專利名稱:組織纖維蛋白原的新用途的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及組織纖維蛋白原的新用途。
背景技術:
組織纖維蛋白原存在于血液當中,是凝血過程中的一種重要蛋白,又稱為凝血因子I,其分子量大約340,000道爾頓,由兩個亞基通過二硫鍵連接形成二聚體,每個亞基由3條多肽鏈相互纏繞組成。在凝血過程中,被凝血酶酶切后生成纖維蛋白進而形成不溶的纖維蛋白多聚體,由纖維蛋白多聚體形成的血纖維和血小板一起構成牢固的止血栓。組織纖維蛋白原在血液中的含量約為1.5-4毫克/毫升,同時組織纖維蛋白原也是一種應激蛋白,其含量與機體的免疫狀態(tài)有關,且可以反映心腦血管疾病的危險程度。
重組蛋白在大腸桿菌中的表達產(chǎn)物很容易錯誤折疊形成包涵體,包涵體一般含有50%以上的重組蛋白,其余為核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等,難溶于水和緩沖液,只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。包涵體復性通常成為制約重組蛋白生產(chǎn)成本的關鍵因素。工業(yè)重組蛋白的復性通常采用先將包涵體溶解于變性劑,然后緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的完全伸展狀態(tài)恢復到正常的折疊結構,同時去除還原劑使二硫鍵正常形成。傳統(tǒng)的復性方法包括稀釋復性、透析復性、超濾復性、柱復性等,吸附法、反膠束法和雙水相萃取法等都可用于重組蛋白質(zhì)的復性。但仍有許多重要的重組蛋白,如重組人血管內(nèi)皮抑素(endostatin)等,難以通過現(xiàn)有的復性方法獲得較高的復性收率。內(nèi)皮抑素是一種通過抑制腫瘤新生血管生長來抑制腫瘤生長的蛋白,大腸桿菌表達的內(nèi)皮抑素形成不溶的包涵體,用傳統(tǒng)方法復性率極低。將完全還原變性的內(nèi)皮抑素透析到PBS緩沖液中,蛋白幾乎完全沉淀。
蛋白構象病(protein misfolding disease)是由于組織中特定的蛋白質(zhì)發(fā)生了構象變化,進而聚集并產(chǎn)生淀粉樣沉淀(amyloidosis),最終出現(xiàn)組織器官的病理性改變的一類疾病,如阿爾茨海默癥,瘋牛病等都屬于這一類病癥。對于這類病癥目前還沒有很好的防治方法。已有的方法包括單克隆抗體技術,化學小分子,合成多肽等。但這些方法存在的缺點在于,所用藥品存在免疫排斥,缺乏廣譜性,副作用大,體內(nèi)半衰期短等弱點。
細胞內(nèi)存在大量的熱休克蛋白(beat shock protein)或分子伴侶(chaperone),在機體遭受刺激時大量表達,保護細胞內(nèi)的蛋白免受高溫、自由基、有機溶劑(如乙醇)等的傷害。但是在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)不存在熱休克蛋白,機體保護細胞外的蛋白分子的機制目前還不清楚。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供組織纖維蛋白原的新用途。
本發(fā)明發(fā)明人的研究表明,組織纖維蛋白原具有分子伴侶活性,能促進變性蛋白正確折疊,該項特性可以在工業(yè)重組蛋白復性,抗蛋白淀粉樣沉淀類疾病,抗蛋白變性,以及制備抗蛋白淀粉樣沉淀、抗蛋白變性的藥物中將得到廣泛應用。
本發(fā)明發(fā)明人的研究表明,組織纖維蛋白原能促進變性重組蛋白二級結構的折疊,提高包涵體的復性回收率,可以廣泛應用于變性重組蛋白的復性。
所述復性過程是先將變性重組蛋白溶液加入到含有組織纖維蛋白原溶液中,除去沉淀后清液經(jīng)柱層析得到可溶性的重組蛋白。當然也可以添加輔助試劑如葡聚糖、環(huán)糊精等。
其中,對于重組人血管內(nèi)皮抑素(endostatin)、金屬基質(zhì)蛋白酶C末端(C-teminalof Matrix Matelloproteinase-2)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor)、血管生長因子受體(Vascular Endothelial Growth Factor)等重組蛋白具有良好的復性效果;組織纖維蛋白原和底物蛋白的摩爾濃度比為1∶5時,即可以達到良好的復性效果。
本發(fā)明發(fā)明人的研究表明,組織纖維蛋白原能防止蛋白構象發(fā)生改變,特別是防止蛋白發(fā)生淀粉樣沉淀,可以用于抗蛋白淀粉樣沉淀。
當組織纖維蛋白原與蛋白摩爾濃度比為1∶5時,即可以達到良好的阻止蛋白發(fā)生淀粉樣沉淀的效果,摩爾濃度比越高,效果越好。
可以將組織纖維蛋白原作為藥物的活性成分,制備抗蛋白淀粉樣沉淀疾病的藥物。
本發(fā)明發(fā)明人的研究表明,組織纖維蛋白原能增強蛋白的抗變性能力,可以廣泛應用于蛋白抗變性,在體外作為蛋白穩(wěn)定劑使用。
當組織纖維蛋白原與蛋白摩爾濃度比為1∶5時,目標蛋白熱穩(wěn)定性即明顯增強,摩爾濃度比越高,效果越好。
可以將組織纖維蛋白原作為藥物的活性成分,制備成抗蛋白變性疾病的藥物,在體內(nèi)使用,所述的蛋白變性包括發(fā)燒引起的熱變性,由煙、酒、氧自由基等有害物質(zhì)造成的蛋白變性等。
組織纖維蛋白原是人體自身的蛋白分子,在體內(nèi)不會被很快降解,也不會產(chǎn)生免疫排斥反應;具有分子伴侶活性,能促進重組蛋白復性,還具有廣譜的非特異性的保護作用,而且其生產(chǎn)純化成本低,在重組蛋白復性,抗蛋白淀粉樣沉淀,抗蛋白變性,以及制備抗蛋白淀粉樣沉淀、抗蛋白變性的藥物中將得到廣泛應用。
具體實施例方式
實施例1、組織纖維蛋白原在變性重組蛋白—內(nèi)皮抑素復性中的應用將組織纖維蛋白原用磷酸鹽緩沖液(PBS)制備成濃度3毫克/毫升的溶液,將經(jīng)過完全還原變性的高濃度內(nèi)皮抑素儲液一步稀釋到該復性液中,使內(nèi)皮抑素的終濃度為0.2毫克/毫升。2小時后,14000rpm(或12000g)離心15min除去沉淀,上清用鎳親和層析柱(因為重組的內(nèi)皮抑素含有鎳親和的組氨酸標簽)分離純化出可溶的內(nèi)皮抑素。產(chǎn)品氧化電泳結果表明二硫鍵形成;HPLC分析的保留時間與復性標準品一致;熒光發(fā)射光譜顯示其最大發(fā)射波長在320nm附近,與復性標準品一致。
實施例2、組織纖維蛋白原在抗蛋白淀粉樣沉淀中的應用酵母朊蛋白是一種類似瘋牛病蛋白的分子,體外能夠自發(fā)的發(fā)生構象改變,形成淀粉樣沉淀或其前體。該過程可以用染料Thioflavin T特異性的熒光變化檢測到。
將酵母朊蛋白以PBS緩沖液配成0.5μM的溶液,實驗組溶液中同時含有0.5μM組織纖維蛋白原,對照組不含有組織纖維蛋白原;室溫靜置,在不同時間點從體系中取樣300μl,加入等體積濃度為25μM的染料Thioflavin T;檢測熒光,最終根據(jù)不同時間點的熒光變化繪制趨勢圖,發(fā)現(xiàn)隨時間延長,不含組織纖維蛋白原的對照組可觀察到熒光明顯有增高的趨勢,表明蛋白淀粉樣沉淀前體含量增加;而實驗組沒有觀察到熒光變化,或熒光變化緩慢,說明蛋白淀粉樣沉淀前體沒有增加,或增加的幅度明顯緩慢。結果表明組織纖維蛋白原對蛋白淀粉樣沉淀前體的形成有抑制作用。
實施例3、組織纖維蛋白原保護檸檬酸合成酶熱變性的實驗檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)中的一個關鍵酶,但該蛋白熱穩(wěn)定性很差,體外在43℃就會很快變性聚集,進而形成沉淀。該聚集過程可以用光散射的變化反映出來。
用熒光儀FL4500(日立公司)檢測光散射過程,調(diào)節(jié)儀器激發(fā)光為500nm,發(fā)射光為500nm,狹縫寬度為2.5nm。
將檸檬酸合成酶溶解在40mMHEPES緩沖液中,使其終濃度為0.15μM,實驗組中加入組織纖維蛋白原HEPES溶液,使其終濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.3、0.45、0.6、0.75μM,對照組加入相同體積的HEPES溶液,將實驗樣品放入43℃水浴中,檢測光散射信號。實驗結果表明,對照組200秒內(nèi)檸檬酸合成酶就開始發(fā)生聚集,可以檢測到光散射信號的增加;而實驗組中加入等摩爾濃度的組織纖維蛋白原后,檸檬酸合成酶聚集明顯變少,且隨組織纖維蛋白原的濃度增加,抑制聚集的效果也增加,當組織纖維蛋白原為檸檬酸合成酶濃度5倍時,可以幾乎完全抑制檸檬酸合成酶的43℃熱變性過程。
權利要求
1.組織纖維蛋白原在變性重組蛋白復性中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用,其特征在于所述復性過程是先將變性重組蛋白溶液加入到含有組織纖維蛋白原的溶液中,得到可溶性的重組蛋白。
3.根據(jù)權利要求1所述的應用,其特征在于所述組織纖維蛋白原與變性重組蛋白摩爾濃度比不低于1∶5。
4.根據(jù)權利要求1或2或3所述的應用,其特征在于所述變性重組蛋白為重組人血管內(nèi)皮抑素、神經(jīng)生長因子、血管生長因子受體或金屬基質(zhì)蛋白酶C末端。
5.組織纖維蛋白原在抗蛋白淀粉樣沉淀中的應用。
6.根據(jù)權利要求5所述的應用,其特征在于所述組織纖維蛋白原與蛋白摩爾濃度比不低于1∶5。
7.組織纖維蛋白原及針對其制備的抗體分子在制備抗蛋白淀粉樣沉淀疾病的藥物中的應用
8.組織纖維蛋白原及針對其制備的抗體分子在抗蛋白變性中的應用。
9.根據(jù)權利要求8所述的應用,其特征在于所述組織纖維蛋白原及針對其制備的抗體分子作為蛋白穩(wěn)定劑的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了組織纖維蛋白原的新用途。本發(fā)明發(fā)明人的研究表明,組織纖維蛋白原能促進變性重組蛋白二、三級結構的折疊,提高包涵體的復性回收率,可以廣泛應用于變性重組蛋白的復性;組織纖維蛋白原能防止蛋白構象發(fā)生改變,特別是防止蛋白發(fā)生淀粉樣沉淀,可以用于抗蛋白淀粉樣沉淀;抗蛋白變性等。組織纖維蛋白原是人體自身的蛋白分子,在體內(nèi)不會被很快降解,也不會產(chǎn)生免疫排斥反應;具有分子伴侶活性,能促進重組蛋白復性,還具有廣譜的非特異性的保護作用;其生產(chǎn)純化成本低。本發(fā)明用途廣泛,能用于重組蛋白復性,抗蛋白淀粉樣沉淀,以及抗蛋白熱變性等。
文檔編號C07K1/14GK1712413SQ200410048078
公開日2005年12月28日 申請日期2004年6月14日 優(yōu)先權日2004年6月14日
發(fā)明者唐華東, 雷清新, 羅永章 申請人:清華大學