快速檢測低豐度蛋白質(zhì)的無封閉的蛋白質(zhì)印跡法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)檢測方法，尤其涉及一種無封閉的蛋白質(zhì)印跡法，適用于快速檢測低豐度蛋白質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)印跡(western blot，簡稱WB)又稱免疫印跡(immunoblotting)是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。由于we stern blot具有SD S-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，已成為當(dāng)前分析蛋白質(zhì)的常用分子生物學(xué)技術(shù)。
[0003]在蛋白質(zhì)印跡過程中，經(jīng)過PAGE電泳分離后的蛋白質(zhì)樣品需要經(jīng)過從PAGE膠轉(zhuǎn)移到膜上固定，為了避免測試試劑的特異性抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合，需要對膜上的潛在結(jié)合位點進行封閉處理;后續(xù)進行Western Blot的檢測和顯色。
[0004]蛋白質(zhì)印跡常規(guī)流程:蛋白提取與樣品制備SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜封閉一一抗體雜交一一底物染色。具體包括以下步驟:
[0005]1.提取樣本總蛋白，并濃縮純化，用超微量核酸蛋白濃度儀器測定樣品提取液蛋白濃度。
[0006]2.按樣本總蛋白梯度20mg進行上樣，變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳分離蛋白。
[0007]3.目標(biāo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜。按B1-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層。30mA恒流條件下，4°C轉(zhuǎn)移過夜。
[0008]4.為了避免測試試劑的特異性抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合，需要對膜上的潛在結(jié)合位點進行封閉處理。加入封閉液后，一般在室溫或者37°C在搖床上緩慢震蕩l_2h，特殊情況在4 °C過夜。
[0009]5.封閉完成后要洗膜，去除膜上未結(jié)合的封閉試劑。常規(guī)的洗滌液為TBST，洗3次，每次15分鐘。
[0010]6.抗體孵育。膜在5 %脫脂奶粉溶液中室溫孵育I小時以封閉膜上的非特異結(jié)合。用TBST洗滌3次，每次15分鐘。封閉過的膜加入一抗室溫孵育1.5小時，抗原抗體結(jié)合，用TBST洗滌3次，每次15分鐘。再加入HRP標(biāo)記的二抗體以結(jié)合一抗，室溫孵育膜I小時。用TBST洗滌3次，每次15分鐘。
[0011]7.壓片顯影定影后觀察。
[0012]每種動物細胞中所含的蛋白質(zhì)一般占到7%— 10%左右，谷類一般含蛋白質(zhì)6%-10%,薯類含蛋白質(zhì)2 % -3 %。而在花生組織中蛋白質(zhì)含量雖然有15 %左右，但雜質(zhì)多，如色素，酚類和糖類多，影響蛋白質(zhì)的提取。進一步地，植物蛋白質(zhì)與動物蛋白質(zhì)比較，成分有所不同，如水稻蛋白缺乏賴氨酸，大豆蛋白缺乏色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等。因此，一般情況下，要分析的植物目標(biāo)蛋白質(zhì)在植物總蛋白質(zhì)比例較低，采用常規(guī)的蛋白質(zhì)印跡法進行檢測常常效果差，蛋白曝光顯影弱或者不出現(xiàn)顯影，靈敏度低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種更實用、更靈敏的針對低豐度蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡法。
[0014]為達到以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0015]—種快速檢測低豐度蛋白質(zhì)的無封閉的蛋白質(zhì)印跡法，其包括以下步驟:
[0016](I)使用凝膠將從樣品中提取的總蛋白質(zhì)進行梯度分離；
[0017](2)將已梯度分離的總蛋白質(zhì)從凝膠印跡到PVDF膜；
[0018](3)將印跡有所述總蛋白質(zhì)的PVDF膜浸泡在100 %甲醇中；
[0019](4)干燥經(jīng)100%甲醇處理的所述PVDF膜；
[0020](5)對干燥的PVDF膜中的目標(biāo)蛋白質(zhì)進行顯色檢測。
[0021 ] 具體地，所述100 %甲醇浸泡PVDF膜的時間為8?15s。
[0022]進一步地，所述經(jīng)100%甲醇處理的PVDF膜的干燥方法為自然晾干。
[0023 ] 優(yōu)選地，所述晾干時間為1?15min。
[0024]更優(yōu)選地，所述PVDF膜放置在濾紙上進行晾干。
[0025]進一步地，所述步驟(5)中對目標(biāo)蛋白質(zhì)的顯色檢測步驟包括:
[0026](5.1)進行目標(biāo)蛋白質(zhì)與該目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體之間的免疫性結(jié)合；
[0027](5.2)進行所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體與顯色標(biāo)記物之間的免疫性結(jié)合；
[0028](5.3)進行顯色反應(yīng)并且展示顯色結(jié)果。
[0029]進一步地，所述步驟(5.1)還包括將未結(jié)合的所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體進行漂洗的步驟:將結(jié)合有所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體的PVDF膜置于含有TBST的洗滌液中漂洗兩次，每次8?15s0
[0030]優(yōu)選地，所述步驟(5.2)還包括將未結(jié)合的所述顯色標(biāo)記物進行漂洗的步驟:將結(jié)合有所述顯色標(biāo)記物的PVDF膜置于含有TBST的洗滌液中漂洗兩次，每次8?15s。
[0031 ]進一步優(yōu)選地，所述樣品來源于植物或動物。
[0032]與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢:
[0033](I)本發(fā)明快速檢測低豐度蛋白質(zhì)的無封閉的蛋白質(zhì)印跡法中，利用PVDF膜進行常規(guī)轉(zhuǎn)膜步驟之后，用100 %甲醇浸泡該PVDF膜，以增強該PVDF膜對已附著在膜上的蛋白質(zhì)分子的吸附能力，避免低豐度的蛋白分子在操作過程中彌散或者逃逸；
[0034](2)本發(fā)明快速檢測低豐度蛋白質(zhì)的無封閉的蛋白質(zhì)印跡法中，讓固著有蛋白質(zhì)的PVDF膜干燥，以恢復(fù)PVDF膜的疏水性，也可以避免在抗體孵育過程中發(fā)生非特異性結(jié)合，以此替代常規(guī)的用脫脂奶粉進行非特異性位點的封閉步驟；
[0035](3)本發(fā)明快速檢測低豐度蛋白質(zhì)的無封閉的蛋白質(zhì)印跡法中，甲醇是公知的溶劑，也易于揮發(fā)，用甲醇處理PVDF膜不僅可以洗去膜上的其他溶液，也輔助該膜迅速干燥；
[0036](4)本發(fā)明快速檢測低豐度蛋白質(zhì)的無封閉的蛋白質(zhì)印跡法中，由于對PVDF膜進行了改進性的處理，對應(yīng)地對抗體的漂洗過程也需要進行優(yōu)化，具體是只需要進行短時間的漂洗，即可達到實驗要求，大大縮短了檢測時間；
[0037](5)本發(fā)明快速檢測低豐度蛋白質(zhì)的無封閉的蛋白質(zhì)印跡法，減少了長時間封閉和漂洗過程中對目標(biāo)蛋白質(zhì)的損失，極大地提高了低豐度的目標(biāo)蛋白質(zhì)在PVDF膜的固著量，并且，避免了一抗孵育過程中脫脂奶粉和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間發(fā)生對抗體的吸附競爭，由此對目標(biāo)蛋白質(zhì)的顯色也更明顯、更清晰；
[0038](6)本發(fā)明快速檢測低豐度蛋白質(zhì)的無封閉的蛋白質(zhì)印跡法，沒有引入專用設(shè)備和專用試劑，易于實現(xiàn)，并且簡化了實驗步驟，縮短了實驗時間，因此對推動蛋白質(zhì)印跡法在蛋白質(zhì)研究中的作用具有重要意義。
【附圖說明】
[0039]圖1為用常規(guī)的蛋白質(zhì)印跡法對提取的花生葉片總蛋白進行檢測，其中，目標(biāo)蛋白質(zhì)AhNCED蛋白的曝光顯影弱。
[0040]圖2為用常規(guī)的蛋白質(zhì)印跡法中的電泳和轉(zhuǎn)膜對提取的花生葉片蛋白進行印跡，之后將PVDF膜用100%甲醇處理，后續(xù)進行常規(guī)的抗體孵育步驟和顯色，其中，目標(biāo)蛋白質(zhì)AhNCED蛋白曝光顯影明顯可見。
[0041]圖3為用發(fā)明快速檢測低豐度蛋白質(zhì)的無封閉的蛋白質(zhì)印跡法對提取的花生葉片蛋白進彳丁檢測，其中，目標(biāo)蛋白質(zhì)AhNCED蛋白曝光顯影突出。
[0042]圖4為本發(fā)明快速檢測低豐度蛋白質(zhì)的無封閉的蛋白質(zhì)印跡法的流程示意圖。
【具體實施方式】
[0043]以下結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0044]以下以花生葉片低豐度9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(簡稱AhNCED蛋白)的檢測為例對本發(fā)明進行詳細介紹。
[0045]對比例
[0046]常規(guī)的蛋白質(zhì)印跡法檢測AhNCED蛋白
[0047](I)取約2g花生葉片放在預(yù)冷的研缽中用液氮研磨至白綠色粉末，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入蛋白提取液5mL，在40C的條件下以12000rpm