專利名稱：生成重組蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及在大腸桿菌(Escherichia coli)宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中生成重組蛋白質(zhì)的方法，更具體提供了控制所述蛋白質(zhì)在大腸桿菌宿主細(xì)胞周質(zhì)及培養(yǎng)上清之間分配的方法。
大腸桿菌是用于生成重組蛋白質(zhì)的應(yīng)用廣泛、方便的系統(tǒng)。該系統(tǒng)地優(yōu)點包括易于基因操作、試劑(包括基因表達(dá)載體)易于獲得、易于生成大量蛋白質(zhì)、系統(tǒng)表達(dá)多種蛋白質(zhì)快速并具有高度適應(yīng)性。綜述參見Baneyx，Current Opinion in Biotechnology，1999，10，411-421。大腸桿菌現(xiàn)今廣泛用于大規(guī)模生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)，例如胰島素、生長激素和抗體(Swartz，Current Opinion in Biotechnology，2001，12，195-201；Humphreys和Glover，Current Opinion in DrugDiscovery and Development，2001，4，172-185；Verma等，Journalof Immunological Methods，1998，216，165-181；Simmons等，Journal of Immunological Methods，2002，263，133-147)。
任何外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)均開始于將該基因的cDNA拷貝插入表達(dá)載體?？梢岳枚喾N形式的表達(dá)載體。此類載體通常包含質(zhì)粒來源的DNA復(fù)制子、抗生素選擇性標(biāo)志以及由多克隆位點分隔開的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子(表達(dá)盒)連同編碼至少一個核糖體結(jié)合位點的DNA序列。外源基因的轉(zhuǎn)錄通常由受調(diào)節(jié)的啟動子控制，可使細(xì)胞生長與產(chǎn)物合成分開，由此較蛋白質(zhì)持續(xù)表達(dá)得到更高的產(chǎn)量。通過確定發(fā)酵過程中誘導(dǎo)表達(dá)的最佳時間，一般是細(xì)胞生長到高細(xì)胞密度時，可以獲得蛋白質(zhì)最大產(chǎn)量。
根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)及其折疊需求，大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白質(zhì)可以在胞漿中生成、或分泌到周質(zhì)或上清(Makrides，MicrobiologicalReviews，1996，60，512-538)。例如，蛋白質(zhì)可以通過信號序列靶向到周質(zhì)，在周質(zhì)中表達(dá)較之胞漿表達(dá)具有若干優(yōu)點，包括宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)較少、重組蛋白質(zhì)降解較弱以及氧化環(huán)境有利于蛋白質(zhì)正確折疊。
盡管蛋白質(zhì)的發(fā)酵產(chǎn)量是影響大腸桿菌重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)成本的關(guān)鍵因素，所生成蛋白質(zhì)的下游加工(downstream processing，DSP)費用在決定產(chǎn)物的最終成本中也很重要。術(shù)語DSP包含大腸桿菌發(fā)酵后得到最終純化的功能性蛋白質(zhì)的所有步驟。根據(jù)所生成的重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位，這些步驟一般可能包括初步回收步驟，諸如離心、過濾、提取以及濃縮/透析步驟，然后是一步或多步純化步驟。最大化上述步驟的效率，以獲得高產(chǎn)量的功能性蛋白質(zhì)，是重組蛋白質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)最小化成本的關(guān)鍵。DSP中所用初步回收步驟的特性會影響所得重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量和質(zhì)量，這取決于包括生產(chǎn)規(guī)模、蛋白質(zhì)性質(zhì)及其在發(fā)酵末期的細(xì)胞定位等若干因素。例如，在周質(zhì)中生成重組蛋白質(zhì)要著重考慮該重組蛋白質(zhì)泄漏(leakage)到上清中的水平，由于發(fā)酵中存在一定水平的泄漏，這對從周質(zhì)中所獲重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量和質(zhì)量產(chǎn)生有害影響。如果高水平的重組蛋白質(zhì)泄漏到上清中，則上清的粘性增加，這使通過離心或過濾初步回收細(xì)胞變得更為困難，從而降低從周質(zhì)中所獲蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。細(xì)胞自身在離心過程中也較不強(qiáng)壯，更有可能裂解而破壞蛋白質(zhì)，并再度增加上清中的蛋白質(zhì)水平而降低產(chǎn)量。另一困難在于，由于污染了來自上清的可能未正確折疊或部分降解的重組蛋白質(zhì)，也可能降低提取過程中從周質(zhì)回收的蛋白質(zhì)質(zhì)量。
因此希望通過控制重組蛋白質(zhì)在周質(zhì)和上清之間的分配，來提高重組蛋白質(zhì)的初步回收效率，從而提高獲得的功能性蛋白質(zhì)的最終產(chǎn)量和質(zhì)量。
在本發(fā)明中，我們已經(jīng)能夠證明，通過調(diào)節(jié)大腸桿菌宿主細(xì)胞的生長速率，有可能控制重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的上清和周質(zhì)之間的分配。根據(jù)蛋白質(zhì)在上清和周質(zhì)之間的分配而不必只是根據(jù)產(chǎn)量來選擇合適的生長速率，可以提高所生成的蛋白質(zhì)的質(zhì)量和/或產(chǎn)量。
因此本發(fā)明提供了控制重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的上清和周質(zhì)之間分配的方法，其中所述細(xì)胞的重組蛋白質(zhì)表達(dá)受可誘導(dǎo)系統(tǒng)的控制，該方法包括
a)提供大腸桿菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)物
b)改變大腸桿菌宿主細(xì)胞的生長速率
c)誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)
其中步驟(b)和(c)可以按任何順序或同時進(jìn)行；以及隨后
d)測定培養(yǎng)上清和大腸桿菌宿主細(xì)胞周質(zhì)中的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量
e)將步驟(d)測定的產(chǎn)量與步驟(b)中采用至少一個另外的生長速率所測定的產(chǎn)量相比較
f)通過步驟(e)的比較來選擇生長速率，使重組蛋白質(zhì)在上清和周質(zhì)之間的分配最適于初步回收該重組蛋白質(zhì)。
本發(fā)明所用重組蛋白質(zhì)可能是具有多于大約10個氨基酸的任何肽、多肽或蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)可能來自任何來源，包括細(xì)菌，但更特別來自哺乳動物來源。在一個實施例中，該重組蛋白質(zhì)是抗體。此處所用術(shù)語“抗體”是指諸如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA的任何類型免疫球蛋白分子，例如IgG類型的成員，如IgG1，也指任何抗原結(jié)合免疫球蛋白片段，諸如Fv、Fab、Fab′和F(ab′)2片段，及其任何衍生物，諸如單鏈Fv片段。上述抗體及其片段可能是天然存在、人源化、嵌合或CDR移植抗體，可能使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)來隨意修飾、添加或缺失氨基酸或結(jié)構(gòu)域。制備這些抗體分子的方法為本領(lǐng)域公知(參見例如Shrader等，WO 92/02551；Ward等，1989，Nature，341，544；Orlandi等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，3833；Riechmann等，1988，Nature，322，323；Bird等，1988，Science，242，423；Queen等，US 5,585,089；Adair，WO91/09967；Mountain和Adair，1992，Biotechnol.Genet.Eng.Rev，10，1-142；Verma等，1998，Journal of Immunological Methods，216，165-181)。
本發(fā)明使用的大腸桿菌宿主細(xì)胞可能是能夠生成重組蛋白質(zhì)的天然存在的大腸桿菌菌株或突變菌株。特定宿主大腸桿菌菌株的例子包括MC4100、TG1、TG2、DHB4、DH5α、DH1、BL21、XL1Blue和JM109。例子還包括修飾的大腸桿菌菌株，例如代謝突變體和蛋白酶缺陷菌株。一個優(yōu)選的大腸桿菌菌株是大腸桿菌W3110(ATCC 27，325)，這是供重組蛋白質(zhì)發(fā)酵的常用宿主菌株。
本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)一般在大腸桿菌宿主細(xì)胞的周質(zhì)或宿主細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)，這取決于該蛋白質(zhì)的特性及生產(chǎn)規(guī)模。將蛋白質(zhì)靶向這些區(qū)室的方法為本領(lǐng)域公知，綜述參見Makrides，Microbiological Reviews，1996，60，512-538。指導(dǎo)蛋白質(zhì)到達(dá)大腸桿菌周質(zhì)的合適信號序列的例子包括大腸桿菌PhoA、OmpA、OmpT、LamB和OmpF信號序列。蛋白質(zhì)可能依賴天然分泌途徑或通過誘導(dǎo)外膜的有限泄漏而致蛋白質(zhì)分泌，從而靶向上清，其例子包括使用pelB前導(dǎo)序列、蛋白質(zhì)A前導(dǎo)序列、共表達(dá)細(xì)菌素(bacteriocin)釋放蛋白質(zhì)、絲裂霉素(mitomycin)誘導(dǎo)的細(xì)菌素釋放蛋白質(zhì)連同在培養(yǎng)基中加入甘氨酸以及共表達(dá)kil基因使膜通透化。
本發(fā)明中重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌宿主細(xì)胞中的表達(dá)受可誘導(dǎo)系統(tǒng)的控制。此處所用術(shù)語“可誘導(dǎo)系統(tǒng)”是指可誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)，其中該重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)受可誘導(dǎo)啟動子的控制。許多適用大腸桿菌使用的可誘導(dǎo)啟動子為本領(lǐng)域公知，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)視啟動子而定，可由多種因素誘導(dǎo)，諸如溫度或生長培養(yǎng)基中特定物質(zhì)的濃度(Baneyx，上文；Goldstein和Doi，1995，Biotechnol.Annu.Rev，105-128)。可誘導(dǎo)啟動子的例子包括可由乳糖或非水解性乳糖類似物、異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的大腸桿菌lac、tac和trc啟動子，以及可由磷酸鹽、色氨酸和L-阿拉伯糖分別誘導(dǎo)的pho A，trp和araBAD啟動子。
此處所用術(shù)語“誘導(dǎo)表達(dá)”是指開始誘導(dǎo)的時刻，例如通過添加誘導(dǎo)劑或改變溫度(若為溫度依賴性誘導(dǎo))。在培養(yǎng)物中添加誘導(dǎo)劑進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)時，可能利用任何適當(dāng)方法添加誘導(dǎo)劑，這取決于發(fā)酵系統(tǒng)和誘導(dǎo)劑，例如一次或多次快速添加(shotaddition)，或通過供料逐漸添加誘導(dǎo)劑。應(yīng)當(dāng)理解，添加誘導(dǎo)劑與實際誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)之間可能有延遲，例如當(dāng)誘導(dǎo)劑是乳糖時，會在乳糖之前利用現(xiàn)存的任何碳源，因而在蛋白質(zhì)表達(dá)誘導(dǎo)發(fā)生前可能存在延遲。
本發(fā)明的大腸桿菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)物可能在支持大腸桿菌生長及重組蛋白質(zhì)表達(dá)的任何培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基可能是任何化學(xué)培養(yǎng)基，例如Pirt S.J.(1975)Principles of Microbe and Cell Cultivation，Blackwell Scientific Publications中提供的培養(yǎng)基，為適合此處所述控制生長速率而做些改變。合適培養(yǎng)基的例子有SM6E，由Humphreys等，2002，Protein Expression and Purification，26，309-320所述。
可以在任何適當(dāng)容器中培養(yǎng)大腸桿菌宿主細(xì)胞，諸如搖瓶或發(fā)酵罐，這取決于所需生成規(guī)模。可利用容量大于1,000升直至約100,000升的多種大規(guī)模發(fā)酵罐。優(yōu)選使用1,000-50,000升發(fā)酵罐，更優(yōu)選1,000-10,000升。還可能使用容量0.5-1,000升的較小發(fā)酵罐。
大腸桿菌發(fā)酵可能在任何適當(dāng)系統(tǒng)中進(jìn)行，例如連續(xù)、分批或補(bǔ)料-分批模式(Thiry和Cingolani，2002，Trends in Biotechnology，20，103-105)，取決于蛋白質(zhì)及所需要的產(chǎn)量。分批模式可能用于按需快速添加營養(yǎng)物或誘導(dǎo)劑?；蛘呖赡苁褂醚a(bǔ)料-分批培養(yǎng)，例如，在誘導(dǎo)前，培養(yǎng)物按使用發(fā)酵罐中最初存在的營養(yǎng)物所能維持的最大特定生長速率以分批模式生長，并在誘導(dǎo)后使用一個或多個營養(yǎng)物補(bǔ)料程序來控制生長速率，直至發(fā)酵完成。也可在誘導(dǎo)前使用補(bǔ)料-分批模式來控制大腸桿菌宿主細(xì)胞的代謝，并使其達(dá)到較高的細(xì)胞密度(Lee，1996，Tibtech，14，98-105)。
本發(fā)明中細(xì)胞在蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)之前以任何適當(dāng)生長速率生長。為達(dá)到高生長速率，大腸桿菌宿主細(xì)胞一般在營養(yǎng)物水平、碳源、溫度和氧條件支持這樣生長的培養(yǎng)中生長。本發(fā)明的大腸桿菌宿主細(xì)胞優(yōu)選以高生長速率生長于營養(yǎng)非限制性條件下，以便在誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)表達(dá)之前獲得高細(xì)胞密度?？梢杂萌舾刹煌绞綔y定生長，最常用的是通過測定600nm光密度隨時間的增加來測定細(xì)胞密度的增加。通過OD600測量值的自然對數(shù)對時間作圖，可以測定特定的生長速率?？梢栽谡麄€培養(yǎng)過程中進(jìn)行生長的測定，例如，通過在線測量或在發(fā)酵過程中每隔一定時間從培養(yǎng)物中取樣。優(yōu)選在誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)表達(dá)之前達(dá)到高細(xì)胞密度?？烧T導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)的合適密度的例子介于約60-100 OD600。
在本發(fā)明方法的步驟(b)中，其生長速率對比該方法步驟(a)所提供的大腸桿菌生長速率而變化。步驟(b)中生長速率的改變可能在步驟(c)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)之前、與誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)同時或誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)之后的任何時刻進(jìn)行。在一個實施例中，于步驟(c)之前改變生長速率，在該方法的步驟(a)中培養(yǎng)物以高生長速率生長，直至達(dá)到高細(xì)胞密度，然后改變生長速率，一旦觀察到所要求的生長速率變化，便誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。在一個所述實施例中，于誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)前約1-3小時改變生長速率。在另一實施例中，培養(yǎng)物在該方法的步驟(a)中以高速率生長，在該方法的步驟(c)中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，然后在該方法的步驟(b)中改變生長速率。在一個所述實施例中，于步驟(c)之后約1-3小時改變生長速率。在另一實施例中，細(xì)胞在該方法的步驟(a)中以高速率生長，而步驟(b)和步驟(c)同步進(jìn)行，即幾乎同時，以便就在要誘導(dǎo)時改變生長速率。
可能利用本領(lǐng)域公知的許多不同方法，根據(jù)發(fā)酵系統(tǒng)來控制大腸桿菌宿主細(xì)胞的生長速率(參見例如Lee 1996，Tibtech，14，98-105)。控制生長速率的合適方法包括改變溫度、可利用的氧水平及營養(yǎng)物水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過測試多個濃度并測量對生長速率的作用，能夠?qū)嶒灤_定為達(dá)到特定的生長速率所需的適當(dāng)溫度變化、氧水平或營養(yǎng)物濃度。在一個實施例中，可以利用發(fā)酵開始時存在的營養(yǎng)物諸如氮和磷酸鹽的濃度，根據(jù)誘導(dǎo)過程中營養(yǎng)物耗盡的時刻，來控制生長速率。在本發(fā)明的一個特定實施例中，控制生長速率的營養(yǎng)源是磷酸鹽。此處實施例提供了合適的磷酸鹽濃度，并為本領(lǐng)域已知(參見例如Pirt，S.J.(1975)Principles of Microbe and CellCultivation，Blackwell Scientific Publications)。發(fā)酵開始時存在的合適磷酸鹽濃度的例子包括25-40mM。因此在本發(fā)明一個實施例中，通過在發(fā)酵開始時調(diào)節(jié)細(xì)胞可利用的磷酸鹽水平，來改變步驟(b)中的生長速率。在另一實施例中，可能通過改變例如經(jīng)補(bǔ)料或快速添加(shot addition)而加入培養(yǎng)物中的營養(yǎng)物諸如碳或氮的濃度，來調(diào)節(jié)生長速率。
在本發(fā)明另一個實施例中，通過調(diào)節(jié)大腸桿菌宿主細(xì)胞可利用的碳水平，來改變步驟(b)中的生長速率。可能提高或降低細(xì)胞可利用的碳源水平，以實現(xiàn)所需的生長速率變化。優(yōu)選通過調(diào)節(jié)加入培養(yǎng)物中的碳源的補(bǔ)料速率，來控制生長速率。此處所用術(shù)語“碳源”是指在生長期間可為大腸桿菌用作能源的碳源，包括糖諸如葡萄糖、乳糖、蔗糖和果糖以及其它碳源諸如甘油、琥珀酸和乳酸。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，碳源是甘油。宿主細(xì)胞優(yōu)選于補(bǔ)料-分批發(fā)酵罐中培養(yǎng)，并且碳源是按適當(dāng)?shù)难a(bǔ)料速率供給的甘油，以提供所需的生長速率。適當(dāng)?shù)母视脱a(bǔ)料速率為本領(lǐng)域公知并包括此處提供的實施例中所述速率。適當(dāng)?shù)母视脱a(bǔ)料速率包括0.5-11ml/h。
此處所用術(shù)語“分配”是指重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌宿主細(xì)胞周質(zhì)及其所生長的上清之間的分布。在本方法步驟(d)中測定周質(zhì)和上清中的產(chǎn)量，以確定重組蛋白質(zhì)的分配?？稍诖竽c桿菌宿主細(xì)胞整個培養(yǎng)期間按合適的時間間隔(例如約每2-4小時)取樣，或者在收獲的時候(例如誘導(dǎo)后約24-36小時)取樣，測定產(chǎn)量。許多蛋白質(zhì)定量方法為本領(lǐng)域公知，包括諸如凝膠電泳、HPLC、層析方法以及免疫檢測方法諸如western印跡和ELISA。例如，可以按Humphreys等，2002，Protein Expression and Purification，26，309-320所述，利用Fab′裝配ELISA測定周質(zhì)提取物和培養(yǎng)上清中的Fab′濃度。
在本發(fā)明方法的步驟(e)中，將步驟(b)中按照兩種或多種不同生長速率生長的大腸桿菌宿主細(xì)胞的上清和周質(zhì)中的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量做比較，以便找到一個生長速率，可以得到最適于初步回收該蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分配。優(yōu)選在步驟(d)中，于每一生長速率誘導(dǎo)后大約相同時間，測定步驟(e)中所要比較的產(chǎn)量。應(yīng)當(dāng)理解，這未必總是可能的，尤其對于按較高生長速率生長的培養(yǎng)物而言，比按較低生長速率生長的培養(yǎng)物更早達(dá)到最大生物量。
本方法步驟(b)中的生長速率變化可能是提高或降低生長速率。步驟(a)中所提供的培養(yǎng)物可能在營養(yǎng)非限制性或營養(yǎng)限制性條件下，按任何適宜的生長速率生長。步驟(a)所提供的培養(yǎng)物優(yōu)選在營養(yǎng)非限制性條件下，按該條件下可能的最大特定生長速率生長。在一個實施例中，步驟(a)中大腸桿菌宿主細(xì)胞的生長速率介于約0.1-0.25/h，優(yōu)選介于0.13-0.22/h。優(yōu)選生長速率在本方法步驟(b)中降低。生長速率可能降至高于0/h的任何可能的生長速率，優(yōu)選介于0/h和步驟(a)所提供的生長速率之間。通過測試至少兩個不同的生長速率并在本方法步驟(e)中做比較，可經(jīng)驗地確定合適的生長速率。每一生長速率可在平行和/或連續(xù)生長的兩個或多個單獨培養(yǎng)物中進(jìn)行測試。在一個實施例中，步驟(b)中的每次培養(yǎng)均有利用不同生長速率同時生長的至少兩個培養(yǎng)物。在另一實施例中，步驟(b)中的每次培養(yǎng)均有利用不同生長速率先后生長的至少兩個培養(yǎng)物。或者，利用步驟(b)中的一個生長速率完成步驟(a)-(d)，然后每次改變步驟(b)中的生長速率，至少再一次完成步驟(b)和(d)，從而可在單一培養(yǎng)中測試兩個或多個不同的生長速率。應(yīng)當(dāng)理解，如果本方法步驟(e)未能確定合適的生長速率，則可重復(fù)本方法的步驟(a)-(d)來測試其它的生長速率。通常測試介于0/h與步驟(a)中培養(yǎng)物生長速率之間的一系列不同生長速率。首次測試的不同生長速率的范圍可能跨越高、低生長速率的很大范圍，如果需要，隨后可通過在步驟(b)中使用較窄的生長速率范圍來重復(fù)本方法步驟(a)-(d)，從而縮小其范圍。例如，供首次測試的合適生長速率可能比營養(yǎng)非限制性條件下的生長速率低約2-約200倍。在一個實施例中，生長速率比營養(yǎng)非限制性條件下的生長速率低約5-約200倍。或者，首次測試的不同生長速率的范圍可能是例如高或低生長速率的很窄范圍，如果需要，隨后可通過在步驟(b)中使用較寬的生長速率范圍來重復(fù)本方法步驟(a)-(d)，從而拓寬其范圍。例如，供首次測試的合適生長速率可能比營養(yǎng)非限制性條件下的生長速率低約2-約50倍或低約100-約200倍。在一個實施例中，生長速率比營養(yǎng)非限制性條件下的生長速率低約5-約20倍。步驟(b)中的合適生長速率可能包括0.0005-0.04/h范圍內(nèi)的生長速率。
一旦比較了重組蛋白質(zhì)在兩個或多個不同生長速率的分配，便在本方法步驟(f)中選擇最適于初步回收該重組蛋白質(zhì)的生長速率。此處所用術(shù)語“初步回收”是指制備適于后續(xù)純化步驟的無細(xì)胞上清或周質(zhì)提取物所需的最初回收步驟。初步回收步驟的例子包括離心、過濾、細(xì)胞提取或裂解、勻漿化、濃縮、透析以及擴(kuò)張床吸附。最適于蛋白質(zhì)初步回收的生長速率即為經(jīng)一步或多步初步回收步驟后可得到最佳蛋白質(zhì)產(chǎn)量和/或質(zhì)量的生長速率。此處所用術(shù)語“質(zhì)量”是指所得蛋白質(zhì)的完整性(integrity)，其是否完整和/或正確折疊。重要的是，最合適的生長速率可能不是在大腸桿菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)最大產(chǎn)量的生長速率，而可能是導(dǎo)致蛋白質(zhì)在周質(zhì)和上清之間最佳分配的生長速率，從而在經(jīng)過一個或多個初步回收步驟后將會得到較好質(zhì)量和/或較高產(chǎn)量的蛋白質(zhì)。因此，步驟(f)所選擇的生長速率可能是培養(yǎng)過程中的蛋白質(zhì)產(chǎn)量與最后回收的蛋白質(zhì)最終產(chǎn)量和質(zhì)量之間的權(quán)衡。
在一個實施例中，重組蛋白質(zhì)可能表達(dá)于大腸桿菌宿主細(xì)胞的周質(zhì)，因為這比上清更易于大規(guī)模處理。所需的第一個初步純化步驟是利用離心或過濾從培養(yǎng)基中回收宿主細(xì)胞。對于周質(zhì)中生成的蛋白質(zhì)而言，一個重要考慮是泄漏到上清中的重組蛋白質(zhì)水平，因為這對周質(zhì)蛋白質(zhì)的初步回收及質(zhì)量有壞影響。上清中增加的蛋白質(zhì)提高了上清的粘性，致使通過離心或過濾回收細(xì)胞變得更為困難并降低周質(zhì)蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。細(xì)胞自身在離心過程中也較不強(qiáng)壯，更有可能裂解而導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)破壞，并進(jìn)一步因蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)釋放而增加上清粘性，從而再度降低周質(zhì)中重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。也可能因污染了上清中可能部分降解或未正確折疊的重組蛋白質(zhì)而降低從周質(zhì)中回收的重組蛋白質(zhì)的質(zhì)量。因此在這些培養(yǎng)物中，重要的是保持上清中重組蛋白質(zhì)水平低，以提高初步回收后重組蛋白質(zhì)的質(zhì)量和/或產(chǎn)量。在此實施例中，通過選擇上清中重組蛋白質(zhì)水平低時的生長速率，即使周質(zhì)中重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量比上清中重組蛋白質(zhì)水平較高時的其它生長速率時要低，也可能提高初步回收后所得重組蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量和/或質(zhì)量。因此，本發(fā)明方法對于周質(zhì)中生成的蛋白質(zhì)，優(yōu)選步驟(f)選擇的生長速率使超過55％的蛋白質(zhì)在周質(zhì)中表達(dá)，而少于45％的蛋白質(zhì)在上清中表達(dá)。優(yōu)選宿主細(xì)胞所生成的蛋白質(zhì)超過80％在周質(zhì)中表達(dá)，而少于20％在上清中表達(dá)。在一個實施例中，宿主細(xì)胞所生成的蛋白質(zhì)超過90％在周質(zhì)中表達(dá)，而少于10％在上清中表達(dá)。在另一實施例中，宿主細(xì)胞所生成的蛋白質(zhì)超過95％在周質(zhì)中表達(dá)，而少于5％在上清中表達(dá)。
在另一實施例中，可在上清中生成蛋白質(zhì)?？紤]到不需提取步驟以及培養(yǎng)基中存在的宿主蛋白質(zhì)較少，可能更容易純化蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)降解較少并可能改善蛋白質(zhì)的折疊，蛋白質(zhì)的質(zhì)量也可能較好。對于上清中生成的蛋白質(zhì)，重要的是使宿主細(xì)胞表達(dá)并分泌到上清中的重組蛋白質(zhì)的量最大化。為確定是否宿主細(xì)胞所生成的所有重組蛋白質(zhì)都分泌到上清中，重要的是也測定周質(zhì)中的重組蛋白質(zhì)水平。如果仍然較高，則可利用本發(fā)明方法來調(diào)節(jié)該重組蛋白質(zhì)的分配，以進(jìn)一步提高上清中的產(chǎn)量。因此，本發(fā)明方法對于上清中生成的蛋白質(zhì)，優(yōu)選步驟(f)中選擇的生長速率使超過55％的蛋白質(zhì)在上清中表達(dá)，而少于45％的蛋白質(zhì)在周質(zhì)中表達(dá)。優(yōu)選宿主細(xì)胞所生成的蛋白質(zhì)超過80％在上清中表達(dá)，而少于20％在周質(zhì)中表達(dá)。在另一個實施例中，宿主細(xì)胞所生成的蛋白質(zhì)超過90％在上清中表達(dá)，而少于10％在周質(zhì)中表達(dá)。在另一實施例中，宿主細(xì)胞所生成的蛋白質(zhì)超過95％在上清中表達(dá)，而周質(zhì)中少于5％。
確定了本方法步驟(f)的合適生長速率后，則可在大腸桿菌宿主細(xì)胞后續(xù)發(fā)酵過程中使用相同的生長速率，確保重組蛋白質(zhì)在上清和周質(zhì)之間達(dá)到所需分配。本發(fā)明因而還提供了在大腸桿菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中生成重組蛋白質(zhì)的方法，其中所述細(xì)胞的重組蛋白質(zhì)表達(dá)受可誘導(dǎo)系統(tǒng)的控制，并且該重組蛋白質(zhì)在上清和周質(zhì)之間的分配最適于初步回收該重組蛋白質(zhì)，所述方法包括大腸桿菌宿主細(xì)胞按上述方法步驟(f)所選定的生長速率生長。后續(xù)發(fā)酵可能與上述方法所用的規(guī)模相同或不同。例如，可能小規(guī)模發(fā)酵大腸桿菌宿主細(xì)胞，來確定最適于初步回收蛋白質(zhì)的生長速率，然后在后續(xù)發(fā)酵中使用步驟(f)選定的生長速率大規(guī)模發(fā)酵宿主細(xì)胞，以生成大量重組蛋白質(zhì)。
本發(fā)明方法所生成的重組蛋白質(zhì)可經(jīng)初步回收，隨后純化。所用初步回收步驟取決于發(fā)酵末期的重組蛋白質(zhì)定位。例如，周質(zhì)中表達(dá)的蛋白質(zhì)可通過離心或過濾從宿主細(xì)胞中回收。然后可以使用諸如熱處理(參見例如US 5,665,866)或機(jī)械提取方法從細(xì)胞內(nèi)提取蛋白質(zhì)。回收上清中表達(dá)的蛋白質(zhì)可使用諸如擴(kuò)張床吸附或離心或過濾方法去除細(xì)胞，然后通過例如離子交換或親和層析捕獲蛋白質(zhì)。然后可根據(jù)重組蛋白質(zhì)的特性及其物理性質(zhì)諸如大小、疏水性和等電點，使用本領(lǐng)域已知的任何方法來純化周質(zhì)提取物或上清中的蛋白質(zhì)。所述方法可能包括分子大小排阻層析、疏水性相互作用層析、離子交換、親和層析和反相HPLC。因此本發(fā)明另一方面提供了在大腸桿菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中生成重組蛋白質(zhì)的方法，其中所述細(xì)胞的重組蛋白質(zhì)表達(dá)受可誘導(dǎo)系統(tǒng)的控制，并且該重組蛋白質(zhì)在上清和周質(zhì)之間的分配最適于初步回收該重組蛋白質(zhì)，所述方法包括大腸桿菌宿主細(xì)胞按上述方法步驟(f)所選定的生長速率生長，然后純化該重組蛋白質(zhì)。
實施例
現(xiàn)僅通過實施例描述本發(fā)明，并參考


圖1.一系列甘油補(bǔ)料速率下的大腸桿菌生長曲線
圖2.一系列甘油補(bǔ)料速率下的大腸桿菌誘導(dǎo)后生長速率
圖3.一系列甘油補(bǔ)料速率下生長的大腸桿菌培養(yǎng)物周質(zhì)和上清之間的Fab′A分配
圖4.一系列無機(jī)磷酸鹽濃度下的大腸桿菌生長曲線
圖5.一系列無機(jī)磷酸鹽濃度下的大腸桿菌誘導(dǎo)后生長速率
圖6.一系列無機(jī)磷酸鹽濃度下生長的大腸桿菌培養(yǎng)物周質(zhì)和上清之間的Fab′B分配
實施例1
使用有限甘油補(bǔ)料控制誘導(dǎo)后生長，來優(yōu)化Fab′A的分配及產(chǎn)量
材料和方法
菌株和質(zhì)粒。本工作中所用菌株是經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110(ATCC 27325)，該質(zhì)粒提供四環(huán)素抗性并帶有編碼Fab′片段Fab′A的輕、重鏈多肽成分的基因。每一多肽前置有大腸桿菌OmpA前導(dǎo)肽。由單個tac啟動子誘導(dǎo)表達(dá)，使輕、重鏈多肽合成并分泌到周質(zhì)，在此部分多肽折疊并裝配成Fab′。
生長培養(yǎng)基
發(fā)酵生長培養(yǎng)基是基于含3.86g/l NaH2PO4.H2O和112g/l甘油的SM6E培養(yǎng)基(Humphreys等，2002，Protein Expression andPurification，26，309-320所述)。
種菌.種菌培養(yǎng)物在添加10μg/ml四環(huán)素的相同培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)物于30℃攪拌溫育約22小時。
發(fā)酵.將0.3-0.5 OD600的種菌培養(yǎng)物接種到發(fā)酵罐中(總體積2.5升)。在生長期保持溫度30℃，誘導(dǎo)前降到25℃。通過不同的攪拌和氣流保持溶氧濃度大于30％空氣飽和度。通過15％(v/v)NH4OH和10％(v/v)濃度的H2SO4自動滴定，來控制培養(yǎng)物pH為7.0。加入10％(v/v)Struktol J673溶液(Schill and Seilacher)來控制發(fā)泡。
在發(fā)酵不同階段加入若干添加劑。生物量濃度達(dá)到約40 OD600時，加入鎂鹽和NaH2PO4.H2O。在誘導(dǎo)期之前及期間再次加入NaH2PO4.H2O，確保磷酸鹽保持過量。當(dāng)發(fā)酵開始時存在的甘油耗盡后(約75 OD600)，按0.5-10.9ml/h的速率連續(xù)補(bǔ)料80％(w/w)甘油。在發(fā)酵同時按1ml/h速率補(bǔ)料IPTG 36小時，使此時發(fā)酵罐中IPTG終濃度為0.5mM。啟動IPTG補(bǔ)料即視為誘導(dǎo)開始。發(fā)酵一般在較低甘油補(bǔ)料速率下(0.5-2.5ml/h)進(jìn)行70-73小時，在較高甘油補(bǔ)料速率下(5.4-10.9ml/h)進(jìn)行50-60小時。
測定生物量濃度(Biomass concentration)及生長速率。通過測量培養(yǎng)物600nm的光密度來測定生物量濃度。生長速率(μ)與生物量濃度隨時間的變化相關(guān)，即
LnXt＝LnX0+μt
其中X0是初始生物量濃度，Xt是時間間隔t之后的生物量濃度。因此，分批培養(yǎng)物的LnXt對t作圖得到斜率為μ(單位/小時)的直線。然而，給予分批培養(yǎng)物線性限制性的甘油補(bǔ)料，會由于生物量及培養(yǎng)體積的增加而導(dǎo)致生長速率下降。因此，通過LnOD600對時間作圖，可確定誘導(dǎo)期間的平均生長速率。(按最小拉丁方法(the least squaresmethod))測定最佳擬和的直線斜率，得到整個補(bǔ)料期間的平均生長速率。
周質(zhì)提取.從培養(yǎng)物樣品中離心收集細(xì)胞。保留上清部分(-20℃)供進(jìn)一步分析。細(xì)胞沉淀部分重懸于原始培養(yǎng)體積的提取緩沖液(100mM Tris-HCl，10mM EDTA；pH 7.4)。在60℃溫育約16小時后，通過離心澄清提取物，保留上清部分(-20℃)供進(jìn)一步分析。
Fab′定量.可以按Humphreys等，2002，Protein Expression andPurification，26，309-320所述，利用Fab′裝配ELISA(assemblyELISA)測定周質(zhì)提取物和培養(yǎng)上清中的Fab′濃度。
結(jié)果
誘導(dǎo)前生長無限制，按最大特定速率(μmax)生長，但接下來在誘導(dǎo)后受限制，在此條件下進(jìn)行Fab′A發(fā)酵(圖1)。按一系列流速對分批培養(yǎng)物給予營養(yǎng)物(甘油)限制性補(bǔ)料，從而控制誘導(dǎo)后的生長速率。選擇可以達(dá)到一系列超過約0/h生長速率的甘油流速。圖2和表1顯示在一系列甘油補(bǔ)料速率下，整個誘導(dǎo)期間的實際平均生長速率。提高甘油補(bǔ)料速率引起培養(yǎng)物所希望的平均生長速率增加。
表1.一系列甘油補(bǔ)料速率下生長的大腸桿菌培養(yǎng)物的平均生長速率。
低甘油補(bǔ)料速率下(0.5-2.5ml/h)誘導(dǎo)后約36小時以及高甘油補(bǔ)料速率下(5.4-10.9ml/h)誘導(dǎo)后約24小時收獲發(fā)酵物，利用Fab′裝配ELISA測定周質(zhì)提取物及培養(yǎng)上清的Fab′濃度。圖3顯示Fab′濃度以及在周質(zhì)和培養(yǎng)上清之間的相對分布。發(fā)現(xiàn)對于Fab′滴度的最適生長速率約為0.0075/h。觀察到一般趨勢，即培養(yǎng)上清中Fab′滴度隨生長速率增加而增加。因此，為優(yōu)化發(fā)酵效能、Fab′產(chǎn)量以及初步回收適合性而選擇的生長速率應(yīng)反映最大產(chǎn)量與最佳Fab′分布之間的平衡。在所述實施例中，選擇甘油補(bǔ)料速率1.6ml/h(生長速率～0.0071/h)用于發(fā)酵放大。
實施例2
通過改變磷酸鹽濃度以控制誘導(dǎo)后生長速率，來優(yōu)化Fab′B的分布及產(chǎn)量
材料和方法
菌株和質(zhì)粒.本工作中所用菌株是經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110(ATCC 27325)，該質(zhì)粒提供四環(huán)素抗性并帶有編碼Fab′片段Fab′B的輕、重鏈多肽成分的基因。由單個tac啟動子誘導(dǎo)表達(dá)，使輕、重鏈多肽合成并分泌到周質(zhì)，在此部分多肽折疊并裝配成Fab′。
生長培養(yǎng)基.
發(fā)酵生長培養(yǎng)基是基于含表2所示濃度的NaH2PO4.H2O的SM6E培養(yǎng)基(Humphreys等，2002，Protein Expression and Purification，26，309-320所述)。
表2.Fab′B發(fā)酵所用NaH2PO4.H2O的量及濃度
種菌.種菌培養(yǎng)物在含合適濃度NaH2PO4.H2O(參見表2)并添加10μg/ml四環(huán)素的相同培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)物于30℃振搖溫育約19-26小時。
發(fā)酵.將0.3-0.5 OD600的種菌培養(yǎng)物接種到發(fā)酵罐中(總體積2.5升)。在生長期保持溫度30℃，誘導(dǎo)前降到27℃。通過不同的攪拌和氣流保持溶氧濃度大于30％空氣飽和度。通過15％(v/v)NH4OH和10％(v/v)濃度的H2SO4自動滴定，來控制培養(yǎng)物pH為7.0。加入10％(v/v)Mazu溶液來控制發(fā)泡。
在發(fā)酵不同階段加入多種添加劑。在發(fā)酵中按2×45ml等份的80％(w/w)溶液加入甘油，一次在生物量濃度為20 OD600時添加，另一次在40 OD600時。生物量濃度達(dá)到約40 OD600時，再加入鎂鹽和鈣鹽。在60 OD600時加入乳糖(60ml 50％(w/w)溶液)，作為誘導(dǎo)期間的誘導(dǎo)劑和碳源。甘油耗盡后發(fā)生誘導(dǎo)(約75-90 OD600)，其標(biāo)志是溶氧濃度增加。按照需要另外加入乳糖，以保持發(fā)酵罐中濃度為0-55g/l。誘導(dǎo)后0-2小時另外加入鎂。發(fā)酵一般進(jìn)行56-61小時。
發(fā)酵分析.如前所述(實施例1)測定周質(zhì)提取物的生物量并定量Fab′。
結(jié)果
通過改變磷酸鹽(NaH2PO4.H2O)的量而保持所有其它初始營養(yǎng)物恒定，來控制誘導(dǎo)后發(fā)酵培養(yǎng)物的生長(圖4)。在生物量增加的誘導(dǎo)期間，測定每次發(fā)酵的生長速率(圖5和表3)。
表3.一系列磷酸鹽濃度下生長的大腸桿菌培養(yǎng)物的平均生長速率。
增加磷酸鹽濃度導(dǎo)致整個誘導(dǎo)期間的生長速率增加。選擇磷酸鹽濃度以便在誘導(dǎo)的不同時間點耗盡(誘導(dǎo)稍前，例如26.9mM，至誘導(dǎo)后不同時間點)。發(fā)生誘導(dǎo)的時刻(生物量濃度)與起始甘油濃度有關(guān)。根據(jù)Pirt，S.J.(1975)Principles of Microbe and CellCultivation，Blackwell Scientific Publications提供的無機(jī)磷酸鹽生物量產(chǎn)量系數(shù)數(shù)據(jù)，計算支持生長至要求的誘導(dǎo)生物量所需磷酸鹽數(shù)量。如此處所述，經(jīng)驗地確定適于Fab′產(chǎn)量及分布的最適磷酸鹽濃度。
誘導(dǎo)后28-31小時收獲發(fā)酵物，通過Fab′裝配ELISA測定周質(zhì)提取物及培養(yǎng)上清的Fab′濃度。圖6顯示收獲時周質(zhì)和培養(yǎng)上清的Fab′濃度。觀察到一般趨勢，即培養(yǎng)上清中Fab′濃度隨磷酸鹽濃度增加而增加。使用周質(zhì)提取物及離心/過濾方法大規(guī)模初步純化的最適磷酸鹽范圍是29.8mM。
權(quán)利要求
1.控制重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的上清和周質(zhì)之間分配的方法，其中所述細(xì)胞的重組蛋白質(zhì)表達(dá)受可誘導(dǎo)系統(tǒng)的控制，該方法包括
a)提供大腸桿菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)物
b)改變大腸桿菌宿主細(xì)胞的生長速率
c)誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)
其中步驟(b)和(c)可以按任何順序或同時進(jìn)行；以及隨后
d)測定培養(yǎng)上清和大腸桿菌宿主細(xì)胞周質(zhì)中的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量
e)將步驟(d)測定的產(chǎn)量與步驟(b)中采用至少一個另外的生長速率所測定的產(chǎn)量相比較
f)通過步驟(e)的比較來選擇生長速率，使重組蛋白質(zhì)在上清和周質(zhì)之間的分配最適于初步回收該重組蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(e)所比較的產(chǎn)量是來自步驟(b)中各培養(yǎng)物采用不同生長速率而同時生長的至少兩個培養(yǎng)物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(e)所比較的產(chǎn)量是來自步驟(b)中各培養(yǎng)物采用不同生長速率而先后生長的至少兩個培養(yǎng)物。
4.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(e)所比較的產(chǎn)量是來自按至少兩種不同生長速率生長的一個培養(yǎng)物，即在步驟(b)中采用一種生長速率完成步驟(a)-(d)，然后每次改變步驟(b)的生長速率，再至少進(jìn)行一次步驟(b)和(d)。
5.權(quán)利要求1-4的方法，其中降低步驟(b)的生長速率。
6.權(quán)利要求1-5的方法，其中改變步驟(b)中大腸桿菌宿主細(xì)胞生長速率包括調(diào)節(jié)細(xì)胞可利用的碳水平。
7.權(quán)利要求6的方法，其中碳源選自葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘油、琥珀酸和乳酸。
8.權(quán)利要求7的方法，其中碳源是甘油。
9.權(quán)利要求1-8的方法，其中改變步驟(b)中大腸桿菌宿主細(xì)胞生長速率包括調(diào)節(jié)細(xì)胞可利用的磷酸鹽水平。
10.權(quán)利要求1-9的方法，其中改變步驟(b)中大腸桿菌宿主細(xì)胞生長速率包括調(diào)節(jié)細(xì)胞可利用的氧水平。
11.權(quán)利要求1-10的方法，其中重組蛋白質(zhì)靶向周質(zhì)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中步驟(f)所選擇的生長速率是使宿主細(xì)胞生成的重組蛋白質(zhì)80％以上在周質(zhì)中表達(dá)。
13.權(quán)利要求1-10的方法，其中重組蛋白質(zhì)靶向上清。
14.權(quán)利要求13的方法，其中步驟(f)所選擇的生長速率是使宿主細(xì)胞生成的重組蛋白質(zhì)80％以上在上清中生成。
15.權(quán)利要求1-14的方法，其中該可誘導(dǎo)系統(tǒng)包含1ac衍生的啟動子。
16.權(quán)利要求15的方法，其中1ac衍生的啟動子是1ac、tac或trc。
17.權(quán)利要求15或16的方法，其中該啟動子由乳糖或IPTG誘導(dǎo)。
18.權(quán)利要求1-17的方法，其中該重組蛋白質(zhì)是抗體或其片段。
19.權(quán)利要求18的抗體，其中該抗體是IgG。
20.權(quán)利要求18的抗體片段，其中該片段是Fab、Fab′、F(ab′)2或scFv。
21.在大腸桿菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中生成重組蛋白質(zhì)的方法，其中所述細(xì)胞的重組蛋白質(zhì)表達(dá)受可誘導(dǎo)系統(tǒng)的控制，并且該重組蛋白質(zhì)在上清和周質(zhì)之間的分配最適于初步回收該重組蛋白質(zhì)，所述方法包括大腸桿菌宿主細(xì)胞按權(quán)利要求1中步驟(f)所選定的生長速率生長。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所生成的重組蛋白質(zhì)隨后被純化。
全文摘要
本發(fā)明提供了控制重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的上清和周質(zhì)之間分配的方法，其中所述細(xì)胞的重組蛋白質(zhì)表達(dá)受可誘導(dǎo)系統(tǒng)的控制，該方法包括a)提供大腸桿菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，b)改變大腸桿菌宿主細(xì)胞的生長速率，c)誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)，其中步驟(b)和(c)可以按任何順序先后或同時進(jìn)行；以及隨后d)測定培養(yǎng)上清和大腸桿菌宿主細(xì)胞周質(zhì)中的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量，e)將步驟(d)測定的產(chǎn)量與步驟(b)中使用至少一個另外的生長速率所測定的產(chǎn)量相比較，f)通過步驟(e)的比較來選擇生長速率，使重組蛋白質(zhì)在上清和周質(zhì)之間的分配最適于初步回收該重組蛋白質(zhì)。
文檔編號C07K16/00GK1849389SQ20048002588
公開日2006年10月18日 申請日期2004年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月9日
發(fā)明者D·J·格洛弗, M·塞德夫, D·G·里克斯 申請人:塞爾技術(shù)R&D有限公司