本發(fā)明涉及分子結(jié)構(gòu)鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種基于質(zhì)譜分析的多糖拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)解析方法。

背景技術(shù)：

糖基化修飾是蛋白質(zhì)上最普遍、最重要的翻譯后修飾之一，具有極其重要的生理和病理功能?；诖壻|(zhì)譜的糖組學(xué)已經(jīng)成為糖基化多糖修飾位點、單糖組成及其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)鑒定和解析的主要分析手段之一。現(xiàn)有多糖的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)采用樹狀來描述。但是目前現(xiàn)有的多糖拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)解析方法需對原始實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行“去同位素”近似預(yù)處理，存在較大的偏差，在應(yīng)用時有較多的限制。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種準(zhǔn)確性較高的基于質(zhì)譜分析的多糖拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)解析方法。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種基于質(zhì)譜分析的多糖拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)解析方法，包括以下幾個步驟：

(1)將待解析樣本經(jīng)電噴霧電離、質(zhì)譜分析后得到含前體離子實驗同位素輪廓信息的一級質(zhì)譜；

(2)將一級質(zhì)譜中的各前體離子實驗同位素輪廓信息與前體離子理論數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到多個候選多糖拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；根據(jù)這些候選多糖拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中單糖的種類，組成及連接方式，計算得到每個候選多糖的每個候選碎片離子的理論同位素輪廓；

(3)將前體離子送入離子阱中進(jìn)行氣相解離得到碎片離子，將碎片離子送入質(zhì)譜分析器和檢測器，得到包含碎片離子實驗同位素輪廓信息的二級質(zhì)譜；

(4)二級質(zhì)譜中各碎片離子的實驗同位素輪廓依次與每個候選多糖的所有理論碎片離子進(jìn)行匹配；碎片離子匹配度最高的候選多糖拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)即為最終的多糖拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

本發(fā)明的解析方法直接進(jìn)行原始實驗數(shù)據(jù)與相應(yīng)理論數(shù)據(jù)的指紋比對。該算法無需對原始實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行“去同位素”近似預(yù)處理，可以避免相應(yīng)的誤差；根據(jù)各個離子中是否有同位素峰缺失和同位素峰相對強度的偏差對理想及非理想實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行很好的區(qū)分，保證蛋白鑒定的可信度；根據(jù)已知重疊離子的同位素峰相對強度關(guān)系對重疊實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的解析。

所述待解析樣本中多糖的濃度為0.5～2μM，溶劑包括NH₄HCO₃、甲醇和水，其中NH₄HCO₃的濃度為8～12mM，甲醇和水的質(zhì)量相同。

步驟(1)所述的電噴霧電離處理的電壓為2～3kV，溫度為280～350℃。

所述前體離子理論數(shù)據(jù)庫通過以下步驟生成：

(a)根據(jù)單糖的種類和數(shù)量計算每一個N-多糖的分子式；

(b)參照標(biāo)準(zhǔn)元素列表，根據(jù)分子式中元素的種類和數(shù)量計算相應(yīng)的同位素輪廓，即得前體離子理論數(shù)據(jù)庫。

碎片離子理論數(shù)據(jù)庫通過以下步驟生成：

(Ⅰ)根據(jù)每一個N-多糖中單糖的種類、排列、標(biāo)注和斷裂規(guī)律，計算每一個碎片離子的分子式；

(Ⅱ)參照標(biāo)準(zhǔn)元素列表，根據(jù)分子式中元素的種類和數(shù)量計算相應(yīng)的同位素輪廓。

上述兩個理論數(shù)據(jù)庫的建立方法，具體可以參照文獻(xiàn)：Ross K.Snider.Efficient Calculation of Exact Mass Isotopic Distributions.Journal of American Society for Mass Spectrometry,2007,18,1511-1515.

所述標(biāo)準(zhǔn)元素列表中含有每一個同位素的精確原子量及豐度。

所述前體離子的實驗同位素輪廓與相應(yīng)的理論同位素輪廓指紋比對的參數(shù)包括同位素峰強度閾值、同位素峰質(zhì)荷比偏差和同位素峰強度偏差。其中閾值(IPACO)用來控制實驗必須看到一定理論強度以上的同位素峰，同位素峰質(zhì)荷比偏差(IPMD)用來控制同位素峰在質(zhì)譜圖橫軸上的偏差，同位素峰強度偏差(IPAD)用來控制同位素峰在質(zhì)譜圖縱軸上的偏差，最佳IPACO、IPMD和IPAD主要由質(zhì)譜儀的性能來決定；可預(yù)先在假陽性率控制的前提下用模型數(shù)據(jù)來優(yōu)化獲得。

所述的氣相解離為高能碰撞誘導(dǎo)解離。所述的高能碰撞誘導(dǎo)解離的歸一化碰撞能量為10～20％。

所述碎片離子實驗同位素輪廓與相應(yīng)的理論同位素輪廓的指紋比對的參數(shù)包括同位素峰強度閾值、同位素峰質(zhì)荷比偏差和同位素峰強度偏差。

通過IPACO、IPMD和IPAD三個參數(shù)進(jìn)行同位素輪廓指紋比對的方法可參照中國專利CN 103389335進(jìn)行。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：本發(fā)明的解析方法基于N-多糖拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的二維正交表述和理論同位素輪廓數(shù)據(jù)庫、支鏈的歸類、串級質(zhì)譜碎片離子的分類與標(biāo)注，多糖實驗串級質(zhì)譜來解析和鑒定多糖的單糖的組成和這些單糖空間排列的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。本發(fā)明的多糖拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表述與解析方法直觀易懂，碎片離子在任意結(jié)構(gòu)的多糖中都可以采用固定的英文字母，羅馬數(shù)字及阿拉伯?dāng)?shù)字的組合來表述，有利于標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，普遍推廣；基于同位素輪廓指紋比對的數(shù)據(jù)庫搜索算法和多糖鑒定，相對于傳統(tǒng)的單純的質(zhì)量指紋比對算法，具有更好的普適性和可信度。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的解析方法的步驟示意圖；

圖2為標(biāo)準(zhǔn)多糖NA2高能碰撞誘導(dǎo)解離正離子模式一級質(zhì)譜圖；

圖3為多糖NA2一級質(zhì)譜觀察到的前體離子(2+)的實驗同位素輪廓與相應(yīng)理論同位素輪廓的指紋比對；

圖4為實施例1中候選多糖的種類示意圖；

圖5為實施例1中候選多糖結(jié)構(gòu)A高能碰撞誘導(dǎo)解離正離子模式二級質(zhì)譜圖；

圖6為多糖NA2前體離子(2+)HCD(NCE10％)解離二級質(zhì)譜中碎片離子y24-1+實驗同位素輪廓與相應(yīng)理論同位素輪廓的指紋比對；

圖7為標(biāo)準(zhǔn)多糖NA2高能碰撞誘導(dǎo)解離正離子模式串級質(zhì)譜經(jīng)本發(fā)明解析方法得到的圖形解離圖。

具體實施方式

下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。

實施例1

一種基于質(zhì)譜分析的多糖拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)解析方法，主要包括5個具體的解析步驟，如圖1所示；每個步驟簡述如下：

(1)將標(biāo)準(zhǔn)多糖NA2配制成溶液，經(jīng)電噴霧電離、質(zhì)譜檢測后得到包含前體離子實驗同位素輪廓信息的一級質(zhì)譜圖，其中，標(biāo)準(zhǔn)多糖NA2的濃度為1μM，溶劑包括NH₄HCO₃、甲醇和水，其中NH₄HCO₃的濃度為10mM，甲醇和水的質(zhì)量相同；電噴霧電離處理的電壓為2.5kV，溫度為300℃；一級質(zhì)譜圖如圖2所示；

(2)將前體離子的實驗同位素輪廓與前體離子理論數(shù)據(jù)庫中的各個多糖逐個進(jìn)行指紋比對，比對結(jié)果如圖3所示，凡是理論同位素輪廓滿足比對閾值(IPACO＝10％以上的每個同位素峰都有被觀察到；且這些同位素峰的IPMD≤15ppm,IPAD≤50％)的數(shù)據(jù)庫中多糖即為該實驗同位素輪廓(或前體離子)對應(yīng)的候選多糖，如圖4所中A、B、C所示。

(3)計算圖3中三個候選多糖所有碎片離子的理論同位素輪廓，如候選結(jié)構(gòu)A的Y系列碎片離子Y24-1+的理論同位素輪廓信息如表1所示。

表1.圖3中候選結(jié)構(gòu)A的Y系列碎片離子Y24-1+的理論和實驗同位素輪廓信息

(4)將一級質(zhì)譜中觀察到的前體離子經(jīng)離子阱中氣相解離(如高能碰撞誘導(dǎo)解離)處理得到碎片離子，高能碰撞誘導(dǎo)解離的歸一化碰撞能量為10％，然后將碎片離子送入質(zhì)譜儀，得到包含碎片離子實驗同位素輪廓信息的二級質(zhì)譜，二級質(zhì)譜圖如圖5所示；

(5)將二級質(zhì)譜中的各個碎片離子的實驗同位素輪廓與三個候選多糖的各碎片離子的理論同位素輪廓依次進(jìn)行指紋比對，如候選多糖結(jié)構(gòu)A的Y系列碎片離子Y24-1+的比對情況如表1和圖6所示。候選結(jié)構(gòu)A，B，C分別從實驗二級質(zhì)譜中匹配到20，18和16個碎片離子；因此匹配度最高的候選結(jié)構(gòu)A為最終的多糖拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，得到的結(jié)構(gòu)如圖7所示。

(6)查閱標(biāo)準(zhǔn)多糖NA2的標(biāo)準(zhǔn)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)與本方法得到的結(jié)構(gòu)相同，說明本發(fā)明的解析方法可信度高。

實施例2

采用與實施例1相同的標(biāo)準(zhǔn)多糖及解析步驟，不同之處在于所采用的條件不同：

(1)電噴霧電離時，標(biāo)準(zhǔn)多糖NA2的濃度為0.5μM，溶劑包括NH₄HCO₃、甲醇和水，其中NH₄HCO₃的濃度為8mM，甲醇和水的質(zhì)量相同；電噴霧電離處理的電壓為2kV，溫度為280℃.

(2)高能碰撞誘導(dǎo)解離的歸一化碰撞能量為15％。

最終得到的多糖拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)結(jié)論不變。

實施例3

采用與實施例1相同的標(biāo)準(zhǔn)多糖及解析步驟，不同之處在于所采用的條件不同：

(1)電噴霧電離時，標(biāo)準(zhǔn)多糖NA2的濃度為2μM，溶劑包括NH₄HCO₃、甲醇和水，其中NH₄HCO₃的濃度為12mM，甲醇和水的質(zhì)量相同；電噴霧電離處理的電壓為3kV，溫度為350℃.

(2)高能碰撞誘導(dǎo)解離的歸一化碰撞能量為20％。

最終得到的多糖拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)結(jié)論不變。