專利名稱：特異性結(jié)合元件及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特異性結(jié)合元件及其在治療中的用途。具體而言，本發(fā)明涉及與CD55結(jié)合的特異性結(jié)合元件、它們的在調(diào)節(jié)補(bǔ)體激活和治療疾病例如腫瘤性疾病中的用途。
人的補(bǔ)體系統(tǒng)包括高度有效的識(shí)別和效應(yīng)物機(jī)制，它包括30種血清和細(xì)胞成分，包括活化蛋白、受體及正性和負(fù)性調(diào)節(jié)物。簡(jiǎn)單地說(shuō)，補(bǔ)體級(jí)聯(lián)包括一個(gè)觸發(fā)步驟、具有反饋回路的放大步驟以及最后的膜攻擊或裂解步驟。補(bǔ)體系統(tǒng)的核心成分是C3。通過(guò)經(jīng)典途徑或旁路途徑生成的C3b對(duì)于調(diào)理和裂解是關(guān)鍵的。當(dāng)補(bǔ)體C1通過(guò)它的C1q亞體與抗體連接形成免疫復(fù)合物時(shí)就觸發(fā)了經(jīng)典途徑。但是對(duì)于旁路途徑，沒(méi)有等效于抗體的觸發(fā)因素。更準(zhǔn)確地說(shuō)，它所處的狀態(tài)是連續(xù)低水平的活化，這是天然C3的硫酯的自發(fā)水解的結(jié)果。這造成C3與血漿或細(xì)胞表面上的非特異性受體分子的結(jié)合。這能造成C3轉(zhuǎn)化酶的生成以及反饋回路的形成。因?yàn)樗娘@著的促炎癥和破壞的能力，在液體相和周圍組織中都有意在預(yù)防補(bǔ)體激活的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。
有四種膜結(jié)合的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，分別被稱為補(bǔ)體受體1(CR1)、CD55、CD46和CD59(Liszewski et al 1996.Adv Immunol 61201-283)。通過(guò)以下之一實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)1.活化蛋白和酶復(fù)合物的自發(fā)衰變(即短的半衰期)2.對(duì)活化復(fù)合物的去穩(wěn)定化和抑制作用3.“活化的”成分的蛋白水解裂解。
CD46、CD55和CD59被廣泛地表達(dá)于許多組織中，包括表面上皮和腫瘤組織。相反地，CR1的表達(dá)被限定于外周血細(xì)胞，因此它并不直接參與對(duì)實(shí)體腫瘤的保護(hù)作用。
絕大多數(shù)腫瘤都是上皮來(lái)源的，盡管絕大多數(shù)的表面上皮表達(dá)補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，但是腫瘤表現(xiàn)出CD55、CD46和CD59的變異表達(dá)。大多數(shù)直結(jié)腸和甲狀腺癌表達(dá)高水平的三種補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(Niehans et al.，1996Am J Pathol 149129-142；Li et al.，2001 Br.J.Cancer 8480-86；Thorsteinsson，1998 APMIS 106869-878；Yamakawa et al.，1994 Cancer 732808-2817)。乳腺導(dǎo)管癌在表型上表現(xiàn)出最大的變異，一些腫瘤只表達(dá)一種抑制物，而其他腫瘤表達(dá)兩種或三種抑制物的不同組合(Niehans et al.，1996，見(jiàn)上；Thorsteinsson et al.，1998，見(jiàn)上)。腎細(xì)胞癌有著一種到三種抑制物的微量到中等的表達(dá)，通常是CD55和CD59(Niehans et al.，1996，見(jiàn)上)，而非小細(xì)胞肺癌和卵巢癌及宮頸癌通常表達(dá)CD59和CD46以及具有變異的CD55免疫反應(yīng)性(Niehans et al.，1996，見(jiàn)上；Bjorge et al.，1977 Cancer Immunol Immunother 42185-192；Simpson et al.，1997 Am JPathol 1511455-1467)。在所建立的細(xì)胞株中已經(jīng)得到了相似的結(jié)果(Bjorge et al.，1996，見(jiàn)上；Gorter et al 1986 Lab Invest 74 1；Juhl et al.，1997J.Surgical Oncol.64222-230；Li et al.，2001，見(jiàn)上)。
所有的三種補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白都被表達(dá)于血管上皮上。在炎癥期間，當(dāng)補(bǔ)體介導(dǎo)損傷的危險(xiǎn)可能被增加時(shí)，它們的特異性作用仍需要明確。促炎癥介質(zhì)TNFα、IL-1β和IFN-γ、以及MAC(膜攻擊復(fù)合物)和凝血酶也上調(diào)了內(nèi)皮細(xì)胞上的CD55，但不是CD46或CD59。這些結(jié)果說(shuō)明CD55在保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞避免炎癥和凝血期間的補(bǔ)體損傷上的關(guān)鍵的重要性。
此外，最近已經(jīng)顯示內(nèi)皮細(xì)胞回縮所暴露出的內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)是旁路補(bǔ)體途徑的強(qiáng)誘導(dǎo)物，它會(huì)釋放出刺激炎癥的過(guò)敏毒素。當(dāng)腫瘤經(jīng)常具有失調(diào)的內(nèi)皮以及暴露的血管壁時(shí)，腫瘤周圍可誘導(dǎo)補(bǔ)體激活。這可能是腫瘤細(xì)胞過(guò)度表達(dá)補(bǔ)體調(diào)節(jié)受體的原因之一。但是，已經(jīng)顯示腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的確能將CD55而不是CD46分泌到它們的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中(Hindmarsh and Marks，1998 J.Immunol.1606 128-6136)。Hindmarsh和Marks說(shuō)明腫瘤來(lái)源而非內(nèi)皮來(lái)源的CD55是功能活化的并能阻止C3b的沉積。但是，炎癥細(xì)胞因子不能上調(diào)基質(zhì)CD55的沉積。更最近地，本發(fā)明者已經(jīng)表明腫瘤和內(nèi)皮細(xì)胞都能將CD55和CD59沉積到細(xì)胞外基質(zhì)中，以及強(qiáng)血管生成生長(zhǎng)因子VEGF可顯著地上調(diào)后者(Liet al.，2001，見(jiàn)上)。VEGF所刺激的內(nèi)皮細(xì)胞所沉積的CD55是功能活化的。VEGF是例外的，因?yàn)樗侵两裎ㄒ灰环N被鑒定出能上調(diào)CD55在細(xì)胞表面的表達(dá)以及上調(diào)CD55在ECM中沉積的細(xì)胞因子。
因?yàn)榻^大多數(shù)腫瘤分泌高水平的VEGF以誘導(dǎo)血管生成，因此它們能刺激CD55在內(nèi)皮細(xì)胞上以及ECM內(nèi)的表達(dá)。令人感興趣的是，用抗CD55單克隆抗體對(duì)直結(jié)腸癌的免疫組化顯示出腫瘤間質(zhì)的強(qiáng)染色(Li etal.，2001，見(jiàn)上；Simpson et al.，1997，見(jiàn)上；Niehans et al.，1996，見(jiàn)上)和血管的強(qiáng)染色(Niehans et al.，1996，見(jiàn)上)。ECM內(nèi)所沉積的CD55是共價(jià)結(jié)合的，因此它們不能被強(qiáng)酸或堿所解離。
CD55相應(yīng)地取代CD2b和CD3b與來(lái)自經(jīng)典和旁路補(bǔ)體途徑的C3轉(zhuǎn)化酶結(jié)合。因此它能阻止CD3b的沉積并抑制下游的膜攻擊復(fù)合物的裝配。CD55具有細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，它由4個(gè)連續(xù)的短共有重復(fù)序列(SCR)區(qū)和細(xì)胞表面近端的富含蘇氨酸/絲氨酸結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成。它在第一和第二SCR結(jié)構(gòu)域之間具有單個(gè)N-糖基化位點(diǎn)以及它在富含蘇氨酸和絲氨酸區(qū)被重度O-糖基化。它通過(guò)糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定連接于細(xì)胞膜并被所有暴露于補(bǔ)體的細(xì)胞表達(dá)，這些細(xì)胞例如是紅細(xì)胞、白細(xì)胞、內(nèi)皮和上皮細(xì)胞。在血漿、唾液和尿液中也已經(jīng)檢測(cè)到少量CD55。這種可溶形式的生物學(xué)意義仍不清楚，因?yàn)樗鼜膩?lái)沒(méi)有表現(xiàn)為是功能活化的。最近已經(jīng)顯示HeLa細(xì)胞和HUVEC將CD55結(jié)合到它們的細(xì)胞外基質(zhì)中，以及這種共價(jià)連接的CD55能抑制CD3b的沉積和促炎癥的過(guò)敏毒素C3a的釋放(Hindmarsh and Marks，1998，見(jiàn)上)。
和使得腫瘤細(xì)胞易感于原位補(bǔ)體激活一樣，抑制補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白功能的抗體也可以使得腫瘤細(xì)胞易感于單克隆抗體所介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。嵌合的抗LewisY單克隆抗體(cH18A)介導(dǎo)了輕微的補(bǔ)體介導(dǎo)的兩種肺腺癌細(xì)胞株的細(xì)胞裂解。但是，阻斷CD46、CD55和CD59功能的抗體的加入顯著地增強(qiáng)了補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解。多種補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的阻斷抗體的應(yīng)用比任何的單一抗體都產(chǎn)生了更強(qiáng)的cH18A介導(dǎo)的裂解(Azuma etal.，1995.Scand J Immunol 42202-208)。一些小組已經(jīng)生成了雙特異性抗體，它具有一個(gè)導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞表面抗原的臂和另一個(gè)導(dǎo)向補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的功能結(jié)構(gòu)域的臂。導(dǎo)向HLA和CD55的SCR3的雙特異性抗體造成了C3b在腎臟腫瘤內(nèi)的沉積增強(qiáng)了92％。在同一研究中，類似的導(dǎo)向腎臟腫瘤抗原和CD55的SCR3的雙特異性抗體造成了C3b在腎臟腫瘤內(nèi)的沉積增加了25-400％，并使得細(xì)胞易感于補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解(Bloket al.，1998 J Immunol 1603437-3443)。最后，當(dāng)用嵌合的抗CD37單克隆抗體激活經(jīng)典補(bǔ)體途徑時(shí)，導(dǎo)向淋巴瘤特異性抗原和CD59功能結(jié)構(gòu)域的雙特異性Fab’伽馬構(gòu)建體將細(xì)胞裂解增加了3-5倍(Harris et al.，1997Clin.Exp.Immunol.107364-371)。
但是，盡管以往的研究已經(jīng)表明識(shí)別CD55的SCR3的單克隆抗體能部分地中和CD55，由此導(dǎo)致C3b沉積增強(qiáng)和MAC復(fù)合物裝配，但是這些抗體的每個(gè)抗體只能與C3轉(zhuǎn)化酶競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合SCR3并因此只部分中和CD55。CD55的分子構(gòu)建體已經(jīng)表明SCR3是CD55的活性結(jié)構(gòu)域以及SCR2和SCR4對(duì)于提供與C3結(jié)合的正確構(gòu)象是必需的。還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SCR1在補(bǔ)體衰變中的作用。但是，盡管SCR2對(duì)于提供與C3結(jié)合的正確構(gòu)象是必需的，但是對(duì)CD55的單個(gè)SCR結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體的研究已經(jīng)表明只有與SCR3結(jié)合的單克隆抗體而不是與SCR1或SCR3結(jié)合的抗體能中和CD55(Coyne et al，1992 J Immunol 149，2906)。
用單克隆抗體791T/36(Embleton et al 1981Br.J.Cancer 43582-587)在骨肉瘤、卵巢癌和直結(jié)腸癌中的成像研究成功地顯像了僅1cm3大小的病灶(Farrands et al 1982 Lancet 2397-400；Farrands et al 1983.J.of Boneand Joint Surg.65638-640；Armitage et al.，1985.Nucl Med Commun 6623-631)。此外，切除腫瘤的放射自顯影顯示了抗體在細(xì)胞表面和基質(zhì)的強(qiáng)定位(Armitage et al.，1984 Br J Surg 71407-412)。這些研究說(shuō)明抗CD55抗體能有效地定位于腫瘤，且沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)正常組織的任何毒性。特別的，沒(méi)有檢測(cè)到放射性標(biāo)記的抗體與血細(xì)胞的結(jié)合以及在內(nèi)皮或正常組織中只見(jiàn)到了背景水平的放射性標(biāo)記。被791T/36所識(shí)別的抗原最近被鑒定為CD55(Spendlove et al Eur J Immunol.302944-2953；Spendlove et al Cancer Res.592282-2286)。利用CD55/CD46嵌合構(gòu)建體可描繪出791T/36與CD55的前兩個(gè)SCR結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點(diǎn)，用肽分析顯示791T/36能與CD55的SCR1-2的三個(gè)不同的區(qū)結(jié)合。其中一個(gè)區(qū)在SCR1內(nèi)以及兩個(gè)區(qū)在SCR2內(nèi)。
WO00/5204闡述了一種利用裸抗體噬菌體文庫(kù)( antibodyphage library)制備抗體的方法，例如針對(duì)促衰變因子(DAF)的抗體。盡管該文件提及了這些抗體在腫瘤診斷或治療中的用途，但是除了一個(gè)推測(cè)的實(shí)施例外還沒(méi)有提供實(shí)施例，其中抗體LU30被建議用于評(píng)價(jià)DAF的過(guò)表達(dá)以及用于治療肺癌，特別是與細(xì)胞毒藥物聯(lián)合使用。
WO/04415描述了針對(duì)抗體791T/36的抗獨(dú)特型抗體105AD7的生成并推測(cè)了105AD7抗體的潛在的治療用途。
但是，至今還沒(méi)有證實(shí)除了抗SCR3抗體以外的抗CD55抗體的治療用途。用導(dǎo)向該分子的其他SCR的抗體的治療學(xué)研究已經(jīng)被限定于免疫交聯(lián)分子(見(jiàn)例如US 4916213(Xoma Corporation)、US 4925922(XomaCorporation)和Byers et al.1987 Cancer Res 475042-5046)。例如，Byers等描述了連接于蓖麻毒素A鏈的791T/36的研究，顯示它顯著地抑制了無(wú)胸腺小鼠內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)。因此在I期臨床試驗(yàn)中篩選了791T/36-RTA在進(jìn)展性直結(jié)腸癌患者中的作用(Byers et al 1989.Cancer Research 496153-6160)。但是，因?yàn)閯┝糠秶鷥?nèi)的毒性，該試驗(yàn)沒(méi)有成功。
令人驚訝的是，本發(fā)明現(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)，盡管以往研究已經(jīng)證實(shí)導(dǎo)向CD55的SCR1或SCR2的抗體對(duì)CD55沒(méi)有任何的中和作用，但是導(dǎo)向SCR1和SCR2兩者的抗體不僅能有效地中和CD55，而且還優(yōu)于SCR3中和抗體。
因此，在第一個(gè)部分，本發(fā)明提供了一種中和CD55的方法，包括施用與CD55的SCR1和SCR2都特異性結(jié)合的裸結(jié)合元件。
通過(guò)中和CD55，可以促進(jìn)補(bǔ)體沉積的增強(qiáng)。因此，在第二個(gè)部分，本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)補(bǔ)體沉積于組織的方法，包括施用與CD55的SCR1和SCR2都特異性結(jié)合的裸結(jié)合元件。
可以體外或體內(nèi)應(yīng)用本發(fā)明的方法。
如上所述，在許多腫瘤細(xì)胞的表面都?？砂l(fā)現(xiàn)CD55，它在此作用為抑制補(bǔ)體的沉積。通過(guò)中和腫瘤細(xì)胞上的這些分子，本發(fā)明的方法能進(jìn)行補(bǔ)體介導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)部分，提供了一種治療腫瘤的方法，包括給有此需要的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的與CD55的SCR1和SCR2特異性結(jié)合的裸結(jié)合元件。
在另一個(gè)部分，提供了，(i)一種與CD55的SCR1和SCR2都結(jié)合的裸結(jié)合元件，或(ii)一種編碼所述的結(jié)合元件的核酸，在制備用于中和CD55的藥物中的用途。
在另一個(gè)部分，提供了一種與SCR1和SCR2都結(jié)合的裸結(jié)合元件在治療腫瘤中的用途。
在另一個(gè)部分，提供了，(i)一種與CD55的SCR1和SCR2都結(jié)合的裸結(jié)合元件，或(ii)一種編碼所述的結(jié)合元件的核酸，在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途。
本發(fā)明也提供了用于治療腫瘤的藥物組合物，其中所述組合物包括與CD55的SCR1和SCR2都結(jié)合的裸結(jié)合元件。
特異性結(jié)合元件“結(jié)合元件”在此是一對(duì)具有彼此的結(jié)合特異性的分子中的一個(gè)元件。因此結(jié)合元件是一種特異性結(jié)合元件。結(jié)合對(duì)的元件可以是天然來(lái)源的或完全或部分合成生成的。分子對(duì)的一個(gè)元件在其表面上具有一個(gè)區(qū)域，該區(qū)域可以是一個(gè)突起或一個(gè)腔，以及可以特異性地結(jié)合于并因此互補(bǔ)于一對(duì)分子的另一個(gè)元件的特殊的空間和極性結(jié)構(gòu)。因此，該分子對(duì)的元件具有彼此特異性結(jié)合的性能。結(jié)合對(duì)的類型的實(shí)例是抗原-抗體、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受體、受體-配體、酶-底物。本發(fā)明涉及的是抗原-抗體類型反應(yīng)，不過(guò)，本發(fā)明的以及用于本發(fā)明的結(jié)合元件可以是任一與CD55的SCR1和SCR2都結(jié)合的成分。
“裸”在此意思是本發(fā)明的或用于本發(fā)明的結(jié)合元件沒(méi)有結(jié)合(例如綴合)于任何具有抗腫瘤性能的藥劑，例如蓖麻毒素。
抗體“抗體”是免疫球蛋白，無(wú)論其是天然的或部分或完全合成生成的。該名詞也覆蓋所有的具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽、蛋白或肽，該結(jié)合區(qū)域就是或同源于抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這些都可以來(lái)源于天然來(lái)源、或它們可以是部分或完全合成生成的?？贵w的實(shí)例是包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域例如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd和雙體的免疫球蛋白同型或它們的同型的亞型和片段。
本發(fā)明的結(jié)合元件可以是抗體例如單克隆或多克隆抗體、或其片段?？贵w的恒定區(qū)可以是任何類型，包括但不限定于人IgG、IgA、IgM、IgD和IgE型?？贵w可以屬于任何亞型例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgG1是優(yōu)選的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體是保藏于ATCC的保藏號(hào)為HB9173的細(xì)胞株所產(chǎn)生的791T/36。
因?yàn)榭梢杂迷S多方法修飾抗體，因此名詞“抗體”應(yīng)當(dāng)被理解為覆蓋任何具有有著所需的特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合元件或物質(zhì)。因此，該名詞覆蓋了抗體片段、衍生物、抗體的功能等效物和同源物，包括任何包括免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，無(wú)論其是天然的或完全或部分合成的。因此也包括那些嵌合分子，所述嵌合分子包括融合于另一種多肽的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其等效物。在EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述了嵌合抗體的克隆和表達(dá)。
已經(jīng)顯示完整抗體的片段可以實(shí)現(xiàn)結(jié)合抗原的功能。這些結(jié)合片段的實(shí)例是(i)由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fab片段；(ii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fd片段；(iii)由單一抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段；(iv)dAb片段(Ward，E.S.et al.，Nature 341544-546(1989))，它由VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；(v)分離的CDR區(qū)；(vi)F(ab’)2片段，包括兩個(gè)連接的Fab片段的二價(jià)片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中用容許兩個(gè)區(qū)連接形成一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的肽交聯(lián)劑連接VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域(Bird et al.，Science242423-426(1988)；Huston et al.，PNAS USA 855879-5883(1988))；(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)以及(ix)“雙體”，基因融合所構(gòu)建的多價(jià)或多特異性的片段(WO94/13804；P.Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448(1993))。
用于本發(fā)明的抗體或多肽的片段，例如791T/36抗體的片段通常的意思是一組至少5到7個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸殘基，常至少是為7到9個(gè)連續(xù)氨基酸、通常是至少約9到13個(gè)連續(xù)氨基酸，更優(yōu)選地是至少約20到30個(gè)或更多的連續(xù)氨基酸以及最優(yōu)選地是最少約30到40個(gè)或更多的連續(xù)氨基酸。一個(gè)優(yōu)選的片段組是那些包括所有或部分單克隆抗體791T/36的CDR區(qū)的組。一個(gè)優(yōu)選的片段組是那些包括所有或部分單克隆抗體791T/36的CDR區(qū)的組。
這樣的一種抗體或多肽、或791T/36抗體的片段的“衍生物”意思是經(jīng)不同的蛋白的氨基酸序列所修飾的抗體或多肽，例如經(jīng)過(guò)處理編碼蛋白的核酸或經(jīng)變更蛋白本身。天然氨基酸序列的這些衍生物可以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、添加、刪除和/或取代，優(yōu)選地假定肽具有抗CD55活性例如CD55中和活性。優(yōu)選地這些衍生物包括25個(gè)或更少的氨基酸的插入、添加、刪除和/或取代，更優(yōu)選地是15個(gè)或更少的氨基酸，甚至更優(yōu)選地是10個(gè)或更少的氨基酸，更優(yōu)選地仍是4個(gè)或更少的氨基酸以及最優(yōu)選地僅僅是1個(gè)或2個(gè)氨基酸。
名詞“抗體”包括已經(jīng)被“人源化”的抗體。本領(lǐng)域已知用于制備人源化抗體的方法。例如，在Winter的美國(guó)專利No.5,225,539中描述了這些方法。人源化抗體可以是具有單克隆抗體例如791T/36的高變區(qū)以及人抗體的恒定區(qū)的修飾抗體。因此，結(jié)合元件可以包括人類恒定區(qū)。
除高變區(qū)外的可變區(qū)也可以來(lái)自于人抗體的可變區(qū)和/或也可以來(lái)自于單克隆抗體例如791T/36。在這樣的情況下，整個(gè)可變區(qū)可以來(lái)自鼠單克隆抗體791T/36，且這種抗體可被認(rèn)為是嵌合的。本領(lǐng)域已知用于制備嵌合抗體的方法。這些方法包括例如在Boss(Celltech)和Cabilly(Genentech)的美國(guó)專利所描述的方法。相應(yīng)地見(jiàn)美國(guó)專利No.4,816,397和4,816,567。
取單克隆和其他抗體以及使用重組DNA技術(shù)的技術(shù)生產(chǎn)保持了原始抗體的特異性的其他抗體或嵌合分子是可能的。這些技術(shù)可以包括將編碼免疫球蛋白可變區(qū)或抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的DNA引入到不同的免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加骨架區(qū)中。見(jiàn)例如EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400。生產(chǎn)抗體的雜交瘤或其他細(xì)胞可以進(jìn)行遺傳學(xué)突變或其他變化，這可能會(huì)或可能不會(huì)改變所產(chǎn)抗體的結(jié)合特異性。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合元件結(jié)合于如

圖1b中所示的序列CD55 SCR1(第83-93位氨基酸)和SCR2(第101-112位氨基酸和第145-157位氨基酸)。
結(jié)合元件可以包括保藏于ATCC的保藏號(hào)為HB9173的細(xì)胞株所產(chǎn)的抗體或其片段的一個(gè)或多個(gè)CDR。
如上所述，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合元件是保藏于ATCC的保藏號(hào)為HB9173的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體791T/36。對(duì)“791T/36”的引用包括那些與791T/36具有顯著同源性的序列。791T/36的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和其他抗體的CDR之間的同源性程度優(yōu)選地是至少60％，更優(yōu)選地是70％，進(jìn)一步優(yōu)選地是80％，甚至更優(yōu)選地是90％或最優(yōu)選地是95％。
通過(guò)對(duì)比用于最佳比較目的的序列(例如，可以在第一個(gè)序列中引入缺口以最好地對(duì)比序列)以及比較相應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸殘基或核苷酸可以測(cè)定出兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的相同性百分比。“最好對(duì)比”是造成最高相同性百分比的兩個(gè)序列的對(duì)比。通過(guò)在被比較序列中的相同的氨基酸殘基或核苷酸的數(shù)目測(cè)定出相同性百分比(即，相同性％＝相同位點(diǎn)的數(shù)目/位點(diǎn)的總數(shù)目×100)。
利用本領(lǐng)域人員已知的數(shù)學(xué)算法可以完成兩個(gè)序列之間的相同性百分比的測(cè)定。用于比較兩個(gè)序列的數(shù)學(xué)算法的實(shí)例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268的算法，經(jīng)Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877改進(jìn)的算法。Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215403-410的NBLAST和XBLAST程序已經(jīng)結(jié)合到這樣的算法中。用NBLAST程序(積分＝100，字長(zhǎng)＝12)可以進(jìn)行BLAST核苷酸搜索以得到與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。用XBLAST程序(積分＝50，字長(zhǎng)＝3)可以進(jìn)行BLAST蛋白搜索以得到與本發(fā)明的蛋白分子同源的氨基酸序列。為了得到用于比較目的的缺口對(duì)比，可以使用缺口的BLAST，如在Altschul et al.(1997)NucleicAcids Res.253389-3402中所描述的那樣。同樣地，可以用PSI-Blast進(jìn)行反復(fù)搜索，這可檢測(cè)兩個(gè)分子(Id.)之間的遠(yuǎn)源關(guān)系。當(dāng)使用BLAST、缺口的BLAST、和PSI-Blast程序時(shí)，可以使用相應(yīng)程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。見(jiàn)http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
用于比較序列的所使用的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)實(shí)例是Myers & Miller，CABIOS(1989)的算法。為CGC序列對(duì)比軟件包的一部分的ALIGN(2.0版)已經(jīng)結(jié)合到這樣的算法中。本領(lǐng)域已知的用于序列分析的其他算法包括如在Torellis & Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.，103-5所描述的ADVANCE和ADAM；和在Pearson & Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.852444-8所描述的FASTA。在FASTA中，ktup是設(shè)定搜索的敏感性和速度的控制選項(xiàng)。
如果存在高度的序列相同性，則在氨基酸序列之間有著相當(dāng)少的差異。因此，例如，它們可以是少于20個(gè)、少于10個(gè)或甚至少于5個(gè)氨基酸的差異。
本發(fā)明已經(jīng)表明可以將導(dǎo)向CD55的SCR1和SCR2的抗體例如791T/36抗體以及它的片段和衍生物用作為滅活CD55并使得腫瘤細(xì)胞易感于補(bǔ)體介導(dǎo)的攻擊的腫瘤治療劑。這可被抗體在癌癥患者的腫瘤內(nèi)的定位以及患者的隨后的存活的增加所例證(見(jiàn)實(shí)施例)。因此，本發(fā)明還提供了與CD55的SCR1和SCR2抗原決定簇都結(jié)合的791T/36或“791T/36”家族的其他多肽的裸“片段”或“衍生物”在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
可以單獨(dú)地或與一種或多種其他的藥劑一起施用所述結(jié)合元件。因此，本發(fā)明還提供了包括與CD55的SCR1和SCR2都結(jié)合的裸結(jié)合元件以及活性藥劑的產(chǎn)物，用作在治療癌癥上同時(shí)、分開(kāi)或依次使用的組合制劑。活性藥劑可以包括化療藥劑包括阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氫葉酸、伊立替康、絲裂霉素C、奧沙利鉑、雷替曲塞、他莫昔芬和順鉑，它們與本發(fā)明的結(jié)合元件有著協(xié)同作用。其他活性藥劑可以包括適合劑量的鎮(zhèn)痛藥物例如非甾體類抗炎藥物(例如阿司匹林、對(duì)乙酰氨基酚、布洛芬或酮洛芬)或阿片制劑例如嗎啡、或止吐藥。在其他的實(shí)施方案中，活性藥劑可以是另一種結(jié)合元件。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以聯(lián)合一種或多種其他的結(jié)合元件施用所述結(jié)合元件。這些結(jié)合元件可以包括但不限定于抗CD20抗體例如利妥康昔(美羅華)(Biogen IDEC(Cambridge，MA，USA))、抗VEGF抗體例如avastin(貝伐單抗)(Genentech(South San Francisco，CA，USA)/Roche(Basel，Switzerland))、抗CD171A抗體例如Panorex(依決洛單抗)(Centocor(Malvern，PA，USA)/Glaxo SmithKline(Uxbridge，UK))、抗CEA抗獨(dú)特型mAb例如CeaVac(Titan Pharmaceuticals(South San Francisco，CA，USA))、抗EGFR抗體例如Erbitux(西妥昔單抗)(ImClone(New York，USA)/BristolMyers Squibb(New York，USA)，Merck(Whitehouse Station，NJ，USA))、抗HMFG抗獨(dú)特型mAb例如TriAb(Titan Pharmaceuticals(South SanFrancisco，CA，USA))、抗EGFR抗體例如ABX-EGF(Abgenix(Fremont，CA，USA)/Amgen Thousand Oaks，CA))和/或抗HER2抗體例如赫賽汀(Genentech(South San Francisco，CA，USA))。
優(yōu)選地，活性藥劑與結(jié)合元件有協(xié)同作用。結(jié)合元件協(xié)同活性藥劑增強(qiáng)殺滅腫瘤的能力可能不是歸因于免疫效應(yīng)物機(jī)制，而可能是容許補(bǔ)體沉積增強(qiáng)和補(bǔ)體裂解的滅活CD55的直接結(jié)果。本發(fā)明的結(jié)合元件可攜帶有可檢測(cè)的標(biāo)記。
治療“治療”包括能對(duì)人或非人的動(dòng)物有益的任何方案。治療可以是針對(duì)已存在的病變或可以是預(yù)防性的(預(yù)防性治療)。治療可以包括治愈、緩解或預(yù)防作用。
“治療癌癥”包括治療癌癥生長(zhǎng)所引起的病變以及包括治療治療腫瘤生長(zhǎng)或腫瘤?？杀槐景l(fā)明的系統(tǒng)所治療的腫瘤的實(shí)例是例如肉瘤包括成骨肉瘤和軟組織肉瘤、以及癌例如乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、子宮癌、宮頸癌和卵巢癌、淋巴瘤包括霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、Wilms瘤和白血病包括急性淋巴細(xì)胞白血病和急性粒細(xì)胞白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。
結(jié)合元件可以與癌細(xì)胞或組織包括腫瘤或非腫瘤細(xì)胞上的CD55的SCR1和SCR2結(jié)合，中和CD55并增強(qiáng)補(bǔ)體沉積和補(bǔ)體介導(dǎo)的這些細(xì)胞的裂解。
本發(fā)明的組合物和方法可被特別地用于治療已有的癌癥以及用于預(yù)防經(jīng)最初治療或手術(shù)后的癌癥的復(fù)發(fā)。
施用可以單獨(dú)施用本發(fā)明的結(jié)合元件，但優(yōu)選地作為藥物組合物施用本發(fā)明的結(jié)合元件，組合物通常包括根據(jù)預(yù)定的施用途徑所選擇的適合的藥用賦形劑、稀釋劑或載體?？梢酝ㄟ^(guò)任何適合的途徑將本發(fā)明的結(jié)合元件施用給所需治療的患者。精確的劑量依賴于多種因素，包括元件的精確性質(zhì)(例如，整個(gè)抗體、片段或雙體)、以及附著于元件的可檢測(cè)標(biāo)記的性質(zhì)。
一些適合的施用途徑包括(但不限定于)口服、直腸、鼻、局部(包括含服和舌下)、陰道或腸外(包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)和硬膜外)施用。靜脈內(nèi)施用是優(yōu)選的。
預(yù)期注射(靜脈內(nèi))將是用于治療性施用組合物的主要途徑，不過(guò)也可以考慮經(jīng)導(dǎo)管或其他外科管路輸送。在重構(gòu)粉末劑型后可以使用液體劑型。
對(duì)于靜脈內(nèi)注射或患病部位的注射，活性成分可以是無(wú)致熱原以及具有適合的pH值、等滲性和穩(wěn)定性的可腸外注射的水溶液的形式。本領(lǐng)域人員利用等滲的賦形劑例如氯化鈉注射液、林格注射液、乳酸林格注射液能很好地制備適合的溶液。可以按需地包括防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其他添加劑。
用于口服施用的藥物組合物可以是片劑、膠囊、粉末或液體形式。片劑可以包括液體載體例如水、石油、動(dòng)物或植物油、礦物油或合成油?？梢园ㄉ睇}水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或甘油例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
也可以經(jīng)微球、脂質(zhì)體、其他的微粒輸送系統(tǒng)或放置于特定組織包括血液中的持續(xù)釋放劑型施用組合物。持續(xù)釋放載體的合適的實(shí)例包括shared articles形式的半透性聚合物基質(zhì)，例如栓劑或微膠囊?？芍踩氲幕蛭⒛z囊的持續(xù)釋放基質(zhì)包括聚乳酸化合物(美國(guó)專利No.3,773,919；EP-A-0058481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酰胺的共聚物(Sidman et al，Biopolymers 22(1)547-556，1985)、聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)或乙炔乙酸乙烯酯(Langer et al，J.Biomed.Mater.Res.15167-277，1981，和Langer，Chem.Tech.1298-105，1982)。用熟知的方法制備含有多肽的脂質(zhì)體DE3,218,121A；Epstein et al，PNAS USA，823688-3692，1985；Hwang et al，PNAS USA，774030-4034，1980；EP-A-0052522；E-A-0036676；EP-A-0088046；EP-A-0143949；EP-A-0142541；JP-A-83-11808；US專利Nos 4,485,045和4,544,545。脂質(zhì)體一般是小的(約200-800埃)單層類型，其中脂類內(nèi)容物大于約30mol％膽固醇，調(diào)整所選的比例使得達(dá)到最佳的多肽漏出速度。
在Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Oslo，A.(ed)，1980中可找到上述的技術(shù)和方案的實(shí)例以及本發(fā)明可使用的其他技術(shù)和方案。
可用將組合物局部施用到腫瘤部位或其他所需的部位或可以用導(dǎo)向腫瘤或其他細(xì)胞的方式輸送組合物。通過(guò)使用導(dǎo)向系統(tǒng)例如抗體或細(xì)胞特異性配體可以用導(dǎo)向治療來(lái)輸送更特異于特定類型的細(xì)胞的活性藥劑。多種原因都可能需要導(dǎo)向治療，例如如果藥劑具有不可接受的毒性，或它需要太高的劑量，或它不能進(jìn)入靶細(xì)胞。
藥物組合物如上所述，本發(fā)明擴(kuò)展到一種用于治療癌癥的藥物組合物，組合物包括與CD55的SCR1和SCR2都結(jié)合的裸結(jié)合元件。除活性成分外，本發(fā)明的和用于本發(fā)明的藥物組合物可以包括藥用可接受的賦形劑、載體、緩沖穩(wěn)定劑或其他本領(lǐng)域人員熟知的材料。這些材料應(yīng)當(dāng)是無(wú)毒的并且應(yīng)當(dāng)不干擾活性成分的效力。載體或其他材料的精確性質(zhì)將依賴于施用途徑，施用途徑可以是口服、經(jīng)注射例如經(jīng)靜脈內(nèi)注射。
劑型可以是一種液體，例如含有pH值為6.8-7.6的非磷酸緩沖液的生理鹽水溶液，或可液化的粉末。
劑量?jī)?yōu)選地將“治療有效量”的組合物施用給個(gè)體，就是足以顯出對(duì)個(gè)體的益處的量。所施用的確切量、施用的速度以及時(shí)程將依賴于所治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重度。治療處方例如決定劑量等最終是在普通執(zhí)業(yè)醫(yī)師和其他醫(yī)師的責(zé)任和判別的范圍內(nèi)，并通常要考慮到所治療的疾病、個(gè)體患者的病變、輸送部位、施用方法以及執(zhí)業(yè)醫(yī)師所知道的其他因素。
最佳的劑量可以被醫(yī)師根據(jù)各種參數(shù)所確定，參數(shù)包括例如年齡、性別、體重、所治療的病變的嚴(yán)重度、所施用的活性成分以及施用途徑。一般地，需要容許飽和受體的血清濃度的多肽和抗體。超過(guò)約0.1nM的濃度通常是足夠的。例如，100mg/m2劑量的抗體提供了近8天的近20nM血清濃度。
作為一般性的指南，可以每周給予10-300mg/m2量的抗體劑量。應(yīng)當(dāng)在更頻繁的間隔內(nèi)使用等效劑量的抗體片段以保持血清水平超過(guò)容許CD55被飽和的濃度。
結(jié)合元件的生產(chǎn)可以完全地或部分地通過(guò)化學(xué)合成生成本發(fā)明的或用于本發(fā)明的結(jié)合元件。根據(jù)已很好確立的、標(biāo)準(zhǔn)的液體或優(yōu)選的固相肽合成方法可以容易地制備結(jié)合元件，在很多地方都可得到對(duì)這些方法的綜合描述(見(jiàn)，例如J.M.Stewart and J.D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，2ndedition，Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois(1984)，in M.Bodanzsky and A.Bodanzsky，The Practice of Peptide Synthesis，SpringerVerlag，New York(1984)；and Applied Biosystems 430A Users Manual，ABIInc.，F(xiàn)oster City，California)，或者可以用液相方法或固相、液相和溶液化學(xué)的任一組合制備溶液中的組合元件，例如通過(guò)首先完成相應(yīng)的肽部分，然后如果需要并合適的在去除任何現(xiàn)有的保護(hù)性基團(tuán)后，通過(guò)相應(yīng)的碳酸或磺酸或它們的反應(yīng)性衍生物的反應(yīng)引入殘基X。
另一個(gè)生產(chǎn)適用于本發(fā)明的結(jié)合元件的常用方法是通過(guò)使用表達(dá)系統(tǒng)中的核酸來(lái)表達(dá)編碼結(jié)合元件的核酸。因此，本發(fā)明還提供了一種編碼與CD55的SCR1和SCR2都結(jié)合的裸結(jié)合元件的分離的核酸在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
用于本發(fā)明的核酸可以包括DNA或RNA并可以是完全或部分合成的。在優(yōu)選的部分，用于本發(fā)明的核酸編碼如上定義的本發(fā)明的結(jié)合元件。本領(lǐng)域熟練人員能確定如何進(jìn)行核酸的取代、刪除和/或添加而仍將提供本發(fā)明的這些結(jié)合元件。
熟練人員利用在此所含的信息和參考文獻(xiàn)以及本領(lǐng)域已知的技術(shù)可以容易地制備編碼用于本發(fā)明的核酸序列(例如，見(jiàn)Sambrook，F(xiàn)ritschandManiatis，″Molecular Cloning″，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989，和Ausubel et al，Short Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，1992)，條件是可得到核酸的序列和克隆。這些技術(shù)包括(i)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增這些例如基因組來(lái)源的核酸樣品，(ii)化學(xué)合成，(iii)制備cDNA序列?？梢陨删幋a抗體片段的DNA并以任何本領(lǐng)域人員所熟知的方法對(duì)其進(jìn)行使用，包括通過(guò)取得編碼DNA、鑒定被表達(dá)部分的每一側(cè)的適合的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)、以及從DNA中切到所述的部分。然后可將該部分可操縱地連接到標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)化可獲得的表達(dá)體系中的適合的啟動(dòng)子上。另一個(gè)重組方法是用適合的PCR引物擴(kuò)增DNA的相關(guān)部分。例如用定向誘變可以進(jìn)行對(duì)該序列的修飾，造成表達(dá)被修飾的肽或根據(jù)所用的宿主細(xì)胞中的密碼子參數(shù)選擇表達(dá)核酸。
核酸可以被包括于質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄盒或表達(dá)盒形式的構(gòu)建體中，構(gòu)建體包括至少一種上述的核酸。構(gòu)建體可以被包括在包括一種或多種上述的構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞內(nèi)。通過(guò)在適宜的條件下培養(yǎng)含有核酸的重組宿主細(xì)胞常可實(shí)現(xiàn)表達(dá)。在通過(guò)表達(dá)特異性結(jié)合元件的生產(chǎn)后，可以用任何適宜的技術(shù)分離并純化，然后按需使用結(jié)合元件。
可以提供分離和/或純化于它們的天然環(huán)境的、基本純凈或均質(zhì)形式的用于本發(fā)明的編碼結(jié)合元件的核酸分子和載體，或?qū)τ诤怂?，可以是游離或基本游離于除編碼具有所需功能的多肽的序列以外的核酸或基因來(lái)源。
在各種不同的宿主細(xì)胞內(nèi)克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)是熟知的。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母菌和桿狀病毒系統(tǒng)。用于表達(dá)異源性多肽的本領(lǐng)域可獲得的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、NSO鼠黑色素瘤細(xì)胞和許多其他的細(xì)胞。常用的優(yōu)選的細(xì)菌宿主是大腸桿菌。
在本領(lǐng)域已經(jīng)很好地建立了抗體和抗體片段在原核細(xì)胞例如大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)。見(jiàn)例如Pluckthun，Bio Technology 9545-551(1991)的綜述。作為用于生產(chǎn)結(jié)合元件的一種選擇，本領(lǐng)域人員也可獲得在真核細(xì)胞培養(yǎng)物中的表達(dá)，見(jiàn)最近的綜述，例如Reff，Curr.Opinion Biotech.4573-576(1993)；Trill etal.，Curr.Opinion Biotech.6553-560(1995)。
或者，利用本領(lǐng)域已知的方法可以在轉(zhuǎn)基因生物體中生產(chǎn)用于本發(fā)明的特異性結(jié)合元件，生物體是例如哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、魚(yú)、昆蟲(chóng)或植物。在這些轉(zhuǎn)基因方法中，通過(guò)包括但不限定于直接注射、電穿孔、核轉(zhuǎn)移技術(shù)的方法或通過(guò)使用載體例如病毒載體可以將編碼結(jié)合元件的核酸引入到細(xì)胞或胚胎內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在鳥(niǎo)類組織中生產(chǎn)特異性結(jié)合元件，優(yōu)選地是在鳥(niǎo)蛋中，例如在2002年11月27日提交的GB0227645.9以及隨后的要求其優(yōu)先權(quán)的PCT申請(qǐng)書(shū)中闡述了該方法。
能選擇或構(gòu)建含有適宜的調(diào)節(jié)序列的合適載體，調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子序列、終止子序列、多腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記物基因和其他適宜的序列。載體可以是質(zhì)粒、病毒例如噬菌體或噬菌粒。對(duì)于詳細(xì)的描述，見(jiàn)例如Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。在Ausubel等編，Short Protocols in Molecular Biology，2nd Edition，John Wiley & Sons(1992)中詳細(xì)描述了許多處理核酸的技術(shù)和方案，例如制備核酸構(gòu)建體、誘變、測(cè)序、將DNA導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)和基因表達(dá)、以及蛋白分析。
用任何合適的方法可以將核酸導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)。導(dǎo)入可采用任何可獲得的技術(shù)。對(duì)于真核細(xì)胞，合適的技術(shù)可以包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-Dextran、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和利用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒例如牛痘的轉(zhuǎn)導(dǎo)或桿狀病毒對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞，合適的技術(shù)可以包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和使用噬菌體的轉(zhuǎn)染。
可以用標(biāo)記物基因例如抗生素耐藥或敏感基因鑒定出含有相關(guān)核酸的克隆，這在現(xiàn)有技術(shù)中是熟知的。
緊隨著導(dǎo)入的是引起或容許核酸的表達(dá)，例如在利于表達(dá)該基因的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
核酸可以被整合到宿主細(xì)胞的基因組(例如染色體)內(nèi)。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過(guò)引入促進(jìn)與基因組重組的序列可以促進(jìn)整合。核酸可以是在細(xì)胞內(nèi)的染色體外的載體，或?qū)?xì)胞是可辨別的異源的或外源性的核酸。
分析本發(fā)明還提供了用于鑒定其他藥劑的分析法，所述藥劑例如為用于增強(qiáng)補(bǔ)體沉積于細(xì)胞樣品或組織的抗體或任選地用于治療癌癥的抗體。
在一個(gè)優(yōu)選的部分，所述分析包括一種用于鑒定能抑制CD55的藥劑的分析方法，包括步驟a)將候選藥劑與CD55的SCR1和SCR2的至少一部分接觸；以及b)確定所述的候選藥劑與SCR1和SCR2兩者的結(jié)合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，分析方法包括用于鑒定能抑制CD55的藥劑的方法，包括
(a)在存在裸結(jié)合元件的條件下，將候選藥劑與CD55的SCR1和SCR2的至少一部分接觸；其中在不存在候選藥劑時(shí)，裸結(jié)合元件能結(jié)合CD55的SCR1和SCR2兩者；以及(b)確定候選藥劑對(duì)裸結(jié)合元件與CD55的SCR1和SCR2結(jié)合的抑制程度。
分析還可以包括選擇與CD55的SCR1和SCR2都結(jié)合的候選藥劑的步驟；和/或確定在存在和不存在候選藥劑時(shí)沉積于細(xì)胞樣品中的補(bǔ)體的量。
在本發(fā)明的分析的優(yōu)選的實(shí)施方案中，CD55的SCR1和SCR2部分包括圖1b所示的序列的第83-93、101-112和145-157位氨基酸。
本發(fā)明還提供了一種篩選方法，包括篩選能抑制裸結(jié)合元件與CD55的SCR1和SCR2都結(jié)合的候選藥劑庫(kù)的步驟。
本發(fā)明的分析可以是一種篩選，其中測(cè)試大量的候選藥劑。因此，可以使用任何本領(lǐng)域人員已知的用于篩選化合物的合適技術(shù)。篩選可以是高通量的篩選。例如，WO84/03564描述了一種方法，其中在固相基質(zhì)上合成大量肽以及將肽與一種藥劑反應(yīng)并洗滌。分析結(jié)合的部分。
本發(fā)明也涉及競(jìng)爭(zhēng)性藥物篩選分析的應(yīng)用，其中能結(jié)合CD55的SCR1和2的中和抗體例如791T/36特異性地競(jìng)爭(zhēng)測(cè)試化合物與CD55的SCR1和2的結(jié)合。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明的篩選方法所鑒定的藥劑以及它們?cè)谥苽溆糜谥委煱┌Y的藥物中的用途。
對(duì)于其他各個(gè)方面，本發(fā)明的每一個(gè)方面的優(yōu)選特征可進(jìn)行必要的改動(dòng)。
現(xiàn)在將在下面的非限制性實(shí)施例中描述本發(fā)明。參照于如下的附圖圖1a代表105AD7雜交瘤的VK和VH cDNA的翻譯CDR序列。大寫(xiě)字母代表CDR區(qū)，小寫(xiě)字母代表鄰近的骨架氨基酸。
圖1b表示CD55的三個(gè)CDR肽的對(duì)比。氨基酸編號(hào)來(lái)自于包括導(dǎo)向序列的CD55的全長(zhǎng)序列。在隨后的分析中所用的CD55肽用下劃線表示。Bullets(·)代表氨基酸相同性，其中具有相似的理化性能的氨基酸被標(biāo)記為()。
圖2說(shuō)明了C3b補(bǔ)體沉積分析。將791T細(xì)胞與作為補(bǔ)體來(lái)源的人血清一起孵育。在存在阻斷抗體(216)、非阻斷抗體(220)或測(cè)試抗體791T/36時(shí)，用兔抗C3b FITC標(biāo)記的抗體測(cè)定C3b沉積。用FACScan流式細(xì)胞儀定量熒光并用平均線性熒光(MLF)表示。
實(shí)施例1 CD55中和分析用免疫親和性-基質(zhì)純化從溶解于辛基-糖苷的791T細(xì)胞中得到純化的CD55抗原。用根據(jù)從純化抗原中所得到的蛋白序列數(shù)據(jù)的引物克隆并測(cè)序CD55 cDNA(Spendlove et al.，1999 Cancer Res 59，2282)。所得到的DNA序列與Caras等所鑒定的序列一致，并保存在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中(登記號(hào)為No.M31516)。
細(xì)胞791T是骨肉瘤細(xì)胞株，它生長(zhǎng)于加有10％熱滅活的胎牛血清的RPMI(Gibco，BRL，Paisley，and UK)中。
單克隆抗體先前已經(jīng)報(bào)道了單克隆抗體791T/36(抗791T gp72的IgG2b；Embleton et al 1981 Br.J.Cancer 43582-587)、BRIC 216(抗CD55的SCR3的IgGl；Tate et al 1989 Biochem J 261，489)、BRIC 220(抗CD55的SCR1的IgGl；Tate et al 1989 Biochem J 261，489)、BRIC 110(抗CD55的SCR2的IgGl；Spring et al.，1987 Immunology 62 377；Coyne et al，1992 JImmunol 149，2906)。從Blood Group Reference laboratory(Bristol，UK)中購(gòu)得BRIC抗體。
方法用含有10％FCS的培養(yǎng)基洗滌過(guò)度表達(dá)CD55的791T腫瘤細(xì)胞并將其以每100μl 1×105個(gè)細(xì)胞的密度重懸。將濃度為50μg/ml的第一抗體與3×樣品體積(3×105個(gè)細(xì)胞/300μl)一起孵育。第一抗體是陽(yáng)性對(duì)照抗體216(抗SCR3)、陰性對(duì)照抗體220(抗SCR1)和測(cè)試抗體791T/36(抗SCR1和2)。在用PBS洗滌前，在4℃下孵育細(xì)胞和抗體1個(gè)小時(shí)。將樣品分成3份每管100μl的樣品。加入作為補(bǔ)體來(lái)源的人血清直到總濃度為5％(未被熱滅活的)。倒轉(zhuǎn)管數(shù)次并在37℃下孵育2個(gè)小時(shí)，每30分鐘混和一次。在加入多克隆兔抗人C3c FITC綴合的抗體(1∶100)之前用PBS洗滌兩次，使得終體積為100μl。在用PBS洗滌兩次之前，將細(xì)胞在4℃孵育1個(gè)小時(shí)并重懸于200μl 1％細(xì)胞固定液中。
結(jié)果圖2顯示在存在非阻斷抗體220時(shí)，沉積到791T細(xì)胞上的C3b水平是輕度的(MLF 200)。在存在CD55中和抗體216時(shí)，觀察到了C3b沉積的增強(qiáng)(MLF 350)。但是，在存在單克隆抗體791T/36時(shí)，沉積了更高水平的C3b(MLF 520)。這說(shuō)明盡管216是C3轉(zhuǎn)化酶與SCR3結(jié)合的有效的競(jìng)爭(zhēng)劑，但是791T/36與SCR1和SCR2域的結(jié)合可功能性滅活CD55，造成C3b的沉積增加了250％。
實(shí)施例2 接受用于腫瘤成像的放射性標(biāo)記的791T/36的復(fù)發(fā)性直結(jié)腸癌患者的長(zhǎng)期存活率抗體和標(biāo)記雜交瘤791T/36克隆3是抗體的來(lái)源(791T/36，IgG2b同種型)。將來(lái)自發(fā)育雜交瘤的鼠的腹水液應(yīng)用到pH7.5，0.1mol/l檸檬酸磷酸緩沖液的蛋白A-“瓊脂糖”柱中，并充分洗滌柱。在pH6.0、5.0、4.5和3.0逐步洗脫所結(jié)合的免疫球蛋白，然后用磷酸緩沖的鹽水透析。然后在1000000g離心透析液1個(gè)小時(shí)，過(guò)濾通過(guò)0.22μm Millex“Millipore”濾器，并以1mg/ml的蛋白濃度儲(chǔ)存在-70℃。如用鼠免疫球蛋白分型抗血清(MilesLaboratories，Stoke Poges，Bucks.)的免疫擴(kuò)散測(cè)試所測(cè)定的那樣，制劑中只含有IgG2b并且是無(wú)致熱原的(Boots Pharmaceuticals，Notts)。
通過(guò)“非水溶性碘化”藥劑用131I標(biāo)記多批抗體制劑。通過(guò)在葡聚糖凝膠G25上的凝膠過(guò)濾去除未結(jié)合的碘。將所標(biāo)記的制劑稀釋為含有1％血清白蛋白的鹽并用Millex過(guò)濾除菌。
用放射性標(biāo)記的單克隆抗體791T/36將72位復(fù)發(fā)性直結(jié)腸癌患者顯像?；颊呓邮?0μg抗體的初始劑量以及隨后的靜脈內(nèi)劑量200μg。將2dl含有200μg抗體和近70MBq131I的制劑輸注到每個(gè)患者的肘前靜脈內(nèi)，輸注時(shí)間在30分鐘以上。
隨診了7年的存活率，并將其與同期的復(fù)發(fā)性直結(jié)腸癌患者的組進(jìn)行比較。在接受791T/36的患者中有12位長(zhǎng)期存活者(16％)，而相反地在同期組中89位患者中只有1位患者存活了7年(p＞0.001)。
表1接受791T/36抗體的直結(jié)腸癌患者的存活率。
這些結(jié)果說(shuō)明在接受放射性標(biāo)記的791T/36抗體的患者的非隨機(jī)試驗(yàn)中的顯著的生存益處。所達(dá)到腫瘤的放射性標(biāo)記的劑量要明顯低于放射性標(biāo)記單獨(dú)引發(fā)殺滅腫瘤所需的水平。因此，更有可能是抗體滅活CD55，容許補(bǔ)體攻擊殘余的腫瘤。因?yàn)檫@些患者只接受791T/36的單次靜脈內(nèi)劑量，所以顯著的存活益處是非常引人注目的。反復(fù)注射人源化791T/36抗體可能有著甚至更為明顯的治療益處。
實(shí)施例3 產(chǎn)生針對(duì)SCR1和SCR2的新的單克隆抗體通過(guò)在3周內(nèi)兩次分別用過(guò)度表達(dá)CD55抗原的791T細(xì)胞(106細(xì)胞)腹腔內(nèi)注射接種6-8周大的Balb/c小鼠。然后用與人Fc融合并用蛋白A色譜法純化的SCR1-2蛋白強(qiáng)化接種鼠。在鼠的尾部取血并篩選血清識(shí)別如先前所描述的(Spendlove et al 2000 Eur J Immunol 30，2944)CHO細(xì)胞所表達(dá)的CD55SCR1-2/CD46SCR3-4嵌合分子的能力。也篩選它們識(shí)別如先前所描述的(Spendlove et al 2000 Eur J Immunol 30，2944)SCR1-2CD55Fc蛋白以及附著于BSA的IC、2N和2C肽的能力。通過(guò)靜脈內(nèi)注射SCR1-2Fc蛋白強(qiáng)化接種產(chǎn)識(shí)別CD55 SCR1和SCR2的抗體的鼠，5天后取出脾細(xì)胞，并用PEG與NSO細(xì)胞以10∶1比例融合。用HAT培養(yǎng)基選擇出雜交瘤，并用ELISA篩選出生產(chǎn)識(shí)別SRR1-2Fc蛋白的抗體的雜交瘤。通過(guò)有限稀釋得到三個(gè)孔的每個(gè)孔1個(gè)細(xì)胞，以保證克隆性，由此克隆出產(chǎn)生正確抗體的雜交瘤。篩選單克隆抗體識(shí)別如先前所描述的(Spendlove et al 2000 Eur J Immunol 30，2944)CHO細(xì)胞所表達(dá)的CD55SCR1-2/CD46SCR3-4嵌合分子的能力。也篩選它們識(shí)別如先前所描述的(Spendlove et al 2000 Eur J Immunol 30，2944)SCR1-2CD55Fc蛋白以及附著于BSA的IC、2N和2C肽的能力。為了確定它們是否識(shí)別與如上所述的用CD55所涂層的791T/36板相同的位點(diǎn)，然后將它們與新的單克隆抗體孵育，然后與生物素化的791T/36孵育。用抗生物素蛋白過(guò)氧化酶和ABTS底物以及讀板器在405nm的OD讀數(shù)定量791T/36的結(jié)合。如果單克隆抗體識(shí)別與791T/36所識(shí)別的相同或相關(guān)位點(diǎn)，那么它們將抑制791T/36與CD55抗原的結(jié)合。
所有在本說(shuō)明書(shū)中所提及的文獻(xiàn)在此一同并入?yún)⒖?。不脫離于本發(fā)明范圍和精神的對(duì)本發(fā)明所描述的實(shí)施方案的各種修飾和變異對(duì)于本領(lǐng)域人員將是顯而易見(jiàn)的。盡管已經(jīng)用具體提及的實(shí)施方案描述本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)明白所要求保護(hù)的發(fā)明不應(yīng)當(dāng)被不適當(dāng)?shù)叵薅ㄓ谶@些具體的實(shí)施方案中。事實(shí)上，本發(fā)明覆蓋了對(duì)本領(lǐng)域人員顯而易見(jiàn)的對(duì)所描述的實(shí)施本發(fā)明的方法的各種修飾。
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權(quán)利要求
1.(i)一種與CD55的SCR1和SCR2都結(jié)合的裸結(jié)合元件或(ii)一種編碼所述的結(jié)合元件的核酸在制備用于中和CD55的藥物中的用途。
2.(i)一種與CD55的SCR1和SCR2都結(jié)合的裸結(jié)合元件或(ii)一種編碼所述的結(jié)合元件的核酸在制備用于增強(qiáng)補(bǔ)體沉積于組織的藥物中的用途。
3.(i)一種與CD55的SCR1和SCR2都結(jié)合的裸結(jié)合元件或(ii)一種編碼所述的結(jié)合元件的核酸在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
4.權(quán)利要求3的用途，其中所述癌癥是直結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、肺癌、肝癌、皮膚癌和髓系(例如骨髓)癌中的一種或多種。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述結(jié)合元件是一種抗體或其片段。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述結(jié)合元件與圖1b所示序列的第83-93位氨基酸和SCR2第101-112位氨基酸和第145-157位氨基酸結(jié)合。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述結(jié)合元件包括由保藏于ATCC的保藏號(hào)為HB9173的細(xì)胞株所產(chǎn)生的抗體或其片段的一種或多種CDR。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述結(jié)合元件是由保藏于ATCC的保藏號(hào)為HB9173的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體791T/36。
9.權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的用途，其中所述結(jié)合元件包括至少一種人類恒定區(qū)。
10.一種用于治療癌癥的與SCR1和SCR2都結(jié)合的裸結(jié)合元件。
11.作為用于同時(shí)、分開(kāi)或依次使用以治療癌癥的組合制劑的一種與CD55的SCR1和SCR2都結(jié)合的裸結(jié)合元件以及一種活性藥劑。12.權(quán)利要求11的組合制劑，其中所述活性藥劑是阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、伊立替康或順鉑。
13.權(quán)利要求11的組合制劑，其中所述活性藥劑是一種抗體。
14.權(quán)利要求13的組合制劑，其中所述活性藥劑是一種抗CD20抗體、抗VEGF抗體、抗CD171A抗體、抗CEA抗獨(dú)特型抗體、抗EGFR抗體、抗HMFG抗獨(dú)特型mAb、抗EGFR抗體、或抗HER2抗體例如赫賽汀(Genentech(South San Francisco，CA，USA))。
15.權(quán)利要求10或11的裸結(jié)合元件，或權(quán)利要求12到14中任一項(xiàng)的組合制劑，其中裸結(jié)合元件是如權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)所定義的裸結(jié)合元件。
16.一種用于治療癌癥的藥物組合物，其中所述組合物包括與CD55的SCR1和SCR2都結(jié)合的裸結(jié)合元件以及藥用可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
17.權(quán)利要求16的藥物組合物，其中所述裸結(jié)合元件是如權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)所定義的裸結(jié)合元件。
18.一種中和CD55的方法，包括施用與CD55的SCR1和SCR2特異性結(jié)合的裸結(jié)合元件。
19.一種增強(qiáng)補(bǔ)體沉積的方法，包括施用與CD55的SCR1和SCR2特異性結(jié)合的裸結(jié)合元件。
20.一種治療癌癥的方法，包括給有此需要的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的與CD55的SCR1和SCR2特異性結(jié)合的裸結(jié)合元件。
21.權(quán)利要求16到18中任一項(xiàng)的方法，其中裸結(jié)合元件是如權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)所定義的裸結(jié)合元件。
22.一種用于鑒定能抑制CD55的藥劑的分析方法，包括步驟a)將候選藥劑與CD55的SCR1和SCR2的至少一部分接觸；以及b)確定所述候選藥劑與SCR1和SCR2兩者的結(jié)合。
23.一種用于鑒定能抑制CD55的藥劑的分析方法，包括(a)在存在裸結(jié)合元件時(shí)，將候選藥劑與CD55的SCR1和SCR2的至少一部分接觸；其中在無(wú)候選藥劑時(shí)，該裸結(jié)合元件能與CD55的SCR1和SCR2兩者結(jié)合；以及(b)確定候選藥劑對(duì)裸結(jié)合元件與CD55的SCR1和SCR2結(jié)合的抑制程度。
24.權(quán)利要求23的分析方法，其中所述結(jié)合元件是如權(quán)利要求6到9中任一項(xiàng)所定義的結(jié)合元件。
25.權(quán)利要求22到24中任一項(xiàng)的分析方法，還包括步驟(c)選擇與CD55的SCR1和SCR2都結(jié)合的候選藥劑；和/或步驟(d)確定在存在或不存在候選藥劑時(shí)在細(xì)胞樣品中所沉積的補(bǔ)體的量。
26.權(quán)利要求22到25中任一項(xiàng)的分析方法，其中CD55的SCR1和SCR2的所述的部分包括圖1b中所示序列的第83-93位、101-112位和145-157位氨基酸。
27.由權(quán)利要求22到26中任一項(xiàng)的分析方法所鑒定的藥劑在生產(chǎn)用于治療癌癥的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及與CD55的SCR1和SCR2都結(jié)合的結(jié)合元件在治療腫瘤和白血病中的用途。所述結(jié)合元件可以是與CD55的SCR1和SCR2結(jié)合以及中和CD55并使得腫瘤細(xì)胞易感于補(bǔ)體介導(dǎo)的攻擊的抗體。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1826357SQ200380104471
公開(kāi)日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2003年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月27日
發(fā)明者吉蓮·琳迪·達(dá)蘭特 申請(qǐng)人:癌癥研究技術(shù)有限公司