專利名稱：用于重度急性呼吸綜合癥病毒抗原檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及SARS病毒抗原的檢測。具體的，本發(fā)明涉及SARS病毒抗體、抗SARS病毒IgG致敏紅細(xì)胞、它們的制備方法、和SARS病毒抗原檢測方法等。
背景技術(shù)：
重度急性呼吸綜合癥(sever acute respiratory syndrome，SARS)是2002年底開始影響世界上幾個(gè)國家和地區(qū)的一種傳染性極強(qiáng)的疾病。根據(jù)目前的研究，這種疾病是由一種新的冠狀病毒引起的。這種疾病的傳染性強(qiáng)，嚴(yán)重影響患者的身體健康，并且有較高的致死率。要很好地預(yù)防這種疾病，只有通過接種疫苗來實(shí)現(xiàn)。疫苗主要分為減毒活疫苗(例如甲肝減毒活疫苗)，滅活疫苗(例如甲肝滅活疫苗)，基因工程疫苗，亞單位疫苗。而研制快而有效的就是滅活疫苗，在滅活疫苗的制備過程中需要一種檢測SARS病毒的方法?，F(xiàn)有技術(shù)中迫切需要能快速且靈敏的測定樣品中的SARS病毒，以便能對疫苗的純化工藝及疫苗本身作出評價(jià)的方法。
本發(fā)明提供了評價(jià)疫苗純化工藝及疫苗本身的方法，從而滿足了現(xiàn)有技術(shù)中的這一需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種測定SARS病毒抗原的方法。為此，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案。
一方面，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合SARS病毒抗原的抗體，特別是多克隆抗體，優(yōu)選IgG，更優(yōu)選人IgG、猴IgG、兔IgG，最優(yōu)選兔IgG。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體。優(yōu)選的，所述抗體具有高效價(jià)。
本發(fā)明還涉及制備特異性結(jié)合SARS病毒抗原的抗體的方法，該方法包括(a)用純化的SARS病毒抗原免疫動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物，如家兔或猴)，例如，采用0，14，21天三針免疫程序，將純化SARS抗原與弗氏完全佐劑等比混合后，2ml/次/只，肌肉注射；(b)從免疫動(dòng)物采血，分離出血清；(c)任選的，將血清滅活，例如經(jīng)56℃，30min滅活；和(d)任選的，用蛋白A法提取SARS抗體陽性血清中的IgG。
另一方面，本發(fā)明制備經(jīng)抗SARS病毒IgG致敏的紅細(xì)胞的方法，包括如下步驟(a)制備醛化紅細(xì)胞，優(yōu)選雙醛化紅細(xì)胞；(b)將醛化紅細(xì)胞鞣化；(c)用抗SARS病毒IgG致敏鞣化紅細(xì)胞；和(d)任選地，加入適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑，凍干。
紅細(xì)胞可采用本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行醛化。例如，可將紅細(xì)胞配成10％(體積比)紅細(xì)胞懸液。緩慢加入等體積1％(體積比)戊二醛，室溫振蕩30分鐘，進(jìn)行單醛化。經(jīng)過洗滌之后加入百分之一體積的甲醛溶液雙醛化。對于醛化后的紅細(xì)胞，可加入終濃度1∶10000(質(zhì)量比)的NaN3，2-8℃保存?zhèn)溆谩?br> 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(a)的紅細(xì)胞是O型紅細(xì)胞，依次采用戊二醛和甲醛進(jìn)行醛化；和/或步驟(b)包括用1∶20000(質(zhì)量比)等體積新鮮配制鞣酸37℃作用15分鐘；和/或步驟(c)包括將適當(dāng)濃度的抗SARS病毒IgG和適當(dāng)濃度的步驟(b)的鞣化紅細(xì)胞在足以致敏紅細(xì)胞的時(shí)間和條件下接觸；優(yōu)選地，步驟(c)包括將4倍體積0.15mol/L pH6.4的PBS、1倍體積適當(dāng)濃度的IgG、1倍體積2.5％鞣化紅細(xì)胞混合均勻后，室溫振蕩結(jié)合1小時(shí)；和/或步驟(c)還可以包括用約1％滅活正常兔血清-PBS洗滌2次，任選地，用0.15mol/L pH7.2的PBS配成約1.25％的致敏紅細(xì)胞；和/或步驟(d)的保護(hù)劑是蔗糖和吐溫-20，優(yōu)選終濃度為10％(質(zhì)量比)蔗糖和萬分之三(體積比)吐溫-20。
在另一個(gè)的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法步驟(c)的IgG優(yōu)選人IgG、猴IgG或兔IgG，更優(yōu)選兔IgG；和/或步驟(c)的IgG的濃度為0.01-2.0mg/ml，更優(yōu)選0.05-0.5mg/ml，最優(yōu)選0.1-0.2mg/ml。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明方法步驟(c)使用0.1-0.2mg/ml的兔IgG致敏紅細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明涉及經(jīng)抗SARS病毒IgG致敏的紅細(xì)胞，優(yōu)選“O”型紅細(xì)胞。該紅細(xì)胞可以是任何來源的，優(yōu)選哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞，更優(yōu)選人紅細(xì)胞，特別是人“O”型紅細(xì)胞。本發(fā)明的紅細(xì)胞可通過本發(fā)明的方法制備。優(yōu)選地，按照本發(fā)明的方法或相當(dāng)?shù)姆椒ǎ景l(fā)明敏化紅細(xì)胞檢測SARS病毒抗原對照的效價(jià)不低于1∶16，優(yōu)選不低于1∶32，更優(yōu)選不低于1∶40，不低于1∶50，不低于1∶60，甚至更優(yōu)選不低于1∶80，不低于1∶96，最優(yōu)選不低于1∶128或更高。
另一方面，本發(fā)明涉及測定SARS病毒抗原的方法，包括如下步驟(a)獲得待測樣品；和(b)采用本發(fā)明的致敏紅細(xì)胞通過反向間接血凝方法測定所述待測樣品是否存在SARS病毒抗原，優(yōu)選地，定量測定該樣品的血凝效價(jià)。
所述待測樣品可以是任何樣品，例如制備SARS疫苗過程中的中間產(chǎn)品、過程液及疫苗原液滅活液、澄清液、超濾液、超濾原濾過液、純化液、純化二峰等等，也可以是動(dòng)物或人的分泌物、排泄物、血液樣品、組織樣品、或任何臨床樣品。而且，如果需要，這些樣品可以經(jīng)過適當(dāng)處理，例如離心、裂解、破碎、純化、滅活等。
反向間接血凝方法是用抗-SARS病毒IgG(兔抗-SARS病毒IgG)致敏的紅細(xì)胞(例如人“O”型紅細(xì)胞)檢測待檢樣品中的SARS病毒抗原。反向間接血凝方法可用于檢測SARS滅活疫苗制備過程中的SARS病毒抗原含量。
反向間接血凝方法是本領(lǐng)域熟知的，可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員按照常規(guī)方法進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)和實(shí)施。例如，可以按照實(shí)施例中提供的方法進(jìn)行。
反向間接血凝方法應(yīng)用時(shí)，出現(xiàn)的非特異反應(yīng)可通過增加SARS病人恢復(fù)期血清的抑制而確定。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括用血凝抑制試驗(yàn)測定非特異性反應(yīng)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，血凝抑制試驗(yàn)包括每次檢測樣品時(shí)，增加SARS抗體陽性血清(例如SARS病人恢復(fù)期血清)的抑制；當(dāng)樣品稀釋液檢測待測樣品血凝效價(jià)≥1∶4，優(yōu)選≥1∶8，更優(yōu)選≥1∶16，例如≥1∶32甚至更高，SARS抗體陽性血清抑制后結(jié)果較抑制前低至少4倍時(shí)判定為SARS抗原陽性；未出現(xiàn)SARS抗體陽性血清抑制，判定為SARS病毒抗原陰性。
另一方面，本發(fā)明還涉及用血凝抑制試驗(yàn)測定反向間接血凝中非特異性反應(yīng)的方法。
再一方面，本發(fā)明涉及檢測SARS抗原的試劑盒，包含經(jīng)抗SARS病毒IgG致敏的紅細(xì)胞和任選的SARS抗體陽性血清。該試劑盒還可以包含樣品稀釋液、陽性對照、陰性對照、微量血凝板、和/或說明書等等。
反向間接血凝方法應(yīng)用時(shí)，出現(xiàn)的非特異反應(yīng)可通過增加SARS病人恢復(fù)期血清的抑制而確定。
在本發(fā)明的特別具體的實(shí)施方式中，如果適當(dāng)?shù)脑?，本發(fā)明所有方面都使用以下SARS病毒毒株Sino 1，Sino 2，Sino 3，Sino 4，和Sino 5。所述病毒毒株分別于2003年6月26日保藏在國際保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號)，保藏號分別為CGMCC No.0962、0963、0964、0965和0966。分類命名為冠狀病毒屬(Coronavirus)SARS病毒。
本發(fā)明所用的病毒抗原和病毒抗原陽性對照可通過以下方法制備。通過Vero細(xì)胞培養(yǎng)SARS病毒，并用甲醛或β-丙內(nèi)酯進(jìn)行滅活而得病毒滅活液；將病毒滅活液進(jìn)行離心后即得病毒澄清液；病毒澄清液通過一定截留直徑的膜包進(jìn)行超濾，濾出的稱為超濾濾過液，未濾出的稱為病毒超濾液；將病毒超濾液進(jìn)行分子篩層析，層析第一峰即是純化液，層析第二峰稱為純化二峰。具體地，滅活和純化方法可參見實(shí)施例所述。
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行舉例說明，這些實(shí)施例對本發(fā)明的范圍沒有任何限制作用。參考這些實(shí)施例，本發(fā)明的上述方面和其他方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是明顯的。


圖1.選擇不同福爾馬林溶液濃度進(jìn)行滅活對SARS病毒感染滴度的影響。
圖2.選擇不同β-丙內(nèi)酯溶液濃度對SARS病毒感染滴度的影響。
實(shí)施例材料和方法1.SARS病人恢復(fù)期血清——北京、張家口、內(nèi)蒙古地區(qū)，北京科興臨床醫(yī)學(xué)部提供。經(jīng)56℃，30min滅活后，2-8℃保存?zhèn)溆?。?.15mol/L pH7.2的PBS 1∶25稀釋，用于血凝抑制試驗(yàn)。
2.陰性血清2. 1健康人血清購自北京市紅十字血液中心。SARS中和抗體陰性。經(jīng)56℃，30min滅活后，2-8℃保存?zhèn)溆谩Ｓ?.15mol/L pH7.2的PBS 1∶25稀釋，用于血凝抑制試驗(yàn)。
2. 2正常兔血清采自健康家兔，分離出血清。經(jīng)56℃，30min滅活后，2-8℃保存?zhèn)溆?。?.15mol/L pH7.2的PBS 1∶100稀釋，得到1％滅活正常兔血清-PBS，用作樣品稀釋液。
3.SARS病毒抗原參比品用Vero細(xì)胞培養(yǎng)、收獲SARS病毒，經(jīng)滅活、離心、超濾、分子篩層析而得。
4.樣品北京科興生物制品有限公司通過Vero細(xì)胞培養(yǎng)SARS病毒，并用甲醛或β-丙內(nèi)酯進(jìn)行滅活而得病毒滅活液；將病毒滅活液進(jìn)行離心后即得病毒澄清液；病毒澄清液通過一定截留直徑的膜包進(jìn)行超濾，濾出的稱為超濾濾過液，未濾出的稱為病毒超濾液；將病毒超濾液進(jìn)行分子篩層析，層析第一峰即是純化液，層析第二峰稱為純化二峰。具體滅活和純化方法同以下實(shí)施例所述。
5.Vero細(xì)胞凍融液將Vero細(xì)胞培養(yǎng)至致密單層，棄培養(yǎng)液。加入維持液，-20℃凍融三次。2-8℃保存?zhèn)溆?。蛋白含?.5mg/ml。
6.Vero蛋白純化液將Vero細(xì)胞培養(yǎng)、收獲，用SARS病毒同一提純工藝提純而得。蛋白含量28μg/ml。
實(shí)施例1 SARS病毒滅活在本發(fā)明中，采用選自福爾馬林溶液和β-丙內(nèi)酯的滅活劑，對含有SARS病毒的樣品進(jìn)行滅活。
1)福爾馬林溶液滅活分別以等體積向待處理的SARS病毒樣品中加入經(jīng)1∶100(體積比)稀釋的福爾馬林溶液，在37℃下用工作濃度分別為1∶1000、1∶2000、1∶4000(體積比)稀釋的福爾馬林溶液處理SARS病毒液，得到SARS病毒推算滅活時(shí)間分別為2.9小時(shí)、6.0小時(shí)和12.5小時(shí)。結(jié)果詳見表1滅活動(dòng)力學(xué)曲線參見圖1。
表1 不同濃度福爾馬林溶液滅活SARS病毒時(shí)間滅活前推算滅活時(shí)間福爾馬林 斜率CCID50/ml (hr)1∶1000 6.7-2.4 2.91∶2000 6.7-1.13 6.01∶4000 6.7-0.53 12.52)β-丙內(nèi)酯溶液滅活分別以等體積向待處理的SARS病毒樣品中加入經(jīng)1∶10(體積比)稀釋的β-丙內(nèi)酯溶液，在4℃下用工作濃度分別為1∶4000、1∶6000、1∶8000(體積比)稀釋的β-丙內(nèi)酯溶液處理SARS病毒液，得到SARS病毒推算滅活時(shí)間分別為2.9小時(shí)、7.2小時(shí)和11.6小時(shí)，結(jié)果見表2。在此基礎(chǔ)上延長至少2倍時(shí)間即為首次滅活時(shí)間。滅活動(dòng)力學(xué)曲線參見圖2。
表2 不同濃度β-丙內(nèi)酯滅活SARS病毒時(shí)間滅活前推算滅活時(shí)間β-丙內(nèi)酯濃度 斜率CCID50/ml (hr)1∶40007.2-2.4 2.91∶60007.2-1.0257.21∶80007.2-0.63 11.6實(shí)施例2 在規(guī)?；苽銼ARS病毒的細(xì)胞工廠中原位滅活SARS病毒在本發(fā)明中還可以在規(guī)?；苽銼ARS病毒的細(xì)胞工廠中原位滅活SARS病毒。
將制備好的滅活劑，即經(jīng)1∶100(體積比)稀釋的福爾馬林溶液，等量加入盛有待滅活SARS病毒的細(xì)胞工廠(購自丹麥NUNC公司)內(nèi)，混勻，在攪拌下，經(jīng)37℃原位滅活2.9～12.5小時(shí)后收獲。
或者當(dāng)采用β-丙內(nèi)酯溶液作為滅活劑時(shí)，將1∶10稀釋后加入，使得β-丙內(nèi)酯溶液與總樣品體積比為1∶6000～1∶8000。滅活溫度2～8℃ 16～24小時(shí)。
實(shí)施例3 SARS病毒超時(shí)滅活或二次滅活1)對由實(shí)施例2所得采用福爾馬林為滅活劑處理得到的病毒滅活液，將其在與如實(shí)施例2所述相同的滅活條件下以首次滅活時(shí)間的3倍進(jìn)行超時(shí)滅活。
2)對由實(shí)施例2所得采用β-丙內(nèi)酯為滅活劑處理得到的滅活病毒液，進(jìn)行二次滅活。再次加入與病毒樣品總體積比為1∶4000-1∶6000(為兩次加β-丙內(nèi)酯工作濃度之和)的量進(jìn)行二次滅活，第二滅活條件是在2-8℃下滅活SARS病毒16-24小時(shí)，室溫作用2天或37℃水浴作用2小時(shí)，以將SARS病毒徹底滅活。
實(shí)施例4 滅活SARS病毒的純化將如實(shí)施例3所得病毒滅活液進(jìn)行如下操作，以純化所得病毒滅活液1)離心澄清，即以2000～4000g離心力在2-8℃離心10～35分，吸上清，得到病毒澄清液；2)超濾濃縮將病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包進(jìn)行超濾濃縮10倍以上，等體積透析3-7次，透析液用0.01M PBS(pH7.0～7.6)，獲得病毒超濾液；濾出的稱為超濾濾過液；3)柱層析將病毒超濾液用Sepharose four fast flow進(jìn)行層析，收集第一穿流峰即為病毒純化液。洗脫液0.01M PBS。層析第二峰稱為純化二峰。
或者，將如實(shí)施例3所得病毒滅活液進(jìn)行如下操作，以純化所得病毒滅活液1)將病毒滅活液進(jìn)行離心澄清，具體的以2000～4000g離心力在2-8℃離心10～35分，吸上清，即為病毒澄清液；2)超濾濃縮將病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包進(jìn)行超濾濃縮10倍以上，等體積透析3-7次，透析液用0.01M PBS(pH7.0～7.6)獲得病毒超濾液；3)向步驟2)所的經(jīng)純化的滅活病毒液中加入終濃度10-100單位Benzonase(默克公司)，1-10mM Mg2+室溫處理4小時(shí)以上，消化體系中Vero細(xì)胞殘留DNA和體系的RNA；消化體系中Vero細(xì)胞殘留DNA；4)再次超濾；5)柱層析將病毒超濾液用Sepharose four fast flow進(jìn)行層析，洗脫液0.01M PBS，收集第一穿流峰即為病毒精純液。
或者，將如實(shí)施例3所得病毒滅活液進(jìn)行如下操作，以純化所得病毒滅活液1)將病毒滅活液進(jìn)行離心澄清，具體的以2000～4000g離心力在2-8℃離心10～35分，吸上清，即為病毒澄清液；2)超濾濃縮將病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包進(jìn)行超濾濃縮10倍以上，等體積透析3-7次，透析液用0.01M PBS(pH7.0～7.6)獲得病毒超濾液；3)柱層析將病毒超濾液用Sepharose four fast flow進(jìn)行層析，洗脫液0.01M PBS，收集第一穿流峰；4)向步驟3)中收集的經(jīng)純化的滅活病毒液中加入終濃度10-100單位Benzonase(默克公司)，1-10mM Mg2+室溫處理4小時(shí)以上，消化體系中Vero細(xì)胞殘留DNA和體系的RNA；5)再次超濾，獲得病毒精純液。
將SARS病毒精純液用作制備高效價(jià)抗體的免疫原和反向間接血凝試驗(yàn)的陽性對照。
將經(jīng)過實(shí)施例1-3所述方法滅活的病毒滅活液依照實(shí)施例4所述方法純化后，將所得病毒純化液進(jìn)一步經(jīng)過如下處理將病毒精純液用選自0.2μm濾器或4-10千戈瑞劑量的鈷60照射樣品(體積不限)60分鐘，除菌，獲得疫苗原液。
實(shí)施例5 高效價(jià)SARS病毒抗體的制備1. SARS抗原免疫兔血清用北京科興純化的SARS病毒抗原免疫家兔，采用0，14，21天三針免疫程序，將純化SARS抗原與弗氏完全佐劑(鼎國生物)等比混合后，2ml/次/只，后肢肌肉注射，28天采血，分離出血清。經(jīng)56℃，30min滅活后，2-8℃保存?zhèn)溆谩?br> 2. SARS抗原免疫猴血清用北京科興純化的SARS抗原免疫猴，采用0，14，21天三針免疫程序，1ml/次/只，后肢肌肉注射，28天采血，分離出血清。經(jīng)56℃，30min滅活后，2-8℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.血清中IgG提取方法用蛋白A法提取SARS抗體陽性血清中的IgG。
(1)加入1/10體積的1.0mol/L Tris(pH8.0)，調(diào)含抗體樣品的pH值至8.0。
(2)將抗體溶液通過蛋白A(Protein A SepharoseTMCL-4B，Amersham)微球柱，流速0.5ml/min。
(3)用10倍柱體積的100mmol/L Tris(pH8.0)洗滌微球。
(4)用10倍柱體積的10mmol/L Tris(pH8.0)洗滌微球。
(5)用50mmol/L甘氨酸(pH3.0)洗脫微球柱，根據(jù)OD280值收集蛋白，即得純化的IgG(酶標(biāo)1∶100)。
實(shí)施例6 敏化紅細(xì)胞的制備單醛化取人“O”型紅細(xì)胞(購自北京市紅十字血液中心)，用生理鹽水洗滌6次，用0.15mol/L，pH7.2PBS配成10％(體積比)紅細(xì)胞懸液。緩慢加入等體積1％(體積比)戊二醛，室溫振蕩30分鐘。如上所述洗滌6次，配成10％(體積比，下同)紅細(xì)胞懸液。
雙醛化10％單醛化紅細(xì)胞懸液中加入百分之一體積的甲醛溶液(38％)，37℃作用1小時(shí)，15分鐘搖一次。用生理鹽水洗滌6次。用0.15mol/L，pH7.2PBS配成10％紅細(xì)胞懸液。加入終濃度1∶10000(質(zhì)量比)的NaN3，2-8℃保存?zhèn)溆谩?br> 敏化紅細(xì)胞取雙醛化紅細(xì)胞，用1∶20000(質(zhì)量比)等體積新鮮配制鞣酸37℃作用15分鐘，洗滌1次，配制成2.5％紅細(xì)胞懸液。
將SARS病人恢復(fù)期血清、SARS抗原免疫猴血清、SARS抗原免疫兔血清提取的IgG(以下簡稱人IgG、猴IgG、兔IgG)按蛋白濃度稀釋，用0.15mol/L pH6.4的PBS稀釋為適宜的致敏濃度。
4倍體積0.15mol/L pH6.4的PBS，1倍體積IgG，1倍體積2.5％鞣化紅細(xì)胞混合均勻后，室溫振蕩結(jié)合1小時(shí)。用1％滅活正常兔血清-PBS洗滌2次，然后用0.15mol/L pH7.2的PBS配成1.25％的致敏紅細(xì)胞，4℃保存?zhèn)溆??；蚣尤虢K濃度為10％(質(zhì)量比)蔗糖和萬分之三(體積比)吐溫-20的保護(hù)劑，凍干備用。
實(shí)施例7反向間接血凝方法的建立反向間接血凝試驗(yàn)1.方法取潔凈的96孔“V”型微量血凝板。將樣品稀釋液加于血凝板各孔中，30μl/孔。取待檢的SARS抗原30μl，從第1孔起順序作倍比稀釋。最后1孔留作空白對照。取陽性對照30μl，從另一排的第1孔起順序作倍比稀釋。各孔中加入致敏紅細(xì)胞懸液(使用以前一定要搖勻)30μl，室溫靜置1-2小時(shí)，判定結(jié)果。
2.結(jié)果判定100％紅細(xì)胞凝集為++++；孔底均勻鋪滿一層紅細(xì)胞；75％紅細(xì)胞凝集為+++；邊緣滑下；50％紅細(xì)胞凝集為++；呈環(huán)狀，周圍有凝集顆粒；25％紅細(xì)胞凝集為+；沉在孔底的紅細(xì)胞周圍有凝集顆粒。陰性(-)紅細(xì)胞沉在孔底，呈圓點(diǎn)，周圍光滑。以50％凝集為終點(diǎn)。
陽性對照、陰性對照成立，實(shí)驗(yàn)成立。
3.結(jié)果計(jì)算方法將結(jié)果整理為可判定結(jié)果孔的高一個(gè)稀釋度為陰性，低一個(gè)稀釋度為++++。根據(jù)可判定結(jié)果孔的四種凝集情況計(jì)算最終的血凝效價(jià)。血凝效價(jià)計(jì)算方法見表一。
表一血凝效價(jià)計(jì)算方法病毒稀釋度(C＝2B＝2A) 血凝效價(jià)1∶A1∶B1∶C (1∶)+++++++ - B×5/4++++++ - B+++++- B×7/8++++-- (A+B)/2血凝抑制試驗(yàn)取潔凈的96孔“V”型微量血凝板。將樣品稀釋液、4％陽性血清稀釋液、4％陰性血清稀釋液，加于血凝板各孔中，30μl/孔，各一排。取待檢的SARS抗原樣品30μl，從每排第1孔起順序作倍比稀釋。最后1孔留做空白對照。取陽性對照30μl，從另一組每排的第1孔起順序作倍比稀釋。37℃作用半小時(shí)，各孔中加入致敏紅細(xì)胞懸液(紅細(xì)胞使用以前一定要搖勻)30μl，室溫靜置1-2小時(shí)，判定結(jié)果。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)同反向間接血凝試驗(yàn)。
結(jié)果1.比較不同提純IgG的致敏效果人IgG、猴IgG、兔IgG致敏紅細(xì)胞后，檢測SARS病毒抗原對照。兔IgG測SARS病毒抗原對照為1∶56，人IgG為1∶2，猴IgG為1∶3。結(jié)果見表二。選擇兔IgG用于致敏。
表二不同IgG致敏效果比較IgG類型 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 結(jié)果人IgG ++ - - - - - -1∶2兔IgG ++++ ++++ ++++ +++++++ ++ -1∶56猴IgG ++++ - - - - - -1∶32.比較不同批紅細(xì)胞IgG的致敏濃度20030811批、20030923批人“O”型紅細(xì)胞分別用兔IgG致敏，檢測SARS病毒抗原對照，比較最佳致敏濃度。
20030811批紅細(xì)胞的最佳致敏濃度為0.1mg/ml，20030923批紅細(xì)胞的最佳致敏濃度為0.2mg/ml，結(jié)果見表三。不同批紅細(xì)胞的最佳SARS抗體致敏濃度不同。不是致敏濃度越大或越小就越好，每批紅細(xì)胞都有一個(gè)最佳致敏濃度。
表三不同批紅細(xì)胞IgG的致敏濃度比較紅細(xì)胞IgG致敏濃度 1∶21∶41∶81∶161∶321∶64 1∶128 結(jié)果批號 (Prmg/ml)20030811 0.1 ++++++++++++++++ ++++ ++ - 1∶6420030923 0.2 ++++++++++++++++ ++++ + - 1∶563.SARS病毒抗原對照反向間接血凝方法建立過程中，用SARS病毒抗原對照跟蹤比較了每一批敏化紅細(xì)胞。用多批兔IgG敏化紅細(xì)胞檢測SARS病毒抗原對照，結(jié)果都在1∶32以上。結(jié)果見表四。敏化紅細(xì)胞檢測SARS病毒抗原對照效價(jià)在1∶32以上，可確定該批敏化紅細(xì)胞為合格批。
表四不同批敏化紅細(xì)胞檢測SARS病毒純化液結(jié)果敏化紅細(xì)胞 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 結(jié)果批號20030816++++ ++++ ++++ ++++ ++ - - -1∶3220030821++++ ++++ ++++ ++++ ++++++++ ++ -1∶12820030828++++ ++++ ++++ ++++ ++++++++ - -1∶9620031005++++ ++++ ++++ ++++ +++++++- -1∶8020031009++++ ++++ ++++ ++++ ++++++ - -1∶64平均值1∶564.血凝抑制陽性血清稀釋液和陰性血清稀釋液同時(shí)檢測抗原對照、Vero細(xì)胞凍融液和Vero蛋白純化液，并與樣品稀釋液的檢測結(jié)果作對比。
樣品稀釋液檢測抗原參比品為1∶32，Vero細(xì)胞凍融液為1∶10，Vero蛋白純化液為陰性。4份陽性血清都能抑制抗原參比品中的SARS病毒抗原，4份陰性血清都不能抑制。4份陽性血清和4份陰性血清對Vero細(xì)胞凍融液都未出現(xiàn)抑制。結(jié)果見表五和表六。
表五陰陽性血清抑制SARS病毒純化液檢測結(jié)果血清及濃度 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 結(jié)果樣品稀釋液 ++++ ++++ ++++ ++++ ++ - 1∶32STS-D-京05 ++++ - - - - - 1∶3STS-D-京06 ++++ ++++ - - - - 1∶6STS-D-張01(2) ++++ ++- - - - 1∶4STS-D-張03 ++++ + - - - - 1∶3.5人陰性血清-1++++ ++++ ++++ ++++ ++ - 1∶32人陰性血清-2++++ ++++ ++++ ++++ ++ - 1∶32人陰性血清-3++++ ++++ ++++ ++++ ++ - 1∶32人陰性血清-4++++ ++++ ++++ ++++ +++- 1∶40
表六陰陽性血清抑制Vero細(xì)胞凍融液檢測結(jié)果血清及濃度 1∶21∶41∶8 1∶16 1∶32 結(jié)果樣品稀釋液 +++++++++++ - - 1∶10STS-D-京05 +++++++++++ - - 1∶10STS-D-京06 +++++++++++ - - 1∶10STS-D-張01(2) +++++++++++ - - 1∶10STS-D-張03 +++++++++++ - - 1∶10人陰性血清-1+++++++++++ - - 1∶10人陰性血清-2+++++++++++ - - 1∶10人陰性血清-3+++++++++++ - - 1∶10人陰性血清-4++++++++++++ - - 1∶12樣品中所含Vero細(xì)胞的蛋白量較高時(shí)，檢測過程中會(huì)出現(xiàn)非特異反應(yīng)，這種非特異反應(yīng)可通過增加SARS病人恢復(fù)期血清的抑制而確定。隨著Vero細(xì)胞蛋白量的下降，非特異反應(yīng)消失。
每次檢測樣品時(shí)，增加陽性血清的抑制。樣品稀釋液檢測待檢SARS抗原血凝效價(jià)≥1∶8，抑制后結(jié)果較抑制前低4倍時(shí)判定SARS抗原陽性。未出現(xiàn)陽性血清抑制，判定為SARS病毒抗原陰性。
實(shí)施例8反向間接血凝方法的應(yīng)用1.檢測Sino1株和Sino3株毒種制備的SARS滅活疫苗不同工序階段產(chǎn)品，結(jié)果見表七。
表七不同毒株的工序產(chǎn)品血凝效價(jià)毒種工藝產(chǎn)品1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶12 結(jié)果 抑制8 結(jié)果Sino SARS病毒滅活液++++ ++++ ++++ ++++ +++- - 1∶40 1∶41株 SARS病毒純化液++++ ++++ ++++ ++++ ++++ + - 1∶56 1∶6SARS病毒純化二峰 - - - - - - - - -Sino SARS病毒滅活液++++ ++++ ++++ ++++ ++ - - 1∶32 1∶33株 SARS病毒純化液++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ - 1∶64 1∶8SARS病毒純化二峰 - - - - - - - - -2.檢測SARS病毒抗原參比品20031009批凍干敏化紅細(xì)胞多次檢測SARS病毒抗原參比品，陽性血清對SARS病毒抗原參比品的抑制結(jié)果低于抑制前四倍以上，SARS病毒抗原參比品的血凝效價(jià)定為1∶75。結(jié)果見表八。
表八SARS病毒抗原參比品血凝效價(jià)1∶21∶41∶81∶16 1∶32 1∶64 1∶128 結(jié)果++++++++++++++++++++++++- 1∶96++++++++++++++++++++++ - 1∶64+++++++++++++++++++++++ - 1∶80+++++++++++++++++++++ - 1∶56+++++++++++++++++++++++ - 1∶80平均值1∶753.檢測SARS疫苗原液檢測20030709批、20030904批、20030906批和20030922批SARS疫苗原液的血凝效價(jià)，分別為1∶32、1∶22、1∶3和1∶28。結(jié)果見表九。
表九四批SARS疫苗原液的血凝效價(jià)疫苗原液批號 血凝效價(jià)(1∶)20030709批 3220030904批 2220030906批 320030922批 28
權(quán)利要求
1.特異性結(jié)合SARS病毒抗原的抗體，特別是多克隆抗體，優(yōu)選IgG，更優(yōu)選人IgG、猴IgG、兔IgG，最優(yōu)選兔IgG。
2.制備特異性結(jié)合SARS病毒抗原的抗體的方法，包括(a)用純化的SARS病毒抗原免疫動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物，如家兔或猴)，例如，采用0，14，21天三針免疫程序，將純化SARS抗原與弗氏完全佐劑等比混合后，2ml/次/只，肌肉注射；(b)從免疫動(dòng)物采血，分離出血清；(c)任選的，將血清滅活，例如經(jīng)56℃，30min滅活；和(d)任選的，用蛋白A法提取SARS抗體陽性血清中的IgG。
3.制備經(jīng)抗SARS病毒IgG致敏的紅細(xì)胞的方法，包括如下步驟(a)制備醛化紅細(xì)胞，優(yōu)選雙醛化紅細(xì)胞；(b)將醛化紅細(xì)胞鞣化；(c)用抗SARS病毒IgG致敏鞣化紅細(xì)胞；和(d)任選地，加入適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑，凍干。
4.權(quán)利要求3的方法，其中，步驟(a)的紅細(xì)胞是O型紅細(xì)胞，依次采用戊二醛和甲醛進(jìn)行醛化；和/或步驟(b)包括用1∶20000(質(zhì)量比)等體積新鮮配制鞣酸37℃作用15分鐘；和/或步驟(c)包括將適當(dāng)濃度的抗SARS病毒IgG和適當(dāng)濃度的步驟(b)的鞣化紅細(xì)胞在足以致敏紅細(xì)胞的時(shí)間和條件下接觸；優(yōu)選地，步驟(c)包括將4倍體積0.15mol/L pH6.4的PBS、1倍體積適當(dāng)濃度的IgG、1倍體積2.5％鞣化紅細(xì)胞混合均勻后，室溫振蕩結(jié)合1小時(shí)；和/或步驟(c)還可以包括用1％滅活正常兔血清-PBS洗滌2次，任選地，用0.15mol/L pH7.2的PBS配成1.25％的致敏紅細(xì)胞；和/或步驟(d)的保護(hù)劑是蔗糖和吐溫-20，優(yōu)選終濃度為10％(質(zhì)量比)蔗糖和萬分之三(體積比)吐溫-20。
5.權(quán)利要求4的方法，其中，步驟(c)的IgG優(yōu)選人IgG、猴IgG或兔IgG，更優(yōu)選兔IgG；和/或步驟(c)的IgG的濃度為0.01-2.0mg/ml，更優(yōu)選0.05-0.5mg/ml，最優(yōu)選0.1-0.2mg/ml。
6.經(jīng)抗SARS病毒IgG致敏的紅細(xì)胞。
7.權(quán)利要求6的紅細(xì)胞，其可通過權(quán)利要求3-5任意一項(xiàng)的方法制備。
8.用于測定SARS病毒抗原的方法，包括如下步驟(a)獲得待測樣品；和(b)采用權(quán)利要求5的致敏紅細(xì)胞通過反向間接血凝方法測定所述樣品是否存在SARS病毒抗原，優(yōu)選地，定量測定該樣品的血凝效價(jià)。
9.權(quán)利要求8的方法，還包括用血凝抑制試驗(yàn)測定非特異性反應(yīng)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中血凝抑制試驗(yàn)包括每次檢測樣品時(shí)，增加SARS抗體陽性血清(例如SARS病人恢復(fù)期血清)的抑制；當(dāng)樣品稀釋液檢測待測樣品血凝效價(jià)≥1∶4，優(yōu)選≥1∶8，SARS抗體陽性血清抑制后結(jié)果較抑制前低至少4倍時(shí)判定為SARS抗原陽性；未出現(xiàn)SARS抗體陽性血清抑制，判定為SARS病毒抗原陰性。
11.檢測SARS抗原的試劑盒，包含經(jīng)抗SARS病毒IgG致敏的紅細(xì)胞和任選的SARS抗體陽性血清。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及SARS病毒抗原的檢測。具體的，本發(fā)明涉及SARS病毒抗體、抗SARS病毒IgG致敏紅細(xì)胞、它們的制備方法、和SARS病毒抗原檢測方法和試劑盒等。本發(fā)明通過反向間接血凝法來檢測SARS病毒抗原。反向間接血凝法是用抗－SARS病毒IgG(例如兔抗－SARS病毒IgG)致敏的紅細(xì)胞(例如人“O”型紅細(xì)胞)檢測待檢樣品中的SARS病毒抗原。反向間接血凝方法可用于檢測SARS滅活疫苗制備過程中的SARS病毒抗原含量。
文檔編號C07K16/10GK1621416SQ20031011524
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月26日
發(fā)明者高強(qiáng), 張建三, 李靜, 李晶, 胡良湘, 李淑芬, 公雪杰, 尹衛(wèi)東 申請人:北京科興生物制品有限公司