一種修飾量子點的新型環(huán)狀多肽配體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種修飾量子點的新型環(huán)狀多肽配體(ATTO?H6)，屬于納米生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明中的新型環(huán)狀多肽配體包括用于和量子點發(fā)生FRET的染料ATTO 590(1)、用于多肽成環(huán)序列(2)、用于結(jié)合量子點的組氨酸間隔序列(3)、用于多肽折疊序列(4)，各序列之間以肽鍵相結(jié)合。該配體合成方法簡單，通過6個組氨酸間隔序列與量子點結(jié)合，大大提高了配體與量子點的結(jié)合速率及穩(wěn)定性，可以作為納米熒光探針廣泛應(yīng)用于生物標記。
【專利說明】
一種修飾量子點的新型環(huán)狀多肽配體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及納米生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種修飾量子點的新型環(huán)狀多肽配體。
【背景技術(shù)】
[0002] 與傳統(tǒng)的有機染料相比，量子點(QDs)具有更優(yōu)異的光譜性質(zhì)，如激發(fā)光譜寬且連 續(xù)分布，而發(fā)射光譜呈對稱分布且寬度窄，顏色可調(diào)，并且光化學(xué)穩(wěn)定性高，不易光解 (Marcel BJ,Mario M,Peter G，et al.Science 1998,281，2013-2016)。這些優(yōu)越的性能使 QDs在體內(nèi)細胞成像和生物特定標記等方面都得到了廣泛應(yīng)用，它正在并將日益成為分子 細胞成像研究中非常重要的一種探針工具。因此，具有高性能的水溶性量子點的合成受到 了密切關(guān)注。
[0003] 基于QDs的傳感器的發(fā)展高度依賴于新的配體與其的自組裝。親和金屬驅(qū)動的量 子點因為其高可控性已經(jīng)有效運用到功能化量子點中。QDs表面的Zn原子和多組氨酸殘基 的金屬親和協(xié)調(diào)作用，含有組氨酸殘基的蛋白質(zhì)和多肽能夠直接接到QDs表面的Zn原子，這 種方法具有很好的穩(wěn)定性，已逐漸成為生物標記中一種常用的方法。研究表明組氨酸個數(shù) (NS6)對多肽配體和量子點自組裝有影響，發(fā)現(xiàn)長組氨酸序列可加強結(jié)合親和力。然而，由 于空間位阻，超過6個組氨酸殘基的多肽序列很難提高結(jié)合力(Wang，J.H.，Li，J.Y.，Chen， Υ·，et al.Electrophoresis 2015,36,2419-2424·)。因此，組氨酸的數(shù)量和結(jié)構(gòu)對多肽配 體起到至關(guān)重要的作用，對于設(shè)計高效多肽配體和量子點自組裝具有重大意義。此外，盡管 組氨酸標簽是最流行的融合標簽之一，它也可能影響目標蛋白和它們的活性和三級結(jié)構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:為了克服現(xiàn)有多肽配體與QDs結(jié)合速度慢、穩(wěn)定性差 等問題，限制其在生物領(lǐng)域中的普及使用；為了解決組氨酸個數(shù)(NS6)對多肽配體和量子 點自組裝有影響，長組氨酸序列可加強結(jié)合親和力，然而由于空間位阻，超過6個組氨酸殘 基的多肽序列很難提高結(jié)合力的技術(shù)問題。，本發(fā)明提供一種與QDs結(jié)合速度快，而且穩(wěn)定 性好的新型環(huán)狀多肽配體。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種修飾量子點的新型環(huán)狀多肽配 體，其特征在于:包括用于和量子點發(fā)生FRET的染料ΑΤΤ0 590(1 )、用于多肽成環(huán)序列（2)、 用于結(jié)合量子點的組氨酸間隔序列(3)、用于多肽折疊序列(4)，各序列之間以肽鍵相結(jié)合。
[0006] 所述的用于和量子點發(fā)生FRET的染料ATTO 590( 1)能作為受體接受量子點的激發(fā) 光再發(fā)出新的波長的發(fā)射光;所述的用于成環(huán)的序列（2)為2個半胱氨酸序列;所述的用于 結(jié)合量子點的組氨酸間隔序列(3)為6個組氨酸間隔其他氨基酸序列;所述的用于多肽折疊 序列(4)為一個D型脯氨酸和一個L型脯氨酸序列。
[0007] 本發(fā)明所述的量子點為含有Zn的量子點，如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdS e/ZnSe或者 CdTe/ZnSe〇
[0008] 采用上述的技術(shù)方案后，本發(fā)明取得的有益效果:本發(fā)明設(shè)計了環(huán)狀含有組氨酸 (Η)的新型的多肽配體(ATTO 590-ATT0-HCHVHdPlPHLHCH，ATT0-H6)。通過D型和L型的脯氨酸 使多肽折疊，然后再通過兩個半胱氨酸的巰基形成二硫鍵，從而使整個多肽結(jié)構(gòu)成為環(huán)狀， 這種新穎的結(jié)構(gòu)將使所有組氨酸結(jié)合在Zn 2+量子點的表面上，可大大減小空間位阻，因此顯 示出更好的結(jié)合力;本發(fā)明提供的修飾量子點的新型環(huán)狀多肽配體，合成方法簡單，可重復(fù) 性高，與量子點結(jié)合速度快，穩(wěn)定性高，解決了現(xiàn)有量子點多肽配體穩(wěn)定性不足而導(dǎo)致其在 生物體內(nèi)的不穩(wěn)定，進一步拓展了量子點一一多肽復(fù)合物作為納米熒光探針在生物中的應(yīng) 用。
【附圖說明】
[0009] 圖1是修飾QDs的新型環(huán)狀多肽配體(ATTO-HCHVHdPlPHLHCH)的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中：
[0010] 1是用于和量子點發(fā)生FRET的染料ΑΤΤ0 590;
[0011] 2是用于多肽成環(huán)序列；
[0012] 3是用于結(jié)合量子點的組氨酸間隔序列；
[0013] 4是用于多肽折疊序列。
[0014]圖2是用熒光毛細管電泳檢測ATT0-H6與QDs結(jié)合的電泳圖，其中：
[0015] 圖 A 中，a，QDs;b，ATT0-H6: QD = 4:1; c，ATT0-H6: QD = 8:1; d，ATT0-H6: QD = 16:1。
[0016] 圖 B為相同序列的直鏈多肽ATTO-HCHVHPPHLHCH 和QDs結(jié)合，a，QDs; b，ATT0-H6: QD =8:1; c，ATT0-H6: QD = 16:1; d，ATT0-H6: QD = 32:1;
[0017] 圖3不同濃度咪唑在毛細管內(nèi)檢測ATT0-H6與QDs結(jié)合的穩(wěn)定性曲線。
【具體實施方式】
[0018] 本發(fā)明將就以下實施例作進一步說明，但應(yīng)了解的是，這些實施例僅為例示說明 之用，而不應(yīng)被解釋為對本發(fā)明實施的限制。
[0019] 實施例1
[0020] 本發(fā)明所述的方法采用常規(guī)的固相Fmoc法，即固相樹脂上被Fmoc保護的單體氨基 酸去保護后露出氨基，通過縮合反應(yīng)與溶液中氨基酸的羧基形成肽鍵，從而將氨基酸連接 到樹脂上，使肽鏈從C端向N端延伸。
[0021] 1、基本材料：
[0022] (1)樹脂與連接分子：固相Fmoc法選擇的樹脂為Rink Amide-ChemTVfatdx?樹脂。 這種樹脂具有非常好的溶脹性，可以使肽鏈之間更好地進行縮合反應(yīng)，且有足夠的網(wǎng)絡(luò)空 間滿足不斷增長的肽鏈。采用HBTU和HOBt作為連接分子，將多肽分子固定到樹脂上。
[0023] (2)單體:合成所用單體為經(jīng)化學(xué)修飾的α-氨基酸。
[0024] 2、反應(yīng)步驟：
[0025]第一步，將第一個氨基酸共價連接到樹脂上
[0026]加入適當?shù)目s合劑如HBTU和HOBt，使被保護氨基酸羧基端與樹脂形成共脂以完成 氨基酸的固定；
[0027]第二步，去保護
[0028]采用堿性溶劑20%哌啶去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基。
[0029]第三步，激活和交聯(lián)
[0030] 采用活化劑HBTU和HOBt活化下一個氨基上的羧基，與樹脂上的氨基交聯(lián)，形成肽 鍵。
[0031] 第四步，重復(fù)第二步和第三步，反復(fù)循環(huán)添加單體氨基酸，按照HCHVHdPlPHLHCH序 列的順序從右到左合成，直到合成完成。
[0032] 3、合成后成環(huán)及處理：
[0033] (1)洗脫和脫保護：用脫保護劑三氟乙酸(TFA)將肽鏈從樹脂上洗脫下來，并脫除 保護基。
[0034] (2)HPLC 分析純化。
[0035] (3)凍干后用NaHC03和Na2C03來做巰基脫氫反應(yīng)，使兩個半胱氨酸的巰基形成二硫 鍵，從而整個多肽成環(huán)狀。
[0036] (4)再次HPLC分析純化，凍干后保存。
[0037] 通過上述方法，合成環(huán)狀多肽序列411'0-!1〇^!^^^1^〇1以1'1'0-冊）。
[0038] 4、QDs和ATT0-H6在毛細管內(nèi)作用研究：
[0039] 在毛細管內(nèi)，先進樣QDs 10s，間隔10s，再進樣ATT0-H6 10s。實驗結(jié)果表明，ΑΤΤ0- H6與QDs的結(jié)合反應(yīng)在16:1達到平衡（如圖2A，曲線d);而對照實驗沒有成環(huán)的ATT0-H6與 QDs的結(jié)合在32:1才達到平衡(如圖2B，曲線d)。
[0040] 為了檢測新型環(huán)狀多肽配體與QDs結(jié)合的穩(wěn)定性，在QDs與ATT0-H6進樣后，再進樣 取代分子Im。實驗結(jié)果表明，加入大量取代分子后，部分ATT0-H6會從QDs表面被取代下來 (如圖3)。
[0041] 測試條件：
[0042]用熒光毛細管電泳檢測ATT0-H6與QDs的結(jié)合，電泳條件：25mM硼酸緩沖液（pH 9.3)，電壓為181^。[00]=2.54]?。
[0043] 對照實驗，用相同序列的直鏈多肽ATTO-HCHVHPPHLHCH和QDs結(jié)合，檢測波長，實線 為565nm檢測QDs，虛線為625nm檢測ΑΤΤ0 590〇
[0044]用不同濃度咪唑在毛細管內(nèi)檢測ATT0-H6與QDs結(jié)合的穩(wěn)定性。電泳條件：25mM硼 酸緩沖液(pH 9.3)，電壓為 181^^170-^:00 = 32:1,^0==2.541^
[0045] 實施例2
[0046]多肽合成步驟參照實施例1，按照HCHLHdPlPHLHCH序列的順序從右到左合成。合成 新型環(huán)狀多肽配體序列:ATTO-HCHLHdPlPHLHCH。
[0047] 實施例3
[0048]多肽合成步驟參照實施例1，按照HCHVHdPlPHVHCH序列的順序從右到左合成。合成 新型環(huán)狀多肽配體序列:ATTO-HCHVHdPlPHVHCH
[0049] 按照實施例1的方法將實施例2~3得到的多肽序列分別與QDs用毛細管電泳分析， 檢測條件與實施例1相同，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們都能和QDs穩(wěn)定結(jié)合。
[0050] 實施例4
[00511多肽合成步驟參照實施例1，按照HCHVHPPHLHCH序列的順序從右到左合成。合成多 肽配體序列:ATTO-HCHVHPPHLHCH。結(jié)果表明，該多肽配體與ATT0-H6相比，結(jié)合效率大大降 低（參照圖2B)。
[0052]通過上述實施例可以看出，本發(fā)明的新型環(huán)狀多肽配體可以實現(xiàn)量子點與多肽配 體的快速結(jié)合，并且穩(wěn)定性高，操作方便。
[0053]以上述依據(jù)本發(fā)明的理想實施例為啟示，通過上述的說明內(nèi)容，相關(guān)工作人員完 全可以在不偏離本項發(fā)明技術(shù)思想的范圍內(nèi)，進行多樣的變更以及修改。本項發(fā)明的技術(shù) 性范圍并不局限于說明書上的內(nèi)容，必須要根據(jù)權(quán)利要求范圍來確定其技術(shù)性范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種修飾量子點的新型環(huán)狀多肽配體，其特征在于：該新型環(huán)狀多肽配體包括用于 和量子點發(fā)生FRET的染料ATTO 590(1)、用于多肽成環(huán)序列（2)、用于結(jié)合量子點的組氨酸 間隔序列(3)、用于多肽折疊序列(4)，各序列之間以肽鍵相結(jié)合。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種修飾量子點的新型環(huán)狀多肽配體，其特征在于:所述用于 和量子點發(fā)生FRET的染料ATTO 590(1)能作為受體接受量子點的激發(fā)光再發(fā)出新的波長的 發(fā)射光。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種修飾量子點的新型環(huán)狀多肽配體，其特征在于:所述的用 于成環(huán)的序列(2)為2個半胱氨酸序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種修飾量子點的新型環(huán)狀多肽配體，其特征在于:所述的用 于結(jié)合量子點的組氨酸間隔序列(3)為6個組氨酸間隔其他氨基酸序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種修飾量子點的新型環(huán)狀多肽配體，其特征在于:所述的用 于多肽折疊序列(4)為一個D型脯氨酸和一個L型脯氨酸序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種修飾量子點的新型環(huán)狀多肽配體，其特征在于:所述的量 子點為含有Zn的量子點，如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。
【文檔編號】C07K7/08GK106008671SQ201610374856
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】王建浩, 張晨澄, 邱琳, 蔣鵬舉, 柳麗, 王車禮, 滕萬, 滕一萬, 陳瑤
【申請人】常州大學(xué)