yǎng)板讀出器(MolecularDevices Corp.,Menlo Park,CA)在405nm下讀出。
實施例5．突變蛋白質的活性。表1概括了以上兩種測定中突變蛋白質的結果?！癊C50,pM”是有效濃度，這個濃度產生在皮摩爾/升的濃度下所測出50％最大反應?；钚允切Я?EC50)和最大反應(Rmax)的函數。在與T細胞測定相對的HUVEC測定中，細胞選擇性突變蛋白質顯示出相對Rmax降低和/或相對效力降低(EC50增加)這樣一種差異活性?！癛max,％wt”是相對野生型所測出的最大反應。根據定義，野生型IL-4給出100％的反應。在T細胞增殖測定中，所有突變蛋白質都顯示了活性。在這項測定中，盡管R121T/E122F/Y124Q顯示出較低的最大反應，突變蛋白質R121D、R121E、R121P和R121T/E122F/Y124Q都比野生型IL-4活力更強。與野生型相比，突變蛋白質Y124Q、Y124R和Y124A/S125A具有高出2-3倍的EC50值和較低的最大反應。但是，它們對T細胞似乎保持了很大比率的IL-4活性。在HUVEC測定中，突變蛋白質R121E、Y124Q和R121T/E122F/Y124Q沒有可以測出的活性，這使它們具有T細胞選擇性，從而對T細胞中表達的IL-4受體(IL-4Rα/IL-2Rγ)具有選擇性。盡管這些突變蛋白質與IL-4Rα發(fā)生正常的相互作用，但它們不使復合IL-4Rα/γ類似亞基活化，所以它們是內皮細胞的IL-4拮抗物。突變蛋白質R121P和Y124R在HUVEC測定中顯示活性，但它們的EC50值增加了50-150倍，而且相對于其激發(fā)T細胞的能力，它們的最大反應較低。雖然這兩種蛋白似乎不是絕對具有T細胞選擇性，但它們對T細胞IL-4受體的活化優(yōu)先于對HUVEC IL-4受體的活化。
表1．活性對于T細胞優(yōu)先于內皮細胞的突變蛋白質
實施例6．HUVEC測定中IL-4突變蛋白質的生物學反應。圖2A和B是一系列相對野生型T細胞選擇性促效劑引起的HUVEC IL-6分泌的劑量-反應圖。IL-4作為內部對照加入各用于進行突變蛋白質活性測定的平板中，圖中示出其代表性曲線。圖4A是R121E相對野生型IL-4的劑量-反應曲線。同樣地，圖4B-F分別是R121P、Y124Q、Y124R、Y124A/S125A、和R121T/E122F/Y124Q相對野生型IL-4的劑量-反應曲線。相對IL-4對照反應，對活性進行了標準化。本測定中，突變蛋白質R121E、Y124Q和R121T/E122F/Y124Q未顯示活性。雖然突變蛋白質R121P和Y124R在本測定中顯示了局部促效活性，但與1°T細胞測定相比，他們的效力較野生型為低。因此，盡管它們有活性，卻還是顯示了對T細胞IL-4受體活化的優(yōu)先性。
實施例7.1°T細胞測定中IL-4突變蛋白質的生物學反應。圖4A和B示出了使用正常捐獻者細胞進行的代表性測定中T細胞選擇性促效突變蛋白質的劑量-反應曲線。IL-4作為內部對照加入各用于進行突變蛋白質活性測定的平板中，圖中示出其代表性曲線。圖6A是R121E相對野生型IL-4的劑量-反應曲線。同樣地，圖6B-F分別是R121P、Y124Q、Y124R、Y124A/S125A和R121T/E122F/Y124Q相對野生型IL-4的劑量-反應曲線。相對IL-4對照反應，對活性進行了標準化。雖然突變蛋白質R121T/E122F/Y124Q在本測定中僅是局部促效劑，突變蛋白質R121E、R121P和R121T/E122F/Y124Q卻比野生型IL-4效力更強。雖然突變蛋白質Y124Q、Y124R和Y124A/S125A的效力在本測定中不如野生型IL-4強，它們仍是一些有效的局部促效劑(Rmax值為野生型的60-70％)。圖6中，活性為同一圖中見到的每種突變蛋白質相對IL-4反應的活性。特別注釋的是突變蛋白質R121E和Y124Q，它們在T細胞測定中顯示很強的活性，而在HUVEC測定中無明顯活性。這兩種突變蛋白質都無疑是T細胞選擇性促效劑。
實施例8．T細胞選擇性突變蛋白質對HUVEC IL-4誘導的IL-6分泌的拮抗性。相對一個恒定濃度(100pM IL-4)、對T細胞選擇性突變蛋白質R121E(●)、Y124Q()和IL-4拮抗劑R121D/Y124D(○)(圖7)進行了滴定。在此條件下，IL-4拮抗劑R121D/Y124D以約1.5的KI值與IL-4相拮抗。HUVEC不表達IL-2Rγ，卻表達IL-4受體類似γ亞基。R121E和Y124Q中被取代的殘基在D-螺旋中，因此它們僅影響IL-4與IL-2Rγ(功能性相互作用)和類似γ亞基(無或非功能性相互作用)的相互作用，而不影向這些突變蛋白質與IL-4Rα結合的能力。因此，借助于它們可選擇性地在T細胞中與IL-2Rγ相互作用而不促進內皮細胞中類似r受體亞式活化的能力，這些T細胞選擇性促效劑能夠在內皮細胞中與IL-4誘導的反應競爭(在這些條件下KI～0.8-1nM)。在使用所述突變蛋白質進行T細胞定向治療時，這種由T細胞選擇性突變蛋白質產生的拮抗能夠與內源產生的IL-4對內皮細胞的影響發(fā)生拮抗作用。
實施例9．IL-4突變蛋白質R121D的生物學反應。IL-4突變蛋白質R121D(Arg-121被Asp取代)按上述方法生成并用1°T細胞測定和HUVEC測定法檢測。圖8A和8B中，數據表示T細胞測定(圖8A)和HUVEC測定(圖8B)中的IL-4(○)和R121D(●)。在T細胞測定中，R121D顯示相對野生型IL-4的EC50值-100pM和Rmax值-60％。在HUVEC測定中不活躍(EC50=●；Rmax=○)。這些結果表明，以Asp單一取代人體IL-4中的Arg-121產生出一個對T細胞具有選擇活性，而對內皮細胞缺乏明顯活性的蛋白質。雖然在T細胞測定中R121D是一個局部促效劑，但它比野生型IL-4效力更強。但是，和R121E一樣，R121D在HUVEC測定中未顯示出活性，說明它無疑是一種T細胞選擇性促效劑。
實施例10．IL-4突變蛋白質T13D/R121E的生物活性。IL-4突變蛋白質T13D/R121E(Thr-13被Asp取代，同時Arg-121被Glu取代)按上述方法生成并用1°T細胞測定和HUVEC測定法檢測。特別關于圖9A-B，在T細胞測定中(A組)，T13D/R121E(▲)顯示出強于IL-4(○)和R121E(△)約2-3倍的EC50值-100pM和相對IL-4的Rmax值100％。在HUVEC拮抗劑測定中(B組)，T13D/R121E(▲)是比R121E(△)強約27倍的IL-4活性拮抗劑，兩者分別顯示出IC50-2.2nM和IC50-60nM值。Thr-13向Asp的取代增強了。T13D/R121E相對于R121E的效力(在T細胞測定中作為促效劑和在HUVEC測定中作為拮抗劑時均是如此)。而Arg-121向Glu的取代使T13D/R121E具有T細胞選擇活性(T細胞測定中為完全促效劑，HUVEC測定中為IL-4拮抗劑)。
實施例11．病理學模型中IL-4選擇性促效劑的評定。
本研究使用體重約為4-6公斤的成年彌猴屬猴子(Macacafasicularis,Charles River Primate Imports,Boston.Mass)進行。動物在經環(huán)境調控的室內單獨養(yǎng)于開放式綱籠，每天喂食兩次，隨意飲水。從第一天研究開始前12小時起，對每個動物實行節(jié)食。
在每項研究中，對動物以肌肉注射鹽酸氯胺酮(Ketaset,10mg/kg)進行麻醉。剪去每個動物的背后上部的毛，用70％的酒精-betadine溶液將背部洗凈。使用1毫升結核菌素注射器向動物背部肌肉注射0.1毫升的IL-4、IL-4選擇性促效劑或載體(0.2％人體血清清蛋白，HSA)。注射位置至少相隔10cm并用不易擦掉的筆標記?；罱M織檢查樣品用6mm穿孔活檢器具獲取并放入OCT，然后在液氮中快速冷凍。注射0、4、8和24小時后進行活檢。
對IL-4、IL-4選擇性促效劑或載體的系統(tǒng)反應按照以下方法鑒定。連續(xù)四天內，皮下施用檢驗物，每天兩次，每次相隔10-12小時，用藥量為0.1毫升/公斤，劑量為0、2.5、25或250μg/kg，每天總劑量分別為0、5、50和500μg/kg。第一次注射載體或IL-4前以及在研究期間每天開始時從每一個動物抽取外周血液樣品，分析等分試樣以獲得完整的血細胞計數和差異數據，以及外周血液單核細胞表面標記的流式細胞光度分析數據。離心剩余的血液試樣，等分血漿試樣于-70℃下儲存以備隨后的化學激活水平分析之用。
準備冷凍切片并使切片恢復至室溫，風干，然后在4℃下用丙酮固定5分鐘。將玻片移入10mM含有0.1％BSA的PBS溶液，放置5分鐘。VCAM-1用人體VCAM-1的單克隆抗體C313.3定位。合適濃度的無關且同型匹配的免疫球蛋用作陰性對照。用載體生物素封閉試劑盒(Vector Laboratories,Burlingame,CA)封閉內源性生物素。切片置于包含所述抗血清的濕盒中，在室溫下培養(yǎng)。該抗血清在含有0.1％BSA和1％正常兔血清的PBS中稀釋。用PBS清洗三遍后，玻片按生產廠說明用Vector ABC Elite試劑盒染色，并與3-氨基酸-9-乙基咔唑/過氧化氫(AEC substrate kit,Vector)一起培養(yǎng)以檢測抗體的結合。切片用0.1M丙酮緩沖液充分清洗，用蒸餾水清洗，然后置于Lerner AQUA-MOUNT(Lerner Laboratories,Pittsburgh,PA)。
樣品由兩個獨立觀察者用為鑒定強度及染色分布設計的盲檢法評分，等級設定于0和3+之間。VCAM-1表達的評分系統(tǒng)為0表示不存在或個別血管的輕微染色；1+表示數個血管的輕微染色；2+表示多數血管的適當強度染色；3+表示多數血管的強烈染色。血管從一系列被von Willebrands Factor(多克隆兔抗人體VWF；Dakoplatts,Carpinteria,CA)染色的切片中得到確認。
紅血球計數、血細胞比容、白血球計數和血小板計數分析使用肝素化血樣在Serono9000血液分析儀(Baker Diagnostics,Allentown,PA)上進行。白血球差異在Diff-Quick染色的血液涂片上評定，每個涂片上數出200個細胞，記錄每種類型細胞的百分比。
外周血液單核細胞(PBMC)表面標記的分析以下述方法進行。取4毫升肝素化血樣，用Hanks平衡鹽溶液(HBSS，無Mg++或Ca++)稀釋并在4毫升Percoll(1.070gm/毫升密度)中分層。試管在1800rpm(Beckman GS-6R),24℃下離心20分鐘。吸取包含淋巴細胞的液層，在1100rpm下離心10分鐘。生成的細胞沉淀物重新懸浮于6毫升含有0.1％迭氮化合物和5％山羊血清的磷酸緩沖鹽溶液。1毫升等量試樣用于以下描述的細胞表面標記分析。
流式細胞光度分析用CD2、CD4、CD8、CD11b、CD16、CD25、CD49和HLA-DR(R&D Systems,Minneapolis,MN)的抗體進行。20微升標記等量試樣與1毫升細胞懸液一起在黑暗中、4℃下溫育60分鐘，然后離心(1000rpm,4℃下10分鐘)。沉淀物用含有1毫升0.1％迭氮化合物和5％山羊血清的PBS溶液清洗三遍后進行FAC分析。
從每項研究得到的血漿樣品用特異ELISA進行MCP-1水平分析。簡單地說，96井平板(Nunc,Kamstrup,Denmark)在4℃下用50微升/井兔抗MCP-1覆蓋16小時，然后用PBS和0.05％Tween-20(清洗緩沖液)清洗，pH7.5。在PBS(200微升)中用2％BSA封閉非特異結合部位，平板在37℃下溫育90分鐘。平板用清洗緩沖液清洗三遍后，加入稀釋的重復試樣(未稀釋、1∶5、1∶10)，然后在37℃下溫育1小時。平板清洗四遍后加入50微升/井的生物素化兔抗-MCP-1、37℃下放置45分鐘。平板清洗四遍后，加入Streptavidin-過氧化物酶共軛物(100微升/毫升)(Dakopatts Carpinteria,CA)、平板在37℃下溫育30分鐘。平板清洗三遍后，加入100微升色素原底物(0.67mg/毫升orthophenylenediamine dichloride,Dakopatts,Carpinteria,CA)。平板在25℃下溫育6分鐘后，在含有2％FCS的清洗緩沖液中用50微升/井的3M H2SO4溶液中斷反應。平板用ELISA讀出器中在490nm下讀出。標準為從100ng/毫升到1pg/毫升(50微升/井)重組MCP-1的0.5對數稀釋。ELISA始終能夠檢測出大于50pg/毫升的MCP-1濃度。
實施例12．利用IL-4選擇性促效劑治療多發(fā)性硬化癥。
利用動物模型預測人體內的藥物應用是一個被廣為接受的研究工具。IL-4選擇性促效劑用于多發(fā)性硬化癥(MS)治療的初始實驗，使用重組人體IL-4選擇性促效蛋白在狨模型中進行。這些研究是為了觀察藥物對急性癥狀學和復發(fā)延遲性疾病的誘發(fā)和嚴重性的預防及治療效果。
實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)是一種由CD4+T細胞介導的中樞神經系統(tǒng)自身免疫炎癥疾病。在體重為300-400克的狨(C.jacchus)體內，按照Massacesi等描述的方法通過免疫接種200毫克新鮮冷凍的死后人腦白質勻漿(BH)誘發(fā)EAE(Massacesi等，Ann.Neurol,37:519(1995))。該人腦白質勻漿經含有3毫克/毫升殺死的結核分枝桿菌(，Mycobacterium tuberculosis)的完全Freund佐劑(CFA)乳化。免疫接種的當天以及兩天以后，靜脈施用1010經10毫升鹽溶液稀釋、無活性的百日咳博代氏桿菌微生物。
按照臨床和病理標準對EAE進行鑒定。利用標準化的評分系統(tǒng)記錄臨床疾病的嚴重程度0=正常神經判定；1=昏睡、厭食、體重下降；2=共濟失調，及以下任一癥狀下肢輕癱/單肢輕癱、感覺喪失、或腦干綜合癥，包括凝視麻痹、或失明；3=截癱或偏癱；4=四肢麻痹。
已經證明磁共振圖像(MRI)是描述早期和晚期免疫介導的MS損傷的有用技術(Stewart等，Brain,114:1069(1991))。MRI用于免疫接種后動物的評定以監(jiān)視疾病隨時間的發(fā)展。MRI數據用Picker International NMR Cryogenic‘2000’系統(tǒng)收集，該系統(tǒng)在0.15泰斯拉(Tesla)的場強下操作，接收感應器具有一個15cm的孔洞以接收圖像。使用了多片自旋反射和反向恢復脈沖序列。自旋反射序列中使用的反射延遲時間為40和60ms，或40和80ms。反向恢復序列中，180-90的脈沖間延遲為400ms。
用鹽酸氯胺酮使狨麻醉，然后置于可供患者調整的激光掃描儀，調整后內眼角與靜磁場的方向垂直。免疫接種前用掃描儀觀察動物，免疫接種9天以后每天觀察。每天掃描觀察以前，檢查動物神經損害跡象。
在免疫接種后的不同時間將動物處死，取出CNS置于10％福爾馬林中固定。做成腦和脊髓石蠟切片并用蘇木精(Hematoxylin)和曙紅(Eosin)染色。對每片冠腦和水平脊髓切片進行分析，按任意等級觀察記錄炎癥和脫髓鞘的組織病理所見炎癥；0=無炎癥出現；+=少數血管周圍套/平均整個切片；++=中等數量血管周套/切片；可能有腦膜炎癥；+++=普遍的血管周成套以及炎癥細胞的實質浸潤。脫髓鞘等級0=無脫髓鞘出現；+=少數脫髓鞘病源點；++=中度脫髓鞘；+++=帶有大部聯(lián)合損傷的大范圍脫髓鞘。
為了進行對急性疾病病理的預療研究，疾病癥狀出現之前按照每天一次到每周一次的用藥計劃，在1-500微克/公斤的劑量范圍內皮下施用試驗藥物。進行既存疾病的治療性調節(jié)研究時，在幾個月的療程中按照每天一次到每周一次的連續(xù)用藥計劃，在1-500微克/公斤的劑量范圍內皮下施用試驗藥物。
實施例13．類風濕性關節(jié)炎的治療類風濕性關節(jié)炎(RA)是一種引起虛弱的炎癥疾病，住留和浸潤滑細胞的慢性活化引起軟骨和骨的破壞，從而導致纖維變性和功能的喪失。由活化T細胞釋放的細胞因子被認為在慢性炎癥反應的保持中起著作用。
按照Joosten等所述方法(Joosten等，關節(jié)炎與風濕??；39:797(1996))用Ⅱ型膠原蛋白在DBA/1小鼠中誘發(fā)RA。膠原蛋白誘導的關節(jié)炎(CIA)通過在小鼠尾基部皮內注射100微升含有100微克膠原蛋白的乳劑誘發(fā)。第21天時，再向動物施行Ⅱ型膠原蛋白(100微克)腹膜內加強注射，膠原蛋白溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。
CIA的鑒定通過直接觀察外周關節(jié)關節(jié)炎的出現并安排對關節(jié)炎嚴重程度評分。當發(fā)現至少兩爪中足趾或其它部位出現紅和/或腫現象時，小鼠確認為患有關節(jié)炎。
對于關節(jié)炎的臨床嚴重程度，根據每個爪的紅腫程度變化在0-2等級內進行評分(0=無變化，0.5=有區(qū)別，1.0=中度變化，1.5=差別明顯，2.0=最大嚴重紅腫)，評分由至少兩個盲檢觀察者進行。
研究結束時，處死部分動物，摘取爪和關節(jié)組織用于病理和組織病理觀察。這些組織經過處理，用于免疫組織化學染色(冷凍切片)，或經固定、石蠟包埋、切片和H&E染色、用于細胞浸潤分析。
本發(fā)明IL-4選擇性促效劑的鼠科動物類似物在CIA模型中的評定，利用鼠科動物同等蛋白分子進行。技術一般熟練者能夠比較鼠科動物IL-4結構和人體IL-4結構，制成相應的鼠科動物IL-4突變蛋白質，并根據活體外測定中的反應做出必要的調整。該測定使用的細胞系，以與人體IL-4突變蛋白質在T細胞和HUVEC中類似的方式對IL-4Rα/IL-2Rγ或者IL-4Rα/類似γ亞基進行表達。加強施用膠原蛋白的前一天給動物用藥，之后的研究期間(40余天)內保持每天一次到每周一次的用藥時間計劃。向動物施用IL-4選擇性促效劑，劑量范圍為1-100微克/公斤。
實施例14．胰島素依賴性糖尿病(IDDM)的治療有文獻報道過Th1細胞在人體疾病的人體和動物模型中對IDDM的參與。不過度肥胖的糖尿病(NOD)小鼠用來檢查與IL-4選擇性促效劑同等的鼠科動物IL-4在IDDM治療中的效力。技術一般熟練者能夠比較鼠科動物IL-4結構和人體IL-4結構，制成相應的鼠科動物IL-4突變蛋白質，并根據活體外測定中的反應做出必要的調整。該測定使用的細胞系，以與人體IL-4突變蛋白質在T細胞和HUVEC中類似的方式對IL-4Rα/IL-2Rγ或者IL-4Rα/類似γ亞基進行表達。活體外T細胞激發(fā)后，準糖尿病NOD小鼠(約7周)顯示出增殖非反應性。該非反應性的時間與胰島炎無關，并持續(xù)至糖尿病發(fā)病。此時年齡為24周。
NOD小鼠中IL-4選擇性促效劑的評定按照與Rapoport等報告相似的方法進行(Rapoport等，實驗方法雜志；178；p.87(1993))。在小鼠年齡約為3周時，按照每天一次或每周一次的用藥時間計劃給小鼠注射試驗物。小鼠長到15周時的12周內均為如此。對照組動物接受含有插入蛋白同等物的治療。
用Tes-Tape檢查小鼠是否有糖尿，如果至少連續(xù)兩周被確認有糖尿，則診斷為糖尿病。52周結束時，丟棄動物，摘取各種器官和組織用于病理學評定。對從每一小鼠中取出的胰腺、下頜唾腺和腎臟進行固定石蠟包埋、切片和染色。經乙醛品紅染色的胰腺切片用于檢查胰島炎浸潤產生顆粒狀β細胞群集的程度。脾臟白細胞按照Zipris等所述方法(Zipris等，免疫學雜志146；p.3763(1991))，使用腹水中的抗Thy-1.2、抗CD4和抗CD8mabs透過FACScan分析計數。
本發(fā)明的其它具體實施方案對于技術熟練者將是顯而易見。本發(fā)明教導了怎樣獲取突變蛋白質。該蛋白質在本文中未做描述，但是具有T細胞活化能力和較低的內皮細胞活化能力，因此屬于本發(fā)明的實質和范圍之內。本文描述的概念和實驗方法適用于其它使用異源多體受體系統(tǒng)的細胞因子，特別是IL-2及相關細胞因子(如IL-7、IL-9和IL-15)、IL-10、α干擾素和γ干擾素。
序列本申請包括以下序列SEQ ID NO:1:hIL-4(氨基酸)SEQ ID NO:2:hIL-4(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:3:R121A(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:4:R121D(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:5:R121E(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:6:R121F(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:7:R121H(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:8:R121I(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:9:R121K(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:10:R121N(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:11:R121P(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:12:R121T(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:13:R121W(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:14:Y124A(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:15:Y124Q(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:16:Y124R(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:17:Y124S(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:18:Y124T(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:19:Y124A/S125(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:20:T13D/R121E(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:21:R121T/E122F/Y124Q(氨基酸，cDNA)SEQ ID NO:22:5＇PCR引物，IL-4SEQ ID NO:23:3＇PCR引物，IL-4SEQ ID NO:24:R121A的誘變引物SEQ ID NO:25:R121D的誘變引物SEQ ID NO:26:R121E的誘變引物SEQ ID NO:27:R121F的誘變引物SEQ ID NO:28:R121H的誘變引物SEQ ID NO:29:R121I的誘變引物SEQ ID NO:30:R121K的誘變引物SEQ ID NO:31:R121N的誘變引物SEQ ID NO:32:R121P的誘變引物SEQ ID NO:33:R121T的誘變引物SEQ ID NO:34:R121W的誘變引物SEQ ID NO:35:Y124A的誘變引物SEQ ID NO:36:Y124Q的誘變引物SEQ ID NO:37:Y124R的誘變引物SEQ ID NO:38:Y124S的誘變引物SEQ ID NO:39:Y124T的誘變引物SEQ ID NO:40:Y124A/S125A的誘變引物SEQ ID NO:41:T13D的誘變引物SEQ ID NO:42:R121T/E122F/Y124Q的誘變引物注引物SEQ ID NO:26和41用于T13D/R121E突變蛋白質。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人Shanefelt,Armen；Greve,Jeffrey；Gundel,Robert(ⅱ)發(fā)明題目T-細胞選擇性白細胞介素-4促效劑(ⅲ)序列數目42(ⅳ)通信地址(A)收信人Bayer有限公司制藥部(B)街道400Morgan Lane(C)城市West Haven(D)州康涅狄格州(CT)(E)國家美國(F)郵政編碼06516-4175(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒體類型3.5英寸磁盤，1.44Mb儲存容量(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS v.6.30(D)軟件Word用于Window6.0(ⅵ)當前申請資料無(ⅶ)先前申請資料(A)申請?zhí)?8/663,756(B)申請日期1996年6月14日(ⅷ)律師/代理人資訊(A)姓名Huw R.Jones(B)注冊號碼33,916(C)參考/摘要號碼5013P1(ⅸ)電信聯(lián)絡資訊(A)電話(203)812-2317(B)傳真(203)812-5492(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)長度129(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(A)說明人體白細胞介素-4蛋白質(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn1 5 10 15Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr20 25 30Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe35 40 45Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu50 55 60Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg65 70 75His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu80 85 90Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn95 100 105Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met110 115 120Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser125(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)長度462(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明人體IL-4蛋白質(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:ATG GGT CTC ACC TCC GAA CTG CTT CCC CCT CTG TTC TTC CTG CTA 45Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu1 5 10 15GCA TGT GCC GGC AAC TTT GTC CAC GGA CAC AAG TGC GAT ATC ACC 90Ala Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys 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Leu Ile Arg95 100 105TTC CTG AAA CGG CTC GAC AGG AAC CTC TGG GGC CTG GCG GGC TTG360Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu110 115 120AAT TCC TGT CCT GTG AAG GAA GCC AAC CAG AGT ACG TTG GAA AAC405Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn125 130 135TTC TTG GAA AGG CTA AAG ACG ATC ATG ACC TTC AAA CAG TCA AAG450Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Thr Phe Lys Gln Ser Lys140 145 150TGT TCG AGC TAG462Cys Ser Ser End153(2)SEQ ID NO:22信息(ⅰ)序列特征(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明5＇PCR引物，IL-4(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:CGCGGATCCA TGGGTCTCAC CTCC 24(2)SEQ ID NO:23信息(ⅰ)序列特征(A)長度29(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明3＇PCR引物，IL-4(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:CGCTCTAGAC TAGCTCGAAC ACTTTGAAT 29(2)SEQ ID NO:24信息(ⅰ)序列特征(A)長度28(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明誘變引物，IL-4/R121A(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:CTAAAGACGA TCATGGCTGA GAAATATT 28(2)SEQ ID 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(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明誘變引物，IL-4/R121F(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:CTAAAGACGA TCATGTTTGA GAAATATT 28(2)SEQ ID NO:28信息(ⅰ)序列特征(A)長度28(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明誘變引物，IL-4/R121H(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:CTAAAGACGA TCATGCACGA GAAATATT 28(2)SEQ ID NO:29信息(ⅰ)序列特征(A)長度28(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明誘變引物，IL-4/R121I(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29:CTAAAGACGA TCATGATAGA GAAATATT 28(2)SEQ ID NO:30信息(ⅰ)序列特征(A)長度28(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明誘變引物，IL-4/R121K(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30:CTAAAGACGA TCATGAAAGA GAAATATT 28(2)SEQ ID NO:31信息(ⅰ)序列特征(A)長度28(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明誘變引物，IL-4/R121N(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31:CTAAAGACGA TCATGAACGA GAAATATT 28(2)SEQ ID NO:32信息(ⅰ)序列特征(A)長度30(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明誘變引物，IL-4/R121P(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32:GCTAAAGACG ATCATGCCAG AGAAATATTC 30(2)SEQ ID NO:33信息(ⅰ)序列特征(A)長度28(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明誘變引物，IL-4/R121T(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:33:CTAAAGACGA TCATGACTGA GAAATATT 28(2)SEQ ID NO:34信息(ⅰ)序列特征(A)長度28(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明誘變引物，IL-4/R12lW(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:34:CTAAAGACGA TCATGTGGGA GAAATATT 28(2)SEQ ID NO:35信息(ⅰ)序列特征(A)長度28(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明誘變引物，IL-4/Y124A(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:35:ATCATGAGAG AGAAAGCATC AAAGTGTT 28(2)SEQ ID NO:36信息(ⅰ)序列特征(A)長度28(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明誘變引物，IL-4/Y124Q(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:36:ATCATGAGAG AGAAACAATC AAAGTGTT 28(2)SEQ ID NO:37信息(ⅰ)序列特征(A)長度28(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明誘變引物，IL-4/Y124R(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37:ATCATGAGAG AGAAACGATC AAAGTGTT 28(2)SEQ ID NO:38信息(ⅰ)序列特征(A)長度28(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明誘變引物，IL-4/Y124S(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:38:ATCATGAGAG AGAAATCATC AAAGTGTT 28(2)SEQ ID NO:39信息(ⅰ)序列特征(A)長度28(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型 cDNA(A)說明誘變引物，IL-4/Y124T(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:39:ATCATGAGAG AGAAAACATC AAAGTGTT 28(2)SEQ ID NO:40信息(ⅰ)序列特征(A)長度33(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明誘變引物，IL-4/Y124A/S125A(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:40:CGATCATGAG AGAGAAAGCT GCTAAGTGTT CGA 33(2)SEQ ID NO:41信息(ⅰ)序列特征(A)長度28(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明誘變引物，IL-4/T13D:T13D取代(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:41:CAGGAGATCA TCAAAGATTT GAACAGCC 28(2)SEQ ID NO:42信息(ⅰ)序列特征(A)長度34(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說明誘變引物，IL-4/R121T/E122F/Y124Q(ⅲ)假設無(ⅳ)反向無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:42:GCTAAAGACG ATCATGACCT TCAAACAGTC AAAG3權利要求
1．一種人體IL-4突變蛋白質，其特征在于該突變蛋白質按照野生型IL-4編號，既具有T細胞活化活性，又具有較低的內皮細胞活化活性。
2．根據權利要求1所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述野生型IL-4D螺旋上的表面暴露殘基發(fā)生突變而產生的突變蛋白質與野生型IL-4相比引起T細胞增殖，并引起HUVECs中IL-6的分泌降低。
3．根據權利要求2所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于相對于野生型，該突變蛋白質的位置121被取代。
4．根據權利要求3所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述位置被丙氨酸取代。
5．根據權利要求3所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述位置被天冬氨酸取代。
6．根據權利要求3所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述位置被谷氨酸取代。
7．根據權利要求3所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述位置被苯丙氨酸取代。
8．根據權利要求3所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述位置被組氨酸取代。
9．根據權利要求3所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述位置被異亮氨酸取代。
10．根據權利要求3所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述位置被賴氨酸取代。
11．根據權利要求3所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述位置被天冬酰氨取代。
12．根據權利要求3所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述位置被脯氨酸取代。
13．根據權利要求3所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述位置被蘇氨酸取代。
14．根據權利要求3所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述位置被色氨酸取代。
15．根據權利要求2所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于相對于野生型，該突變蛋白質的位置124被取代。
16．根據權利要求15所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述位置被丙氨酸取代。
17．根據權利要求15所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述位置被谷氨酰胺取代。
18．根據權利要求15所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述位置被精氨酸取代。
19．根據權利要求15所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述置被絲氨酸取代。
20．根據權利要求15所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述位置被蘇氨酸取代。
21．根據權利要求2所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于相對于野生型，該突變蛋白質的位置124和125被取代。
22．根據權利要求21所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述兩位置124和125被丙氨酸取代。
23．根據權利要求2所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于相對于野生型，該突變蛋白質的位置121、122和124被取代。
24．根據權利要求23所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述位置121被蘇氨酸取代、位置122被苯丙氨酸取代，位置124被谷氨酰胺取代。
25．根據權利要求1所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于所述突變蛋白質在所述野生型IL-4的A-或C-α螺旋的結合表面上另外含有至少一個氨基酸被取代，從而所述突變蛋白質以至少以比天然IL-4更大的親和力與IL-4Rα受體結合。
26．根據權利要求25所述的人體IL-4突變蛋白質，其特征在于位置13被天冬氨酸取代，位置121被谷氨酸取代。
27．一種藥用組合物，該組合物由有效量的人體IL-4突變蛋白質和藥用上可接受的載體混合組成，該IL-4突變蛋白質按照野生型IL-4編號，既具有T細胞活化活性，又具有較低的內皮細胞活化活性。
28．一種多聚核苷酸分子，該多聚核苷酸分子編碼根據權利要求1所述的人體IL-4突變蛋白質及其簡并變異體。
29．一種宿主細胞，該宿主細胞被根據權利要求28所述的多聚核苷酸轉化。
30．一種載體，該載體包含根據權利要求28所述的多聚核苷酸，該多聚核苷酸引導既具有T細胞活化活性又具有較低內皮細胞活化活性的人體IL-4突變蛋白質的表達，所述載體能夠轉染靶生物體以及繼后在活體內表達所述人體IL-4突變蛋白質，該人體IL-4突變蛋白質由所述多聚核苷酸編碼。
31．一種選擇人體IL-4突變蛋白質的方法，該人體IL-4突變蛋白質按照野生型IL-4編碼，既具有T細胞活化活性，又具有較低的內皮細胞活化活性，該方法包括使所述野生型IL-4D螺旋上的表面暴露殘基發(fā)生變異，由此產生的突變蛋白質與野生型IL-4相比引起T細胞增殖，并引起HUVECs中IL-6的分泌減少。
32．一種治療患有IL-4可治病癥患者的方法，包括施用治療有效量的人體IL-4突變蛋白質，該人體IL-4突變蛋白質按照野生型IL-4編號，它既具有T細胞活化活性，又具有較低的內皮細胞活化活性。
33．根據權利要求32所述的方法，其中所述IL-4可治病癥為一種自身免疫性疾病。
34．根據權利要求33所述的方法，其中所述自身免疫病癥為多發(fā)性硬化癥。
35．根據權利要求33所述的方法，其中所述自身免疫病癥為類風濕關節(jié)炎。
36．根據權利要求33所述的方法，其中所述自身免疫病癥為胰島素依賴性糖尿病。
37．根據權利要求33所述的方法，其中所述的自身免疫病癥為系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
38．根據權利要求32所述的方法，其中所述IL-4可治病癥為一種傳染性疾病。
39．根據權利要求38所述的方法，其中所述傳染性疾病為萊姆病。
40．根據權利要求32所述的方法，其中所述IL-4可治病癥為一種Th1極性化疾病。
41．根據權利要求40所述的方法，其中所述Th1極性化疾病為牛皮癬。
42．根據權利要求32所述的方法，其中所述IL-4可治病癥為癌癥。
43．根據權利要求42所述的方法，其中所述癌癥選自急性成淋巴細胞白血病和非何杰金淋巴腫瘤。
44．根據權利要求32所述的方法，其中所述IL-4可治病癥為軟骨性疾病。
45．根據權利要求44所述的方法，其中所述軟骨性疾病為骨關節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及按照野生型IL－4編號、既具有T細胞活化活性、又具有較低內皮細胞活化活性的人體IL－4突變蛋白質。具體地說,本發(fā)明涉及野生型IL－4D螺旋上的表面暴露殘基發(fā)生變異而產生的人IL－4突變蛋白質,該突變蛋白質與野生型IL－4相比可引起T細胞增殖,并引起HUVECs中IL－6的分泌減少。本發(fā)明獲得了毒性較低、賦予該白細胞介素更多治療用途的IL－4突變蛋白質。此外,本發(fā)明還涉及單、雙及三次突變的IL－4突變蛋白質,在根據野生型IL－4編號時(His=1),這些突變蛋白質以指示標記R121A、R121D、R121E、R121F、R121H、R121I、R121K、R121N、R121P、R121T、R121W;Y124A、Y124Q、Y124R、Y124S、Y124T、Y124A/S125A、T13D/R121E;以及R121T/E122F/Y124Q表示。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明突變蛋白質的多核苷酸、包含該多核苷酸的載體、轉化的宿主細胞、包含突變蛋白質的藥用組合物、以及治療方法。
文檔編號C07K14/435GK1222194SQ97195497
公開日1999年7月7日 申請日期1997年5月30日 優(yōu)先權日1997年5月30日
發(fā)明者A·B·沙納菲爾特, J·格雷維, R·貢德爾 申請人:美國拜爾公司