專利名稱：一種產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)皺胃酶工程菌株的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
在干酪生產(chǎn)過程中，需在乳中加入凝乳酶使其中的酪蛋白凝固成固態(tài)膠體，同時(shí)加入乳酸菌發(fā)酵劑并經(jīng)壓榨成型和后期成熟而形成各種形態(tài)結(jié)構(gòu)和風(fēng)味的干酪制品。近年來世界干酪產(chǎn)量一直保持上升的態(tài)勢，因此對凝乳酶的需求量也在逐年增加。目前，世界上凝乳酶制劑年需求量為2.5X106L，產(chǎn)量占全世界酶制劑總量的15%，成為第二大酶制劑， 而且需求量仍在不斷增加。傳統(tǒng)的凝乳酶為犢牛皺胃酶，是從未斷奶犢牛第四胃(皺胃) 的鹽浸出液中提取出來的粗制酶。因該酶具有凝乳活力與蛋白水解活力比值高的特性而成為制作干酪的首選酶，用犢牛皺胃酶制作出來的干酪在風(fēng)味、質(zhì)地和產(chǎn)量等方面均優(yōu)于其他來源的凝乳酶。因此被廣泛用于干酪制造業(yè)。目前世界年均約5000萬頭犢牛被宰殺供提取皺胃酶以用于干酪的生產(chǎn)。由于全球性的犢牛短缺使皺胃酶的來源變得極不穩(wěn)定，而且生產(chǎn)成本高。近年來人們對于瘋牛病的恐慌使?fàn)倥０櫸该傅膽?yīng)用受到置疑。為了解決這一矛盾，人們在不斷尋找新來源的具有凝乳作用的蛋白酶以替代犢牛皺胃酶，其中包括植物和微生物來源的凝乳酶。植物凝乳酶來源廣泛，如無花果蛋白酶和木瓜蛋白酶等，但受時(shí)間、地域、生長周期等條件的限制，而且用植物來源的凝乳酶生產(chǎn)干酪將導(dǎo)致凝乳質(zhì)地松軟、干酪產(chǎn)率偏低且易產(chǎn)生苦味等不良現(xiàn)象。利用微生物凝乳酶生產(chǎn)干酪將導(dǎo)致產(chǎn)品性狀不一致，而且微生物來源的凝乳酶具有蛋白水解特異性差、耐熱性能強(qiáng)和蛋白水解活性高的特點(diǎn)，不但導(dǎo)致干酪得率降低而且成熟后會(huì)產(chǎn)生苦味，因此使其應(yīng)用受到了限制。在這種情況下世界各干酪生產(chǎn)大國都在積極尋求新的凝乳酶資源來滿足干酪生產(chǎn)的需要。因此，如何開發(fā)優(yōu)質(zhì)和經(jīng)濟(jì)的犢牛皺胃酶替代品成為當(dāng)今世界研究的熱門課題之一。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用微生物基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組皺胃酶是解決上訴問題的理想途徑。重組皺胃酶成本較低、酶提取方便、經(jīng)濟(jì)效益高，同時(shí)酶受奶粉成分和酸度影響較小，生產(chǎn)的干酪在得率與產(chǎn)品品質(zhì)上甚至優(yōu)于以犢牛皺胃酶制造的干酪。國外大公司如丹麥諾維信、美國Sigma、英國格連契昂哈賽等已經(jīng)利用現(xiàn)代生物技術(shù)改良菌種，生產(chǎn)出高活力的重組酶，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。我國所用的凝乳酶小部分是從微生物中提取的，主要還是依賴于進(jìn)口。我國還沒有跨入用基因工程技術(shù)生產(chǎn)凝乳酶的國家之列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建方法。產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建方法按以下步驟進(jìn)行一、根據(jù)Genebank中發(fā)表的乳酸克魯維酵母PMRl的基因序列(AJ001018)設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，然后以乳酸克魯維酵母GG799基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得乳酸克魯維酵母GG799的PMRl基因；
二、乳酸克魯維酵母GG799的PMRl基因和質(zhì)粒pBluescript-II同時(shí)用&ic I和 Xho I進(jìn)行雙酶切，回收所需目的片段并進(jìn)行連接，獲得連接產(chǎn)物pBluescript-11-PMRl ；三、連接產(chǎn)物pBluescript-11-PMRl轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取陽性克隆液體搖瓶培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒pBluescript-11-PMRl，經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定后用Avr II酶切重組質(zhì)粒 pBluescript-11-PMRl和含有kocin抗性編碼基因質(zhì)粒，回收所需目的片段連接得構(gòu)建重組質(zhì)粒pBluesk-Z-PMRl，將重組質(zhì)粒pBluesk_Z-PMRl轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆用于重組質(zhì)粒pBluesk-Z-PMRl的酶切鑒定和PCR鑒定；四、將重組質(zhì)粒pBluesk-Z-PMRl分別用I和Bio I進(jìn)行線性化，回收并純化雙酶切產(chǎn)物，然后轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母GG799感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建PMRl基因缺陷型乳酸克魯維酵母GG799，所得重組菌株即為乳酸克魯維酵母GG799 PMRl基因缺陷型菌株；五、按照乳酸克魯維酵母密碼子使用偏好性對野生型犢牛皺胃酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，將其中稀有密碼子換成高頻率表達(dá)密碼子，然后進(jìn)行全基因合成，得優(yōu)化犢牛皺胃酶基因，然后轉(zhuǎn)入PMD18-T載體，獲得含有優(yōu)化犢牛皺胃酶基因的PMD18-T載體；六、用Ml I和Not I分別雙酶切含有優(yōu)化犢牛皺胃酶基因的PMD18-T載體和乳酸克魯維酵母GG799表達(dá)載體pKLACl，回收純化目的片段并進(jìn)行連接得重組質(zhì)粒 pKLACl-S-chymosin，所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐抗性的LB 固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取陽性克隆液體搖瓶培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒pKLACl-S-chymosin， 經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定后用Mc II進(jìn)行線性化，回收并純化酶切產(chǎn)物，然后采用化學(xué)法轉(zhuǎn)化PMRl基因缺陷型乳酸克魯維酵母GG799感受態(tài)細(xì)胞，獲得含有多個(gè)皺胃酶基因串連表達(dá)框的乳酸克魯維酵母GG799 PMRl基因缺陷型轉(zhuǎn)化株，即完成產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建；其中步驟一中上游引物的核苷酸序列為5' -GGCGAGCTCTGCAGTATATATGAGTGACA-3'，下游引物的核苷酸序列為5' -GGTCTCGAGTTGAGGAGCTATATGAGTCC-3‘；步驟五中優(yōu)化犢牛皺胃酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明中產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建方法，所得的重組乳酸克魯維酵母可用來生產(chǎn)制造干酪用的重組皺胃酶，且重組皺胃酶的活力高達(dá)860U/mL，本發(fā)明中為采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)凝乳酶做了突出貢獻(xiàn)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建方法按以下步驟進(jìn)行一、根據(jù)Genebank中發(fā)表的乳酸克魯維酵母PMRl的基因序列(AJ001018)設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，然后以乳酸克魯維酵母GG799基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得乳酸克魯維酵母GG799的PMRl基因；二、乳酸克魯維酵母GG799的PMRl基因和質(zhì)粒pBluescript-II同時(shí)用&ic I和 Xho I進(jìn)行雙酶切，回收所需目的片段并進(jìn)行連接，獲得連接產(chǎn)物pBluescript-11-PMRl ；
三、連接產(chǎn)物pBluescript-11-PMRl轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取陽性克隆液體搖瓶培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒pBluescript-11-PMRl，經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定后再用Avr II酶切重組質(zhì)粒 pBluescript-11-PMRl和含有kocin抗性編碼基因質(zhì)粒，回收所需目的片段連接得重組質(zhì)粒pBluesk-Z-PMRl，將重組質(zhì)粒pBluesk_Z-PMRl轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆用于重組質(zhì)粒pBluesk-Z-PMRl的酶切鑒定和PCR鑒定；四、將重組質(zhì)粒pBluesk-Z-PMRl分別用I和Bio I進(jìn)行線性化，回收并純化雙酶切產(chǎn)物，然后轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母GG799感受態(tài)細(xì)胞，從而構(gòu)建PMRl基因缺陷型乳酸克魯維酵母GG799感受態(tài)細(xì)胞，即為乳酸克魯維酵母GG799 PMRl基因缺陷型菌株；五、按照乳酸克魯維酵母密碼子使用偏好性對野生型犢牛皺胃酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，將其中稀有密碼子換成高頻率表達(dá)密碼子，然后進(jìn)行全基因合成，得優(yōu)化犢牛皺胃酶基因，然后轉(zhuǎn)入PMD18-T載體，獲得含有優(yōu)化犢牛皺胃酶基因的pMDlS-Τ載體；六、用Ml I和Not I分別雙酶切含有優(yōu)化犢牛皺胃酶基因的PMD18-T載體和乳酸克魯維酵母GG799表達(dá)載體pKLACl，回收純化目的片段并進(jìn)行連接得重組質(zhì)粒 pKLACl-S-chymosin，所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐抗性的LB 固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取陽性克隆液體搖瓶培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒pKLACl-S-chymosin， 經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定后用Mc II進(jìn)行線性化，回收并純化酶切產(chǎn)物，然后采用化學(xué)法轉(zhuǎn)化PMRl基因缺陷型乳酸克魯維酵母GG799感受態(tài)細(xì)胞，獲得含有多個(gè)皺胃酶基因串連表達(dá)框的乳酸克魯維酵母GG799PMR1基因缺陷型轉(zhuǎn)化株，即完成產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建；其中步驟一中上游引物的核苷酸序列為5' -GGCGAGCTCTGCAGTATATATGAGTGACA-3'，下游引物的核苷酸序列為5' -GGTCTCGAGTTGAGGAGCTATATGAGTCC-3‘；步驟五中優(yōu)化犢牛皺胃酶基因的核苷酸序列為:ATGAGATGTTTGGTTGTTTTGTTGGCTGTTTTCGCTTTGTCTCAAGG TGCTGAAATTACTAGAATTCCATTGTATAAAGGTAAATCTTTGAGAAAAGCTTTGAAAGAACATGGTTTGTTGGAAG ATTTCTTGCAAAAACAACAATATGGTATTTCTTCTAAATATTCTGGTTTCGGTGAAGTTGCTTCTGTTCCATTGACT AATTATTTGGATTCTCAATATTTCGGTAAAATTTATTTGGGTACTCCACCACAAGAATTCACTGTTTTGTTCGATAC TGGTTCTTCTGATTTCTGGGTTCCATCTATTTATTGTAAATCTAATGCTTGTAAAAATCATCAAAGATTCGATCCAA GAAAATCTTCTACTTTCCAAAATTTGGGTAAACCATTGTCTATTCATTATGGTACTAGATCTATGCAAGGTATTTTG GGTTATGATACTGTTACTGTTTCTAATATTGTTGATATTCAACAAACTGTTGGTTTGTCTACTCAAGAACCAGGTGA TGTTTTCACTTATGCTGAATTCGATGGTATTTTGAGAATGGCTTATCCATCTTTGGCTTCTGAATATTCTATTCCAG TTTTCGATAATATGATGAATAGACATTTGGTTGCTCAAGATTTGTTCTCTGTTTATATGGATAGAAATGGTCAAGAA ACTATGTTGACTTTGGGTGCTATTGATCCATCTTATTATACTGGTTCTTTGCATTGGGTTCCAGTTACTGTTCAACA ATATTGGCAATTCACTGTTGATTCTGTTACTATTTCTGGTGTTGTTGTTGCTTGTGAAGGTGGTTGTCAAGCTATTT TGGATACTGGTACTTCTAAATTGGTTGGTCCATCTTCTGATATTTTGAATATTCAACAAGCTATTGGTGCTACTCAA AATCAATATGGTGAATTCGATATTGATTGTGATAATTTGTCTTATATGCCAACTGTTGTTTTCGAAATTAATGGTAA AATGTATCCATTGACTCCATCTGCTTATACTTCTCAAGATCAAGGTTTCTGTACTTCTGCTTTCCAATCTGAAAATC ATTCTCAAAAATGGATTTTGGGTGATGTTTTCATTAGAGAATATTATTCTGTTTTCGATAGAGCTAATAATTTGGTT GGTTTGGCTAAAGCTATTTAA。本實(shí)施方式中質(zhì)粒pBluescript-II、大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞、含有kocin抗性編碼基因質(zhì)粒和乳酸克魯維酵母GG799及其表達(dá)載體pKLACl均為購買得到(New EnglandBiolabs Inc.，MA, USA)；本實(shí)施方式中涉及引物合成與基因合成的部分由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成；本實(shí)施方式在具體操作中涉及使用的各種反應(yīng)試劑均為購買得到(寶生物工程有限公司，大連，中國)；本實(shí)施方式在具體操作中涉及使用的試劑盒均按說明書操作(寶生物工程有限公司，大連，中國)。本實(shí)施方式步驟三中氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基每IOOOmL由50 μ g的氨芐青霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、20g的瓊脂、IOg NaCl的和余量的水組成，pH值為 6. 0 8. O。本實(shí)施方式步驟四中構(gòu)建PMRl基因缺陷型乳酸克魯維酵母GG799的篩選過程將轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母GG799感受態(tài)細(xì)胞的產(chǎn)物稀釋后涂布于含有10mmOl/LCaCl2和50 μ g/ mLZeocin的YPD固體培養(yǎng)基中，挑取生長的陽性菌落，接種到含有1 Ommol/LCaCl2和50 μ g/ mLZeocin的YPD液體培養(yǎng)基中擴(kuò)培后用于鑒定；PMRl基因缺陷型菌株與野生型菌株相比生長緩慢，在鈣離子缺陷培養(yǎng)基中和含有EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)的培養(yǎng)基中無法正常生長，通過添加鈣離子可緩解或彌補(bǔ)缺陷型菌株的生長缺陷，以此對缺陷型菌株進(jìn)行表型鑒定。本實(shí)施方式步驟五中野生型犢牛皺胃酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNo. 1所示； 步驟五中優(yōu)化犢牛皺胃酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，總計(jì)有編碼315個(gè)氨基酸的密碼子被優(yōu)化，其中333個(gè)核苷酸發(fā)生改變。本實(shí)施方式步驟六中氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中每IOOOmL由50 μ g的氨芐青霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、IOg NaCl的和余量的水組成，pH值為6. 0 8. 0。本實(shí)施方式步驟六中獲得含有多個(gè)皺胃酶基因串連表達(dá)框的乳酸克魯維酵母 GG799PMR1基因缺陷型轉(zhuǎn)化株，即完成產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建的過程及效果驗(yàn)證將化學(xué)法轉(zhuǎn)化PMRl基因缺陷型乳酸克魯維酵母GG799感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物稀釋后均勻涂布于含有5mmol/L乙酰胺和10mmol/LCaCl2的YCB瓊脂培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng) 48h，挑取菌落擴(kuò)培后，用試劑盒提取陽性轉(zhuǎn)化子的DNA，對陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定；通過PCR 的方法分別篩選出了含有多個(gè)皺胃酶基因串連表達(dá)框的乳酸克魯維酵母GG799PMR1基因缺陷型轉(zhuǎn)化株；將篩選出來的乳酸克魯維酵母GG799 PMRl基因缺陷型轉(zhuǎn)化株接種于含有 IOmm0VLCaCl2 WYPD培養(yǎng)基中進(jìn)行重組皺胃酶的表達(dá)，用Arima法檢測培養(yǎng)基中重組皺胃酶的活力為860U/mL。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建方法按以下步驟進(jìn)行一、根據(jù)Genebank中發(fā)表的乳酸克魯維酵母PMRl的基因序列設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，然后以乳酸克魯維酵母GG799基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得乳酸克魯維酵母 GG799 的 PMRl 基因；二、乳酸克魯維酵母GG799的PMRl基因和質(zhì)粒pBluescript-II同時(shí)用MeI和Xho I 進(jìn)行雙酶切，回收所需目的片段并進(jìn)行連接，獲得連接產(chǎn)物pBluescript-11-PMRl ；三、連接產(chǎn)物pBluescript-11-PMRl轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取陽性克隆液體搖瓶培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒pBluescript-11-PMRl，經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定后再用Avr II酶切重組質(zhì)粒 pBluescript-11-PMRl和含有kocin抗性編碼基因質(zhì)粒，回收所需目的片段連接得構(gòu)建重組質(zhì)粒pBluesk-Z-PMRl，將重組質(zhì)粒pBluesk_Z-PMRl轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆用于重組質(zhì)粒PBluesk-Z-PMRl的酶切鑒定和PCR鑒定；四、將重組質(zhì)粒pBluesk-Z-PMRl分別用MeI和Bio I進(jìn)行線性化，回收并純化雙酶切產(chǎn)物，然后轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母GG799感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建PMRl基因缺陷型乳酸克魯維酵母GG799，所得重組菌株即為乳酸克魯維酵母GG799 PMRl基因缺陷型菌株；五、按照乳酸克魯維酵母密碼子使用偏好性對野生型犢牛皺胃酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，將其中稀有密碼子換成高頻率表達(dá)密碼子，然后進(jìn)行全基因合成，得優(yōu)化犢牛皺胃酶基因，然后轉(zhuǎn)入PMD18-T載體，獲得含有優(yōu)化犢牛皺胃酶基因的pMDIS-T載體；六、用MlI和Not I分別雙酶切含有優(yōu)化犢牛皺胃酶基因的pMDIS-T載體和乳酸克魯維酵母GG799表達(dá)載體pKLACl，回收純化目的片段并進(jìn)行連接得重組質(zhì)粒 pKLACl-S-chymosin，所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐抗性的LB 固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取陽性克隆液體搖瓶培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒pKLACl-S-chymosin， 經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定后再用Mc II進(jìn)行線性化，回收并純化酶切產(chǎn)物，然后采用化學(xué)法轉(zhuǎn)化PMRl基因缺陷型乳酸克魯維酵母GG799感受態(tài)細(xì)胞，獲得含有多個(gè)含皺胃酶基因串連表達(dá)框的乳酸克魯維酵母GG799 PMRl基因缺陷型轉(zhuǎn)化株，即完成產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建；其中步驟一中上游引物的核苷酸序列為5' -GGCGAGCTCTGCAGTATATATGAGTGACA-3‘ ，下游引物的核苷酸序列為5' -GGTCTCGAGTTGAGGAGCTATATGAGTCC-3‘；步驟五中優(yōu)化犢牛皺胃酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟一中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟二中乳酸克魯維酵母GG799的PMRl基因的雙酶切體系如下
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟二中質(zhì)粒pBluescript-II的雙酶切體系如下
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟二中連接的體系如下成分用量IOxT4 Buffer2 |iL酶切后的乳酸克魯維酵母GG7992|iL的PMRl基因酶切后的質(zhì)粒pBluescript-II15|iLT4DNA連接酶Ιμ 連接條件為16°C連接過夜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中重組質(zhì)粒PBluescript-II-PMRl的酶切體系如下成分用量重組質(zhì)粒 pBluescript-11-PMRl20μLAvrW5μ IOxBufFerΙΟμ ddH2065 μ 酶切條件為37°C，2 汕。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中含有kocin抗性編碼基因質(zhì)粒的酶切體系如下成分用量含有Zeocin抗性編碼基因質(zhì)粒20|iLAvrW5μ IOxBufFerΙΟμ ddH2065 μ 酶切條件為37°C，2 汕。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中連接的體系如下成分用量IOxT4 Buffer2 |iL酶切后的含有Zeocin抗性編碼基15|iL因質(zhì)粒酶切后的重組質(zhì)粒2|iLpBluescript-11-PMRlT4DNA連接酶Ιμ 連接條件為16°C連接過夜。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟四中重組質(zhì)粒PBluesk-Z-PMRl的線性化體系如下
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟六中含有優(yōu)化犢牛皺胃酶基因的PMD18-T載體的雙酶切體系如下成分含有優(yōu)化犢牛皺胃酶基因的pMD18-T載體 Sal I Notl IOxBuffer ddH20
全文摘要
一種產(chǎn)皺胃酶乳酸克魯維酵母工程菌株的構(gòu)建方法，它涉及一種產(chǎn)皺胃酶工程菌株的構(gòu)建方法。方法擴(kuò)增得到的GG799的PMR1基因插入質(zhì)粒pBluescript-II中得重組質(zhì)粒pBluescript-II-PMR1，然后插入Zeocin抗性編碼基因得重組質(zhì)粒pBluesk-Z-PMR1，線性化后再轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母GG799感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建GG799 PMR1基因缺陷型菌株；優(yōu)化犢牛皺胃酶基因并插入GG799表達(dá)載體pKLAC1中得重組質(zhì)粒pKLAC1-S-chymosin，線性化后轉(zhuǎn)化PMR1基因缺陷型GG799感受態(tài)細(xì)胞即完成。本發(fā)明中所得的重組乳酸克魯維酵母可用來生產(chǎn)制造干酪用的重組皺胃酶。
文檔編號C12R1/645GK102174559SQ20111005390
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月7日
發(fā)明者馮鎮(zhèn), 張?zhí)m威 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)