一種多指標并行檢測蛋白芯片檢測試劑盒、制備方法及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于硝酸纖維素膜和近紅外熒光分子標記的多指標并行檢測的蛋白芯片檢測試劑盒，其包括：一微陣列蛋白芯片，所述微陣列蛋白芯片是以硝酸纖維素膜為固相基片，在該固相基片上的不同區(qū)域固定有不同的第一蛋白質(zhì)而形成，每一第一蛋白質(zhì)均能與體內(nèi)的疾病標志物特異性結(jié)合，形成免疫復合物；以近紅外熒光素分子標記第二種能與所述免疫復合物特異性結(jié)合的第二蛋白質(zhì)，該第二蛋白質(zhì)與所述免疫復合物形成標記免疫復合物。本發(fā)明紅外熒光信號是靜態(tài)信號，信號不隨時間變化，信號和目標蛋白濃度成比例關(guān)系，因此可以用于精確定量，并且操作簡單，便于實現(xiàn)系統(tǒng)的自動化。本發(fā)明還公開了該蛋白芯片檢測試劑盒的制備方法和檢測方法。
【專利說明】-種多指標并行檢測蛋白芯片檢測試劑盒、制備方法及檢 測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及近紅外熒光素分子標記在蛋白芯片檢測中的應用。尤其涉及一種基于 硝酸纖維素膜和近紅外熒光分子標記應用于多指標并行檢測蛋白芯片檢測試劑盒、制備方 法及檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白芯片技術(shù)作為近年來發(fā)展起來的一種多指標并行檢測的新興技術(shù)，具有高通 量，高信息量的特點，在科研和臨床診斷領(lǐng)域具有廣泛的應用前景。但是，由于技術(shù)上的一 些因素，限制了其實際應用，尤其是在臨床診斷領(lǐng)域還沒有得到應有的推廣。例如，芯片片 基的選擇包括有硅片和玻璃片等無機材料和硝酸纖維素膜，尼龍膜，瓊脂糖凝膠，以及塑料 片等有機材料片基，其中又以玻璃片和硝酸纖維素膜的應用比較廣泛，但是都存在各自的 缺點。硝酸纖維素膜具有蛋白吸附量大和使用方便等優(yōu)點，而且來源穩(wěn)定，價格低廉，是蛋 白質(zhì)分析中最為常用的一種材料。但是在蛋白芯片檢測中，往往采用熒光標記技術(shù)，而一 般的熒光染料因為它們的激發(fā)光和檢測光的波長位于可見光區(qū)，容易形成高背景的熒光干 擾，不能有效地用于檢測硝酸纖維素膜上的蛋白。因此，目前基于硝酸纖維膜等具有高熒 光背景的作為芯片片基的蛋白芯片技術(shù)難以做到精確定量，從而限制了這類產(chǎn)品的實際應 用。
[0003] 目前一些蛋白芯片技術(shù)采用化學發(fā)光方式進行標記和信號檢測。但是化學發(fā) 光是動態(tài)信號，信號隨時間變化，造成定量不精確。近紅外熒光材料的發(fā)射波長范圍在 650-1000nm，在這個范圍內(nèi)，生物體自發(fā)熒光較弱，因此，使用近紅外熒光材料作為檢測熒 光標記物，具有低背景熒光、檢測信噪比高，檢測靈敏度高的特點。更為重要的是，在紅外波 長區(qū)硝酸纖維素膜幾乎不發(fā)熒光，因此在紅外波長區(qū)檢測硝酸纖維素膜上結(jié)合的蛋白具有 低背景的優(yōu)勢，而且具有很高的信噪比，從而獲得很高的檢測靈敏度。結(jié)合硝酸纖維素膜和 紅外熒光染料的優(yōu)勢，可以有效地提高蛋白芯片檢測性能，使蛋白芯片產(chǎn)品獲得更為廣泛 的應用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一在于針對現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足而提供一種基 于硝酸纖維素膜和近紅外熒光分子標記應用于多指標并行檢測蛋白芯片檢測試劑盒。
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二在于利用上述檢測試劑盒的制備方法。
[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之三在于提供上述檢測試劑盒的檢測方法。
[0007] 作為本發(fā)明第一方面的一種多指標并行檢測蛋白芯片檢測試劑盒，其特征在于： 包括：
[0008] 一微陣列蛋白芯片，所述微陣列蛋白芯片是以硝酸纖維素膜為固相基片，在該固 相基片上的不同區(qū)域固定有不同的第一蛋白質(zhì)而形成，每一第一蛋白質(zhì)均能與體內(nèi)的疾病 標志物特異性結(jié)合，形成免疫復合物；
[0009] 以近紅外熒光素分子標記第二種能與所述免疫復合物特異性結(jié)合的第二蛋白質(zhì)， 該第二蛋白質(zhì)與所述免疫復合物形成標記免疫復合物。
[0010] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述第一蛋白質(zhì)為特異性抗原，所述體內(nèi)的疾病 標志物為與第一蛋白質(zhì)對應的疾病標志性免疫球蛋白抗體，所述第二蛋白質(zhì)為抗人免疫球 蛋白抗體的動物源性抗體。
[0011] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述第一蛋白質(zhì)為特異性抗原或抗體，所述體內(nèi) 的疾病標志物為與第一蛋白質(zhì)對應的疾病標志性免疫球蛋白抗體或抗原，，所述第二蛋白 質(zhì)為特異性抗原或者抗體。
[0012] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述近紅外突光素分子為發(fā)射波長為650-1000nm 的近紅外熒光染料。
[0013] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述近紅外熒光染料為琥珀酰亞胺酯或琥珀酰亞 胺酯 IRDye800。
[0014] 作為本發(fā)明第二方面的多指標并行檢測蛋白芯片檢測試劑盒的制備方法，具體包 括如下步驟：
[0015] ( 1)微陣列蛋白芯片制備步驟
[0016] 裁取硝酸纖維素膜作為蛋白芯片的固相基片，然后在固相基片上劃格形成若干區(qū) 域，使用自動芯片點樣儀，將若干不同的能與體內(nèi)的疾病標志物特異性結(jié)合而形成免疫復 合物的第一蛋白質(zhì)固定在固相基片的不同區(qū)域內(nèi)；
[0017] (2)以近紅外熒光分子標記第二種能與所述免疫復合物特異性結(jié)合的第二蛋白質(zhì) 制備步驟。
[0018] 作為本發(fā)明第三方面的多指標并行檢測蛋白芯片檢測試劑盒的檢測方法，其具體 步驟如下：
[0019] (1)將含體內(nèi)的疾病標志物樣本與所述微陣列蛋白芯片不同區(qū)域內(nèi)的不同的第一 蛋白質(zhì)反應，形成抗原/抗體免疫復合物；
[0020] (2)將近紅外熒光素分子標記的第二蛋白質(zhì)與上述抗原/抗體免疫標記物反應， 形成標記免疫復合物；
[0021] (3)信號檢測；
[0022] (4)計算待測物濃度或量。
[0023] 由于采用了如上的技術(shù)方案，本發(fā)明結(jié)合硝酸纖維素膜和紅外熒光染料的優(yōu)勢， 克服了以硝酸纖維素膜為片基和以一般熒光染料為標記物的蛋白芯片技術(shù)所擁有的背景 熒光干擾大所造成的靈敏度低，定量不精確的缺點，建立了一種基于硝酸纖維素膜為片基 和以近紅外熒光染料為標記物的蛋白芯片檢測技術(shù)和試劑準備方法。
[0024] 本發(fā)明的工作原理為：使用自動芯片點樣儀，將多種能與含體內(nèi)的疾病標志物特 異性結(jié)合的蛋白質(zhì)固定在硝酸纖維素膜上，形成特定的蛋白芯片微陣列，當檢測樣本與蛋 白芯片接觸時，樣本中的待測物與蛋白芯片上的捕獲蛋白形成特異性免疫復合物，再將以 近紅外熒光染料標記的第二蛋白質(zhì)與蛋白芯片接觸，與蛋白芯片上形成的特異性免疫復合 物形成近紅外標記特異性免疫復合物。使用熒光掃描儀讀取反應完畢后蛋白芯片熒光強 度，以定標物質(zhì)的熒光強度作為參照，計算待測物的濃度或量。
[0025] 本發(fā)明所采用的方法包括夾心法和間接法免疫檢測。
[0026] 當使用夾心法檢測待測物時，其第一蛋白質(zhì)為特定的抗體或抗原，第二蛋白質(zhì)為 抗原或抗體，將特定的抗體(捕獲抗體，當待測物為抗原時）或者抗原(捕獲抗原，當待測物 為抗體時）固定于蛋白芯片片基上形成蛋白微陣列，制備成適合免疫反應的蛋白芯片集成 塊，每個集成塊包括多個蛋白微陣列（每個微陣列即是一個蛋白芯片)，用于同時并行檢測 待測樣本，標準物質(zhì)和質(zhì)控物質(zhì)。標準物質(zhì)和質(zhì)控物質(zhì)含有已知濃度或量的待測抗原或者 抗體。以近紅外熒光染料標記另外一種特異識別待測抗原或者抗體的抗體或者抗原，制備 成檢測抗體或者檢測抗原。將檢測樣本，標準物質(zhì)和質(zhì)控物質(zhì)與蛋白芯片反應時，待測物與 捕獲抗原或抗體形成免疫復合物，再將近紅外熒光染料標記的多個抗體或抗原混合與蛋白 芯片反應，即形成近紅外熒光染料標記的捕獲抗體-待測抗原-檢測抗體形式的雙抗體夾 心復合物（當待測物為抗原時)或者近紅外熒光染料標記的捕獲抗原-待測抗體-檢測抗原 形式的雙抗原夾心復合物（當待測物為抗體時)。反應結(jié)束后，用紅外熒光掃描儀讀取蛋白 芯片熒光強度，以與標準物質(zhì)反應的蛋白芯片獲得的數(shù)據(jù)為計算依據(jù)，制備標準曲線，計算 樣本中待測物的濃度或量以及質(zhì)控品中質(zhì)控物質(zhì)的濃度或量，質(zhì)控品中質(zhì)控物質(zhì)的濃度或 量作為實驗有效性的判斷依據(jù)。
[0027] 當使用間接法檢測待測物時，第一蛋白質(zhì)為特定的抗原，第二蛋白質(zhì)為抗體，待測 物是樣本中的抗體。將特定的抗原(檢測抗原）固定于蛋白芯片片基上形成蛋白微陣列，制 備成適合免疫反應的蛋白芯片集成塊，每個集成塊包括多個蛋白微陣列（每個微陣列即是 一個蛋白芯片)，用于同時并行檢測待測樣本，標準物質(zhì)和質(zhì)控物質(zhì)。標準物質(zhì)和質(zhì)控物質(zhì) 含有已知濃度或量的待測抗體。以近紅外熒光染料標記一種特異結(jié)合待測抗體的外源性抗 體，制備成檢測抗體。將檢測樣本，標準物質(zhì)和質(zhì)控物質(zhì)與蛋白芯片反應時，待測抗體與檢 測抗原形成免疫復合物，再將近紅外熒光染料標記的多個檢測抗體混合與蛋白芯片反應， 即形成近紅外熒光染料標記的檢測抗原-待測抗體-檢測抗體形式的免疫復合物。反應結(jié) 束后，用紅外熒光掃描儀讀取蛋白芯片熒光強度，以與標準物質(zhì)反應的蛋白芯片獲得的數(shù) 據(jù)為計算依據(jù)，計算樣本中待測物的濃度或量以及質(zhì)控品中質(zhì)控物質(zhì)的濃度或量，質(zhì)控品 中質(zhì)控物質(zhì)的濃度或量作為實驗有效性的判斷依據(jù)。
[0028] 本發(fā)明中使用的熒光掃描儀為常用的實驗掃描儀器，例如美國LI-C0R公司的 Odyssey近紅外成像系統(tǒng)。
[0029] 本發(fā)明與其他蛋白芯片檢測方法比較，具有以下的優(yōu)點：
[0030] 材料背景信號和生物背景信號低，信噪比高，檢測靈敏度高。目前的蛋白芯片一般 的熒光染料進行標記。但是，在一般的熒光染料的波長范圍內(nèi)，生物物質(zhì)會產(chǎn)生干擾背景熒 光，同時硝酸纖維素膜也會產(chǎn)生很強的干擾背景熒光，因此，使用基于硝酸纖維素膜芯片片 基和一般熒光染料標記的蛋白芯片檢測靈敏度低，檢測結(jié)果不夠穩(wěn)定。而結(jié)合近紅外標記 和硝酸纖維素膜，則具有低背景的優(yōu)勢，而且具有很高的信噪比，從而獲得很高的檢測靈敏 度，大大提高檢測靈敏度。
[0031] 本發(fā)明紅外熒光信號是靜態(tài)信號，信號不隨時間變化，信號和目標蛋白濃度成比 例關(guān)系，因此可以用于精確定量，并且操作簡單，便于實現(xiàn)系統(tǒng)的自動化。另外由于紅外熒 光信號是靜態(tài)信號，信號不隨時間變化，反應完成后并不需要立即進行檢測，因此檢測過程 容易把握，檢測設備設計更簡單，易于實現(xiàn)系統(tǒng)的自動化檢測。而化學發(fā)光標記檢測則對設 備的設計和制造要求更高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1為本發(fā)明實施例1所述的抗體陣列圖示意圖。
[0033] 圖2為本發(fā)明實施例1所述的標準曲線圖。
[0034] 圖3為本發(fā)明實施例2所述的用紅外熒光掃描儀讀取蛋白芯片熒光強度示意圖。

【具體實施方式】
[0035] 實施例1 :
[0036] 雙抗體夾心法檢測多種腫瘤標志物
[0037] 檢測多種腫瘤標志物(包括 CA72-4、SCC、c-PSA、NSE、CA125、CK19、CA19-9、AFP、 CEA、CA242、β -HCG、CA15-3 等 12 種腫瘤標志物）
[0038] 1、紅外熒光標記12種單克隆抗體
[0039] 12 種單克隆抗體(包括 CA72-4、SCC、c-PSA、NSE、CA125、CK19、CA19-9、AFP、CEA、 CA242、β -HCG、CA15-3)分別用PBS透析，按照7 μ LNHS活化的琥珀酰亞胺酯IRDye800近 紅外熒光染料(美國LI-C0R公司)標記lmg單克隆抗體的比例將抗體與熒光染料混合，再加 入1/10體積的1M NaHC03，混合均勻后室溫避光反應1小時。反應結(jié)束后，將標記物置入孔 徑為10K透析袋中，用PBS 4°C透析過夜，以去除游離的熒光染料。溶液中添加終濃度為1M BSA和2mM疊氮鈉，2-8 °C避光保存。
[0040] 2、蛋白芯片的制作
[0041] 固相載體：硝酸纖維素膜。
[0042] 固相載體上所用蛋白質(zhì)：12種具備檢測活性的單克隆抗體（CA72-4、SCC、c-PSA、 NSE、CA125、CK19、CA19-9、AFP、CEA、CA242、β -HCG、CA15-3)。
[0043] 點樣物為 Α1，Α2 - CEA 抗體；Β1，Β2 - β-HCG 抗體；C1，C2 - CA72-4 抗體；D1，D2- CA15-3 抗體；El，E2 - c-PSA 抗體；Fl，F(xiàn)2 - CK19 抗體；A3, A4 - AFP 抗體；B3, B4 - CA19-9 抗體；C3, C4一CA242 抗體；D3, D4 - CA125 抗體；E3, E4 - NSE 抗體；F3, F4 - SCC 抗體；具體 點樣方陣見表1所示。
[0044] 表 1
[0045] 抗體點陣分布表
[0046]

【權(quán)利要求】
1. 一種多指標并彳T檢測蛋白芯片檢測試劑盒，其特征在于：包括： 一微陣列蛋白芯片，所述微陣列蛋白芯片是以硝酸纖維素膜為固相基片，在該固相基 片上的不同區(qū)域固定有不同的第一蛋白質(zhì)而形成，每一第一蛋白質(zhì)均能與體內(nèi)的疾病標志 物特異性結(jié)合，形成免疫復合物； 以近紅外熒光素分子標記第二種能與所述免疫復合物特異性結(jié)合的第二蛋白質(zhì)，該第 二蛋白質(zhì)與所述免疫復合物形成標記免疫復合物。
2. 如權(quán)利要求1所述的多指標并行檢測蛋白芯片檢測試劑盒，其特征在于：所述第一 蛋白質(zhì)為特異性抗原，所述體內(nèi)的疾病標志物為與第一蛋白質(zhì)對應的疾病標志性免疫球蛋 白抗體，所述第二蛋白質(zhì)為抗人免疫球蛋白抗體的動物源性抗體。
3. 如權(quán)利要求1所述的多指標并行檢測蛋白芯片檢測試劑盒，其特征在于：所述第一 蛋白質(zhì)為特異性抗原或抗體，所述體內(nèi)的疾病標志物為與第一蛋白質(zhì)對應的疾病標志性免 疫球蛋白抗體或抗原，，所述第二蛋白質(zhì)為特異性抗原或者抗體。
4. 如權(quán)利要求1或2或3所述的多指標并行檢測蛋白芯片檢測試劑盒，其特征在于： 所述近紅外熒光素分子為發(fā)射波長為650-1000nm的近紅外熒光染料。
5. 如權(quán)利要求4所述的多指標并行檢測蛋白芯片檢測試劑盒，其特征在于：所述近紅 外熒光染料為琥珀酰亞胺酯或琥珀酰亞胺酯IRDye800。
6. 權(quán)利要求1至5任一項權(quán)利要求所述的多指標并行檢測蛋白芯片檢測試劑盒的制備 方法，具體包括如下步驟： (1) 微陣列蛋白芯片制備步驟 裁取硝酸纖維素膜作為蛋白芯片的固相基片，然后在固相基片上劃格形成若干區(qū)域， 使用自動芯片點樣儀，將若干不同的能與體內(nèi)的疾病標志物特異性結(jié)合而形成免疫復合物 的第一蛋白質(zhì)固定在固相基片的不同區(qū)域內(nèi)； (2) 以近紅外熒光分子標記第二種能與所述免疫復合物特異性結(jié)合的第二蛋白質(zhì)制備 步驟。
7. 權(quán)利要求1至5任一項權(quán)利要求所述的多指標并行檢測蛋白芯片檢測試劑盒的檢測 方法，其特征在于，具體步驟如下： (1) 將含體內(nèi)的疾病標志物樣本與所述微陣列蛋白芯片不同區(qū)域內(nèi)的不同的第一蛋白 質(zhì)反應，形成抗原/抗體免疫復合物； (2) 將近紅外熒光素分子標記的第二蛋白質(zhì)與上述抗原/抗體免疫標記物反應，形成 標記免疫復合物； (3) 信號檢測； (4) 計算待測物濃度或量。
【文檔編號】G01N33/544GK104122398SQ201310157055
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月28日
【發(fā)明者】朱躍為, 柳飛舟, 季海鵬, 喻長杰 申請人:上海銘源數(shù)康生物芯片有限公司