專利名稱：Fsh糖基化突變體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有卵泡刺激激素活性的多肽、這些多肽的制備方法以及這些多肽在治療中的應用，特別是用于治療生殖障礙。
背景技術：
a.促性腺激素卵泡刺激激素(FSH)是對人生育具有關鍵作用的促性腺激素家族其中一個成員。促性腺激素還包括黃體生成素(LH)和絨毛膜促性腺激素(CG)，都是異二聚體，各包括一個共同的α-亞基(92個氨基酸)和一個獨有的β-亞基(FSH的β-亞基有111個氨基酸)。α和β亞基的成熟形式的氨基酸序列分別示于SEQID NO1和SEQ ID NO2。
人FSH已經(jīng)由腦下垂體和絕經(jīng)后尿(EP 322，438)分離出來，并且已經(jīng)在哺乳動物細胞中重組產(chǎn)生(US5,639,640，US5,156,957，US4,923,805，US4,840,896，US5,767,251，EP211，894和EP521,586)。后者文獻也公開了人FSH β-亞基基因。美國專利US5,405,945公開了經(jīng)修飾的僅包含一個內含子的人α-亞基基因。
Liu等(J Biol Chem 1993，15；268(2)21613-7)、Grossmann等(MolEndocrinol 1996 10(6)769-79)、Roth和Dias(Mol Cell Endocrinol 19951；109(2)143-9)、Valove等(Endocrinology 1994；135(6)2657-61)、Yoo等(J BiolChem 1993 25；268(18)13034-42)、US5,508,261以及Chappel等(HumanReproduction，1998，13(3)1835)揭示了各種關于結構-功能關系的研究并鑒定了參與受體結合和激活以及參與FSH二聚化的氨基酸殘基。
b.促性腺激素在輔助生殖技術中的應用促性腺激素在生殖周期中發(fā)揮重要作用，在外源性療法中使用促性腺激素是諸如體外受精(IVF)、體外受精與胞漿內精子注射結合(IVF/ICSI)和胚胎移植(ET)等輔助生殖技術(ART)以及通過天然方式或宮內受精(IUI)接受體內受精的不孕病人排卵誘導(OI)所必需的。
美國專利US4,589,402和US4,845,077公開了不含LH的純化人FSH及其在體外受精中的用途。EP322438公開了一種基本上沒有LH活性但具有至少6200U/mg FSH活性的蛋白質，其中FSHα-亞基和β-亞基可以分別是野生型或其特定的截短形式。
要獲得治療效果，需要較長治療時間，一般要連續(xù)8至10日有時甚至長達21日刺激婦女的卵泡生成，要長達18個月誘導促性腺激素分泌不足的男性的精子生成。重組hFSH通常每日經(jīng)肌內(i.m.)或皮下(s.c.)途徑注射來給予，結果給病人帶來不適，并且局部注射部位可能產(chǎn)生反應。減少給藥頻率有利于治療，并使促性腺激素的給藥更方便，更有耐藥性，感覺更舒適。
c.FSH的糖基化促性腺激素是糖蛋白，每個亞基帶有對體內活性和功能非常重要的天冬酰胺聯(lián)的(N-聯(lián)的)低聚糖側鏈。多肽中加入碳水化合物(糖基化)是翻譯后事件，結果是將糖鏈加入特定的天冬酰胺(N-聯(lián)的)或絲氨酸/蘇氨酸(O-聯(lián)的)氨基酸中。與糖蛋白類蛋白質部分的不變氨基酸序列相反，碳水化合物結構是變化的，這個特征稱為微不均一性。例如，同一蛋白質上N-糖基化位點可含有不同的碳水化合物結構。此外，對于一給定糖蛋白上相同糖基化位點，也可以有不同的碳水化合物結構。這種不均一性是非模板引導合成碳水化合物的結果。
蛋白質的N-糖基化具體發(fā)生在共有模式Asn-Xaa-Ser/Thr上，在較少情況下發(fā)生在共有模式Asn-Xaa-Cys上，其中Xaa可以是任何氨基酸殘基。不過，一個共有三肽的存在不足以確保天冬酰胺殘基發(fā)生糖基化。例如，Asn-Pro-Ser/Thr序列的N-糖基化速率比Asn-Xaa-Ser/Thr的其它共有模式低50倍。
人FSH含有4個N-聯(lián)糖基化位點兩個在共同的α-亞基的位置52和78上，另外兩個在β-亞基的位置7和24上。與FSH的α-亞基相連的碳水化合物是二聚體組裝、整合、信號轉導的關鍵，而β-亞基碳水化合物對二聚體組裝、分泌以及將異二聚體從循環(huán)中清除是十分重要的。
Galway等(Endocrinology 1990；127(1)93-100)論證了在N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶-I CHO細胞系或缺乏唾液酸轉運的CHO細胞系中產(chǎn)生的FSH突變體具有與野生型細胞分泌的FSH或純化垂體FSH相同的體外活性，但沒有體內活性，這可能是由于糖基化不足夠的突變體在血清中很快被清除所致。D′Antonio等(Human Reprod 1999；14(5)1160-7)描述了在血流中循環(huán)的各種FSH同種型。這些同種型具有相同氨基酸序列，但它們的翻譯后修飾程度不同。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，酸性較弱的同種型組別比酸性同種型組別在體內更快被清除，這可能是同種型之間唾液酸含量不同所致。另外，Bishop等(Endocrinology1995；136(6)2635-40)認為循環(huán)半衰期似乎是體內活性的主要決定因子。由這些觀察結果可以推斷，導入附加糖基化位點以增加多肽的唾液酸含量可以延長FSH的半衰期。
d.FSH突變體將hCG(CTP)的羧基末端肽與天然重組人FSH(rhFSH)融合，已經(jīng)獲得了半衰期延長的FSH激動劑。CTP部分由氨基酸112-118至145組成，有4個O-聯(lián)的糖基化位點，分別位于位置121、127、132和138上。美國專利US5,338,835和US5,585,345公開了一種修飾FSH β-亞基，它在hCG的CTP部分C-末端Glu延伸。這種修飾類似物據(jù)說具有天然FSH的生物活性，但其循環(huán)半衰期較長。美國專利US5,405,945公開了hCG β-亞基的羧基末端部分或其突變體對CG、FSH和LH的清除產(chǎn)生重大的影響。
美國專利US5,883,073公開了一些單鏈蛋白質，它們由對CG、TSH、LH和FSH有激動活性或拮抗活性的兩個α-亞基組成。美國專利US5,508,261公開了一些對LH和FSH受體有結合親和力的異二聚體多肽，它們含有一個糖蛋白激素α-亞基和一個非天然存在的β-亞基多肽，其中所述β-亞基多肽是包含4個相連接次序列(subsequences)的氨基酸鏈，其中各個次序列選自一列特定的序列。Klein等(2003)公開了一個半衰期延長了的單鏈FSH類似物，其中α-和β-亞基由含有2個N-聯(lián)糖基化位點的寡肽偶接。
WO 01/58493公開了嘗試提高FSH體內半衰期而可以在FSH α-亞基實施的77種突變以及在FSH β-亞基實施的51種突變。WO 01/58493公開了突變的α-和β-亞基可獨立使用(1個附加糖基化位點)或結合使用(2個附加糖基化位點)。利用FSH三維結構的50個模型鑒定了128種候選突變體，它們是只基于hCG結構以及FSH與hCG的序列對比而產(chǎn)生的，盡管hCG與FSH的β-亞基之間僅有32％同一性。WO 01/58493沒有揭示FSH的任何α-或β-亞基的生產(chǎn)或測試，其中所述FSH的糖基化位點是通過定點誘變技術導入的。
因此，臨床上需要一種產(chǎn)物，它提供部分或全部與FSH相關的治療效果，與現(xiàn)有的FSH產(chǎn)品相比給藥頻率較少，其循環(huán)FSH活性的水平與目前治療相比最好更穩(wěn)定。
本發(fā)明針對這樣的產(chǎn)品及制備這樣的產(chǎn)品的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及一種突變的FSH，其中FSH α-亞基包含SEQ ID NO3所示的序列，F(xiàn)SH β-亞基包含SEQ ID NO4所示的序列。該突變的FSH的N-糖基化可發(fā)生在所述突變的FSH的天冬酰胺殘基0、1、2、3、4、5或6上。突變的α亞基的N83可以是糖基化的。突變的β亞基的N55可以是糖基化的。
本發(fā)明還涉及一種分離的DNA，其編碼包含SEQ ID NO3所示序列的FSH α-亞基突變體。本發(fā)明還涉及一種分離的DNA，其編碼包含SEQ IDNO4所示序列的FSH β-亞基突變體。
本發(fā)明還涉及一種含有DNA的載體，其中所述DNA編碼包含SEQ IDNO3所示序列的FSH α-亞基突變體。所述載體可以是表達載體。
本發(fā)明還涉及一種含有DNA的載體，其中所述DNA編碼包含SEQ IDNO4所示序列的FSH β-亞基突變體。所述載體可以是表達載體。
本發(fā)明還涉及一種含有第一DNA和第二DNA的載體，其中第一DNA編碼包含SEQ ID NO3所示序列的FSH α-亞基突變體，第二DNA編碼包含SEQ ID NO4所示序列的FSH β-亞基突變體。所述載體可以是表達載體。
本發(fā)明還涉及一種含有載體的細胞，其中所述載體含有編碼包含SEQ IDNO3所示序列的FSH α-亞基突變體的DNA。所述載體可以是表達載體。所述細胞可以是哺乳動物細胞。
本發(fā)明還涉及一種含有載體的細胞，其中所述載體含有編碼包含SEQ IDNO4所示序列的FSH β-亞基突變體的DNA。所述載體可以是表達載體。所述細胞可以是哺乳動物細胞。
本發(fā)明還涉及一種含有載體的細胞，所述載體含有第一DNA和第二DNA，其中所述第一DNA編碼包含SEQ ID NO3所示序列的FSH α-亞基突變體，所述第二DNA編碼包含SEQ ID NO4所示序列的FSH β-亞基突變體。所述載體可以是表達載體。所述細胞可以是哺乳動物細胞。
本發(fā)明還涉及一種含有第一和第二載體的細胞，其中第一載體含有編碼包含SEQ ID NO3所示序列的FSH α-亞基突變體的DNA，第二載體含有編碼包含SEQ ID NO4所示序列的FSH β-亞基突變體的DNA。所述載體可以是表達載體。所述細胞可以是哺乳動物細胞。
本發(fā)明還涉及一種FSH突變體的生產(chǎn)方法，包括培養(yǎng)能夠使蛋白質糖基化的哺乳動物細胞，其中所述細胞含有第一表達載體和第二表達載體，所述第一表達載體含有編碼包含SEQ ID NO1所示序列的FSH α-亞基的DNA，所述第二表達載體含有編碼包含SEQ ID NO2所示序列的FSH β-亞基的DNA。
本發(fā)明還涉及一種含有FSH突變體和藥用載體或賦形劑的組合物，其中FSH α-亞基包含SEQ ID NO3所示的序列，F(xiàn)SH β-亞基包含SEQ ID NO4所示的序列。
本發(fā)明還涉及一種治療不孕哺乳動物的方法，包括把有效量的突變的FSH突變體給予有需要的哺乳動物，其中FSH α-亞基包含SEQ ID NO3所示的序列，F(xiàn)SH β-亞基包含SEQ ID NO4所示的序列。
本發(fā)明還涉及一種刺激哺乳動物卵泡生成的方法，包括把有效量的突變的FSH突變體給予有需要的哺乳動物，其中FSH α-亞基包含SEQ ID NO3所示的序列，F(xiàn)SH β-亞基包含SEQ ID NO4所示的序列。
本發(fā)明還涉及一種誘導哺乳動物卵巢超排卵(hyperstimulation)的方法，包括把有效量的突變的FSH突變體給予有需要的哺乳動物，其中FSH α-亞基包含SEQ ID NO3所示的序列，F(xiàn)SH β-亞基包含SEQ ID NO4所示的序列。


圖1所示為表達αtH83N亞基所用的表達載體的質粒圖譜。
圖2所示為瞬時表達βE55/V57T亞基所用的表達載體的質粒圖譜。
圖3所示為表達βE55/V57T亞基所用的表達載體的質粒圖譜。
圖4所示為GM-1的形態(tài)學。A和C部分是對GM-1和Gonal-F進行的MALDI-TOF質譜；B部分是對GM-1和Gonal-F進行的LDS-PAGE分析。
圖5所示為GM-1在未完全發(fā)育的大鼠兩日排卵誘導模型中的性能。
具體實施例方式
雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，增加FSH的碳水化合物含量可以延長體內半衰期，但改善FSH的半衰期遠比簡單地導入附加糖基化位點來得復雜。雖然導入碳水化合物需要一個糖基化共有序列，但不能充分保證將來用到碳水化合物附加位點。其它因子，例如生物合成過程中局部蛋白質折疊和構象等等，也決定一個寡糖是否附在一給定的共有序列位點上。另外，共有序列必須處于這樣的位置該位點的糖基化不會干擾受體結合，或者影響到糖蛋白的折疊、構象或穩(wěn)定性。
為此，目前具有較長半衰期的FSH類似物限于融合蛋白，其中多肽的融合部分包括附加糖基化位點。必須通過定點誘變技術將糖基化位點導入，由此產(chǎn)生半衰期較長的FSH類似物。
因為共有殘基需要加在與碳水化合物的加入相配的位置上，所以利用定點誘變加入糖基化位點時認識FSH的結構至關重要。如果突變引入糖基化位點，則突變的殘基不應該破壞該蛋白質的三維結構或者不應該明顯損害該蛋白質所希望的功能，如受體結合或激活。此外，加入的共有殘基不應該嵌入折疊蛋白質結構內部，否則不可能在特定位點上發(fā)生糖基化。
直至最近，促性腺激素的三維結構僅限于hCG晶體結構的兩個獨立的報導基因部分去糖基hCG的其中一個結構(Lapthor等，1994；Wu et al.，1994)以及全糖基化hCG和兩個Fv片段的三元復合物低解離結構(Tegoni等，1999)。
雖然hCG和FSH具有基本上相同的折疊模式，但這兩種結構明顯不同(Fox等，2001)，由預先確定的hCG結構無法適當?shù)啬MFSH分子各氨基酸殘基的詳細結構(Wu等，1994；Lapthorn等，1994)。
本發(fā)明針對一種FSH突變體，它僅基于人FSH分子三維晶體結構而設計(Fox等，2001)。本發(fā)明的FSH突變體(“GM-1”)經(jīng)修飾帶有下列取代，從而產(chǎn)生了附加糖基化識別位點α-亞基的H83N和β-亞基的E55N/V57T。重組FSH的一或多個附加糖基化位點可發(fā)生糖基化。突變的FSH中一或多個附加糖基化位點的糖基化可于體內或體外發(fā)生。
本發(fā)明的FSH突變體可通過本領域已知的任何合適方法產(chǎn)生。這些方法包括構建核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼各自FSH突變體以及在合適轉染宿主內表達氨基酸序列。本發(fā)明的FSH突變體也可通過化學合成或者化學合成與重組DNA技術結合來產(chǎn)生。
本發(fā)明的FSH突變體可包含F(xiàn)SH的α-和β-亞基，為兩條分離的多肽鏈形式，其中所述兩條鏈在體內二聚化從而形成二聚體多肽，或者它可包含單鏈構造體，所述構造體的兩個亞基由肽鍵或肽接頭共價連接。接頭肽的氨基酸殘基表現(xiàn)出對FSH突變體活性影響不大的性質。
本發(fā)明的FSH突變體具有比野生型FSH長的半衰期。本發(fā)明的FSH突變體也具有比野生型FSH高的穩(wěn)定性。FSH突變體包含的寡糖可位于N-聯(lián)糖基化位點0、1、2、3、4、5或6上。FSH突變體可含有一或多個FSH突變同種型，其中每個同種型所含的寡糖位于N-聯(lián)糖基化位點0、1、2、3、4、5或6上。
通過分離或合成編碼親代FSH亞基(例如分別具有SEQ ID NO3和4所示氨基酸序列的hFSH-α或hFSH-β)的核苷酸序列，可以構建編碼本發(fā)明FSH突變體的α-或β-亞基的核苷酸序列。再將該核苷酸序列改性以取代有關的氨基酸殘基。由定點誘變可修飾核苷酸序列。另一個選擇是，由化學合成來制備核苷酸序列，其中基于FSH突變體的具體氨基酸序列來設計寡核苷酸。
可將編碼多肽的核苷酸序列插入重組載體中，并與在所希望的轉染宿主細胞中表達多肽所需的調控序列操作性相連。本領域技術人員無需進行過多實驗就可以在這些載體、表達調控序列和宿主中作出選擇。重組載體可以是自動復制的載體，即以染色體外實體存在的載體，其復雜與染色體復制無關，例如質粒。或者，載體可以是這樣的載體當被導入宿主細胞時與該宿主細胞基因組整合，并與染色體一起復制到它已經(jīng)被整合的基因組中。
載體可以是一種表達載體，其中編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列與該核苷酸序列轉錄所需的附加節(jié)段操作性相連。載體可以由質?；虿《拘訢NA產(chǎn)生。通過商業(yè)途徑可以獲得大量的在本文所述宿主細胞中表達的合適表達載體，或者可參見文獻描述。
重組載體還可以包含能夠使該載體在有關宿主細胞中復制的DNA序列。例如，這樣的序列(當宿主細胞是哺乳動物細胞時)是SV40復制起點。載體還可以包含選擇性標記物，例如其產(chǎn)物與宿主細胞缺失互補的基因，譬如說編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因或者賦予藥物抗性的物質，例如氨比西林、卡那霉素、四環(huán)素氯霉素、新霉素、潮霉素或甲氨蝶呤。
載體也可以包含擴增基因，例如DHFR，這樣可為合適的培養(yǎng)基選擇具有擴增基因和側翼序列多重拷貝的細胞，包括突變的FSH DNA。此處的術語“調控序列”定義為包括需要或有利于表達本發(fā)明多肽的全部組件。例如，在哺乳動物細胞中引導轉錄的合適調控序列包括SV40和腺病毒的早期和后期啟動子，譬如說腺病毒2主要后期啟動子、MT-1(金屬硫蛋白基因)啟動子和人細胞巨化病毒即刻早期基因啟動子(CMV)。
本發(fā)明還涉及編碼FSH H83N α-亞基的分離DNA以及編碼FSHE55N/V57T β-亞基的分離DNA。不論是通過定點誘變、合成、PCR還是其它方法制備的編碼FSH突變體的本發(fā)明核苷酸序列，都可任選地包括一個編碼信號肽的核苷酸序列。當多肽由它表達的細胞中分泌出來時就含有信號肽。這樣的信號肽如果存在的話，應該能夠被選取來表達多肽的細胞所識別。該信號肽可以與多肽同源(例如，正常情況下與hFSH亞基聯(lián)合)或者異源(例如，來自除hFSH以外的其它來源)，或者可以與宿主細胞同源或異源，即正常情況下由宿主細胞表達或者正常情況下不是由宿主細胞表達。
可使用任何合適的宿主產(chǎn)生本發(fā)明的多肽亞基，包括細菌、真菌(包括酵母)、植物、昆蟲、哺乳動物或其它合適的動物細胞或細胞系，以及轉基因動物或植物。合適的哺乳動物宿主細胞的例子包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(例如CHO-KL；ATCC CCL-61)、綠猴細胞系(COS)(例如COS 1(ATCCCRL-1650)、COS 7(ATCC CRL-1651))、小鼠細胞(例如NSIO)、幼倉鼠腎(BI-EK)細胞系(例如ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)、和人細胞(例如BEK293(ATCC CRL-1573))、以及組織培養(yǎng)基中的植物細胞。其它合適的細胞系已為本領域所知，可通過公共保藏機構獲得，如美國菌種保藏中心。將外源DNA引入哺乳動物宿主細胞的方法包括磷酸鈣介導的轉染法、電穿孔法、DEAE-右旋糖介導的轉染法、脂質體介導的轉染法和病毒性載體。
運用本領域公知的方法在適合產(chǎn)生多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，在允許表達和/或分離多肽的條件下，在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐內的適當培養(yǎng)基中通過振蕩培養(yǎng)瓶培養(yǎng)、小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連接式、分批式、流加式或者固態(tài)發(fā)酵法)培養(yǎng)細胞。根據(jù)本領域已知的程序，培養(yǎng)用的適當營養(yǎng)培養(yǎng)基包括碳源和氮源以及無機鹽。適當?shù)呐囵B(yǎng)基可通過商業(yè)途徑獲得，或者可按照已公開的組成制備(例如，參見美國菌種保藏中心的目錄)。如果多肽分泌進入營養(yǎng)培養(yǎng)基中，那么可從培養(yǎng)基中直接回收多肽。如果不分泌多肽，那么可從細胞溶解物中回收多肽。
運用本領域已知的方法可回收突變的FSH多肽。例如，可用常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，包括但不限于，離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)、或沉淀。突變的FSH多肽可通過本領域公知的各種方法純化，包括但不限于，色譜法(例如離子交換色譜法、親和色譜法、疏水色譜法、聚焦色譜法和尺寸排阻色譜法)、電泳方法(例如制備性等電聚焦)、差異溶解度法(例如硫酸銨沉淀法)、SDS-PAGE或者萃取。
本發(fā)明還涉及一種含有本發(fā)明FSH突變體的藥物組合物。所述藥物組合物用來刺激卵泡生成，例如可與排卵誘導或輔助生殖技術(ART)聯(lián)用。因為本發(fā)明的FSH突變體用來誘導多卵泡發(fā)育和成熟特別有效，所以它特別適用于希望收獲多個卵母細胞的ART。
另一個選擇是，小心選取劑量，本發(fā)明的FSH突變體可用于OI的誘導單一卵泡生成，或者用于IUI、體內受精的誘導少量卵泡生成(最多3個卵泡左右)。減少FSH突變體劑量或者給藥頻率比常規(guī)FSH制劑少都可實現(xiàn)單一卵泡生成。例如，本發(fā)明的FSH制劑用于OI的劑量是每隔二日225-400 IU或以下，取決于病人的反應。通過超聲波檢查法可跟蹤病人的反應。
本發(fā)明的FSH突變體可用于控制性超排卵(controlled ovarianhyperstimulation，COH)方案中。COH的標準方案包括一個向下調節(jié)的階段，在這個階段中，通過給予促性腺激素釋放激素(GnRH)激動劑來抑制內源性黃體生成激素(LH)，接著的是一個刺激階段，在這一階段中，每日給予卵泡刺激素(FSH)，通常約150-225 IU/天，誘導卵泡發(fā)育(卵泡生成)。另一種選擇是在自然月經(jīng)或誘導月經(jīng)后開始用FSH刺激，然后給予GnRH拮抗劑(通常在刺激階段的約第6開始)。當至少有3個卵泡＞16毫米(其中一個是18毫米)時，給予單丸劑(single bolus)hCG(5-10,000 IU)模擬天然LH峰并引發(fā)排卵。注射hCG后36-38小時定為回收卵母細胞的時間。
本發(fā)明的FSH突變體也可用于OI和IUI。例如，在自然月經(jīng)或誘導月經(jīng)后開始用本發(fā)明的制劑進行FSH刺激，每日劑量為75-150 IU。當有1或3個卵泡的直徑到達至少16毫米時，給予單丸劑hCG誘導排卵。通過定期性交或IUI進行體內受精。
因為本發(fā)明的FSH突變體與野生型FSH制劑相比具有較長的半衰期，所以上述方案可采用較低IU劑量的FSH，和/或可縮短FSH刺激階段，但能夠獲得相同或更好的反應(以卵泡數(shù)目和卵泡生存能力計)。例如，每日給予約50-150 IU FSH，較好約50-100 IU FSH，更好約50-75 IU FSH，本發(fā)明的FSH制劑可以獲得足夠的卵泡生成。FSH的給予通常以日或半日計。給藥時間可少于約14天，較好少于約12天，更好少于約11或10天。對于OI，本發(fā)明的FSH突變體制劑的給予劑量是25-150 IU FSH/天，較好是50-125 IU FSH/天。治療男性不孕癥時，本發(fā)明的FSH突變體制劑的給予劑量是每周三次，每次150-300 IU，直至精子生成水平足夠通過定期性交或ART技術進行受精。
因為本發(fā)明的突變FSH具有較長的半衰期，所以可作為長效型制劑給藥。常規(guī)FSH可每隔一天給予約300 IU，獲得相似效果要每天給予約150 IU。術語“長效的”指的是包括給藥頻率少于每隔一天的FSH制劑。本發(fā)明的突變FSH可每隔二天、每隔三天、每隔四天、每隔五天或每隔六天給予，而獲得的效果與每日給予常規(guī)FSH相若或者更好。
在本發(fā)明一相關方面中，采用FSH突變體或含有FSH突變體的藥物組合物制備治療疾病、障礙或病癥的藥物。在另一方面，本發(fā)明的多肽或藥物組合物用于哺乳動物特別是人的治療方法中，所述方法包括把這些多肽或藥物組合物給予有需要的哺乳動物。
對于本領域技術人員顯而易見的是，有效量的本發(fā)明的多肽、制劑或組合物取決于疾病類型、劑量、給藥進度、是單獨給予所述多肽、制劑或組合物還是與其它治療藥物聯(lián)用、組合物的血清半衰期以及病人的一般健康狀況。一般地，有效量的本發(fā)明的制劑或組合物足夠保證治療效果。
本發(fā)明的FSH突變體可以藥物組合物形式給予，所述藥物組合物還包括一或多種個藥用載體或賦形劑?！八幱玫摹敝傅氖遣粫邮艿牟∪水a(chǎn)生任何不利影響的載體或賦形劑。這樣的藥用載體和賦形劑是本領域熟知的，運用已知方法可將本發(fā)明的多肽配制成藥物組合物(例如見A.R.Gennaro的參考書Remington’s Pharmaceutical Sciences，第8部分，第20版，(1990)，MerckPublishin Companyg；S.Frokjaer和L.Hovgaard的Pharmaceutical FormulationDevelopment of Peptides and Proteins，Eds.，Taylor & Francis(2000)；以及A.Kibbe的Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，Pharmaceutical Press(2000))?？捎糜诎景l(fā)明多肽的組合物中的藥用賦形劑包括例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、等滲劑、非離子表面活性劑或去污劑(“潤濕劑”)、抗氧化劑、膨脹劑或填充劑、螯合劑或助溶劑。
包含本發(fā)明FSH突變體的藥物組合物可以配制成各種形式，包括液體(例如容易使用的溶液或懸液)、凝膠、凍干形式或任何其它合適的形式，譬如粉劑或適合制備溶液的晶體。組合物形式取決于要治療的具體情況，這對本領域技術人員是顯而易見的。
包含本發(fā)明FSH突變體的藥物組合物可通過靜脈內、肌內、腹膜內、皮內、皮下、舌下、口腔、鼻內、透皮等途徑，或者通過吸入或其它任何可接受的方式(例如用Powder Ject或Pro Lease技術或者筆型注射系統(tǒng))給予。給藥模式取決于要治療的具體情況，這對本領域技術人員是顯而易見的。本發(fā)明的藥物組合物可經(jīng)皮下途徑給予，因為這種方式允許病人自己給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可與其它治療藥物聯(lián)用。這些藥物可作為同一藥物組合物的一部分，或者可與本發(fā)明的多肽分開給予，其給藥時間可以與本發(fā)明的多肽同時進行，又可以按照任何其它可接受的治療進度。另外，本發(fā)明的多肽、制劑或藥物組合物可作為其它療法的輔助手段。
本發(fā)明還涉及多個方面，參見以下非限制性實施例的描述。
實施例1 FSH單突變體候選糖基化位點的鑒定采用人FSH的三維晶體結構來鑒定FSH的α-和β-亞基的候選糖基化位點。晶體結構中每個不對稱單元含有兩個FSH分子(4個亞基)。這兩個FSH分子是疊加的，對它們進行比較，肉眼檢查每個殘基以鑒定潛在的N-糖基化位點。FSH的晶體結構與關于FSH/FSHR受體相互作用的認識結合，有助于選擇潛在的N-糖基化位點。主要設計標準是對三維結構的破壞盡可能小，對預測的結合和激活位點的破壞盡可能小，以及預計的三維結構與糖基化相配。
基于以上標準，對FSH的氨基酸序列作了20個單突變體(8α和12β)，包括以下2個突變體α-亞基H83Nβ-亞基E55N/V57TFSH單突變體的瞬時表達參照實施例3所述的方法，進行定點誘變獲得各個突變體。這些突變體與互補野生型亞基一起小規(guī)模地在CHO-Dukx細胞中瞬時表達，表達的方法與實施例4所述的方法類似。對得到的培養(yǎng)上清液進行ELISA分析，結果顯示20個突變體中有19個能夠瞬時表達。對照物和突變體的瞬時表達水平的范圍是0-1.95μg/ml，平均值為0.59μg/ml，中值為0.5μg/ml，模擬轉染重復確認為0μg/ml。
FSH單突變體的形態(tài)分析在允許完整FSH異二聚體與自由α-和β-亞基分離的非還原性LDS PAGE條件下，通過電泳分析來自FSH單突變體瞬時表達得到的濃縮培養(yǎng)上清液等分試樣。將蛋白質電泳轉移到PVDF并用針對FSH α-和β-亞基的初級抗體加以分析。預先篩選以測試購買的大量不同初級抗體，有時在測試后再作確認分析，但最有用的初級抗體證明是1.5μg/ml Chromaprobe BHS 104(生物素化的多克隆山羊抗FSHα-亞基)和1.5μg/ml Chromaprobe BHS 105(小鼠單克隆抗FSH β-亞基)。
兩種附加型式的形態(tài)分析加上異二聚體-完整樣品的蛋白質印跡。用蛋白質印跡分析異二聚體-解離樣品以及用放射自顯影法分析帶有代謝標記35S-Cys的突變體和對照物的電泳分離異二聚體-解離免疫沉淀物。
在19個可表達的FSH突變體中，由亞基或異二聚體的表觀分子量分布遷移證明，只有5個突變體表現(xiàn)出糖基化程度增大。該5個表現(xiàn)出糖基化程度增大的突變體包括一個α-亞基和四個β-亞基，包括βE55N/V57T在內。
有趣的是，α-亞基突變體αH83N的糖基化沒有增大，但似乎可導致蛋白質群的異二聚體豐度相對于在相同瞬時條件下共表達的野生型FSH亞基的異二聚體豐度高。
瞬時表達的FSH單突變體的半衰期將由瞬時表達獲得的包括βE55N/V57T在內的5個高度糖基化單突變體的藥物動力學與Gonal-F進行比較。Gonal-F是FSH的一種重組形式，不易將它與天然hFSH區(qū)分開來。由ELISA定量測定每個PK實驗的注射物質中以及注射后在預定時間收集到的大鼠血清樣品中的FSH含量。包括β亞基突變體E55N/V57T在內的5個單突變體中沒有一個的半衰期比對照Gonal-F的半衰期長。
單一位點糖基化突變體的純化和分析使4個高度糖基化β亞基單突變體中3個突變體(包括E55N/V57T突變體)表達并通過免疫親和色譜法純化。將包括E55N/V57T突變體在內的該3個高度糖基化β亞基突變體的體外活性與重組FSH進行比較，觀察在(i)上和125I放射標記的FSH競爭與含有人FSH受體(Ki)的膜制劑結合的能力以及刺激產(chǎn)生與FSHR偶合的cAMP的能力(EC50)KiEC50βE55N/V57T 8.6×10-10M3.9×10-11MrhFSH 4.8×10-10M1.2×10-11M上述結果顯示，β-亞基突變體E55N/V57T具有與野生型FSH相當?shù)捏w外活性。事實上，該3個β-亞基單突變體每一個的體外活性都比得上野生型FSH。此外，對純化的β-亞基單突變體作質譜分析，顯示這3個突變體中每一個的質量分布都發(fā)生遷移。不過，在靜脈注射單劑給予未發(fā)育成熟的雌性大鼠之后測定純化蛋白質的藥物動力學時，沒有一個糖基化突變體的半衰期是大大延長的。rhFSH的半衰期為3.8±0.6h，βE55N/V57T的半衰期是4.8±0.4h。
實施例2 雙糖基化突變體的生產(chǎn)和分析由于單獨α-和β-亞基的單突變體無法提高FSH的半衰期，所以在瞬時表達中將2個α-亞基單突變體與3個β-亞基單突變體結合，構建6個不同雙突變體，包括GM-1，它包括α-亞基突變體H83N和β-亞基突變體E55N/V57T。
6個雙突變體中有5個(包括GM-1)能夠表達。對可表達的5個雙突變體進行分析，分析它們刺激產(chǎn)生與FSHR偶合的cAMP的能力。該5個雙突變體中每一個，包括GM-1在內，在體內刺激與FSHR偶合的cAMP產(chǎn)生的能力比得上rhFSH。
將該同樣的5個FSH雙突變體的藥物動力學與重組hFSH和CTP-FSH進行比較。表1的結果顯示，GM-1的半衰期遠遠大于rhFSH，接近CTP-FSH。
表1-藥物動力學

考慮到β-亞基單突變體E55N/V57T本身對半衰期沒有作用，故GM-1具有延長的半衰期就令人驚訝了。另外，α-亞基突變體H83N不會增大糖基化，所以GM-1的半衰期延長就更令人驚訝了。
實施例3 GM-1的產(chǎn)生將人FSH的α-和β-亞基的cDNA亞克隆到pDONR載體(Invitrogen)。采用QuikChangeTM定點誘變試劑盒(Stratagene)把N-聯(lián)糖基化位點導入FSH的α-和β-亞基內。QuikChangeTM系統(tǒng)使用兩個含有所希望的突變的合成寡核苷酸引物。采用以下成對的寡核苷酸導入N-聯(lián)糖基化位點表2-寡核苷酸

運用ABI PRISM BigDyeTMTerminator v3.0 Ready Reaction CycleSequencing Kit測序試劑盒確認突變體的序列，然后用ABI PRISM 310 GeneticAnalyzer分析儀進行分析。
運用GatewayTM克隆技術(Invitrogen)，將αH83N和βE55/V57T突變體亞克隆到修飾的pCI表達載體中，得到質粒p13251和p13252，見圖1和圖2。pCI哺乳動物表達載體預先已經(jīng)用GATEWAY載體轉化系統(tǒng)(Invitrogen)轉化為GATEWAY目的載體。pCI表達載體含有用于調節(jié)插入基因表達的人細胞巨化病毒即刻早期增強子/啟動子、用于啟動表達的基因內含子上游、以及用于終止轉錄的來自插入基因的猿病毒40后期聚腺苷酸化信號下游。
還將αH83N突變體亞克隆到Dα載體中，得到質粒p13538，見圖3。Dα載體是pCLH3AXSV2DHFR的衍生物。把該載體修飾成包括異源內含子，該內含子帶有用合成剪接供體改造的促性腺激素α亞基基因內含子A的2kbXbaI-PstI片段上游(含有剪接受體)。所述異源內含子位于啟動子與XhoI克隆位點之間，把它放在RNA轉錄物5’未翻譯區(qū)內。Dα載體的詳細描述可參見Kelton等的文獻(Mol Cell Endocrinol 89141-151(1992))。
實施例4 突變的FSH的表達使p13251(αH83N)和p13251(βE55/V57T)共轉染，在無血清培養(yǎng)基中瞬時表達促性腺激素，首先得到FSH的GM-1糖基化突變體(“GM-1 Lot 1”)。對于大規(guī)模lipofectamine轉染試劑介導的轉染(12-24 T175瓶)，轉染之前需要在生長培養(yǎng)基(MEM a(+)，10％FBS，1％L-谷酰胺)中接種CHO-Dukx細胞18至24小時，為1.3×107細胞/瓶。轉染細胞要大批制備lipofectamine2000/Optimem mix混合物(一份17.6)，并且還要用33mcg DNA為每個T175瓶每個亞基(共66mcg)制備一批在Optimem中的DNA。將Optimem/DNA與Optimem/Lipofectamine制劑混合20分鐘之后，向最新加入的(43.8ml/瓶)細胞單層施加在Optimem中的DNA/Lipofectamine復合物(約10ml/瓶)。保持37°4至6小時，把該細胞單層加到50ml生長培養(yǎng)基中。轉染后約24小時，將細胞轉染到生產(chǎn)培養(yǎng)基(加入了L-谷酰胺的Sigma CHO PFM，或者轉移到Serono專有配方Sigma CHO PFM C0234)中。48小時后收獲條件生產(chǎn)培養(yǎng)基。
實施例5 突變的FSH的克隆原克隆(Protoclones)運用標準方法使CHO-DUKX細胞與在Dα中的αH83N(質粒#13538)以及在pCIattR中的βE55N/V57T(質粒#13252)(兩種突變體比率為1∶3)進行磷酸鈣共轉染。在選擇培養(yǎng)基(MEMα(-)，10％dFBS，4mM L-谷酰胺)中接種細胞，96孔板中每孔10,000個細胞(共1596個孔)，轉染后48小時產(chǎn)生原克隆。大約2星期之后，細胞按1∶8分裂到含0.02μM MTX的選擇培養(yǎng)基中。在6至8星期時間內，提高MTX的濃度(0.1μM(192孔)、0.5μM、1.0μM(116孔))，重復此分裂過程，在1.0μM MTX中有116個原克隆存活。
從96孔板(在1.0μM MTX中，10％FBS)取24h表達樣品，以DSL ELISA評價該116個原克隆的表達。表達水平的范圍是超刻度低值至3.72μg/ml。將最高表達水平的17個原克隆在24孔板、T25瓶中擴增，然后低溫保存每個原克隆，每個一組，每組3個小瓶。解凍頭2個原克隆，按T25規(guī)模擴增以便確認表達。GM1-21和GM1-22的容積產(chǎn)率分別是1.74和0.74μg/ml，比產(chǎn)率分別是5.06和1.28pcd?；谶@些結果，選取GM1-21進行克隆，并且在滾瓶中生產(chǎn)第二批GM-1，參見實施例6所述。
克隆使96孔板分別接種，至0.25、0.5、1.0和2.0 GM-1-21細胞/孔，從而啟動限制性稀釋克隆?？寺∨囵B(yǎng)基是無MTX的含10％cFBS和1％L-谷酰胺的DMEM/F12。用顯微鏡檢查全部孔，消除含多個細胞的任何孔。
生長大約2星期之后，在24孔板以及最后在T25瓶中擴增細胞群。一旦細胞到80-100％的匯合，用DSL FSH ELISA測定容積產(chǎn)率(樣品含10％FBS)。使最佳的8個克隆在T75瓶中擴增，測定24h容積表達和比表達。每個克隆一組，每組3個小瓶，低溫保存在含10％cFBS、1％L-谷酰胺和10％DMSO的DMEM/F12中。CHO-B1-GM1-21-98的容積產(chǎn)率是7.21μg/ml，比產(chǎn)率是6.25pcd。相反，CHO-B1-GM1-21-107的比產(chǎn)率最高，為7.71pcd，容積產(chǎn)率為5.81μg/ml。
使CHO-B1-GM1-21-98和CHO-B1-GM1-21-107在4個T175瓶中擴增。當?shù)竭_大約90％匯合時，將pre-MCB(每個克隆25個小瓶)低溫保存在含10％FBS、1％L-谷酰胺和10％DMSO的DMEM/F12中。每小瓶的GM1-21-98(第7代)含有3.26百萬個細胞，每小瓶的GM1-21-07(第6代)含有6.1百萬個細胞。每庫取一小瓶送至Charles River Laboratories實驗室(Malvem，PA)作GMP測試。這些測試包括PTC支原體、不育、LCMV攻擊的MAP測試、HAP測試、分析異嗜性鼠白血病毒的延伸體外聚焦誘導試驗(Extended In Vitro FocusInduction Assay)、分析鼠白血病毒的延伸XC空斑測定(Extended XC PlaqueAssay)、以及同工酶分析，每個小瓶都接受全部測試。
實施例6 突變的FSH的附加表達參照實施例5所述生長原克隆GM1-21的方法，在2個850cm2滾瓶中生產(chǎn)GM-1(“GM-1 Lot 2”)。本實施例采用無血清生產(chǎn)培養(yǎng)基(DMEM-F12+IFCS)的體積是2600ml。含有大約0.2mg GM-1的小量(13ml)濃縮培養(yǎng)基上清液于-80℃保存在SRBI，這是因為在透析轉移過程中損失了36ml濃縮培養(yǎng)上清液。利用DSL ActiveFSH ELISA進行定量分析，轉化比是1IU＝138ngFSH。
實施例7 突變的FSH的純化樣品制備收獲含有突變FSH的生產(chǎn)培養(yǎng)基，用0.22μm過濾裝置過濾，凍存于-70℃。4℃下解凍培養(yǎng)基中的目標蛋白質，過夜，并采用Ultrasette ScreenChannel TFF裝置、10K Omega膜、P/N OS010C70(Pall Life Science)進行超聲波濃縮?；厥毡Ａ粑?，相對于3×5升含有0.5M NaCl的pH7.4 0.1M Tris透析，過夜。回收透析后的蛋白質，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，立即純化或者凍存于-70℃直至純化。
免疫親和純化用抗FSH免疫親和樹脂B5(Serobio)純化糖基化突變體GM-1，每毫升樹脂含有2.2mg抗-FSH抗體。在1.5cm×10cm OmniFit柱中制備10.2ml床體積。預先用含有0.5M NaCl的pH7.4 0.1M Tris平衡樹脂。以1ml/分鐘的速率裝載透析后的粗蛋白質。依次用5柱體積含0.5M NaCl的pH7.4 0.1MTris、5柱體積pH7.6 100mM碳酸氫銨洗滌柱，目標蛋白質用18-20柱體積1M NH4OH洗脫。合并含有洗脫蛋白質的餾分，用冰醋酸中和，用Amicon stirredcell裝置和Amicon YM 10膜進行超聲波濃縮。在Pierce Snakeskin透析管10KMWCO中相對于4×5升水透析保留物，透析時間為24小時。回收透析后的蛋白質，通過Centriprep YM 10濃縮至體積大約1ml。
特性分析對于異二聚體純度為73.8-80.6％，通過此單一步驟免疫親和方法回收純化蛋白質GM-1的表觀回收率是31.4-52.9％，蛋白質的濃度由氨基酸組成分析確定，其中分子量根據(jù)亞基的MALDI-TOF糖型分布最初估計是35,000 Da。
通過N-末端肽測序來確認蛋白質的特性。在GM-1中鑒定到的全部N-末端序列反映FSH的α-亞基或β-亞基末端。雖然不能夠確定可用銀染色看到的單一低豐度蛋白質帶的特性，但是數(shù)據(jù)仍然與亞基純度≥80％相一致。
實施例8 突變的FSH的形態(tài)為了測定純化蛋白質的糖型分布，對GM-1和Gonal-F進行MALDI-TOF質譜分析。質譜分析結果示于圖4A，由此圖可見，GM-1中含有高度糖化形式的質量等級(mass class)的相對豐度比Gonal-F高26％，其中，GM-1含有總共36.8％亞基糖型，而Gonal-F含有29.2％亞基糖型。Gonal F與GM-1的MALDI-TOF質譜之差異與通過銀染色的PAGE以及蛋白質印跡(圖4B)觀察到的亞基和異二聚體的表觀分子量分布遷移是一致的。
在MALDI-TOF質譜條件下，GM-1似乎偏向于保留αβ異二聚體構象，見圖4C，與在Gonal F看到的αα、αβ和ββ二聚體的隨機分布相反。這提示在MALDI-TOF樣品制備條件下GM-1的解離比Gonal-F少，與GM-1異二聚體可能有更高的熱力學和動力學穩(wěn)定性相符。設計了一個GM-1糖基化模型，通過雙觸角、巖藻糖基化、二唾液酸化糖型不分等級地隨機占據(jù)完全無糖基化亞基的6個位點，隨機占據(jù)呈二元分布，將該模型與觀察到的質譜作比較。結果顯示，端點級(α0)的占據(jù)率比預期高(0.021 vs 0.0)，(α1或β0)級的占據(jù)率比預期低(0.095 vs 0.214)，(α2或β1)級的占據(jù)率比預期高(0.516 vs 0.428)，(α3或β2)級的占據(jù)率比預期高(0.312 vs 0.285)，β3級的占據(jù)率比預期低(0.056 vs0.071)。
實施例9 突變的FSH的分析突變的FSH的體外結合用FSHR cAMP試驗測定GM-1 Lot1和GM-1 Lot2的功效。使大批重組地表達人FSH受體或人LH受體的CHO細胞系在pH7.4 0.025M Tris(含有0.25M蔗糖、10mM MgCl2、1mM EDTA以及千分之一Sigma蛋白酶抑制劑雞尾酒(p8350))中生長，并通過氮氣空化作用(20分鐘內平衡至900psi，然后快速釋放壓力)使其分裂。待初步澄清后(10min×1000xg，4℃)，超離心使膜餾分沉淀(60min×100,000xg，4℃)。將膜餾分重懸于結合緩沖液(pH7.40.01M Tris，含有5mM MgCl2)中，以Bradford(BioRad)蛋白質檢測法估算蛋白質濃度，凍存于-80℃以備將來使用。一般地，每孔取15μg適當帶有FSHR或LHR的膜蛋白進行競爭試驗作分析。
評價96孔板(100μl/樣品孔)的放射配體結合情況。分析緩沖液是pH7.40.01M Tris，含有5mM MgCl2和0.1％BSA以及0.3nM125I-hCG(分析LHR時)或者0.4nM125I-FSH(分析FSHR時)。用分析緩沖液稀釋競爭GM-1，使其與帶放射標記的配體混合，然后加入帶受體的膜。在500nM無標記hCG或FSH存在下測定非特異性結合。在37℃下?lián)u動平衡90分鐘進行結合。用低蛋白質結合微孔濾膜(Millipore Multiscreen)過濾，終止結合試驗，所述濾膜預先在分析緩沖液中培育。用冰冷結合緩沖液(無BSA的分析緩沖液)洗滌濾孔三次，干燥，再穿插。運用專門針對125I放射的預先編程檢測窗口在HP CobraII gamma計數(shù)器上測量結合放射活性。以單一位點模型和Graph Pad Prizm軟件分析數(shù)據(jù)。
突變的FSH的體外功能測定上述促性腺激素受體轉染的CHO細胞中產(chǎn)生cAMP的劑量反應曲線，確定GM-1 Lot1和GM-1 Lot2的功能。下表3給出了兩批各自前導蛋白質的豁免鑒定(release qualification)數(shù)據(jù)
表3-GM-1的體外功能與受體結合特性

實施例10 突變的FSH的穩(wěn)定性使GM-1無菌等分試樣在4℃保持3個月，進行為期3個月的穩(wěn)定性研究，測定GM-1生物活性穩(wěn)定性。抽取該等分試樣中的GM-1，在以下不同時間進行FSHR cAMP試驗對其進行測試時間0點、7天、32天和91天。在本研究條件下，GM-1在4℃儲存91天，其EC50變化少于2倍。這些數(shù)據(jù)表示，4℃儲存GM-1，其生物活性可穩(wěn)定地保存長達3個月。
實施例11 突變的FSH的活性圖5所示為GM-1在未發(fā)育成熟大鼠2日排卵誘導模型中的性能。給予單劑重組hFSH無法引起排卵反應，但給予單劑GM-1就能夠引起排卵反應。此外，在標準Steel-man Pohley卵巢增重試驗中，GM-1的性能與Gonal-F相若(數(shù)據(jù)未示出)。
圖5測試用的劑量是6、12和24 IU FSH。在此模型中以單劑、10 IU、三劑方案(4×25％、2×50％和1×100％)測試FSH-CTP(Organon 36286)，觀察到每只動物的平均卵巢數(shù)目分別是16.3±3.8、19.1±3.6和21.5±3.9(數(shù)據(jù)未示出)。由以上數(shù)據(jù)可見，以1×100％給予12 IU GM-1可引發(fā)排卵反應，每只動物平均產(chǎn)生9.4±2.1卵子(給予6 IU產(chǎn)生6.8±1.6卵子/動物，給予24 IU產(chǎn)生14.6±3.6卵子/動物)。這些數(shù)據(jù)也證實了通過調節(jié)劑量方案，GM-1有可能趨向于產(chǎn)生“單一排卵”或更容易受控。
序列表<110>L.加羅內(Garone，Louise)S.阿金斯托(Arkinstall，Steven)W.布龍迪克(Brondyk，William)R.坎貝爾(Campbell，Robert)江旭亮(Jiang，Xuliang)S.麥肯納(McKenna，Sean)M.泰珀(Tepper，Mark)<120>FSH糖基化突變體<130>05558.00003.PZUS00<160>8<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>92<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro1 5 10 15Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys20 25 30Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu35 40 45Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser50 55 60Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr65 70 75 80
Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser85 90<210>2<211>111<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu100 105 110<210>3<211>92<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>alpha亞基突變體H83N<400>3Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro1 5 10 15Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys20 25 30Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu35 40 45Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser50 55 60Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr65 70 75 80Ala Cys Asn Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser85 90<210>4<211>111<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>beta亞基突變體E55N/V57T<400>4Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu1 5 10 15
Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Asn Leu Thr Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu100 105 110<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>alpha H83N突變生成oligo 1<400>5cacacggcgt gcaactgcag tacttg26<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>alpha H83N突變生成oligo 2
<400>6caagtactgc agttgcacgc cgtgtg 26<210>7<211>49<212>DNA<213>人工<220>
<223>beta E55N/V57T突變生成oligo 1<400>7gcactctcac tgtttcatat gtcaggttct tgaaggtaca tgttttctg 49<210>8<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>beta E55N/V57T突變生成oligo 2<400>8cagaaaacat gtaccttcaa gaacctgaca tatgaaacag tgagagtgc 49
權利要求
1.一種突變的FSH，其中α-亞基包含SEQ ID NO3所示的序列，β-亞基包含SEQ ID NO4所示的序列。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種可用來誘導人病人卵泡生成的新穎FSH突變體，其糖基化程度增大，半衰期延長。所述FSH突變體允許使用較低累積劑量的FSH，就可獲得相同或更好的臨床效果。
文檔編號C07H21/04GK1984926SQ200480032665
公開日2007年6月20日 申請日期2004年9月2日 優(yōu)先權日2003年9月2日
發(fā)明者L·M·加羅內, S·J·阿金斯托, W·H·布龍迪克, R·K·坎貝爾, 江旭亮, S·D·麥肯納, M·泰珀 申請人:應用研究系統(tǒng)Ars股份公司