專利名稱:產(chǎn)乳酸酵母的制作方法
背景領(lǐng)域 本發(fā)明一般涉及的是酵母(例如真菌),它們?cè)谂囵B(yǎng)時(shí)可以產(chǎn)生相對(duì)高濃度的乳酸。本發(fā)明還涉及培養(yǎng)基,當(dāng)在其中培養(yǎng)產(chǎn)乳酸酵母時(shí),與在本領(lǐng)域內(nèi)已知的某些培養(yǎng)基中培養(yǎng)該酵母相比,將產(chǎn)生相對(duì)更低水平的副產(chǎn)品雜質(zhì)。
乳酸(2-羥基丙酸,CH3CHOHCOOH)是天然存在的、可以通過發(fā)酵或者化學(xué)合成產(chǎn)生的羥基酸。乳酸是具有旋光活性的最簡(jiǎn)單的羥基酸。L(+)-乳酸可以通過發(fā)酵直接產(chǎn)生,而不含有D(-)-乳酸(例如已知的化學(xué)合成產(chǎn)生兩種異構(gòu)體的外消旋混合物)。同樣,D(-)-乳酸也可以通過發(fā)酵產(chǎn)生而不含有L(+)-乳酸。乳酸可以用于食物中作為防腐劑和增香劑。乳酸衍生物可以用在工業(yè)應(yīng)用中,例如涂料和電沉積涂層、藥物和化妝品。通過乳酸脫水可以產(chǎn)生的重要化合物是多聚(乳酸)塑料。L(+)-乳酸是可生物降解塑料應(yīng)用中的優(yōu)選聚合原料。
可以通過成批方式培養(yǎng)某些微生物,例如某些乳桿菌(Lactobacillus),芽孢桿菌(Bacillus),乳球菌(Lactococcus),或者根霉(Rhizopus)進(jìn)行L(+)-乳酸發(fā)酵。在乳酸發(fā)酵中可能遇到的一個(gè)問題是由于未解離的酸的積累(例如降低發(fā)酵培養(yǎng)液的pH)導(dǎo)致的生長(zhǎng)和代謝的抑制(Buchta,1983;Hongo et al.,1985;Benninga,1990)。在某些情況下,可以通過在發(fā)酵中加入試劑如Ca(OH)2,CaCO3,NaOH,或者NH4OH控制發(fā)酵過程的pH在中性或者接近中性。結(jié)果是產(chǎn)生的發(fā)酵培養(yǎng)液可能含有高濃度的各種不同的鹽類,從培養(yǎng)液中回收未解離的乳酸可能是非常昂貴的。而且,某些乳桿菌為產(chǎn)生乳酸可能具有復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)需求(WO 99/19503),它們需要復(fù)雜的氮源,例如酵母提取物或者玉米漿(CSL)。這些復(fù)雜的氮源可能包含額外的有機(jī)和無機(jī)雜質(zhì),它們可能使乳酸的回收復(fù)雜化。
另外一種解除由培養(yǎng)基中乳酸積累造成的抑制的方法涉及在例如某些根霉種的發(fā)酵過程中從培養(yǎng)液中連續(xù)除去乳酸。樹脂,例如聚乙烯吡啶,可以用于這種連續(xù)清除。
在用作聚合物級(jí)別的原料時(shí),優(yōu)選地將乳酸回收和純化到最高可能的純度水平。優(yōu)選地,有機(jī)雜質(zhì)(例如來自復(fù)合氮源),無機(jī)雜質(zhì)(與培養(yǎng)基組分和中和物質(zhì)有關(guān))以及生產(chǎn)有機(jī)體在發(fā)酵過程中分泌的代謝中間產(chǎn)物都被除去。
轉(zhuǎn)化了攜帶乳酸脫氫酶(例如攜帶LDH)的質(zhì)粒的野生型釀酒酵母在培養(yǎng)時(shí)可以生產(chǎn)一些乳酸。但是,該重組酵母細(xì)胞同時(shí)從葡萄糖形成乙醇,這會(huì)導(dǎo)致三個(gè)問題。首先,在乳酸發(fā)酵中用于產(chǎn)生乙醇的葡萄糖是一種碳的流失,在以每克葡萄糖計(jì)算乳酸產(chǎn)量時(shí)會(huì)降低乳酸產(chǎn)量。第二,乙醇在培養(yǎng)液中的積累降低了乳酸生產(chǎn)的發(fā)酵效率。第三,乙醇實(shí)際上是一種雜質(zhì),需要在乳酸純化過程中去除。
在某些酵母、主要是克雷樹(crabtree)效應(yīng)陽性的酵母中,丙酮酸脫羧化的主要途徑涉及丙酮酸脫羧酶。克雷樹效應(yīng)陽性的酵母在有氧條件下在過量糖(例如葡萄糖)存在時(shí)或者當(dāng)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速率高于臨界生長(zhǎng)速率時(shí)就會(huì)從丙酮酸產(chǎn)生醇。克雷樹效應(yīng)陽性酵母的示例有釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、光滑假絲酵母(Candidaglabrata)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。為了將向乙醇的碳流動(dòng)改道,以提高來自丙酮酸的乳酸的產(chǎn)量,需要限制酵母中的丙酮酸脫羧化。
在釀酒酵母中,丙酮酸脫羧酶(EC 4.1.1.1)催化丙酮酸向乙醛的轉(zhuǎn)化,這是發(fā)酵代謝中的第一步。當(dāng)釀酒酵母中的丙酮酸脫羧酶結(jié)構(gòu)基因被破壞,則酵母不能產(chǎn)生乙醇(Hohmann,1997)。已經(jīng)提出,除了分解代謝活性,丙酮酸脫羧酶還有生物合成的功能。在本領(lǐng)域內(nèi)已知丙酮酸脫羧酶陰性(Pdc-)(例如沒有可以檢測(cè)量的丙酮酸脫羧酶活性)的釀酒酵母菌株,如果葡萄糖作為唯一碳源,不加入少量乙醇或者乙酸鹽(例如生長(zhǎng)所需的5%的碳)時(shí),不能在在合成培養(yǎng)基上在葡萄糖受限制的恒化器中需氧生長(zhǎng)。
發(fā)明公開 本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及的是耐酸(AT)的酵母菌株。AT酵母株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)基本上不產(chǎn)生乙醇,它們包含有包括了外源性乳酸脫氫酶(LDH)基因的基因組。優(yōu)選地,該外源LDH基因是L-乳酸脫氫酶基因。所述外源LDH基因可以是AT酵母的至少一條染色體上的元件和/或AT酵母中的至少一個(gè)質(zhì)??梢园撏庠碙DH基因。該LDH可以在AT酵母株中表達(dá),且其表達(dá)產(chǎn)生了具有乳酸脫氫酶活性的乳酸脫氫酶蛋白。在一些實(shí)施方案中,AT酵母株沒有可以檢測(cè)量的丙酮酸脫羧酶活性。在某些實(shí)施方案中,AT酵母株的野生型菌株是克雷樹效應(yīng)陽性的。而且,AT酵母株能夠在基本培養(yǎng)基中,在低于其親本酵母株的pH下產(chǎn)生乳酸。AT酵母株的親本株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)也基本上不產(chǎn)生乙醇,其基因組中包括能夠被表達(dá)的外源乳酸脫氫酶(LDH)基因,這樣產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有乳酸脫氫酶活性。但是親本菌株未經(jīng)過能使其耐酸的處理(例如選擇)。
AT酵母株優(yōu)選能夠在pH低于大約3.5、更優(yōu)選在pH低于大約2.8、最優(yōu)選在pH低于大約2.3的條件下產(chǎn)生乳酸。還優(yōu)選AT酵母株能夠在基本培養(yǎng)基(例如在分批培養(yǎng)中,在分批補(bǔ)料培養(yǎng)中或者恒化器)中需氧培養(yǎng)時(shí),在培養(yǎng)基中產(chǎn)生大于大約500mM的乳酸。優(yōu)選地,AT酵母株能夠在pH大約2.3和2.4之間在培養(yǎng)液中生產(chǎn)500mM乳酸。更為優(yōu)選地,AT酵母株在基本培養(yǎng)基中需氧培養(yǎng)時(shí),能夠產(chǎn)生多于大約565mM的乳酸,最優(yōu)選多于大約665mM的乳酸。在一些實(shí)施方案中,AT酵母株在含有葡萄糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),能夠每100克葡萄糖產(chǎn)生大于約50克乳酸。在某些實(shí)施方案中,優(yōu)選地,在含有葡萄糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),AT酵母株能夠每100克葡萄糖產(chǎn)生50克到85克乳酸,更為優(yōu)選地,AT酵母株能夠每100克葡萄糖產(chǎn)生約70克到85克乳酸。優(yōu)選地,AT酵母株產(chǎn)生的乳酸是L-(+)乳酸。優(yōu)選地,該AT酵母株屬于選自下列的屬酵母屬(Saccharomyces),假絲酵母屬(Candida),裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces),有孢圓酵母屬(Torulaspora),克魯維酵母屬(Kluyveromyces),接合酵母屬(Zygosaccharomyces)和德克酵母屬(Dekkera)。更為優(yōu)選地,AT酵母株屬于酵母屬,假絲酵母屬,裂殖酵母屬,或克魯維酵母屬。更為優(yōu)選地,AT酵母株屬于酵母屬,例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在某些實(shí)施方案中,AT酵母株可以是具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxP ura3-52 YEpLpLDH的釀酒酵母。在某些實(shí)施方案中,酵母株可以選自耐熱克魯維酵母(Kluyveromycesthermotolerans),Zygosaccharomyces bailii,粟酒裂殖酵母(Schizosaccharornyces pombe),和光滑假絲酵母(Candidaglabrata)。
在某些實(shí)施方案中,AT酵母株的生長(zhǎng)依賴于具有C2碳源,這樣,在一些情況下,該AT酵母株能夠在包含基本上由葡萄糖和至少一種C2碳源組成的碳源的第二種基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在某些實(shí)施方案中,AT酵母株可以是不依賴于C2碳源的(例如CI酵母株)。在某些實(shí)施方案中,CI酵母株能夠在包含至少一種選自下述的確定碳源的另一種基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖和半乳糖。在某些實(shí)施方案中,CI酵母能夠在以葡萄糖作為唯一碳源的第二種基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
AT酵母株能夠在基本上由至少一種確定的碳源、至少一種確定的氮源、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銅、氯化鐵、硫酸錳、鉬酸鈉、硫酸鋅、生物素、肌醇、硫胺素和水組成的第二種基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。所述確定的氮源可以包含至少一種選自由尿素、磷酸銨、硝酸銨和硫酸銨組成之組中的化合物。
在某些實(shí)施方案中,屬于AT酵母株基因組一部分的外源性乳酸脫氫酶基因可以是植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum),牛,干酪乳桿菌(Lactobacillus casei),巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium),米根霉(Rhizopus oryzae),或者嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophylus)的乳酸脫氫酶基因。這些基因的核苷酸序列的示例可以在GenBank中分別以登錄編號(hào)AJ293008,NP776524,M76708,M22305,Q9P4B6,和M19396得到。在一些實(shí)施方案中,外源乳酸脫氫酶基因是植物乳桿菌的乳酸脫氫酶基因。優(yōu)選地,外源LDH基因是L-乳酸脫氫酶基因。優(yōu)選地,外源乳酸脫氫酶基因與啟動(dòng)子有效連接。所述啟動(dòng)子優(yōu)選是強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中,該優(yōu)選的啟動(dòng)子是選自由下列各項(xiàng)組成之組中的啟動(dòng)子磷酸丙糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子、丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子、乙醇脫氫酶啟動(dòng)子和L-蘇氨酸脫氫酶啟動(dòng)子。優(yōu)選地,啟動(dòng)子是磷酸丙糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中,啟動(dòng)子可以是丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子,例如克魯維酵母的丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)基本上不產(chǎn)生乙醇的耐酸(AT)釀酒酵母,其基因組包含了能夠在AT釀酒酵母中表達(dá)的外源乳酸脫氫酶基因。在某些實(shí)施方案中,AT釀酒酵母沒有可檢測(cè)量的丙酮酸脫羧酶活性。優(yōu)選地,外源LDH基因是L-乳酸脫氫酶基因。所表達(dá)的乳酸脫氫酶蛋白具有乳酸脫氫酶活性,且與其親本釀酒酵母株相比,AT釀酒酵母能夠在更低的pH下在基本培養(yǎng)基中產(chǎn)生乳酸。優(yōu)選地,外源乳酸脫氫酶基因是植物乳桿菌的乳酸脫氫酶基因。優(yōu)選地,在AT釀酒酵母中至少一個(gè)質(zhì)粒包含外源的乳酸脫氫酶基因。在某些實(shí)施方案中,AT釀酒酵母可以具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxPpdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxP ura3-52 YEpLpLDH。
優(yōu)選地,在第二種基本培養(yǎng)基中需氧培養(yǎng)時(shí),AT釀酒酵母能夠在培養(yǎng)液中產(chǎn)生大于約500mM的乳酸。優(yōu)選地,第二種培養(yǎng)液的pH在大約2.3和2.4之間。
本發(fā)明的某些實(shí)施例涉及具有包含外源乳酸脫氫酶基因的基因組的重組酵母株,所述外源乳酸脫氫酶基因能夠在該重組酵母株中表達(dá)。優(yōu)選地,外源LDH基因是L-乳酸脫氫酶基因。表達(dá)產(chǎn)生的乳酸脫氫酶具有乳酸脫氫酶活性,且該重組酵母株在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生至少大約565mM的乳酸,更優(yōu)選至少大約665mM的乳酸。重組酵母株能夠在低于大約3.5、優(yōu)選低于大約2.8、更優(yōu)選低于大約2.3、最優(yōu)選低于大約2.0的pH下產(chǎn)生乳酸。在某些實(shí)施方案中,重組酵母株的野生型菌株是克雷樹效應(yīng)陽性。優(yōu)選重組酵母是釀酒酵母。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及耐酸的不依賴于C2碳源(CI)的酵母株。CI酵母在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)基本上不產(chǎn)生乙醇,其基因組包含能夠被表達(dá)的外源乳酸脫氫酶基因。優(yōu)選地,外源LDH基因時(shí)L-乳酸脫氫酶基因。表達(dá)產(chǎn)生的乳酸脫氫酶蛋白具有乳酸脫氫酶活性。CI酵母株能夠在葡萄糖作為唯一碳源的第一種基本培養(yǎng)基中在需氧條件下培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生乳酸,并且在比親本株培養(yǎng)更低的pH條件下在第一種基本培養(yǎng)基中產(chǎn)生乳酸。優(yōu)選地,親本株是依賴于C2碳源的。在某些實(shí)施方案中,CI酵母沒有可檢出量的丙酮酸脫羧酶活性。在某些實(shí)施方案中,同一菌株的野生型酵母株是克雷樹效應(yīng)陽性的。在一些實(shí)施方案中,CI酵母株可以包含植物乳桿菌,牛,干酪乳桿菌,巨大芽孢桿菌,米根霉,或者嗜熱脂肪芽孢桿菌的外源乳酸脫氫酶基因。優(yōu)選地,CI酵母株包含植物乳桿菌的乳酸脫氫酶基因。CI酵母株染色體可以包含外源乳酸脫氫酶基因和/或至少一個(gè)包含外源乳酸脫氫酶基因的質(zhì)粒可以存在于CI酵母株內(nèi)。在某些實(shí)施方案中,外源乳酸脫氫酶基因可以是2μ質(zhì)粒的一部分。
在某些實(shí)施方案中,CI酵母株能夠在低于大約2.8、更優(yōu)選低于大約2.3的pH下產(chǎn)生乳酸。在某些實(shí)施方案中,CI酵母株培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中,能夠每100克葡萄糖產(chǎn)生大于大約50克的乳酸;在一些實(shí)施方案中,產(chǎn)生大約50克到85克的乳酸/100克葡萄糖;在一些實(shí)施方案中,產(chǎn)生大約70克到85克的乳酸/100克葡萄糖。在一些實(shí)施方案中,CI酵母株在基本培養(yǎng)基中需氧培養(yǎng)時(shí)能夠在培養(yǎng)液中產(chǎn)生多于大約565mM的乳酸。優(yōu)選地,CI酵母株在大約pH2.3-2.4下培養(yǎng)。更為優(yōu)選地,CI酵母株能夠產(chǎn)生多于大約665mM的乳酸。優(yōu)選地,CI酵母株屬于選自下列各項(xiàng)的屬酵母屬,假絲酵母屬,裂殖酵母屬,有孢圓酵母屬,克魯維酵母屬,接合酵母屬和德克酵母屬。更為優(yōu)選地,CI酵母株屬于選自由酵母屬,假絲酵母屬,裂殖酵母屬和克魯維酵母屬組成之組中的屬。在一些實(shí)施方案中,CI酵母株屬于選自由釀酒酵母,耐熱克魯維酵母,Zygosaccharomyces bailii,粟酒裂殖酵母和光滑假絲酵母組成之組的種。在某些實(shí)施方案中,CI酵母可以是具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxP ura3-52 YEpLpLDH的釀酒酵母。CI酵母株能夠在需氧分批培養(yǎng)、需氧分批補(bǔ)料培養(yǎng)或者需氧恒化器中生長(zhǎng)。
CI酵母株能夠在包含至少一種確定碳源的第二種基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng),所述碳源選自由葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖和半乳糖組成之組。某些CI酵母株能夠在基本上由至少一種確定的碳源(選自由葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖和半乳糖組成之組)、至少一種確定的氮源(選自由尿素、磷酸銨、硝酸銨和硫酸銨組成之組)、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銅、氯化鐵、硫酸錳、鉬酸鈉、硫酸鋅、生物素、肌醇、硫胺素和水組成的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基,所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基基本上由至少一種確定的碳源、至少一種確定的氮源、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銅、氯化鐵、硫酸錳、鉬酸鈉、硫酸鋅、生物素、肌醇、硫胺素和水組成。在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基基本上由基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成。在某些實(shí)施方案中,確定的碳源包含C2碳源,并可選地包含至少一種選自由葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖組成之組中的化合物?;蛘?,在一些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基中包含葡萄糖作為唯一碳源。在某些實(shí)施方案中,氮源是選自由尿素、磷酸銨、硝酸銨和硫酸銨組成之組中的化合物。在一些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基包含大約0.5-5g硫酸銨/升;更優(yōu)選大約0.5-2g/升的硫酸銨;最優(yōu)選大約1-2g/升的硫酸銨。在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基包含大約0.1-2g/升的尿素;更優(yōu)選大約0.1-1g/升的尿素;最優(yōu)選大約0.5-2g/升的尿素。在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基可以包含碳酸鈣。在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基可以包含大約2.78g/升的碳酸鈣。在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基包含大約1000ppm Ca+2。在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基包含大約5g-10g/升的葡萄糖。在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基包含大約0.2g-2g/升的磷酸二氫鉀;大約0.1g-1g/升的硫酸鎂;大約5-50微克/升的硫酸銅;大約0.05-0.25mg/升的氯化鐵;大約0.05-0.5mg/升的硫酸錳;大約0.05-0.25mg/升的鉬酸鈉;大約0.05-0.5mg/升的硫酸鋅;大約0.5-2.5微克/升的生物素;大約0.5-4mg/升的肌醇;大約0.05-0.5mg/升的硫胺素。
在一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的基本培養(yǎng)基可以包含大約5g-100g/升的葡萄糖或者大約0.1-1wt%乙醇,大約5g/升的硫酸銨或者大約1g/升的尿素,大約1g/升的磷酸二氫鉀,大約0.5g/升的硫酸鎂;大約40微克/升的硫酸銅;大約0.2mg/升的氯化鐵;大約0.4mg/升的硫酸錳;大約0.2mg/升的鉬酸鈉;大約0.4mg/升的硫酸鋅;大約2微克/升的生物素;2mg/升的肌醇;以及大約0.4mg/升的硫胺素。在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基還包含大約0.1-1wt%乙醇。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及基本上由水、大約70g/升的葡萄糖,大約0.5wt%乙醇,大約1g/升的尿素,大約1g/升的磷酸二氫鉀,大約0.5g/升的硫酸鎂七水合物;大約2.78g/升碳酸鈣,大約62.5微克/升五水硫酸銅;大約200微克/升氯化鐵;大約450微克/升的一水硫酸錳;大約235微克/升的二水鉬酸鈉;大約712微克/升的七水硫酸鋅;2微克/升的生物素;2000微克/升的肌醇;以及400微克/升的硫胺素鹽酸鹽組成的培養(yǎng)基。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及包含下述的培養(yǎng)基大約400-1100ppm的N,大約215-287ppm的K+,大約525-700ppm的PO4-2,大約49ppm的Mg+2,大約195ppm的SO4-2,大約1100ppm的Ca+2,大約0.07ppm的Fe+3,大約0.145ppm的Mn2+,大約0.09ppm的Mo-4,大約0.16ppm的Zn+2,大約0.015ppm的Cu+2,大約0.002mg/升的生物素,大約2mg/升的肌醇,大約0.4mg/升的硫胺素鹽酸鹽,和水。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及具有包含外源性乳酸脫氫酶基因的基因組的重組酵母株,所述外源乳酸脫氫酶基因能夠在重組酵母株中表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)生的乳酸脫氫酶具有乳酸脫氫酶活性,并且為該重組酵母株在包含葡萄糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),它能夠每100克葡萄糖產(chǎn)生至少大約50克的乳酸。優(yōu)選地,該重組酵母株能夠每100克葡萄糖產(chǎn)生大約50-85克的乳酸,最優(yōu)選地,重組酵母株在包含葡萄糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),能夠每100克葡萄糖產(chǎn)生大約70-85克的乳酸。該重組酵母株能夠在低于大約3.5、優(yōu)選低于大約2.8、更優(yōu)選低于大約2.3、最優(yōu)選低于大約2的pH下生長(zhǎng)。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及生產(chǎn)乳酸的方法,包括在第一種培養(yǎng)基中需氧培養(yǎng)具有包含外源乳酸脫氫酶基因的基因組的重組酵母株,所述外源乳酸脫氫酶基因能夠在該重組酵母株中表達(dá),其中表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有乳酸脫氫酶活性,所述重組酵母株在包含葡萄糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),它能夠產(chǎn)生至少大約50克乳酸/100克葡萄糖,并且其中所述重組酵母株能夠在低于大約3.5的pH下生長(zhǎng)。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及通過選擇過程回收的耐酸(AT)酵母株,所述選擇過程包括在第一種需氧培養(yǎng)液中培養(yǎng)第一種酵母株(例如親本株)。通過用第一種酵母株接種第一種基本培養(yǎng)基開始第一種需氧培養(yǎng),所述第一種酵母株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)基本上不產(chǎn)生乙醇,并且包含具有能夠表達(dá)的外源乳酸脫氫酶基因的基因組。在某些實(shí)施方案中,該第一種酵母株缺少丙酮酸脫羧酶活性或者乙醇脫氫酶活性中的至少一種。表達(dá)產(chǎn)生的乳酸脫氫酶蛋白具有乳酸脫氫酶活性。在某些實(shí)施方案中,第一種酵母株的野生型酵母株是克雷樹效應(yīng)陽性的。在第一種需氧培養(yǎng)物生長(zhǎng)的過程中,培養(yǎng)液的pH下降。選擇過程還包含確定第一種酵母株仍然能夠在第一種基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的最低pH的步驟,以及在第一種需氧培養(yǎng)物仍然在生長(zhǎng)、而pH在最低值附近時(shí)從第一種需氧培養(yǎng)物中回收至少一種第二種酵母株的步驟。在某些實(shí)施方案中,選擇步驟還可以包含步驟(1)通過用回收的第二種酵母株接種新鮮的基本培養(yǎng)基開始培養(yǎng)第二種需氧培養(yǎng)物。在第二種需氧培養(yǎng)物生長(zhǎng)過程中,培養(yǎng)液的pH下降。接下來,(2)在第二種需氧培養(yǎng)物仍然在生長(zhǎng)、而培養(yǎng)物的pH低于第一種需氧培養(yǎng)物的大約最低pH時(shí),從第二種需氧培養(yǎng)物中回收至少一種第三種酵母株。在一些實(shí)施方案中,步驟(1)和(2)重復(fù)至少一次,包括用從前一個(gè)重復(fù)中回收的酵母株接種新鮮的培養(yǎng)基。優(yōu)選地,在最后一次重復(fù)中AT酵母株保持生長(zhǎng)的需氧培養(yǎng)物的大約最低pH,要低于在前一個(gè)重復(fù)中AT酵母株保持生長(zhǎng)的需氧培養(yǎng)物的大約最低pH。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及通過如下過程篩選出的不依賴于C2碳源(CI)的耐酸酵母株,該過程包含用其生長(zhǎng)需要包含C2碳源的基本培養(yǎng)基的AT酵母株接種基本培養(yǎng)基。酵母株在使用第二種基本培養(yǎng)基的系列分批需氧培養(yǎng)物中培養(yǎng)。在系列培養(yǎng)開始時(shí),第二種基本培養(yǎng)基包含葡萄糖和C2碳源作為唯一碳源,其濃度足以使酵母培養(yǎng)物生長(zhǎng)。在系列分批培養(yǎng)進(jìn)行中,C2碳源的濃度降低,每一次后續(xù)的分批培養(yǎng)都用在系列培養(yǎng)中前面的分批培養(yǎng)中生長(zhǎng)的酵母進(jìn)行接種。從系列分批培養(yǎng)中回收至少一個(gè)能夠在沒有C2碳源、使用葡萄糖作為唯一碳源的情況下生長(zhǎng)的CI酵母株。在某些實(shí)施方案中,該AT株缺少丙酮酸脫羧酶活性或者乙醇脫氫酶活性中的至少一種。在一些實(shí)施方案中,該AT株可以是克雷樹效應(yīng)陽性的。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及生產(chǎn)乳酸或者其鹽的方法。該方法包括在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)AT酵母株或者CI酵母株。所述酵母株和基本培養(yǎng)基如上所述。在一些實(shí)施方案中,由培養(yǎng)AT或者CI酵母株產(chǎn)生的培養(yǎng)液,與在基本上相同的基本培養(yǎng)基中在基本相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)親本株得到的培養(yǎng)液相比,包含更少ppm的下列各項(xiàng)中至少一種甘油、赤蘚醇、馬來酸、丙酮酸、琥珀酸、甲酸和富馬酸。
在其中培養(yǎng)AT或者CI酵母株以產(chǎn)生乳酸及其鹽的培養(yǎng)基可以是基本培養(yǎng)基,其中包含至少一種選自以下各項(xiàng)的確定碳源葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖和半乳糖。在某些實(shí)施方案中,其中的酵母株是不依賴于C2碳源的,該基本培養(yǎng)基包含葡萄糖作為唯一碳源。在其他實(shí)施方案中,AT酵母株是C2碳源依賴性的,且基本培養(yǎng)基包含基本上由葡萄糖和至少一種C2碳源組成的碳源。在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基基本上由至少一種確定的碳源、至少一種確定的氮源、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銅、氯化鐵、硫酸錳、鉬酸鈉、硫酸鋅、生物素、肌醇、硫胺素和水組成,其中所述氮源選自由尿素、硫酸銨、磷酸銨和硝酸銨組成之組。在一些實(shí)施方案中,從得到的培養(yǎng)液中回收和純化乳酸。純化可以包含蒸餾、離子交換、納米過濾(nanofiltration)或者溶劑提取中的至少一項(xiàng)。
在一些實(shí)施方案中,培養(yǎng)產(chǎn)生的培養(yǎng)液包含大于大約500mM的乳酸,更優(yōu)選565mM的乳酸,最優(yōu)選大于大約665mM乳酸。在某些實(shí)施方案中,AT或者CI酵母株能夠在低于大約3.5、更優(yōu)選低于大約2.8、最優(yōu)選低于大約2.3的pH下產(chǎn)生乳酸。優(yōu)選地,所產(chǎn)生的乳酸基本上由L-乳酸組成。在某些實(shí)施方案中,AT或者CI酵母株可以屬于選自由以下各項(xiàng)組成之組中的屬酵母屬,假絲酵母屬,裂殖酵母屬,和克魯維酵母屬;更為優(yōu)選地,該AT或者CI酵母株可以是釀酒酵母。在某些實(shí)施方案中,該AT或者CI酵母株可以是具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxP ura3-52YEpLpLDH的釀酒酵母。AT或者CI酵母株可以在需氧分批培養(yǎng)、需氧補(bǔ)料分批培養(yǎng)或者需氧恒化器中培養(yǎng)。在某些實(shí)施方案中,來自AT酵母株培養(yǎng)的培養(yǎng)液與在基本上相同的基本培養(yǎng)基中在基本相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)其親本株得到的培養(yǎng)液相比,包含更少ppm的下列各項(xiàng)中的至少一種甘油、赤蘚醇、馬來酸、丙酮酸、琥珀酸、甲酸和富馬酸。乳酸或者其鹽的生產(chǎn)方法還可以進(jìn)一步包括通過例如蒸餾、離子交換、納米過濾或者溶劑提取中的至少一項(xiàng),對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行純化的步驟。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及保藏號(hào)為NRRL Y-30696的耐酸酵母株。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及保藏號(hào)為NRRL Y-30697和Y-30698的C2碳源非依賴性耐酸酵母株。
某些實(shí)施方案涉及包含至少500mM乳酸和第一組化合物的發(fā)酵培養(yǎng)液。更優(yōu)選地,培養(yǎng)液包含至少大約565mM的乳酸,最優(yōu)選至少大約665mM的乳酸。發(fā)酵中乳酸的mM數(shù)與第一組化合物的mM數(shù)的比例至少是大約54,更優(yōu)選至少大約66,最優(yōu)選至少大約184。第一組化合物由甘油、赤蘚醇、甘露醇、蘋果酸、丙酮酸、琥珀酸、甲酸和富馬酸組成。優(yōu)選地,發(fā)酵培養(yǎng)液的pH在大約2.3和2.4之間。優(yōu)選地,發(fā)酵培養(yǎng)液是釀酒酵母的發(fā)酵產(chǎn)物,更為優(yōu)選的是如上所述的重組釀酒酵母的發(fā)酵產(chǎn)物。產(chǎn)生發(fā)酵的培養(yǎng)可以在需氧分批培養(yǎng)、需氧分批補(bǔ)料培養(yǎng)或者需氧恒化器中進(jìn)行。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及包含復(fù)制起點(diǎn)和與啟動(dòng)子有效連接的乳桿菌乳酸脫氫酶基因的質(zhì)粒。該復(fù)制起點(diǎn)優(yōu)選是本領(lǐng)域內(nèi)已知的酵母復(fù)制起點(diǎn),例如2μ復(fù)制起點(diǎn)。優(yōu)選地,乳酸脫氫酶基因是L-乳酸脫氫酶基因。乳桿菌乳酸脫氫酶基因可以是任何一個(gè)在與啟動(dòng)子有效連接時(shí)能夠在酵母中表達(dá)的乳酸脫氫酶基因。優(yōu)選地,乳酸脫氫酶基因是植物乳桿菌的乳酸脫氫酶基因。啟動(dòng)子可以是被酵母識(shí)別的本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何啟動(dòng)子。優(yōu)選地,啟動(dòng)子可被釀酒酵母識(shí)別。在某些實(shí)施方案中,啟動(dòng)子可以是磷酸丙糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中,啟動(dòng)子可以是丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子,例如克魯維酵母丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子。在其他實(shí)施方案中,啟動(dòng)子選自乙醇脫氫酶啟動(dòng)子和L-蘇氨酸脫氫酶啟動(dòng)子。
日用品應(yīng)用需要有經(jīng)濟(jì)合算的乳酸生產(chǎn)過程的開發(fā)。理想的是能夠有釀酒酵母株,以及其它酵母,它們不產(chǎn)生乙醇但是產(chǎn)生乳酸。這些能夠在化學(xué)成分確定的基本培養(yǎng)基中在低pH環(huán)境下、不需要C2化合物進(jìn)行生長(zhǎng)的酵母是合乎需要的。
附圖的簡(jiǎn)要描述
圖1是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的工藝流程圖。
圖2是YEpLpLDH的質(zhì)粒圖譜。
圖3圖示了包含外源乳酸脫氫酶基因的Pdc陰性釀酒酵母菌株的乳酸生產(chǎn)。
圖4圖示了本發(fā)明的耐酸釀酒酵母菌株的乳酸生產(chǎn)。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式 “丙酮酸脫羧酶”(Pdcp)指的是可以催化丙酮酸向乙醛轉(zhuǎn)化的任何蛋白質(zhì)(例如酶)?!癙DC”指的是野生型的丙酮酸脫羧酶基因?!錺dc″指的是突變型丙酮酸脫羧酶基因。“沒有可檢測(cè)量的丙酮酸脫羧酶活性”指的是使用以前描述的方法(van Maris,et al.2003),酵母中的丙酮酸脫羧酶活性低于0.005微摩爾·分鐘-1·毫克-1蛋白的檢測(cè)限度??梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的方法降低或者基本上去除酵母株中的丙酮酸脫羧酶活性。例如,可以突變、破壞丙酮酸脫羧酶結(jié)構(gòu)基因、丙酮酸脫羧酶結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子、調(diào)控丙酮酸脫羧酶結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的基因或者該調(diào)控基因的啟動(dòng)子,或者缺失該基因的至少一部分。而且,可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他方法改變基因的表達(dá)。例如,可以向酵母株中引入反義構(gòu)建體,其降低丙酮酸脫羧酶mRNA向丙酮酸脫羧酶蛋白質(zhì)的翻譯。
“乳酸脫氫酶”(Ldhp)指的是催化丙酮酸向乳酸轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)(例如酶)。″LDH″指的是野生型基因,它在表達(dá)時(shí)產(chǎn)生具有乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)?!錶dh″指的是突變型乳酸脫氫酶基因。如本發(fā)明中使用的,LDH可以包括本領(lǐng)域內(nèi)名稱不是乳酸脫氫酶、但在表達(dá)時(shí)產(chǎn)生具有乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因。乳酸脫氫酶基因可以是立體特異的。即乳酸脫氫酶基因可以催化反應(yīng)而只產(chǎn)生L-乳酸或者D-乳酸。其他乳酸脫氫酶催化既產(chǎn)生L-乳酸又產(chǎn)生D-乳酸的反應(yīng)。L-乳酸脫氫酶基因催化丙酮酸向L-乳酸的轉(zhuǎn)化。
“Pdc陰性酵母株”指的是沒有可檢測(cè)的丙酮酸脫羧酶活性并且不能在需氧環(huán)境中在合成培養(yǎng)基中以葡萄糖作為唯一碳源生長(zhǎng)的酵母。至少有一些Pdc陰性的菌株在基本培養(yǎng)中中在需氧環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)不產(chǎn)生可檢測(cè)量的乙醇(例如低于大約1ppm)。在需氧的葡萄糖限制型恒化器中在合成培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Pdc陰性釀酒酵母,需要添加少量的C2碳源(例如乙醇、乙醛和/或乙酸鹽)。Pdc陰性菌株的同基因野生型菌株是克雷樹效應(yīng)陽性的,具有可檢測(cè)的丙酮酸脫羧酶活性(參見下面的討論)。從克雷樹效應(yīng)陽性的野生型菌株中去除丙酮酸脫羧酶活性(例如通過破壞或者突變結(jié)構(gòu)基因,或者破壞基因表達(dá)的調(diào)控等等)后可以產(chǎn)生不能在包含葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Pdc陰性菌株。
“野生型酵母”指的是這樣的酵母,當(dāng)在其基因組中引入可遺傳的遺傳改變時(shí),導(dǎo)致突變型酵母的產(chǎn)生。需要重申的是,突變酵母株具有與其野生型株不同的基因型,該不同表現(xiàn)在其基因組中引入了在野生型酵母株基因組中不存在的某些突變、刪除或者插入。因此,野生型酵母株缺少在突變體酵母株基因組中存在的改變。在一些情況下,突變體酵母株可以與野生型菌株具有不同的基因型。突變體酵母株可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備,包括那些涉及同源重組、定向誘變或者隨機(jī)誘變等等的方法。在某些情況下,突變體酵母株可以通過包括自然選擇的過程回收。
“親本酵母”指的是從中直接衍生新型酵母株的酵母。例如,親本株可以包含在其基因組中具有外源乳酸脫氫酶基因、生長(zhǎng)需要C2碳源(參見下面)的酵母。具有乳酸脫氫酶基因的耐酸酵母株可以通過對(duì)耐酸的選擇過程而由自親本株衍生得到。耐酸的依賴于C2碳源的酵母株繼而又可以成為通過對(duì)耐酸酵母株進(jìn)行不依賴于C2碳源的選擇過程得到具有乳酸脫氫酶基因的、不依賴于C2碳源的耐酸酵母株的親本株。在一些情況下,親本酵母株也是野生型株,盡管這并不是必需的。
″不依賴于C2碳源的酵母株”指的是基本上不產(chǎn)生乙醇并且在以葡萄糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)不需要C2碳源的酵母。不依賴于C2碳源的酵母株可以通過處理(例如選擇或者定點(diǎn)誘變等等)在其中葡萄糖是僅有的另一碳源的基本培養(yǎng)基中在需氧培養(yǎng)下生長(zhǎng)需要C2碳源的親本株(基本上不產(chǎn)生乙醇)而產(chǎn)生。
“耐酸酵母”指的是在低于其親本株能夠產(chǎn)生乳酸的pH下能夠產(chǎn)生乳酸的酵母。耐酸酵母在需氧環(huán)境下生長(zhǎng)時(shí)不能產(chǎn)生可檢測(cè)量(例如低于1ppm)的乙醇。對(duì)于分批培養(yǎng)中的釀酒酵母,本發(fā)明的某些耐酸釀酒酵母能夠產(chǎn)生乳酸的pH低于大約4。
“克雷樹效應(yīng)(crabtree effect)”定義為酵母株在(a)包含過量氧氣和過量糖(例如碳水化合物)的環(huán)境下(在某些實(shí)施方案中“過量糖”是大約1mM以上的濃度)或者(b)酵母株的特異生長(zhǎng)速率高于在葡萄糖上的臨界特異生長(zhǎng)速率(例如在葡萄糖上最大特異生長(zhǎng)速率的大約三分之二)的培養(yǎng)基中進(jìn)行的乙醇發(fā)酵。如果一個(gè)酵母株表現(xiàn)出克雷樹相應(yīng),則它是“克雷樹效應(yīng)陽性”,并且克雷樹效應(yīng)陽性的酵母株在存在過量的糖時(shí)使用丙酮酸脫羧酶途徑作為其主要的丙酮酸脫羧途徑??死讟湫?yīng)陽性的酵母的示例可以在釀酒酵母,光滑假絲酵母(也被稱為光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)等),Zygosaccharomyces bailii和粟酒裂殖酵母等等中找到?!翱死讟湫?yīng)陰性酵母株”使用丙酮酸脫氫酶復(fù)合反應(yīng)作為其丙酮酸脫羧的主要機(jī)制。當(dāng)在需氧情況下糖過量時(shí)生長(zhǎng),在克雷樹陰性酵母株中幾乎沒有乙醇發(fā)酵,主要進(jìn)行的是呼吸型丙酮酸代謝途徑。在克雷樹陰性酵母株中去除丙酮酸脫羧酶活性看起來對(duì)于利用糖進(jìn)行需氧生長(zhǎng)沒有影響??死讟潢幮越湍傅氖纠梢栽诋a(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis),馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中找到。
屬于“培養(yǎng)基”指的是包含充足營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(包括至少一種碳源)、微生物(例如酵母)可以在其上生長(zhǎng)的固體或者液體培養(yǎng)基。在恒化器、分批補(bǔ)料或者分批培養(yǎng)中,培養(yǎng)基是液體。
“碳源”指的是有機(jī)化合物(例如確定的碳源,如葡萄糖等等)或者有機(jī)化合物的混合物(例如酵母提取物),它們可以被微生物(例如酵母)同化,用于制造新的細(xì)胞物質(zhì)。有機(jī)化合物混合物可以是復(fù)合碳源(其中的確切組分和/或有機(jī)成分的量是未知的)或者是由已知的有機(jī)化合物(例如葡萄糖、果糖、麥芽糖等等)以已知的量組成的確定碳源。在某些情況下,復(fù)合碳源也可以用作復(fù)合氮源。復(fù)合碳源的示例包括淀粉、麥芽葡萄糖、纖維素水解物以及淀粉水解物等等,它們與酶組合在一起產(chǎn)生葡萄糖。確定的碳源優(yōu)選是至少大約90wt%純,更為優(yōu)選是大約95wt%純,最優(yōu)選是大約98wt%純。例如,如果葡萄糖是唯一的碳源,則該碳源將包含至少大約90%的葡萄糖。如果葡萄糖和果糖是確定碳源的組分,則至少大約90%的碳源是葡萄糖和果糖。確定的碳源優(yōu)選地包含最少量的高級(jí)糖類。
“C2碳源”指的是具有兩個(gè)碳的碳源。C2碳源的示例有乙酸鹽、乙醛和乙醇。
“基本培養(yǎng)基”或者“合成培養(yǎng)基”指的是用于培養(yǎng)微生物(例如酵母)、包含氮源、鹽類、微量元素、維生素以及碳源的培養(yǎng)基,這些成分都是確定的。碳源可以包含葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、半乳糖或者果糖等中的至少一種?;九囵B(yǎng)基包含非蛋白質(zhì)氮源。合成培養(yǎng)基不包含例如組成不確定的營(yíng)養(yǎng)物來源,例如玉米漿、酵母提取物或者蛋白胨等等,它們可以用在復(fù)合培養(yǎng)基中。
“能夠在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)”指的是微生物(例如酵母)在引入到液體培養(yǎng)基中后在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下(例如pH和溫度等)進(jìn)行復(fù)制、從而使培養(yǎng)物的生長(zhǎng)階段內(nèi)培養(yǎng)物的生物量增加的能力。
“在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)”指的是在液體培養(yǎng)基中微生物的生長(zhǎng)和/或微生物產(chǎn)生的乳酸的連續(xù)積累。
“恒化器”指的是使微生物(例如酵母)可以進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)的裝置,其中的特異生長(zhǎng)速率和細(xì)胞數(shù)目可以被獨(dú)立地控制。連續(xù)培養(yǎng)基本上是恒定體積的流動(dòng)系統(tǒng),向其中連續(xù)加入培養(yǎng)基,并且可以有任何溢流的連續(xù)取出。這樣的系統(tǒng)一旦處于平衡中,則細(xì)胞數(shù)目和營(yíng)養(yǎng)物的狀態(tài)保持恒定,系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)之中。恒化器可以通過稀釋速率和改變限制性營(yíng)養(yǎng)物如碳或氮源的濃度而對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)胞群密度和特異生長(zhǎng)速率進(jìn)行控制。
本領(lǐng)域內(nèi)已知恒化器可以用于微生物突變體的選擇中。當(dāng)培養(yǎng)物生長(zhǎng)在恒化器中時(shí),通過改變條件(例如降低接種菌株生長(zhǎng)所需的第二種碳源的濃度等),那些在改變后的條件下在群體中能夠生長(zhǎng)更快的微生物將被選擇出來,其生長(zhǎng)優(yōu)于在新的條件下生長(zhǎng)不好的微生物。通常,這種選擇需要在恒化器培養(yǎng)的生長(zhǎng)階段內(nèi)持續(xù)增加或者減少至少一種培養(yǎng)基的組分。
“分批培養(yǎng)”指的是密閉的微生物培養(yǎng),其生長(zhǎng)在固定體積的培養(yǎng)基中進(jìn)行,培養(yǎng)基由于生長(zhǎng)中的微生物的作用而連續(xù)改變,直至不再適于生長(zhǎng)。在分批培養(yǎng)中,除了在需氧培養(yǎng)中的分子氧之外,在培養(yǎng)之前所有微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都存在于培養(yǎng)基中。在本領(lǐng)域內(nèi)已知在分批培養(yǎng)中對(duì)微生物進(jìn)行延長(zhǎng)培養(yǎng)(例如搖瓶)可以用于選擇在接種菌株不能生長(zhǎng)或者生長(zhǎng)不好的條件下生長(zhǎng)相對(duì)較好的自發(fā)突變體。
“系列分批培養(yǎng)”包括將第一種酵母株的第一個(gè)分批培養(yǎng)物接種于具有至少一種確定組分(即某種碳源的濃度)的培養(yǎng)基中,這種組分將要在該系列的過程中被改變。將已經(jīng)生長(zhǎng)的第一個(gè)分批培養(yǎng)物的一份用于接種第二個(gè)分批培養(yǎng)基。然后已經(jīng)生長(zhǎng)的第二個(gè)分批培養(yǎng)物的一份用于接種第三個(gè)分批培養(yǎng)基,等等。在一個(gè)系列中步驟的數(shù)目可以不同。在系列培養(yǎng)的過程中,增加或者降低該確定組分的濃度。選擇那些在該系列中的一個(gè)給定步驟(例如分批培養(yǎng))中的條件下能夠生長(zhǎng)最好的微生物(例如比在該特定培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)不如它好的其他微生物)更好地生長(zhǎng),用作下一個(gè)分批培養(yǎng)的接種物。這樣,在整個(gè)系列過程中,可以選擇能夠在第一種酵母株不能生長(zhǎng)的條件下生長(zhǎng)或者在相同的生長(zhǎng)條件下其生長(zhǎng)優(yōu)于第一種酵母株的微生物。在本領(lǐng)域內(nèi)已知接下來從已經(jīng)選擇的培養(yǎng)物中分離單個(gè)的純菌株。這可以通過取少量培養(yǎng)生物劃線涂平板進(jìn)行,或者通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他方法進(jìn)行。
“分批補(bǔ)料培養(yǎng)”指的是一種培養(yǎng)技術(shù),其中在微生物培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)容器或者發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基中加入一種或者更多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。與恒化器相反,在培養(yǎng)過程中微生物一直保留。在一些情況中,所有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均逐步加入到發(fā)酵罐中。時(shí)間條件、溫度條件、pH條件、通氣條件和特定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)加入到發(fā)酵罐中的速率取決于使用的具體菌株。
“選擇”指的是將酵母置于有利于具有一個(gè)特定基因型或者多個(gè)特定基因型的細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下。特定基因型(通常是遺傳突變的結(jié)果)使被選擇的酵母在某些環(huán)境條件下具有優(yōu)勢(shì),這樣被選擇的酵母的后代能夠優(yōu)于親本生長(zhǎng)和/或取代親本。
術(shù)語“基因”指的是染色體DNA、質(zhì)粒DNA、cDNA、合成的DNA或者其他編碼肽、多肽、蛋白質(zhì)或者RNA分子的DNA,以及編碼序列側(cè)翼的參與表達(dá)調(diào)控的區(qū)域。
“突變”指的是核酸序列的任何改變或變化。存在幾種類型,包括點(diǎn)突變、移框和剪接的改變??梢蕴禺惖鼗蛘唠S機(jī)進(jìn)行突變。
“開放閱讀框(ORF)″指的是編碼肽、多肽或者蛋白質(zhì)的DNA或RNA區(qū)域。
術(shù)語“啟動(dòng)子”或者“啟動(dòng)子區(qū)域”指的是包含通過提供RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)和/或在正確位點(diǎn)起始轉(zhuǎn)錄所需要的其他因子,控制信使RNA(mRNA)產(chǎn)生的元件的DNA序列。
“質(zhì)?!敝傅氖黔h(huán)形的、染色體外的自我復(fù)制型DNA段。
術(shù)語“基因組”包括宿主細(xì)胞內(nèi)的染色體和質(zhì)粒。
“2μ質(zhì)?!敝傅氖悄軌蛟谀承┙湍讣?xì)胞(例如釀酒酵母)中復(fù)制的酵母克隆載體。某些可能位于質(zhì)粒上的基因在質(zhì)粒上與被酵母宿主細(xì)胞(例如轉(zhuǎn)化了該2μ質(zhì)粒的酵母)識(shí)別和使用的啟動(dòng)子有效連接后可以被表達(dá)。
“轉(zhuǎn)錄”指的是從DNA模板產(chǎn)生互補(bǔ)RNA的過程。
“翻譯”指的是從信使RNA產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
“濃度至少是”指的是在特定的酵母培養(yǎng)物中能夠達(dá)到的最低濃度(例如克乳酸/升或者mM)。
如在本發(fā)明中的使用,“乳酸”包括未解離的乳酸和乳酸鹽。這樣,Xg乳酸/100g葡萄糖指的是相對(duì)于向發(fā)酵中補(bǔ)飼的每100g葡萄糖而言,未解離的乳酸和乳酸陰離子組合的總量。如果發(fā)酵物的pH值在3.0和4.5之間,則會(huì)有相當(dāng)大量的乳酸以未解離的形式存在。實(shí)際上,在25℃、pH3.0時(shí),未解離的乳酸與乳酸根的摩爾比是大約7.0;在25℃、pH大約4.5時(shí),這個(gè)比例是大約0.23。在溶液中存在的未解離乳酸的總量是溶液pH和混合物中乳酸總濃度的函數(shù)。溶液pH越低,以未解離的形式存在的乳酸的百分比就越高,例如,當(dāng)培養(yǎng)基的pH等于乳酸的pKa(大約3.8)時(shí),50%的乳酸以未解離的形式存在。在pH4.2時(shí),大約31%的乳酸未解離,在pH4.0和3.9時(shí),分別有大約41%和47%的乳酸未解離。在更高的pH下,未解離的乳酸的分?jǐn)?shù)更低,在pH4.5時(shí)是18%,在pH5.0時(shí)是6.6%。
“發(fā)酵培養(yǎng)液”指的是當(dāng)微生物(例如酵母)在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)后產(chǎn)生的培養(yǎng)液。發(fā)酵培養(yǎng)液包含液體發(fā)酵培養(yǎng)基中任何未利用的組分以及生物體發(fā)酵產(chǎn)生的任何代謝物或者產(chǎn)物。
應(yīng)當(dāng)注意,這里提到的某些物種的名稱,例如光滑球擬酵母,可以指的是Barnet,Payne和Yarrow(1)在物種描述中給出的名稱。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案可以參考圖1更好地理解。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)基本上不產(chǎn)生乙醇的酵母株(例如Pdc-酵母株)10可以具有引入到其基因組中的外源性L-乳酸脫氫酶基因,產(chǎn)生酵母株20。優(yōu)選地,外源LDH基因是L-乳酸脫氫酶基因。在某些實(shí)施方案中,酵母10是沒有丙酮酸脫羧酶活性的克雷樹效應(yīng)陽性的酵母。在某些實(shí)施方案中,酵母10屬于選自由酵母屬,假絲酵母屬,裂殖酵母屬,有孢圓酵母屬,克魯維酵母屬,接合酵母屬和德克酵母屬組成之組中的屬。更為優(yōu)選地,酵母株屬于酵母屬。酵母株可以是屬于耐熱克魯維酵母,Zygosaccharomyces bailii,釀酒酵母,粟酒裂殖酵母,Torulaspora globosa,Torulaspora delbruckii,Dekkerabruxellensis,或者光滑假絲酵母(也被稱為光滑球擬酵母)的種,優(yōu)選地,酵母株屬于釀酒酵母或光滑假絲酵母;更優(yōu)選地,酵母株屬于釀酒酵母。優(yōu)選地,酵母株屬于釀酒酵母,該酵母株具有的基因型是pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxP。在一些實(shí)施方案中,酵母是具有基因型pdc1,5,6Δ(例如部分或者完全破壞了PDC 1,5,6結(jié)構(gòu)基因)的釀酒酵母。
優(yōu)選地,酵母是非致病性的。酵母能夠在需氧分批培養(yǎng)中或者在需氧的恒化器中,在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
在一些實(shí)施方案中,酵母株10可以是對(duì)于ura、leu或者h(yuǎn)is等等營(yíng)養(yǎng)缺陷的。在某些實(shí)施方案中,酵母株是ura-。
酵母株10具有至少一個(gè)外源乳酸脫氫酶基因(例如編碼具有乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì))引入其基因組中產(chǎn)生trLDH(使用LDH轉(zhuǎn)化的)酵母株20。外源乳酸脫氫酶基因的引入可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法進(jìn)行(例如轉(zhuǎn)化和電穿孔等等)。tr-LDH酵母株20的基因組包含外源乳酸脫氫酶基因。即,酵母株20的至少一條染色體可以包含至少一個(gè)外源乳酸脫氫酶基因和/或該酵母株中至少一個(gè)質(zhì)粒可以包含外源乳酸脫氫酶基因。如果酵母株10是營(yíng)養(yǎng)缺陷的,則外源乳酸脫氫酶基因的引入可以這樣進(jìn)行,同時(shí)引入使tr-LDH酵母株20不再是營(yíng)養(yǎng)缺陷型的另一基因。這可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法進(jìn)行。
如這里所使用的,外源乳酸脫氫酶基因可以是(1)來自另一個(gè)生物體的基因,(2)來自相同物種或者菌株(例如親本株酵母10)的基因,或者(3)已經(jīng)進(jìn)行了遺傳修飾的(1)或(2)的基因(例如改變了密碼子用于改善在酵母株10中的表達(dá),定位或者隨機(jī)突變等等)。優(yōu)選地,外源乳酸脫氫酶基因是植物乳桿菌,牛,干酪乳桿菌,巨大芽孢桿菌,米根霉,或嗜熱脂肪芽孢桿菌的經(jīng)修飾或者未經(jīng)修飾的乳酸脫氫酶基因,更為優(yōu)選地,它是未經(jīng)修飾的乳酸脫氫酶基因。更為優(yōu)選地,外源乳酸脫氫酶基因是植物乳桿菌的乳酸脫氫酶基因。優(yōu)選地,乳酸脫氫酶基因是L-乳酸脫氫酶基因。
優(yōu)選地,外源乳酸脫氫酶基因與啟動(dòng)子有效連接。啟動(dòng)子可以被例如酵母株10識(shí)別。即,該啟動(dòng)子可以啟動(dòng)外源乳酸脫氫酶基因在被轉(zhuǎn)化的酵母20中的轉(zhuǎn)錄。在某些實(shí)施方案中,啟動(dòng)子可以是磷酸丙糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子(tpi)。其他可以在某些實(shí)施方案中使用的啟動(dòng)子包括丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子,乙醇脫氫酶啟動(dòng)子,以及L-蘇氨酸脫氫酶啟動(dòng)子。優(yōu)選地,使用的啟動(dòng)子是在宿主生物體中強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中,與外源乳酸脫氫酶基因連接的啟動(dòng)子是克魯維酵母的丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子。
當(dāng)tr-LDH酵母20中的至少一個(gè)質(zhì)粒包含外源乳酸脫氫酶基因時(shí),該質(zhì)粒優(yōu)選地是高拷貝的質(zhì)粒。在某些實(shí)施方案中,質(zhì)??梢允?μ質(zhì)粒或者低拷貝數(shù)著絲粒質(zhì)粒。優(yōu)選地,具有外源乳酸脫氫酶基因的質(zhì)粒是具有與外源乳酸脫氫酶(LDH)基因有效連接的磷酸丙糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子(tpi)的2μ質(zhì)粒。在某些實(shí)施方案中,使用包含與tpi啟動(dòng)子有效連接的植物乳桿菌L-乳酸脫氫酶基因的2μ質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(例如通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法)酵母株10(例如Pdc陰性釀酒酵母菌株)。在一些實(shí)施方案中,乳酸脫氫酶基因是L-乳酸脫氫酶基因。
使用多拷貝數(shù)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化可以使轉(zhuǎn)化后的酵母株20基因組內(nèi)具有一拷貝以上的外源乳酸脫氫酶基因。在某些實(shí)施方案中,可以向酵母株的染色體中引入多拷貝的乳酸脫氫酶基因(例如通過同源重組或者插入等等)??梢韵蛞粭l染色體中引入多拷貝或者將多拷貝引入不同染色體上的位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中,外源乳酸脫氫酶基因可以位于tr-LDH菌株20內(nèi)的染色體和質(zhì)粒二者上。
可以對(duì)tr-LDH菌株20進(jìn)行選擇以得到耐酸的(AT)酵母株30。對(duì)于選擇過程,將tr-LDH菌株20需氧生長(zhǎng)在包含葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖中至少一種的基本培養(yǎng)基中。在某些實(shí)施方案中,tr-LDH酵母株20是C2碳源依賴性的,基本培養(yǎng)基中可以包含C2碳源。優(yōu)選地,基本培養(yǎng)基中包含葡萄糖和C2碳源。
在某些實(shí)施方案中,使用tr-LDH酵母株20接種分批培養(yǎng)的培養(yǎng)基。監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)過程以及pH的改變和所產(chǎn)生的乳酸(以及其鹽)的量。估計(jì)tr-LDH酵母株20仍然能夠生長(zhǎng)并產(chǎn)生乳酸的最低pH。培養(yǎng)tr-LDH酵母株20的培養(yǎng)物,在培養(yǎng)物達(dá)到其仍然能夠生長(zhǎng)的最低pH時(shí)取出一份培養(yǎng)物。將取出的該份培養(yǎng)物接種下一個(gè)分批培養(yǎng),在酵母細(xì)胞仍然能夠生長(zhǎng)并產(chǎn)生乳酸的(a)與前一個(gè)分批培養(yǎng)相同的低pH下或者(b)低于前一個(gè)分批培養(yǎng)的pH下取出一份培養(yǎng)物??梢允褂眠@小份接種下一個(gè)分批培養(yǎng)。重復(fù)該步驟多次,直至回收的酵母株(例如耐酸酵母)30能夠生長(zhǎng)的pH低于tr-LDH親本株20能夠生長(zhǎng)的pH。與親本株(例如Pdc陰性的tr-LDH酵母株20)相同,耐酸的(AT)酵母株30基本上不產(chǎn)生乙醇,且其基因組包含能夠在AT酵母株30中有效表達(dá)的外源乳酸脫氫酶基因。
在某些實(shí)施方案中,AT酵母株30可以從恒化器中回收。需氧培養(yǎng)的恒化器培養(yǎng)物使用基本培養(yǎng)基從tr-LDH酵母株20開始。在一些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基包含C2碳源。在酵母培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程中,基本培養(yǎng)基的pH逐漸降低,然后可以從恒化器中回收可以在低于tr-LDH酵母株20生長(zhǎng)的pH下生長(zhǎng)的AT酵母株30。在某些實(shí)施方案中,AT酵母株30可以在培養(yǎng)物達(dá)到在培養(yǎng)物中的酵母仍然能夠生長(zhǎng)時(shí)的最低pH下回收。AT酵母株30如上面描述。
在某些實(shí)施方案中,如上面描述選擇的C2碳源依賴型AT酵母株30,在包含C2碳源以及至少一種碳源(例如葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖中至少一種)的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),能夠在pH2.3和2.4之間產(chǎn)生多于大約500mM的乳酸。在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基可以包含葡萄糖和C2碳源作為唯一碳源。在某些實(shí)施方案中,C2碳源依賴型AT酵母株30在包含C2碳源以及至少一種其他碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),可以產(chǎn)生多于565mM的乳酸。C2碳源依賴型AT酵母株能夠在pH低于大約3.5、優(yōu)選在pH低于大約2.8,更為優(yōu)選pH低于大約2.3時(shí)產(chǎn)生乳酸。
可以使用C2碳源依賴型AT酵母株30接種基本培養(yǎng)基進(jìn)行一系列需氧分批培養(yǎng)。在系列開始時(shí),基本培養(yǎng)基中可以包含葡萄糖和C2碳源作為唯一碳源,其濃度足以使酵母培養(yǎng)物生長(zhǎng)。C2碳源的濃度在系列分批培養(yǎng)過程中降低,每一個(gè)后續(xù)的分批培養(yǎng)物都可以使用來自該系列中更早的分批培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的酵母進(jìn)行接種??梢詮南盗蟹峙囵B(yǎng)液中回收能夠在沒有C2碳源、具有葡萄糖作為唯一碳源時(shí)生長(zhǎng)的、耐酸的C2碳源非依賴型(CI)的酵母株40。
或者,可以使用C2碳源依賴型AT酵母株30接種含有如上描述的基本培養(yǎng)基的需氧恒化器(例如包含C2碳源),C2碳源的濃度可以隨著恒化器中AT酵母株的培養(yǎng)進(jìn)程降低。一旦C2碳源耗盡,就可以從恒化器中回收CI酵母株40。
由于CI酵母株40來自AT酵母株30,它可以包含外源乳酸脫氫酶基因,該基因是植物乳桿菌,牛,干酪乳桿菌,巨大芽孢桿菌,米根霉,或者嗜熱脂肪芽孢桿菌的乳酸脫氫酶基因。外源乳酸脫氫酶基因可以位于CI酵母株40的染色體和/或質(zhì)粒(例如2μ質(zhì)粒)上。優(yōu)選地,CI酵母株40能夠在低于大約3.5的pH下、更優(yōu)選在低于大約2.8的pH下、最優(yōu)選在低于大約2.3的pH下產(chǎn)生乳酸。優(yōu)選地,CI酵母株40在基本培養(yǎng)基中需氧培養(yǎng)時(shí)能夠在培養(yǎng)液中產(chǎn)生多于大約565mM的乳酸,更為優(yōu)選多于大約665mM的乳酸。CI酵母株40可以選自由釀酒酵母,耐熱克魯維酵母,Zygosaccharomyces bailii,粟酒裂殖酵母和光滑假絲酵母組成之組。在某些實(shí)施方案中,CI酵母株可以是具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxP ura3-52 YEpLpLDH的釀酒酵母。CI酵母株能夠在需氧的分批培養(yǎng)中、需氧分批補(bǔ)料培養(yǎng)中或者需氧恒化器中生長(zhǎng)。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及能夠在化學(xué)成分確定的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的釀酒酵母及其它酵母的特征。加入最少量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),產(chǎn)生的發(fā)酵培養(yǎng)液中將含有更少量的不需要的殘留有機(jī)和無機(jī)雜質(zhì)以及生物體分泌的代謝中間物。在某些實(shí)施方案中,從加入最少量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生的發(fā)酵培養(yǎng)液中回收和純化乳酸可以顯著降低生產(chǎn)成本。因此,優(yōu)選地使用基本培養(yǎng)基用于乳酸發(fā)酵工藝。提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)足以使生長(zhǎng)進(jìn)行并且維持代謝,而沒有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過量。AT和CI酵母可以在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
本發(fā)明的基本培養(yǎng)基可以包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基,該基礎(chǔ)培養(yǎng)基基本上由至少一種確定的碳源、至少一種確定的氮源、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銅、氯化鐵、硫酸錳、鉬酸鈉、硫酸鋅、生物素、肌醇、硫胺素和水組成。在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基基本上由該基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成。當(dāng)某些C2碳源依賴型AT酵母株在這種培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)基中可以包含至少一種C2碳源。在培養(yǎng)AT或CI菌株時(shí)可以屬于培養(yǎng)基一部分的其他碳源包括葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖。在某些實(shí)施方案中,在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)CI菌株或者不依賴C2碳源的AT菌株時(shí),葡萄糖可以是唯一碳源。
在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基中包含水、大約5-100g/升的葡萄糖。在某些實(shí)施方案中,培養(yǎng)基中還包含0.1-1wt%的乙醇。在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基中還包含碳酸鈣,優(yōu)選是大約2.78g/升的碳酸鈣。在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基中包含大約1000ppmCa+2。在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基中的氮源可以是選自由尿素、硫酸銨、硝酸銨和磷酸銨組成之組中的化合物。在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基中包含大約0.5-5g/升的硫酸銨;更優(yōu)選大約0.5-2g/升的硫酸銨;最優(yōu)選大約1-2g/升的硫酸銨。在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基中包含大約0.1-2g/升的尿素;更優(yōu)選大約0.1-1g/升的尿素;最優(yōu)選大約0.5-2g/升的尿素。
在某些實(shí)施方案中,基本培養(yǎng)基中包含水,大約0.2-2g/升的磷酸二氫鉀;大約0.1-1g/升的硫酸鎂;大約5-50微克/升的硫酸銅;大約0.05-0.25mg/升的氯化鐵;大約0.05-0.5mg/升的硫酸錳;大約0.05-0.25mg/升的鉬酸鈉;大約0.05-0.5mg/升的硫酸鋅;大約0.5-2.5微克/升的生物素;大約0.5-4mg/升的肌醇;以及大約0.05-0.5mg/升的硫胺素。
在一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的基本培養(yǎng)基可以包含水,大約5-100g/升的葡萄糖或者大約0.1-1wt%的乙醇,大約5g/升的硫酸銨或者大約1g/升的尿素,大約1g/升的磷酸二氫鉀,大約0.5g/升的硫酸鎂;大約40微克/升的硫酸銅;大約0.2mg/升的氯化鐵;大約0.4mg/升的硫酸錳;大約0.2mg/升的鉬酸鈉;大約0.4mg/升的硫酸鋅;大約2微克/升的生物素;大約2mg/升的肌醇;以及大約0.4mg/升的硫胺素。
如上面的解釋,AT或者CI酵母可以在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)以產(chǎn)生乳酸。所產(chǎn)生的發(fā)酵培養(yǎng)液可以具有2.3和2.4之間的pH。在某些實(shí)施方案中,發(fā)酵培養(yǎng)液包含至少大約500mM的乳酸和由甘油、赤蘚醇、甘露糖醇、蘋果酸、丙酮酸、琥珀酸、甲酸和富馬酸組成的第一組化合物。發(fā)酵培養(yǎng)液中乳酸的mM數(shù)與第一組化合物的mM數(shù)的比例可以是至少大約54。優(yōu)選地,發(fā)酵培養(yǎng)液包含至少大約565mM的乳酸,更優(yōu)選地至少大約665mM的乳酸。在某些實(shí)施方案中,在pH2.3-2.4下生產(chǎn)乳酸。優(yōu)選地,乳酸的mM數(shù)與第一組化合物的mM數(shù)的比例大于大約66,最優(yōu)選大于大約184。優(yōu)選地,與在基本上相同的基本培養(yǎng)基中、在基本上相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)其親本株產(chǎn)生的培養(yǎng)液相比,培養(yǎng)AT酵母株產(chǎn)生的培養(yǎng)液將包含更低ppm的甘油、赤蘚醇、蘋果酸、丙酮酸、琥珀酸、甲酸和富馬酸中的至少一種??梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的方法純化AT或CI酵母發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵培養(yǎng)液,回收乳酸。純化可以包含蒸餾、離子交換、納米過濾或者溶劑提取中的至少一項(xiàng)。
包含了以下實(shí)施例以示范本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,在下文實(shí)施例中公開的技術(shù)代表的是發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明實(shí)施中運(yùn)行良好的技術(shù),因此可以被認(rèn)為是實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方法。但是,根據(jù)本公開內(nèi)容,本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,在公開的具體實(shí)施方案中可以進(jìn)行許多改變,仍得到同樣或者類似的結(jié)果,而不偏離本發(fā)明的精神和范疇。
在接下來的實(shí)施例中使用以下的菌株。
表1使用的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株 菌株 描述 CEN.PK 113.7DMATa URA3 PDCI PDC5 PDC6具有丙酮酸脫羧酶活性的野生型酵母 CEN.PK182MATa pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxPPdc陰性酵母 CEN.PK111-61AMATa ura3-52 leu2-112 his3-Δ1ura-酵母 RWB837 MATa pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6.-2)∷loxP ura3-52Pdc陰性u(píng)ra-酵母 RWB876 MATa pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6.-2)∷loxP ura3-52 YEpLpLDH具有外源乳酸脫氫酶活性的Pdc陰性酵母 m850-a MATa pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6.-2)∷loxP ura3-52 YEpLpLDH具有外源乳酸脫氫酶活性的Pdc陰性酵母,耐酸的 Lp4和Lp4fMATa pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6.-2)∷loxP ura3-52 YEpLpLDH具有外源乳酸脫氫酶活性的Pdc陰性酵母,耐酸的,C2碳源非依賴型 LDH來自植物乳桿菌,參見圖2中YELpLDH的圖譜 一方面,本發(fā)明公開并請(qǐng)求保護(hù)下述內(nèi)容本文所公開的生產(chǎn)乳酸、酸耐受以及C2碳源非依賴型的真菌細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)物,尤其是釀酒酵母菌株的細(xì)胞,這些細(xì)胞包括RWB876及其衍生物,包括m850-a、Lp4和Lpf,特別是那些產(chǎn)生乳酸的細(xì)胞;那些產(chǎn)生乳酸并且也耐酸的細(xì)胞;或者是那些產(chǎn)生乳酸、耐酸并且不依賴于C2碳源的細(xì)胞。
這些細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)可以是基本上生物純的培養(yǎng)物,其中包含、基本上由或者由單一菌株組成。本發(fā)明例證性的菌株生物純培養(yǎng)物實(shí)施方案有具有外源乳酸脫氫酶活性的RWB876(MATa pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6.-2)∷loxP ura3-52YEpLpLDH)Pdc陰性酵母;具有外源乳酸脫氫酶活性、耐酸的m850-a(MATa pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6.-2)∷loxP ura3-52 YEpLpLDH)Pdc陰性酵母;具有外源乳酸脫氫酶活性、耐酸、不依賴于C2碳源的Lp4和Lp4f(MATa pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6.-2)∷loxP ura3-52YEpLpLDH)Pdc 陰性酵母,它們已經(jīng)以生物純培養(yǎng)物的形式,已經(jīng)按照一定的條件作了保藏,該條件能夠確保在本專利申請(qǐng)的待審期間,由美國(guó)專利商標(biāo)委員會(huì)確定根據(jù)37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122的規(guī)定有此權(quán)利的人可以獲得這些培養(yǎng)物。在提出了本申請(qǐng)的同族申請(qǐng)或子申請(qǐng)的國(guó)家,根據(jù)外國(guó)專利法需要,也可以獲得這些保藏物。但是,應(yīng)當(dāng)理解,這種保藏物的可獲得性不應(yīng)構(gòu)成由違背政府行為授予的專利權(quán)而實(shí)施本發(fā)明的許可。
此外,此處的培養(yǎng)物保藏物是按照微生物保藏布達(dá)佩斯條約的規(guī)定作出保藏并向公眾提供的,即它們將以足夠的小心進(jìn)行貯存,能夠使它們?cè)谧罱淮握?qǐng)求提供保藏物樣品之后保持存活和未被污染狀態(tài)至少五年的時(shí)間,并且在任一情形下,能夠自保藏為起保持這種狀態(tài)至少30年,或者是可能授權(quán)的、公開該培養(yǎng)物的任何專利的任何有效期內(nèi)。保藏人認(rèn)可,在保藏機(jī)構(gòu)按請(qǐng)求提供樣品時(shí),由于保藏物的狀況而無法如此時(shí),替換保藏物的責(zé)任。所有關(guān)于這些保藏物對(duì)公眾可獲得性的限制在公開它們的專利授權(quán)之后均不可撤銷地消除了。
培養(yǎng)物RW876,m850-a,Lp4和Lp4f于2003年10月21日根據(jù)布達(dá)佩斯協(xié)約保藏于Northern Regional Research Center(NRRL),Agricultural Research Service Culture Collection(NationalCenter for Agricultural Utilization Research,US Department ofAgriculture,1815 North University Street,Peoria,Illinois61604,U.S.A)的永久收藏中,并分別給予登錄編號(hào)Y-30696,Y-30697,和Y-30698。以前已經(jīng)保藏了CEN.PK113.7D,CEN.PK182,CEN.PK111-61A,RWB837,它們分別具有登錄編號(hào)NRRL Y-30646,NRRLY-30647,NRRL Y-30648,和NRRL Y-30649。
實(shí)施例1在化學(xué)成分確定的基本培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)生產(chǎn)乳酸 使用RWB876菌株和M1培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,M1培養(yǎng)基的組成在下面的表2中列出。
表2 M1培養(yǎng)基 制備50%的葡萄糖儲(chǔ)液,與培養(yǎng)基的其他成分分開高壓滅菌,最后在培養(yǎng)基中加入葡萄糖溶液達(dá)到70g/升的終濃度。在冷卻的高壓滅菌培養(yǎng)基中加入乙醇。
在培養(yǎng)基中加入Ca+2源,以使細(xì)胞更好地保持其活性和生理狀態(tài)。在本實(shí)施例中,總共加入了1112ppm的Ca+2。M1培養(yǎng)基的pH未調(diào)整。
在含有100ml(終體積)M1培養(yǎng)基的250ml裝有三層擋板的搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵。在32℃下,在New Brunswick G-25搖床中發(fā)酵,振蕩速度180rpm。菌株RW876在M1培養(yǎng)基中發(fā)酵的結(jié)果描繪于圖3中。隨著乳酸濃度的升高,RW876培養(yǎng)液的pH持續(xù)下降。該生物體能夠在pH大約3.0時(shí)生長(zhǎng),但是隨著pH進(jìn)一步降低,培養(yǎng)物的生長(zhǎng)停止,細(xì)胞開始死亡。在OD660nm處測(cè)定的細(xì)胞密度的降低表明了細(xì)胞的死亡。
釀酒酵母細(xì)胞一般在pH低于大約3.0的培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)。在低pH下(例如隨著乳酸的積累)能夠持續(xù)產(chǎn)生乳酸的細(xì)胞是合意的。將發(fā)酵結(jié)束時(shí)(其中培養(yǎng)基的pH已經(jīng)降低到2.80)存活的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中,選擇在pH低于大約3.0下持續(xù)生長(zhǎng)的耐酸細(xì)胞。重復(fù)轉(zhuǎn)移過程,并且轉(zhuǎn)移時(shí)的pH逐漸從2.80降低到2.70,最后降低到2.60。在每一次轉(zhuǎn)移之后,讓存活的細(xì)胞生長(zhǎng)并產(chǎn)生乳酸長(zhǎng)達(dá)48小時(shí)??偣策M(jìn)行21次連續(xù)轉(zhuǎn)移,以獲得耐酸的突變體,稱為m850-a。再進(jìn)行另外五次連續(xù)轉(zhuǎn)移,以穩(wěn)定突變體。
實(shí)施例2耐酸突變體m850-a及其親本株RWB876發(fā)酵的比較 在本實(shí)施例中,將生長(zhǎng)在M1培養(yǎng)基中的耐酸突變體m850-a的乳酸產(chǎn)生能力與其親本株RWB876的乳酸產(chǎn)生能力進(jìn)行比較。在M1培養(yǎng)基中于搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵,使用實(shí)施例1中描述的條件。結(jié)果總結(jié)于下面的表3中。在pH低于大約3.0時(shí)耐酸突變體m850-a繼續(xù)生長(zhǎng)的能力使得它與其親本株RW876相比,在其發(fā)酵培養(yǎng)液中積累更高濃度的乳酸。
表3 *glu.=葡萄糖;lact.=乳酸 實(shí)施例3當(dāng)耐酸突變體m850-a及其親本株RWB876都在初始pH低的M1培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),二者的比較 在搖瓶中,使用M1培養(yǎng)基,在實(shí)施例1中描述的條件下進(jìn)行本實(shí)驗(yàn),區(qū)別在于培養(yǎng)基的初始pH調(diào)整到3.50且不加入碳酸鈣。結(jié)果總結(jié)于表4中。兩個(gè)菌株都能夠在沒有碳酸鈣時(shí)在pH3.50下開始生長(zhǎng)。在低pH下,耐酸的突變體m850-a在發(fā)酵培養(yǎng)液中比其親本株表現(xiàn)出生長(zhǎng)并產(chǎn)生更高濃度乳酸的能力。
表4 *glu.=葡萄糖;lact.=乳酸 實(shí)施例4對(duì)實(shí)施例2的發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行分析 生產(chǎn)聚合物級(jí)別乳酸的最終成本與去除發(fā)酵培養(yǎng)液中生成的雜質(zhì)的成本是相關(guān)的。分析實(shí)施例2中的發(fā)酵培養(yǎng)液中乳酸的濃度和某些雜質(zhì)的濃度。
向?qū)嵤├?中進(jìn)行的發(fā)酵中輸入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(不包括乙醇和葡萄糖)是2.504g/升,對(duì)于菌株RWB876和菌株m850-a的發(fā)酵而言分別產(chǎn)生557.9mM和686.4mM的乳酸。對(duì)最后發(fā)酵培養(yǎng)液(例如菌株RWB876和菌株m850-a的培養(yǎng)液)進(jìn)行多元醇和有機(jī)酸的HPLC分析,結(jié)果總結(jié)于表5中。RWB876的發(fā)酵產(chǎn)生出557.9mM的乳酸,以及總計(jì)為15.634mM的多元醇和其他有機(jī)酸。m850-a菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生了總計(jì)為12.740mM的多元醇和其他有機(jī)酸,以及686.4mM的乳酸。這些發(fā)酵副產(chǎn)物(例如多元醇和有機(jī)酸)和某些未利用的培養(yǎng)基組分的至少部分去除是獲得高純度(例如聚合物級(jí)別)的乳酸是必要的。本發(fā)明的菌株在乳酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)低于本領(lǐng)域內(nèi)已知的某些產(chǎn)生乳酸的重組大腸桿菌菌株所產(chǎn)生的雜質(zhì)(Chang,et al.1999)。
表5 實(shí)施例5 PDC陰性的釀酒酵母突變體能夠使用葡萄糖作為唯一碳源(不依賴于C2)進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)和乳酸生產(chǎn)。
在搖瓶中,使用M1培養(yǎng)基,在實(shí)施例1中描述的條件下進(jìn)行本實(shí)驗(yàn),區(qū)別在于沒有加入0.5%的乙醇。從C2碳源依賴型m850-a中分離兩種耐酸的C2碳源非依賴型釀酒酵母菌株。使用一系列的分批培養(yǎng)分離這兩個(gè)菌株,培養(yǎng)中的C2碳源濃度在系列中逐漸降低。如表6表示的,分離出了兩個(gè)突變體菌株(例如Lp4(NRRL Y-30697)和Lp4f(NRRL Y-30698)),它們能夠使用葡萄糖作為唯一碳源用于生長(zhǎng)和乳酸的生產(chǎn)。在30次轉(zhuǎn)移后分離出Lp4,在45次轉(zhuǎn)移后分離出Lp4f。Lp4比Lp4f更不耐酸。這些突變體保持了它們?cè)诖_定的培養(yǎng)基中(即使培養(yǎng)基不包含乙醇)在低pH下生長(zhǎng)和產(chǎn)生乳酸的能力。
表6 *glu.=葡萄糖;lact.=乳酸 實(shí)施例6對(duì)實(shí)施例5的發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行分析 對(duì)于實(shí)施例5中進(jìn)行的發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸入(除了葡萄糖)是2.504g/升,菌株Lp4和菌株Lp4f的發(fā)酵分別產(chǎn)生410mM和577mM的乳酸。對(duì)最后的發(fā)酵培養(yǎng)液(例如菌株Lp4和Lp4f的培養(yǎng)液)進(jìn)行多元醇和有機(jī)酸的HPLC分析,其結(jié)果總結(jié)于表7中。Lp4的發(fā)酵產(chǎn)生了410mM的乳酸,以及總計(jì)為6.214mM的多元醇和其他有機(jī)酸。Lp4f菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生了總計(jì)為3.139mM的多元醇和其他有機(jī)酸,以及577mM的乳酸。這些發(fā)酵副產(chǎn)物(例如多元醇和有機(jī)酸)和某些未利用的培養(yǎng)基組分的至少部分去除將可獲得高純度(例如聚合物級(jí)別)的乳酸。這些不依賴于C2的突變體(例如Lp4和Lp4f)在乳酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生的經(jīng)分析的總雜質(zhì)低于RWB876或者m850-a發(fā)酵產(chǎn)生的雜質(zhì)。
表7 實(shí)施例7在10L攪拌罐中培養(yǎng)耐酸突變體m850-a用于乳酸生產(chǎn) 在New Brunswick Bioflow 10-L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵,工作容積是6L。培養(yǎng)基(M1)如實(shí)施例1所示。通氣是0.33vvm,振蕩是250rpm。溫度控制在32℃。不對(duì)pH進(jìn)行控制。
在罐內(nèi)接種后,前22-24小時(shí)出現(xiàn)生長(zhǎng)期。在生長(zhǎng)期期間,保持乙醇濃度(通過補(bǔ)充25%的乙醇溶液)在3-4g/升。當(dāng)細(xì)胞密度(OD660nm)達(dá)到10.0時(shí),通過加入大約70g/升的葡萄糖和2.78g/升碳酸鈣開始乳酸生產(chǎn)階段。
隨著發(fā)酵進(jìn)行,pH繼續(xù)降低,如圖4所示。當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到大約20g/升時(shí),停止乙醇補(bǔ)飼,這樣乙醇的濃度從3-4g/升逐漸降低到2-3g/升,最后降低到1-2g/升。發(fā)酵結(jié)束時(shí),葡萄糖和乙醇都被耗盡。使用描述的條件,在81小時(shí)內(nèi)從74g/升的葡萄糖得到大約61g/升的乳酸,最終的pH是2.60。
參考文獻(xiàn)
以下的參考文獻(xiàn)提供了示例性的步驟或者其他詳情,對(duì)這里列出的步驟給予補(bǔ)充,這些參考文獻(xiàn)在這里特別引用作為參考。
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權(quán)利要求
1.生產(chǎn)乳酸的方法,包括將在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)基本上不產(chǎn)生乙醇的耐酸(AT)酵母株在第一種培養(yǎng)基中進(jìn)行需氧培養(yǎng),其中所述AT酵母株包含含有能夠在該AT酵母株中表達(dá)的外源性乳酸脫氫酶基因的基因組,其中表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有乳酸脫氫酶活性,該AT酵母株能夠在較其親本酵母株生長(zhǎng)的pH更低的pH下在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
2.權(quán)利要求1的方法,其中所述AT酵母株是不依賴于C2碳源的,能夠在低于大約3.5的pH下產(chǎn)生乳酸。
3.權(quán)利要求1的方法,其中所述AT酵母株是不依賴于C2碳源的,能夠在低于大約2.8的pH下產(chǎn)生乳酸。
4.權(quán)利要求1的方法,其中所述AT酵母株是不依賴于C2碳源的,能夠在低于大約2.3的pH下產(chǎn)生乳酸。
5.權(quán)利要求1的方法,其中所述AT酵母株在包含葡萄糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠每100克葡萄糖產(chǎn)生多于大約50克的乳酸。
6.權(quán)利要求1的方法,其中所述AT酵母株在包含葡萄糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠每100克葡萄糖產(chǎn)生大約50-85克的乳酸。
7.權(quán)利要求1的方法,其中所述AT酵母株在包含葡萄糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠每100克葡萄糖產(chǎn)生大約70-85克的乳酸。
8.權(quán)利要求1的方法,其中培養(yǎng)AT酵母株產(chǎn)生的培養(yǎng)液,與在基本上相同的基本培養(yǎng)基中在基本相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)親本株得到的培養(yǎng)液相比,包含更少ppm的下列各項(xiàng)中的至少一種甘油、赤蘚醇、蘋果酸、丙酮酸、琥珀酸、甲酸和富馬酸。
9.權(quán)利要求1的方法,其中所述AT酵母株屬于選自下述組中的屬酵母屬,假絲酵母屬,裂殖酵母屬,和克魯維酵母屬。
10.權(quán)利要求1的方法,其中所述AT酵母株是釀酒酵母。
11.權(quán)利要求1的方法,其中所述AT酵母株是具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxP ura3-52YEpLpLDH的釀酒酵母。
12.權(quán)利要求1的方法,其中的培養(yǎng)在需氧分批培養(yǎng)、需氧分批補(bǔ)料培養(yǎng)或者需氧恒化器中進(jìn)行。
13.權(quán)利要求1的方法,其中所述AT酵母株是不依賴于C2碳源的。
14.權(quán)利要求13的方法,其中所述第一種培養(yǎng)基是包含至少一種選自下述的確定碳源的基本培養(yǎng)基葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖和半乳糖。
15.權(quán)利要求14的方法,其中葡萄糖是唯一的碳源。
16.權(quán)利要求1的方法,其中所述AT酵母株是依賴于C2碳源的,并且第一種培養(yǎng)基是包含基本上由葡萄糖和至少一種C2碳源組成的碳源的基本培養(yǎng)基。
17.權(quán)利要求1的方法,其中所述第一種培養(yǎng)基基本上由至少一種確定的碳源、至少一種氮源、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銅、氯化鐵、硫酸錳、鉬酸鈉、硫酸鋅、生物素、肌醇、硫胺素和水組成,其中所述氮源選自由尿素、硫酸銨、磷酸銨和硝酸銨組成之組。
18.權(quán)利要求1的方法,其中AT酵母株的染色體包含外源乳酸脫氫酶基因。
19.權(quán)利要求1的方法,其中在AT酵母株中存在至少一個(gè)包含該外源乳酸脫氫酶基因的質(zhì)粒。
20.權(quán)利要求1的方法,其中所述外源乳酸脫氫酶基因是植物乳桿菌,牛,干酪乳桿菌,巨大芽孢桿菌,米根霉,或者嗜熱脂肪芽孢桿菌的乳酸脫氫酶基因。
21.權(quán)利要求1的方法,其中所述外源乳酸脫氫酶基因是植物乳桿菌的乳酸脫氫酶基因。
22.權(quán)利要求1的方法,其中還包括回收和純化乳酸或者其鹽的方法。
23.權(quán)利要求22的方法,其中所述純化步驟包含蒸餾、離子交換、納米過濾或者溶劑提取中的至少一項(xiàng)。
24.在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)基本上不產(chǎn)生乙醇的耐酸(AT)酵母株,其中所述AT酵母株包含含有能夠在該AT酵母株中表達(dá)的外源乳酸脫氫酶基因的基因組,其中表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有乳酸脫氫酶活性,該AT酵母株能夠在比其親本酵母株生長(zhǎng)的pH更低的pH下在基本培養(yǎng)基中產(chǎn)生乳酸。
25.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株沒有可檢測(cè)量的丙酮酸脫羧酶活性。
26.權(quán)利要求25的AT酵母株,其中所述AT酵母株的野生型菌株是克雷樹效應(yīng)陽性的。
27.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株能夠在pH低于大約3.5下產(chǎn)生乳酸。
28.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株能夠在pH低于大約2.8下產(chǎn)生乳酸。
29.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株能夠在pH低于大約2.3下產(chǎn)生乳酸。
30.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株在基本培養(yǎng)基中需氧培養(yǎng)時(shí)能夠在培養(yǎng)液中產(chǎn)生大于大約500mM的乳酸。
31.權(quán)利要求30的AT酵母株,其中所述AT酵母株能夠產(chǎn)生大于大約565mM的乳酸。
32.權(quán)利要求30的AT酵母株,其中所述AT酵母株能夠產(chǎn)生大于大約665mM的乳酸。
33.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株屬于選自由以下各項(xiàng)組成之組中的屬酵母屬,假絲酵母屬,裂殖酵母屬,有孢圓酵母屬,克魯維酵母屬,接合酵母屬和德克酵母屬。
34.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株屬于選自由以下各項(xiàng)組成之組中的屬酵母屬,假絲酵母屬,裂殖酵母屬,和克魯維酵母屬。
35.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株屬于酵母屬。
36.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株是釀酒酵母。
37.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株是具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxPura3-52 YEpLpLDH的釀酒酵母。
38.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株是耐熱克魯維酵母、Zygosaccharomyces bailii、粟酒裂殖酵母或者光滑假絲酵母。
39.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株是不依賴于C2碳源的。
40.權(quán)利要求39的AT酵母株,其中所述AT酵母株能夠在包含選自由葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖和半乳糖組成之組中的至少一種確定碳源的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
41.權(quán)利要求39的AT酵母株,其中所述AT酵母株能夠在包含葡萄糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
42.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株是依賴于C2碳源的,且該AT酵母株能夠在包含基本上由葡萄糖和至少一種C2碳源組成的碳源的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
43.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中AT酵母株能夠在基本上由至少一種確定的碳源、至少一種確定的氮源、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銅、氯化鐵、硫酸錳、鉬酸鈉、硫酸鋅、生物素、肌醇、硫胺素和水組成的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng),其中所述確定的氮源選自由尿素、硫酸銨、磷酸銨和硝酸銨組成之組。
44.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中AT酵母株的染色體包含外源乳酸脫氫酶基因。
45.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中在AT酵母株中存在至少一個(gè)包含該外源乳酸脫氫酶基因的質(zhì)粒。
46.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中所述外源乳酸脫氫酶基因與啟動(dòng)子有效連接。
47.權(quán)利要求46的AT酵母株,其中所述啟動(dòng)子是磷酸丙糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子。
48.權(quán)利要求46的AT酵母株,其中所述啟動(dòng)子選自由丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子、乙醇脫氫酶啟動(dòng)子和L-蘇氨酸脫氫酶啟動(dòng)子組成之組。
49.權(quán)利要求46的AT酵母株,其中所述啟動(dòng)子是克魯維酵母的丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子。
50.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中所述外源乳酸脫氫酶基因是植物乳桿菌,牛,干酪乳桿菌,巨大芽孢桿菌,米根霉或者嗜熱脂肪芽孢桿菌的乳酸脫氫酶基因。
51.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中所述外源乳酸脫氫酶基因是植物乳桿菌的乳酸脫氫酶基因。
52.權(quán)利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株能夠產(chǎn)生基本上由L-乳酸組成的乳酸。
53.在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)基本上不產(chǎn)生乙醇的耐酸(AT)釀酒酵母,其中所述AT釀酒酵母包含含有能夠在該AT釀酒酵母中表達(dá)的外源乳酸脫氫酶基因的基因組,其中表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有乳酸脫氫酶活性,該AT釀酒酵母能夠在比其親本釀酒酵母株生長(zhǎng)的pH更低的pH下在基本培養(yǎng)基中產(chǎn)生乳酸。
54.權(quán)利要求53的耐酸(AT)釀酒酵母,其中所述AT釀酒酵母沒有可檢測(cè)量的丙酮酸脫羧酶活性。
55.權(quán)利要求53的耐酸(AT)釀酒酵母,其中所述外源乳酸脫氫酶基因是植物乳桿菌的乳酸脫氫酶基因。
56.權(quán)利要求53的耐酸(AT)釀酒酵母,其中AT釀酒酵母中的至少一個(gè)質(zhì)粒包含該外源乳酸脫氫酶基因。
57.權(quán)利要求53的AT釀酒酵母,其中所述AT釀酒酵母具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxPura3-52 YEpLpLDH。
58.權(quán)利要求53的AT釀酒酵母,其中所述AT釀酒酵母在基本培養(yǎng)基中需氧培養(yǎng)時(shí)能夠在培養(yǎng)液中產(chǎn)生多于大約500mM的乳酸。
59.在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)基本上不產(chǎn)生乙醇的C2碳源非依賴型(CI)耐酸酵母株,其中所述酵母株包含含有能夠被表達(dá)的外源乳酸脫氫酶基因的基因組,其中表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有乳酸脫氫酶活性,該酵母在需氧條件下在包含葡萄糖作為唯一碳源的第一種基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生乳酸,并且該CI酵母株能夠在比其親本株生長(zhǎng)的pH更低的pH下在第一種基本培養(yǎng)基中產(chǎn)生乳酸。
60.權(quán)利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株沒有可檢測(cè)量的丙酮酸脫羧酶活性。
61.權(quán)利要求60的CI酵母株,其中該相同菌株的野生型酵母是克雷樹效應(yīng)陽性的。
62.權(quán)利要求59的CI酵母株,其中所述外源乳酸脫氫酶基因是植物乳桿菌,牛,干酪乳桿菌,巨大芽孢桿菌,米根霉,或者嗜熱脂肪芽孢桿菌的乳酸脫氫酶基因。
63.權(quán)利要求59的CI酵母株,其中所述外源乳酸脫氫酶基因是植物乳桿菌的乳酸脫氫酶基因。
64.權(quán)利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株的染色體包含該外源乳酸脫氫酶基因。
65.權(quán)利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株中存在至少一個(gè)包含該外源乳酸脫氫酶基因的質(zhì)粒。
66.權(quán)利要求65的CI酵母株,其中所述至少一個(gè)質(zhì)粒是2μ質(zhì)粒。
67.權(quán)利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株能夠在低于大約2.8的pH下產(chǎn)生乳酸。
68.權(quán)利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株能夠在低于大約2.3的pH下產(chǎn)生乳酸。
69.權(quán)利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生多于大約50克乳酸/100克葡萄糖。
70.權(quán)利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生大約50-85克的乳酸/100克葡萄糖。
71.權(quán)利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生大約70-85克的乳酸/100克葡萄糖。
72.權(quán)利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株在第二種基本培養(yǎng)基中需氧培養(yǎng)時(shí),能夠在培養(yǎng)液中產(chǎn)生多于大約565mM的乳酸。
73.權(quán)利要求72的CI酵母株,其中所述CI酵母株能夠產(chǎn)生多于大約665mM的乳酸。
74.權(quán)利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株屬于選自由以下各項(xiàng)組成之組中的屬酵母屬,假絲酵母屬,裂殖酵母屬,有孢圓酵母屬,克魯維酵母屬,接合酵母屬和德克酵母屬。
75.權(quán)利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株屬于選自由以下各項(xiàng)組成之組中的屬酵母屬,假絲酵母屬,裂殖酵母屬和克魯維酵母屬。
76.權(quán)利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株選自由釀酒酵母,耐熱克魯維酵母,Zygosaccharomyces bailii,粟酒裂殖酵母和光滑假絲酵母組成之組。
77.權(quán)利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株是具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxPura3-52 YEpLpLDH的釀酒酵母。
78.權(quán)利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株能夠在包含選自由葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖和半乳糖組成之組中的至少一種確定碳源的第二種基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
79.權(quán)利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株能夠在基本上由選自由葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖和半乳糖組成之組中的至少一種確定碳源、選自由尿素、硫酸銨、磷酸銨和硝酸銨組成之組中的至少一種氮源、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銅、氯化鐵、硫酸錳、鉬酸鈉、硫酸鋅、生物素、肌醇、硫胺素和水組成的第二種基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
80.基本上由至少一種確定的碳源、至少一種氮源、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銅、氯化鐵、硫酸錳、鉬酸鈉、硫酸鋅、生物素、肌醇、硫胺素和水組成的基本培養(yǎng)基。
81.權(quán)利要求80的基本培養(yǎng)基,其中所述確定的碳源包含C2碳源。
82.權(quán)利要求81的基本培養(yǎng)基,其中所述確定的碳源還包含選自由葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖組成之組中的至少一種化合物。
83.權(quán)利要求80的基本培養(yǎng)基,其中葡萄糖是唯一的碳源。
84.權(quán)利要求80的基本培養(yǎng)基,其中所述基本培養(yǎng)基包含大約5-100g/升的葡萄糖。
85.權(quán)利要求84的基本培養(yǎng)基,其中所述基本培養(yǎng)基包含0.1wt%-1wt%的乙醇。
86.權(quán)利要求80的基本培養(yǎng)基,其中所述基本培養(yǎng)基包含碳酸鈣。
87.權(quán)利要求80的基本培養(yǎng)基,其中所述氮源包含選自由尿素、硫酸銨、磷酸銨和硝酸銨組成之組中的至少一種化合物。
88.權(quán)利要求80的基本培養(yǎng)基,其中所述基本培養(yǎng)基包含大約0.5-5g/升的硫酸銨。
89.權(quán)利要求80的基本培養(yǎng)基,其中所述基本培養(yǎng)基包含大約0.5-2g/升的硫酸銨。
90.權(quán)利要求80的基本培養(yǎng)基,其中所述基本培養(yǎng)基包含大約1-2g/升的硫酸銨。
91.權(quán)利要求80的基本培養(yǎng)基,其中所述基本培養(yǎng)基包含大約0.1-2g/升的尿素。
92.權(quán)利要求80的基本培養(yǎng)基,其中所述基本培養(yǎng)基包含大約0.1-1g/升的尿素。
93.權(quán)利要求80的基本培養(yǎng)基,其中所述基本培養(yǎng)基包含大約0.5-2g/升的尿素。
94.權(quán)利要求80的基本培養(yǎng)基,其中所述基本培養(yǎng)基包含大約0.2-2g/升的磷酸二氫鉀;大約0.1-1g/升的硫酸鎂;大約5-50微克/升的硫酸銅;大約0.05-0.25mg/升的氯化鐵;大約0.05-0.5mg/升的硫酸錳;大約0.05-0.25mg/升的鉬酸鈉;大約0.05-0.5mg/升的硫酸鋅;大約0.5-2.5微克/升的生物素;大約0.5-4mg/升的肌醇;以及大約0.05-0.5mg/升的硫胺素。
95.權(quán)利要求80的基本培養(yǎng)基,其中所述基本培養(yǎng)基包含大約5-100g/升的葡萄糖或者大約0.1-1wt%的乙醇,大約5g/升的硫酸銨或者大約1g/升的尿素,大約1g/升的磷酸二氫鉀,大約0.5g/升的硫酸鎂;大約40微克/升的硫酸銅;大約0.2mg/升的氯化鐵;大約0.4mg/升的硫酸錳;大約0.2mg/升的鉬酸鈉;大約0.4mg/升的硫酸鋅;大約2微克/升的生物素;大約2mg/升的肌醇;以及大約0.4mg/升的硫胺素。
96.具有包含外源乳酸脫氫酶基因的基因組的重組酵母株,所述外源乳酸脫氫酶基因能夠在該重組酵母株中表達(dá),其中所述表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有乳酸脫氫酶活性;當(dāng)在包含葡萄糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),該重組酵母株能夠產(chǎn)生至少大約50克乳酸/100克葡萄糖,并且該重組酵母株能夠在低于大約3.5的pH下生長(zhǎng)。
97.權(quán)利要求96的重組酵母株,其中所述重組酵母株在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生大約50-85克的乳酸/100克葡萄糖。
98.權(quán)利要求96的重組酵母株,其中所述重組酵母株在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生大約70-85克的乳酸/100克葡萄糖。
99.權(quán)利要求96的重組酵母株,其中所述重組酵母株能夠在低于大約2.8的pH下產(chǎn)生乳酸。
100.權(quán)利要求96的重組酵母株,其中所述重組酵母株能夠在低于大約2.3的pH下產(chǎn)生乳酸。
101.權(quán)利要求96的重組酵母株,其中所述重組酵母株能夠在低于大約2.0的pH下產(chǎn)生乳酸。
102.一種生產(chǎn)乳酸的方法,其中包括在第一種培養(yǎng)基中需氧培養(yǎng)具有包含外源乳酸脫氫酶基因的基因組的重組酵母株,所述外源乳酸脫氫酶基因能夠在該重組酵母株中表達(dá),所述表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有乳酸脫氫酶活性,該重組酵母株在包含葡萄糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),能夠產(chǎn)生至少大約50克乳酸/100克葡萄糖,并且該重組酵母株能夠在低于大約3.5的pH下生長(zhǎng)。
103.通過包含下述步驟的選擇過程回收到的耐酸(AT)酵母株(a)在第一種需氧培養(yǎng)物中培養(yǎng)第一種酵母株,其中該第一種需氧培養(yǎng)物是通過用第一種酵母株接種第一種基本培養(yǎng)基而開始的,該第一種酵母株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)基本上不產(chǎn)生乙醇,并且該第一種酵母株具有包含能夠在所述第一種酵母株中表達(dá)的外源乳酸脫氫酶基因的基因組,其中所述表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有乳酸脫氫酶活性,在第一種需氧培養(yǎng)物生長(zhǎng)的過程中,培養(yǎng)物的pH下降,(b)確定第一種酵母株仍然能夠在第一種基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的大致最低pH,以及(c)在第一種需氧培養(yǎng)物仍然生長(zhǎng)、pH大約在最低值時(shí)從第一種需氧培養(yǎng)物中回收至少一種第二種酵母株。
104.權(quán)利要求103的AT酵母株,其中所述第一種酵母株缺少丙酮酸脫羧酶活性或者乙醇脫氫酶活性中的至少一種。
105.權(quán)利要求104的AT酵母株,其中所述第一種酵母株的野生型酵母菌株是克雷樹效應(yīng)陽性的。
106.權(quán)利要求103的AT酵母株,其中所述選擇過程還包括以下步驟(d)培養(yǎng)第二種需氧培養(yǎng)物,其中所述第二種需氧培養(yǎng)物是通過用所回收的第二種酵母株接種新鮮的基本培養(yǎng)基而開始的,其中在第二種需氧培養(yǎng)物生長(zhǎng)過程中,培養(yǎng)物的pH下降,以及(e)在第二種需氧培養(yǎng)物仍然生長(zhǎng)、且pH低于第一種需氧培養(yǎng)物的大約最低pH時(shí),從第二種需氧培養(yǎng)物中回收至少一種第三種酵母株。
107.權(quán)利要求106的AT酵母株,其中所述選擇過程還包括重復(fù)步驟(d)和(e)至少一次,包括使用從前一次重復(fù)中回收的酵母株接種新鮮的基本培養(yǎng)基。
108.權(quán)利要求107的AT酵母株,其中最后一次重復(fù)中AT酵母株保持生長(zhǎng)的需氧培養(yǎng)物的大約最低pH低于前一次重復(fù)中AT酵母株保持生長(zhǎng)的需氧培養(yǎng)物的大約最低pH。
109.通過包括以下步驟的篩選過程回收的耐酸的C2碳源非依賴型(CI)酵母株(a)用第一種酵母株接種基本培養(yǎng)基,該酵母株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)基本上不產(chǎn)生乙醇,并且當(dāng)葡萄糖是基本培養(yǎng)基中唯一的其他碳源時(shí)需要C2碳源,其中該酵母株的基因組包含能夠被表達(dá)的外源乳酸脫氫酶基因,其中所述表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有乳酸脫氫酶活性,其中所述酵母在需氧條件下在包含葡萄糖和C2碳源的第一種基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生乳酸或其鹽;并且其中所述第一種酵母株能夠在低于其親本株生長(zhǎng)的pH下在第一種基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng);(b)使用第二種基本培養(yǎng)基在一系列的需氧分批培養(yǎng)中培養(yǎng)第一種酵母株,其中在該系列開始時(shí),第二種基本培養(yǎng)基包含葡萄糖和C2碳源作為唯一碳源,其濃度足以使得酵母培養(yǎng)物生長(zhǎng),并且該C2碳源的濃度隨著分批培養(yǎng)系列的進(jìn)行而下降,且其中每一后續(xù)的分批培養(yǎng)都使用在該系列中較早的分批培養(yǎng)中生長(zhǎng)的酵母進(jìn)行接種;以及(c)從分批培養(yǎng)系列中回收至少一個(gè)能夠不需要C2碳源、使用葡萄糖作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)的CI酵母株。
110.權(quán)利要求109的CI酵母株,其中所述第一種酵母株缺少丙酮酸脫羧酶活性或者乙醇脫氫酶活性中的至少一種。
111.權(quán)利要求109的CI酵母株,其中所述第一種酵母株的野生型酵母菌株是克雷樹效應(yīng)陽性的。
112.保藏號(hào)為NRRL Y-30696的酵母株。
113.保藏號(hào)為NRRL Y-30698的酵母株。
114.一種培養(yǎng)基,其基本上由水,大約70g/升的葡萄糖,大約0.5wt%的乙醇,大約1g/升的尿素,大約1g/升的磷酸二氫鉀,大約0.5g/升的七水硫酸鎂;大約2.78g/升的碳酸鈣,大約62.5微克/升的五水硫酸銅;大約200微克/升的氯化鐵;大約450微克/升的一水硫酸錳;大約235微克/升的二水鉬酸鈉;大約712微克/升的七水硫酸鋅;2微克/升的生物素;2000微克/升的肌醇;以及400微克/升的硫胺素鹽酸鹽組成。
115.一種培養(yǎng)基,其包含大約400-1100ppm的N,大約215-287ppm的K+,大約525-700ppm的PO4-2,大約49ppm的Mg+2,大約195ppm的SO4-2,大約1100ppm的Ca+2,大約0.07ppm的Fe+3,大約0.145ppm的Mn+2,大約0.09ppm的Mo-4,大約0.16ppm的Zn+2,大約0.015ppm的Cu+2,大約0.002mg/升的生物素,大約2mg/升的肌醇,以及大約0.4mg/升的硫胺素鹽酸鹽。
116.一種發(fā)酵培養(yǎng)液,其中包含
至少大約500mM的乳酸和第一組化合物,
其中發(fā)酵中乳酸的mM數(shù)與第一組化合物的mM數(shù)的比例至少是大約54,其中所述第一組化合物由甘油、赤蘚醇、甘露醇、蘋果酸、丙酮酸、琥珀酸、甲酸和富馬酸組成。
117.權(quán)利要求116的發(fā)酵培養(yǎng)液,其中所述發(fā)酵培養(yǎng)液的pH在大約2.3和2.4之間。
118.權(quán)利要求116的發(fā)酵培養(yǎng)液,其中所述培養(yǎng)液包含至少大約565mM的乳酸。
119.權(quán)利要求116的發(fā)酵培養(yǎng)液,其中所述培養(yǎng)液包含至少大約665mM的乳酸。
120.權(quán)利要求116的發(fā)酵培養(yǎng)液,其中所述比例大于大約66。
121.權(quán)利要求116的發(fā)酵培養(yǎng)液,其中所述比例大于大約184。
122.權(quán)利要求116的發(fā)酵培養(yǎng)液,其中所述發(fā)酵培養(yǎng)物是釀酒酵母菌株的發(fā)酵產(chǎn)物。
123.包含酵母復(fù)制起點(diǎn)以及與啟動(dòng)子功能性連接的乳桿菌乳酸脫氫酶基因的酵母質(zhì)粒。
124.權(quán)利要求122的質(zhì)粒,其中所述復(fù)制起點(diǎn)是2μ復(fù)制起點(diǎn)。
125.權(quán)利要求122的質(zhì)粒,其中所述乳酸脫氫酶基因是L-乳酸脫氫酶基因。
126.權(quán)利要求122的質(zhì)粒,其中所述乳酸脫氫酶基因是植物乳桿菌的乳酸脫氫酶基因。
127.權(quán)利要求122的質(zhì)粒,其中所述啟動(dòng)子是磷酸丙糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子。
128.權(quán)利要求122的質(zhì)粒,其中所述質(zhì)粒是YEpLpLDH。
全文摘要
本文公開了酵母,當(dāng)培養(yǎng)它們時(shí)能夠產(chǎn)生相對(duì)高濃度的乳酸。本文還公開了當(dāng)產(chǎn)乳酸酵母于其中培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生相對(duì)更低水平的副產(chǎn)物雜質(zhì)的培養(yǎng)基。
文檔編號(hào)C07K14/39GK1902319SQ200480034218
公開日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2004年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月20日
發(fā)明者劉嘉麗, J·C·列文瑟 申請(qǐng)人:泰特&萊爾組分美國(guó)公司