專利名稱：牛初乳中乳鐵蛋白的分離純化技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從牛初乳中分離純化乳鐵蛋白的方法，特別是建立了一套適合工業(yè)化生產(chǎn)乳鐵蛋白的新技術(shù)。該技術(shù)具有生產(chǎn)成本低，操作簡單，無污染，不改變?nèi)殍F蛋白活性等特點，生產(chǎn)的乳鐵蛋白純度可達(dá)85％以上，乳鐵蛋白的得率在70％以上。
乳鐵蛋白(Lactoferrin，簡稱Lf)是富含在初乳中的一種功能因子，它最初于1939年由Sorensen等在動物乳中發(fā)現(xiàn)，1953年P(guān)olis等在制備乳過氧化物酶時得到了它的粗制品，1960年Johansson和Montreuil等從人乳中首次分離出Lf。Lf因最先在乳汁中被發(fā)現(xiàn)而得名，后來的研究表明，它也廣泛存在于動物體的淚液、唾液、汗液、胰液、膽汁、精液等內(nèi)、外分泌液中，只是在乳汁中含量較高，如牛初乳中的Lf質(zhì)量濃度為1g/L，而在其它分泌物中含量甚微。近代研究證明，Lf具有許多獨特的生物學(xué)功能增強鐵的傳遞和吸收；廣譜的抗菌性；免疫作用；抗氧化作用；促進腸道菌群的平衡；作為生長因子；抗炎癥；抗病毒；抗癌癥作用等。對Lf的分離、加工、綜合利用的研究，已經(jīng)成為食品界，特別是乳品界關(guān)心的熱點。
Lf是一種鐵結(jié)合性糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族。分子的主體是一個大約有700個氨基酸殘基構(gòu)成的、相對分子質(zhì)量約為80,000Da的單肽鏈，并連接1～2個配糖體，其組成包括甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸、巖藻酸等。牛乳Lf由703氨基酸構(gòu)成，等電點在8.0。
由于Lf具有一些非凡的生理功能，自1960年以來人們就試著采用各種方法來制備Lf，人乳中Lf含量雖然豐富，但是依靠從人乳中提取Lf并不現(xiàn)實。商用Lf通常從牛乳中分離提取，特別是牛初乳和乳清，資源豐富，可實現(xiàn)規(guī)?；⑸唐坊a(chǎn)。物料的前期處理方法基本相同，都是采用新鮮牛初乳通過離心脫去脂肪(4℃，3000rpm，30min)得到脫脂乳，將脫脂乳稀釋后，邊攪拌邊向其中加入1M鹽酸溶液調(diào)整脫脂乳的pH值到4.6(酪蛋白的等電點)，室溫放置30min，離心除去酪蛋白(4℃，3000rpm，30min)，得到的上清就是我們需要的乳清(或直接運用生產(chǎn)奶酪的副產(chǎn)物乳清)，用它來分離Lf。
乳鐵蛋白的分離純化方法較多，常見的有吸附色譜法、親和色譜法、固定化單克隆抗體法、超濾法、鹽析法、離子交換法等。吸附色譜法是利用固相吸附劑通過與蛋白質(zhì)分子相結(jié)合，利用不同物質(zhì)和吸附劑結(jié)合力的差異性而將它們分離，其缺點是吸附容量小、效率低；親和色譜法親和色譜是一種新興的分離技術(shù)，它用來生產(chǎn)高純度的Lf，該方法分離效果好純度高，且沒有生物活性損失，是生產(chǎn)醫(yī)藥用高純度Lf最有效的方法之一，其缺點是成本昂貴，難以工業(yè)化生產(chǎn)；固定化單克隆抗體法該方法實際上是利用抗原-抗體之間的高特異性結(jié)合反應(yīng)而實現(xiàn)目標(biāo)物的分離。載有單克隆抗體的免疫色譜是一種親和力色譜法，它較成功的實現(xiàn)了Lf的一步分離，回收率達(dá)到97％，該方法的優(yōu)點是分離效果好純度高，抗體被固定可重復(fù)使用，其缺點是柱的制備工藝復(fù)雜，抗體成本昂貴(1000美元/克)，難以工業(yè)化生產(chǎn)；超濾法超濾是一種基本的膜分離技術(shù)，其原理是根據(jù)膜孔徑不同可以實現(xiàn)不同分子質(zhì)量和分子形狀的大分子物質(zhì)的分離，由于超濾法提供了不加熱或不發(fā)生相變進行大分子質(zhì)量組分的濃縮、分離的機會，非常適合熱敏性的功能性組分的分離，但膜的污染和產(chǎn)品純度較低難以滿足生產(chǎn)的要求。鹽析法鹽析法通常是利用飽和硫酸銨沉淀乳鐵蛋白，該方法盡管生產(chǎn)成本簡單，但由于乳清中添加硫酸銨帶來了污染，產(chǎn)品的純度也較低，制約了其應(yīng)用。離子交換法該方法原理是根據(jù)離子交換劑對不同的離子或離子化合物的結(jié)合力不同而實現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的分離。Grove最早使用DEAE纖維素陰離子交換樹脂分離出較純的Lf成分，此后，他又開發(fā)出磷酸纖維素交換色譜法，并由Foley等對此法加以改進，得到的Lf的純度為81％左右；羧甲基陽離子交換色譜法被應(yīng)用于Lf和乳過氧化氫酶的分離。樹脂能用0.2MNaOH和0.2MHCl再生，此法較DEAE纖維法更有效。盡管有人在嘗試運用離子交換法生產(chǎn)乳鐵蛋白，但由于所選樹脂的種類、性能不同、交換條件不同，未能完全實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的在于建立一套適合工業(yè)化從牛初乳中分離純化乳鐵蛋白的方法，純化的乳鐵蛋白純度可達(dá)85％以上。
綜合國內(nèi)外的文獻(xiàn)資料可知，乳鐵蛋白的分離純化工藝復(fù)雜，產(chǎn)品的純度較低，產(chǎn)品的價格高，難以商品化。本發(fā)明選用羧甲基陽離子交換樹脂，采用分批交換的方法，結(jié)合超濾脫鹽和冷凍干燥工藝成功地建立了適合工業(yè)化生產(chǎn)乳鐵蛋白的方法。該技術(shù)的主要特點為①所選樹脂符合食品衛(wèi)生生產(chǎn)要求，分離純化乳鐵蛋白后，原料乳可繼續(xù)利用，無任何污染。
②該技術(shù)的工藝簡單，設(shè)備投資低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
③該技術(shù)生產(chǎn)的乳鐵蛋白，較好的保持了乳鐵蛋白的活性，生產(chǎn)出的乳鐵蛋白純度較高，可以滿足食品及醫(yī)療行業(yè)的需要。
具體實施條件與發(fā)明制作方案1、牛初乳離心脫脂(3000rpm，30min)，用1M的HCl調(diào)pH至4.6，沉淀酪蛋白，離心(3000rpm，30min)，得乳清備用；2、樹脂活化，根據(jù)需要稱取一定量樹脂，用去離子水浸泡(常溫下1-2天，或沸水1-2小時)，再浸泡于10％NaCl溶液中，配制成Na型樹脂；3、用1MNaOH將乳清pH調(diào)至5-8，加入Na型陽離子交換樹脂，于0-50℃攪拌2-20h，用濾布抽濾分離樹脂，用去離子水洗除雜蛋白，再用0.1-15％鹽溶液(NaCl，KCl，CaCl2，MgCl2，NaCO3等)洗脫樹脂，洗脫液超濾脫鹽。濃縮液冷凍干燥得乳鐵蛋白。
4、可用ELISA方法檢測乳清中乳鐵蛋白的交換情況，檢測樹脂的洗脫情況。產(chǎn)品經(jīng)SDS-PAGE進行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)分析其純度。
為了更加清楚的說明本發(fā)明，下面結(jié)合實施例進行詳細(xì)說明實施例1稱取2g CM-SEPHAROSE FF(PHARMACIA)樹脂，加入200mL去離子水浸泡24h，收集樹脂浸泡于10％的NaCl溶液中30min，制備成Na型樹脂。將樹脂加入5L脫脂乳清液中(pH值為6.9)，于4℃輕輕攪拌交換8小時。用濾布分離收集樹脂，經(jīng)過交換后的脫脂乳清的pH、顏色、氣味、感官均未發(fā)生變化。
將收集的樹脂用pH為6.9去離子水清洗，以除掉雜蛋白，然后再用5％的鹽溶液洗脫樹脂，用抽濾的方式將樹脂和洗脫液分離，收集洗脫液進行超濾脫鹽，超濾膜的截留分子量為3-5萬，超濾壓力為0.15-0.2MPa。經(jīng)超濾脫鹽后的乳鐵蛋白濃縮液進行冷凍干燥，收集產(chǎn)品4.01g。產(chǎn)品經(jīng)電泳分析純度為86％，得率為69％。
實施例2稱取30g SEPABEADS FP-CM13(MITSUBISHI KASEI)陽離子交換樹脂進行活化，經(jīng)平衡后裝柱子(直徑10cm)，用蠕動泵將2L含10％KCl溶液過柱，然后用去離子水過柱，制備成K型陽離子交換樹脂。然后將80L脫脂常乳乳清(pH6.6，4℃)以6L/h流速通過柱子進行交換，經(jīng)交換過的乳清顏色，味道，均未發(fā)生變化。
將交換過的柱子先用去離子水過柱，除去乳清和雜蛋白，接著用15L含12％KCl溶液過柱洗脫乳鐵蛋白，收集洗脫液15L。洗脫液經(jīng)超濾脫鹽和冷凍干燥后，得乳鐵蛋白7.2g，經(jīng)檢測乳鐵蛋白純度為81％，得率為73％。
實施例3稱取5g CM-SEPHADEX C-50(PHARMACIA)樹脂，加入400mL去離子水浸泡24h，收集樹脂浸泡于10％的NaCl溶液中30min，制備成Na型樹脂230mL。將樹脂加入20L脫脂初乳乳清液中(pH值為6.8)，于4℃輕輕攪拌交換12小時。用濾布分離收集樹脂，經(jīng)過交換后的脫脂乳清的pH、顏色、氣味、感官均未發(fā)生變化。
將收集的樹脂用pH為6.8去離子水清洗，以除掉雜蛋白，然后先用1％的鹽溶液洗脫樹脂，以除去結(jié)合不牢的雜蛋白，再用5％的鹽溶液洗脫樹脂，用抽濾的方式將樹脂和洗脫液分離，收集洗脫液進行超濾脫鹽，超濾膜的截留分子量為3-5萬，超濾壓力為0.15-0.2MPa。經(jīng)超濾脫鹽后的濃縮液進行冷凍干燥，收集乳鐵蛋白產(chǎn)品14.5g。產(chǎn)品經(jīng)電泳分析純度為92％，得率為65％。本實施例采用兩步法洗脫樹脂，產(chǎn)品的純度有了較大提高，但產(chǎn)品的得率有所下降(產(chǎn)品的得率以初乳中乳鐵蛋白含量為1g/L計算)。
權(quán)利要求
1.牛初乳中乳鐵蛋白的分離純化技術(shù)，該發(fā)明是運用離子交換方法制備一種純度可達(dá)85％以上的乳鐵蛋白成品，本發(fā)明有其特有的技術(shù)優(yōu)勢。其特征在于本發(fā)明人建立了一套適合工業(yè)化生產(chǎn)乳鐵蛋白的方法，將活化的弱酸性陽離子交換樹脂與脫脂初乳(或初乳乳清)混合，在0-50℃范圍內(nèi)，輕輕攪拌2-20h，用濾布將樹脂分離，用去離子水洗脫樹脂除去雜蛋白，然后用0.1％-15％的鹽溶液(NaCl，KCl，CaCl2，MgCl2，NaCO3等)洗脫樹脂，洗脫液用截留分子量為30000-50000的膜超濾脫鹽，濃縮液冷凍干燥后得乳鐵蛋白產(chǎn)品。該方法具有生產(chǎn)工藝簡便，設(shè)備簡單，無污染，副產(chǎn)物方便利用，保持乳鐵蛋白活性，對人體健康無害等特點。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，本發(fā)明的特征是運用離子交換方法分離純化乳鐵蛋白，運用超濾脫鹽技術(shù)和冷凍干燥方法制備乳鐵蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述，本發(fā)明所選樹脂為弱酸性陽離子交換樹脂，交換基團為羧甲基，所選樹脂符合食品衛(wèi)生生產(chǎn)要求，交換條件為0-50℃，pH5-8，時間2-20h，攪拌速度200r/min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述，選用濾布(孔徑100-600目)分離樹脂，采用超濾脫鹽(截留分子量為3-5萬)方法，具有快速方便等特點，符合工業(yè)化生產(chǎn)要求。采用冷凍干燥技術(shù)，可以較好的保持乳鐵蛋白的活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述，本發(fā)明技術(shù)生產(chǎn)乳鐵蛋白，其特征在于生產(chǎn)工藝簡便，設(shè)備簡單，投資成本低，能耗低，對環(huán)境無污染，分離乳鐵蛋白后的初乳清，無顏色、味道的改變，可繼續(xù)開發(fā)利用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、4所述，本發(fā)明建立了一套完善的分離純化乳鐵蛋白的方法，具有成本低，操作簡單，無污染，不改變?nèi)殍F蛋白活性等特點，生產(chǎn)的乳鐵蛋白純度可達(dá)85％以上，乳鐵蛋白的得率在70％以上。
全文摘要
乳鐵蛋白具有多種生物學(xué)功能，在食品及醫(yī)療行業(yè)應(yīng)用潛力巨大。本發(fā)明建立了一套適合工業(yè)化的從牛初乳中分離純化乳鐵蛋白的方法，生產(chǎn)的乳鐵蛋白具有成本低、工藝簡單、設(shè)備投資低、無污染、產(chǎn)品純度高、保持活性好等特點。具體方法為①活化弱酸性陽離子交換樹脂，制備成Na或K型；②初乳脫脂，沉淀酪蛋白備用；③在合適的pH和溫度下將樹脂和乳清混合，輕輕攪拌2－20h；④用濾布將樹脂與乳清分離，并用去離子水清洗樹脂，除去乳清和雜蛋白；⑤用合適的鹽溶液洗脫乳鐵蛋白；⑥洗脫液采用超濾工藝脫鹽；⑦超濾濃縮液采用冷凍干燥方法干燥得乳鐵蛋白產(chǎn)品；⑧運用SDS－PAGE電泳分析產(chǎn)品純度。
文檔編號C07K14/79GK1663961SQ20041008026
公開日2005年9月7日 申請日期2004年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月29日
發(fā)明者胡志和, 龐廣昌, 張東送, 陳慶森 申請人:天津商學(xué)院