專利名稱：：具有改良生物學(xué)特性的hiv融合抑制肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)gp41的氨基酸序列的合成肽。更具體地，本發(fā)明涉及與HlVgp41的天然氨基酸序列相比具有某些氨基酸差異的fflV融合抑制肽，這些氨基酸差異使得該HIV融合抑制肽具有有益的生物學(xué)特性。
背景技術(shù)：
：眾所周知，細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞膜和病毒膜間的融合過(guò)程而被HIV感染。該過(guò)程普遍接受的一個(gè)模型是病毒包膜糖蛋白復(fù)合物(gpl20/gp41)與目標(biāo)細(xì)胞膜的細(xì)胞表面受體間發(fā)生相互作用。當(dāng)gpl20與細(xì)胞受體(例如，與趨化因子共受體如CCR-5或CXCR-4結(jié)合的CD4)結(jié)合后，誘導(dǎo)gpl20/gp41復(fù)合物的構(gòu)象改變，從而使得gp41插入到該目標(biāo)細(xì)胞的膜中并介導(dǎo)膜融合。gp41的氨基酸序列，以及其在不同fflV毒抹之間的變體為公眾所知。圖1為普遍接受的gp41的功能域示意圖(注意氨基酸序列數(shù)根據(jù)fflV毒抹不同可能略有變化)。所述膜融合域被認(rèn)為參予向目標(biāo)細(xì)胞膜的插入以及目標(biāo)細(xì)胞膜的破裂。含有跨膜錨序列的跨膜域位于該蛋白質(zhì)C端。在膜融合域和跨膜域間是兩個(gè)獨(dú)特區(qū)域，稱為七肽重復(fù)序列(HR)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域有多個(gè)七肽。含HR1區(qū)域的氨基酸序列和含HR2區(qū)域的氨基酸序列在fflV-l包膜蛋白中各自是高度保守區(qū)域。HR2區(qū)域被普遍描述為含有SEQIDNO:1氨基酸殘基，或其多態(tài)性氨基酸殘基(例如，參見圖2)。如在圖l進(jìn)一步所示，該HR區(qū)域具有多個(gè)7氨基酸殘基延伸鏈或"七肽"(每個(gè)七肽中的7個(gè)氨基酸以"a"到"g"表示)，第一("a")和第四("d")位置主要被疏水殘基占據(jù)，而帶電荷殘基通常在第五("e")和第七("g")位置。在HIVgp41氨基酸序列中還存在含有以異亮氨酸或亮氨酸開始并結(jié)束的8氨基酸序列的亮氨酸拉鏈樣基序。如圖1所示，該HR2區(qū)域只有一個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序，而HR1區(qū)域有五個(gè)亮氨酸4立鏈樣基序。該七肽和拉鏈樣基序凈皮認(rèn)為是對(duì)形成gp41巻曲螺旋結(jié)構(gòu)有貢獻(xiàn)的氨基酸序列特征。人們發(fā)現(xiàn)衍生自HlVgp41的HR1區(qū)域("HR1肽")或HR2區(qū)域("HR2肽")天然序列的肽在體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)臨床研究中抑制HIV向宿主細(xì)胞的傳播。例如，HR2肽，以DP178(也稱為T20，恩夫韋地，和Fuzeon⑧；SEQIDNO:2)、T651(SEQIDNO:3)、T649(SEQIDNO:4)為例，分別以0.5ng/ml(EC50抗HIV-1LAI)、5ng/ml(IC50;HIV醒1IIIB)、和2ng/ml(IC50;HIV-lIIIB)的量阻斷目標(biāo)細(xì)胞的感染。人們已經(jīng)努力提高HIVgp41衍生肽的生物活性，如設(shè)法穩(wěn)定肽的螺旋結(jié)構(gòu)。例如，本發(fā)明人在PCT公開WO2005/067960號(hào)中公開了具有螺旋穩(wěn)定性的合成肽，并在本文以SEQIDNO:5-7示例。能夠抑制fflV融合(在fflV感染目標(biāo)細(xì)胞過(guò)程中HIVgp41介導(dǎo)病毒膜和細(xì)胞膜之間類肽。與合成肽相關(guān)的另一個(gè)缺陷涉及在水基藥學(xué)上可接受的載體中的溶解性和穩(wěn)定性，如在制備HIV融合抑制肽的注射溶液配方的過(guò)程中。例如，很難得到含SEQIDNO:2的氨基酸序列合成肽濃度超過(guò)100mg/ml的可注射水性溶液，而不遇到溶解性問(wèn)題(其中該配方象一種凝月交，而不是一種溶液，或者超過(guò)一個(gè)預(yù)定期間該肽沉淀而析出溶液)和穩(wěn)定性問(wèn)題(超過(guò)一個(gè)預(yù)定時(shí)間該肽降解)，和不需要在該配方中添加附加成分來(lái)促進(jìn)穩(wěn)定性和/或溶解性。期望研制一種具有改善的溶解性和穩(wěn)定性，同時(shí)還具有改善的藥理性質(zhì)的fflV融合抑制肽。因而，需要fflV融合抑制肽(a)當(dāng)以有效量加入時(shí)，能夠干擾HIVgp41介導(dǎo)的病毒融合過(guò)程，更優(yōu)選地，干擾實(shí)現(xiàn)融合所必需的gp41構(gòu)象變化，從而抑制HlVgp41對(duì)目標(biāo)細(xì)胞膜的融合；(b)在水性溶液中顯示改善的溶解性和穩(wěn)定性；和(c)顯示改善的藥理性質(zhì)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了上述需求。發(fā)明概述本發(fā)明涉及是fflV融合抑制肽的分離肽。一方面，本發(fā)明涉及衍生自具有氨基酸序列SEQIDNO:5的基本氨基酸序列("基本序列")的HIV融合抑制肽，但其中每個(gè)HIV融合抑制肽在其氨基酸序列中具有多個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序，且在其氨基酸序列中具有至少一個(gè)額外的、形成亮氨酸拉鏈樣基序所非必需的亮氨酸(即在序列中亮氨酸拉鏈樣基序的氨基酸位置1或8處之外的氨基酸，如SEQIDNO:5中示例的在氨基酸位置21處用亮氨酸取代異亮氨酸)，從而與基本序列不同。本發(fā)明涉及衍生自具有氨基酸序列SEQIDNO:5的基本氨基酸序列("基本序列")的fflV融合抑制肽，但是其中每個(gè)fflV融合抑制肽在其氨基酸序列中具有兩個(gè)以上亮氨酸4立鏈樣基序而與基本序列不同。本發(fā)明還涉及一系列HIV融合抑制肽，其中每個(gè)fflV融合抑制肽(a)含有衍生自HlVgp41的HR2區(qū)域的氨基酸序列；(b)含有具有不少于2個(gè)但不多于5個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序的氨基酸序列；(c)在其氨基酸序列中在亮氨酸拉鏈樣基序的氨基酸位置1或8處之外具有至少一個(gè)額外的亮氨酸(例如與SEQIDNO:5-7的任意一個(gè)或多個(gè)基本序列相比較)；和(d)優(yōu)選地顯示出一種或多種生物學(xué)性質(zhì)的改善。在某些實(shí)施方案中，該fflV融合抑制肽的長(zhǎng)度介于15至60個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該HIV融合抑制肽進(jìn)一步包含N末端基團(tuán)或C末端基團(tuán)，或者兩者；這些末端基團(tuán)可以包括但不限于在N末端的氨基或乙?；?；和在C末端的羧基或氨基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fflV融合抑制肽可以自聚而形成多聚體，例如三聚體，或合成為多聚形式，例如三聚體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的HIV融合抑制肽的長(zhǎng)度介于15至60個(gè)氨基酸，只要這些肽顯示有至少兩個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序，并顯示有至少一個(gè)額外的、形成亮氨酸拉鏈樣基序所非必需的異亮氨酸或亮氨酸(例如在SEQIDNO:9或SEQIDNO:16的位置21處)。例如，氨基酸長(zhǎng)度長(zhǎng)于或短于SEQIDNO:16的肽認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要這些肽顯示有至少兩個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序，并顯示有至少一個(gè)額外的、形成亮氨酸拉鏈樣基序所非必需的異亮氨酸。當(dāng)本發(fā)明中的肽比SEQIDNO:5或SEQIDNO:16的長(zhǎng)度長(zhǎng)時(shí)，該額外的氨基酸殘基可以，例如，來(lái)自與通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)技術(shù)通常與SEQIDNO:5相對(duì)應(yīng)的gp41區(qū)域鄰接(氨基和/或羧基鄰接)的HlVgp41氨基酸序列。本發(fā)明還涉及一系列HIV融合抑制肽，其中每個(gè)fflV融合抑制肽(a)含有衍生自HlVgp41的HR2區(qū)域的氨基酸序列；(b)含有具有大于2個(gè)但不超過(guò)5個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序的氨基酸序列；和(c)在其氨基酸序列中在亮氨酸拉鏈樣基序的氨基酸位置1或8處之外具有至少一個(gè)額外的亮氨酸(例如與SEQIDNO:5-7的任意一個(gè)或多個(gè)基本序列相比較)；和(d)優(yōu)選地顯示出一種或多種生物學(xué)性質(zhì)的改善。在某些實(shí)施方案中，該HIV融合抑制肽的長(zhǎng)度介于15至60個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fflV融合抑制肽進(jìn)一步包含N末端基團(tuán)或C末端基團(tuán)，或者兩者；這些末端基團(tuán)可以包括但不限于在N末端的氨基或乙?；?；和在C末端的羧基或氨基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fflV融合抑制肽可以自聚而形成二聚體或多聚體，例如三聚體，或合成為多聚形式，例如三聚體。此外，本發(fā)明涵蓋提高源自HlVgp41的HR2區(qū)域，更優(yōu)選地源自基本氨基酸序列SEQIDNO:5的肽的一種或多種生物學(xué)性質(zhì)的方法，其中該方法包括制備fflV融合抑制肽，該肽具有類似于SEQIDNO:5的氨基酸序列，不同之處在于該fflV融合抑制肽氨基酸序列(a)有多個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序，且具有除形成亮氨酸拉鏈樣基序所需的亮氨酸外的至少一個(gè)額外的亮氨酸(即除亮氨酸拉鏈樣基序位置1或8處之外)；或(b)有超過(guò)兩個(gè)的亮氨酸拉鏈樣基序；和其中該fflV融合抑制肽，且優(yōu)選地，顯示出一種或多種生物學(xué)性質(zhì)的改善。在某些實(shí)施方案中，該HIV融合抑制肽長(zhǎng)度介于15至60個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該HIV融合抑制肽進(jìn)一步包括N末端基團(tuán)或C末端基團(tuán)，或者兩者；這些末端基團(tuán)可以包括但不限于在在N末端的氨基或乙?；?；以及在末C端的羧基或氨基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fflV融合抑制肽可以自聚形成二聚物或多聚體，例如三聚體，或合成為多聚形態(tài)，例如三聚體。優(yōu)選地，經(jīng)證實(shí)通過(guò)本發(fā)明的HIV融合抑制肽改善(與基本氨基酸序列相比較)的一種或多種生物學(xué)性質(zhì)可選自生物半衰期(例如，使該fflV融合抑制肽在血流中被降解和/或被去除之前能在體內(nèi)存活更長(zhǎng)時(shí)間)，在水性溶液中的溶解性，在水性溶液中的穩(wěn)定性，更強(qiáng)的對(duì)抗已經(jīng)對(duì)衍生自HIVgp41HR2區(qū)域自然序列(例如SEQIDNO:2)的合成肽形成耐受性的fflV毒林的能力(更強(qiáng)的抗病毒活性)，或者其組合。本發(fā)明還提供了藥物組合物或藥劑，其包含本發(fā)明的HIV融合抑制肽和至少一種附加成分，包括藥學(xué)上可接受的載體、大分子或其組合。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的HIV融合抑制肽的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，fflV融合抑制肽用作包含一種或多種附加抗病毒劑的治療方案的一部分。這種治療方案用于治療fflV感染。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了使用本發(fā)明的HIV融合抑制肽來(lái)抑制fflV向目標(biāo)細(xì)胞傳播的方法，該方法包括向病毒和細(xì)胞中加入抑制細(xì)胞被病毒感染的有效量的本發(fā)明的HIV融合抑制肽。該方法可用于治療HIV感染的個(gè)體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抑制fflV向目標(biāo)細(xì)胞傳播包括抑制gp41介導(dǎo)的HIV-1與目標(biāo)細(xì)胞的融合，和/或抑制HIV感染細(xì)胞與目標(biāo)細(xì)胞的合胞體形成。本發(fā)明還提供了治療HIV感染(優(yōu)選地，fflV-l感染)的方法，該方法包括向fflV感染個(gè)體給予包含本發(fā)明的HIV融合抑制肽的藥物組合物。優(yōu)選地，該藥物組合物為抑制fflV向目標(biāo)細(xì)胞傳播的有效量，和/或?yàn)橐种苂p41介導(dǎo)的fflV與目標(biāo)細(xì)胞融合的有效量。還提供了抑制HIV融合的方法，該方法包括在細(xì)胞存在下將病毒與抑制fflV融合有效量的本發(fā)明的HIV融合抑制肽接觸。這些方法可用于治療fflV感染個(gè)體。中的用途(例如用于抑制HIV傳播的方法中，抑制fflV融合的方法中，和/或治療fflV感染的方法中)，該用途如本文所述。該藥物優(yōu)選為包含本發(fā)明的fflV融合抑制肽與藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物的形式。本發(fā)明的HIV融合抑制肽可以根據(jù)公知的方法常規(guī)地制備，包括重組表達(dá)編碼所述肽的核酸。例如，可以將構(gòu)建成重組表達(dá)fflV融合抑制肽的細(xì)胞在合適的條件下培養(yǎng)合適的時(shí)間，以使該肽表達(dá)，并從中獲得該肽。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的HIV融合抑制肽的分離的核酸分子，以及包含該核酸分子的載體，包括表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了含這種載體的細(xì)胞，如大腸桿菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中該細(xì)胞能表達(dá)核酸以制備所述HIV融合抑制肽。本發(fā)明的HIV融合抑制肽也可以通過(guò)例如合成方法制備。例如，一是供特定的肽片斷，每個(gè)肽片斷能作為中間體與一組肽片斷中的一個(gè)或多個(gè)其它肽片斷共價(jià)連接從而得到具有SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、或SEQIDNO:15中任一氨基酸序列的fflV融合抑制肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一組肽片斷中的該肽片斷以能夠得到具有SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15的氨基酸序列的目標(biāo)HIV融合抑制肽的方式在液相中連接。還纟是^f共了制備fflV融合抑制肽的方法，該方法包括合成其組成性肽片斷，然后組裝該肽片斷而形成該HIV融合抑制肽，其中該fflV融合抑制肽具有SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、或SEQIDNO:15任一種的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用合成方法來(lái)形成該HIV融合抑制肽的二聚體或多聚體，例如三聚體。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用重組方法和/或接頭來(lái)形成該fflV融合抑制肽的二聚體或多聚體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該HIV融合抑制肽形成的多聚體為線性多聚體；在另一個(gè)實(shí)施方案中，該多聚體是非線性的，例如聚集體。本發(fā)明的上述以及其它目標(biāo)、特征和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)結(jié)合附圖并閱讀下述本發(fā)明的詳細(xì)描述將會(huì)變得清楚。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1為HIV-lgp41的示意圖，顯示了七肽重復(fù)l區(qū)(HR1)和七肽重復(fù)2區(qū)(HR2)，以及gp41的其它功能區(qū)。為了說(shuō)明的目的顯示了與gpl60HIVmB毒抹相關(guān)的HR1和HR2相對(duì)應(yīng)的示例性天然氨基酸序列，以及該氨基酸位置編號(hào)。圖2是為了說(shuō)明的目的非限制性地顯示了以不同實(shí)驗(yàn)室毒抹和臨床分離抹確定的HIV-1gp41的HR2區(qū)所含有的天然氨基酸序列的比較，其中以單字母氨基酸代碼表示一些氨基酸序列的變化(例如多態(tài)性)。圖3是具有氨基酸序列SEQIDNO:9的HIV融合抑制肽SEQIDNO:9的合成示意圖，該合成使用包括3個(gè)肽片斷裝配的片斷縮合方法。圖4是具有氨基酸序列SEQIDNO:9的HIV融合抑制肽SEQIDNO:9的合成示意圖，該合成使用包括2個(gè)肽片斷裝配的片斷縮合方法。發(fā)明詳細(xì)描述定義"個(gè)體"，當(dāng)被用于本說(shuō)明書和權(quán)利要求的目的時(shí)，指哺乳動(dòng)物，且優(yōu)選人。"目標(biāo)細(xì)胞"，當(dāng)被用于本說(shuō)明書和權(quán)利要求的目的時(shí)，指能夠被HIV感染的細(xì)胞。優(yōu)選地，該細(xì)胞為人細(xì)胞；更優(yōu)選地，能通過(guò)一種過(guò)程，包括膜融合被HIV感染的人細(xì)胞。"藥學(xué)上可接受的載體"，當(dāng)被用于本說(shuō)明書和權(quán)利要求的目的時(shí)，指不顯著改變所加入的活性成分(例如，本發(fā)明的HIV融合抑制肽)的生物活性的載體介質(zhì)。藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于下列物質(zhì)的一種或多種水、緩沖水、生理鹽水、0.3%的甘氨酸、醇溶液、等滲水溶液；還可包括一種或多種物質(zhì)如甘油；油；鹽，如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和銨鹽、磷酸鹽；-炭酸酯；脂肪酸；糖類(例如甘露醇)；多糖；聚合物；賦形劑；和防腐劑和/或穩(wěn)定劑(增加保存期限或是該組合物的制備和分布所必需的和適合的)。優(yōu)選地，該藥學(xué)上可接受的載體適合靜脈給藥、肌肉給藥、皮下給藥或腸胃外給藥。除非另外特別指明，"含異亮氨酸或亮氨酸的氨基酸"，當(dāng)被用于本說(shuō)明書和權(quán)利要求的目的而涉及本發(fā)明的fflV融合抑制肽時(shí)，分別指異亮氨酸或亮氨酸，或者它們各自天然存在的氨基酸(例如L-氨基酸)，非天然存在的氨基酸(例如D-氨基酸)，異構(gòu)形式(例如正亮氨酸、異亮氨酸異構(gòu)體等等)或者衍生形態(tài)(例如叔亮氨酸)。氨基酸異亮氨酸或亮氨酸的優(yōu)選形式可用于排除不是優(yōu)選氨基酸形式的氨基酸形式。本發(fā)明的HIV融合抑制肽在其氨基酸序列中還可包含存在于其來(lái)源HIVgp41的HR2區(qū)序列中的一種或多種多態(tài)性(例如參見圖2)，除了在本文所教導(dǎo)的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位置處包含含異亮氨酸或亮氨酸的氨基酸。"HIV"指人免疫缺陷病毒，優(yōu)選fflV-l。術(shù)語(yǔ)"分離的"，當(dāng)涉及到本發(fā)明的fflV融合抑制肽、或者肽片斷時(shí)，指基本上不含不構(gòu)成該肽自身整體結(jié)構(gòu)部分的成分，如基本上不含化學(xué)合成、制備或用生物、生物化學(xué)或化學(xué)方法修飾時(shí)的化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。"i至3個(gè)氨基酸替代"，當(dāng)涉及到本發(fā)明的mv融合抑制肽時(shí)，指本發(fā)明的HIV融合抑制肽還可以具有SEQIDNO:9-15中的任一氨基酸序列，不同之處在于與SEQIDNO:9-15中任一相比具有不少于一個(gè)且不多于三個(gè)氨基酸差異；并且還具有(a)多個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序，除形成亮氨酸拉鏈樣基序所需的亮氨酸外的至少一個(gè)額外的亮氨酸(即除亮氨酸拉鏈樣基序位置1或8處外)，或者(b)3到5個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序；并具有抗fflV的抗病毒活性(抑制HIV-介導(dǎo)的融合的活性)。在此方面，具有替代的fflV融合抑制肽的氨基酸差異(當(dāng)與SEQIDNO:9-15相比時(shí))位于氨基酸序列中本發(fā)明的HIV融合抑制肽所示的亮氨酸和/或異亮氨酸殘基之外的位置上(參見例如本文中的圖示(i)和(n))。該不少于一個(gè)且不多于三個(gè)氨基酸差異包括但不限于保守氨基酸替代(公知地包括與被取代的氨基酸具有實(shí)質(zhì)上相同的電荷、大小、親水性、和/或芳香性的氨基酸替代；例子包括但不限于甘氨酸-丙氨酸-纈氨酸、色氨酸-酪氨酸、天冬氨酸-谷氨酸、精氨酸-賴氨酸、天冬酰胺-谷氨酰胺、和絲氨酸-蘇氨酸)和/或多態(tài)性(例如如圖2中所示，或者如在實(shí)驗(yàn)室、不同的分化枝、和/或fflV-l臨床分離株中所觀察到的)。例如，當(dāng)涉及到SEQIDNO:11、12或13時(shí)，fflV融合抑制肽在SEQIDNO:11、12、或13任一的氨基酸殘基IO、17、24、31和38之外處有1至3個(gè)氨基酸差異。例如，當(dāng)涉及到SEQIDNO:9和SEQIDNO:14時(shí)，fflV融合抑制肽在SEQIDNO:9或SEQIDNO:14的氨基酸殘基10、17、21、24和38之外處有1至3個(gè)氨基酸差異。例如，當(dāng)涉及到SEQIDNO:10或SEQIDNO:15時(shí)，HIV融合抑制肽在SEQIDNO:10或SEQIDNO:15的氨基酸殘基IO、17、21、31和38處之外有1至3個(gè)氨基酸差異。該實(shí)施方案的示例性例子包括但不限于氨基酸序列SEQIDNO:16，其中可以為一至三個(gè)氨基酸替代的氨基酸差異的位置用Xaa表示(代表任何氨基酸，天然或非天然發(fā)生的；即在該氨基酸位置上可以使用多種可能的氨基酸)。同樣，可以具有一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸替代，例如賴氨酸被精氨酸或組氨酸替代、精氨酸#1賴氨酸或組氨酸替代、谷氨酸纟皮天冬氨酸替代，或天冬氨酸被谷氨酸替代。為了說(shuō)明的目的，氨基酸位置10、17、24、31和38用下劃線表示。參考SEQIDNO:9-15，注意在SEQIDNO:16中"Zaa"表示可以為亮氨酸或異亮氨酸的氨基酸，而Baa用于表示優(yōu)選為亮氨酸或異亮氨酸的氨基酸，但也可能為Xaa，前提是至少一個(gè)Baa為亮氨酸或異亮氨酸。SEQIDNO:16:XaaXaaXaaEAXaaDRAZaaAEXaaAARZaaEAZaaZaaRABaaXaaEXaaXaaEKBaaEAAZaaREZaa在一個(gè)實(shí)施方案中，與SEQIDNO:16所需相對(duì)應(yīng)的fflV融合抑制肽在每個(gè)氨基酸位置3、10、17、24、31和/或38處具有異亮氨酸或亮氨酸，從而使該肽表現(xiàn)出2、3、4或5個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在肽的位置21處該肽還具有非亮氨酸拉鏈樣基序亮氨酸或異亮氨酸，優(yōu)選亮氨酸。本發(fā)明的HIV融合抑制肽還包括衍生自與存在于實(shí)驗(yàn)室、HIV分化枝或臨床分離抹中的SEQIDNO:5(通過(guò)序列比對(duì))相對(duì)應(yīng)的HIVgp41的HR2區(qū)的肽，只要該fflV融合抑制肽滿足SEQIDNO:16的氨基酸需求。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種fflV融合抑制肽與SEQIDNO:9-15的任一相比具有1到3個(gè)氨基酸替代。在某些實(shí)施方案中，該HIV融合抑制肽為15到60個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fflV融合抑制肽還包含N末端基團(tuán)或C末端基團(tuán)，或者兩者；且該末端基團(tuán)可以包含但不限于在N末端的氨基或乙?；缓驮贑末端的羧基或氨基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fflV融合抑制肽可以自聚成二聚體或多聚體，例如三聚體，或者例如可被合成、表達(dá)成或連接成二聚體或多聚體形態(tài)，例如三聚體。本發(fā)明的HIV融合抑制肽還可包括具有美國(guó)專利2006/0247416所公開的肽的變體氨基酸序列的肽(其全部?jī)?nèi)容以參照的方式并入本文)，只要該HIV融合抑制肽滿足SEQIDNO:16的氨基酸需求。在一個(gè)實(shí)施方案中，與SEQIDNO:9-15中的任一相比，這種fflV融合抑制肽具有1到3個(gè)氨基酸替代。在某些實(shí)施方案中，該fflV融合抑制肽為15到60個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施方案中，該HIV融合抑制肽還包括N末端基團(tuán)或C末端基團(tuán)，或者兩者；且該末端基團(tuán)可以包含但不限于在N末端的氨基或乙?；?；和在C末端的羧基或氨基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該HIV融合抑制肽可自聚成二聚物或多聚物，例如，三聚物，或者例如可被合成、表達(dá)成或連接成二聚物或多聚物形態(tài)，例如三聚物。術(shù)語(yǔ)"反應(yīng)官能團(tuán)"，當(dāng)被用于本說(shuō)明書和權(quán)利要求的目的時(shí)，指能與另一種化學(xué)基團(tuán)或化學(xué)部分形成化學(xué)鍵的化學(xué)基團(tuán)或化學(xué)部分。關(guān)于化學(xué)基團(tuán)，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的反應(yīng)官能團(tuán)包括這些基團(tuán)，包括但不限于馬來(lái)酰亞胺、巰基、羧酸、氫、磷?；?、酰基、幾基、乙酰基、疏水性(基團(tuán))、胺、氨基、丹磺?；?、磺基、丁二酰亞胺、疏醇反應(yīng)(基)、胺反應(yīng)(基)、羧基反應(yīng)(基)等。用于本發(fā)明時(shí)，優(yōu)選的反應(yīng)官能團(tuán)能用于排除優(yōu)選的反應(yīng)官能團(tuán)之外的反應(yīng)官能團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"接頭"，當(dāng)被用于說(shuō)明書和權(quán)利要求的目的時(shí)，指作為分子橋可操作地連接兩個(gè)不同分子的化合物或部分(例如接頭的第一反應(yīng)官能團(tuán)與大分子載體的反應(yīng)官能團(tuán)共價(jià)結(jié)合，該接頭的第二反應(yīng)官能團(tuán)與HIV融合抑制肽的反應(yīng)官能團(tuán)共價(jià)結(jié)合)。該接頭可以是氨基酸，如在制備含有本發(fā)明的fflV融合抑制肽的一個(gè)或多個(gè)拷貝的重組融合蛋白質(zhì)中?？蛇x擇地，所述兩種不同分子可通過(guò)分步方式連接到接頭上(例如通過(guò)化學(xué)耦合)。通常，對(duì)接頭的大小或組成沒有特別的限制，只要其能滿足作為分子橋的目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的接頭包括但不限于化學(xué)鏈、化合物(例如試劑)、氨基酸等。如現(xiàn)有技術(shù)公知，該接頭可包括但不限于同型雙功能接頭、異型雙功能接頭、生物穩(wěn)定接頭、水解接頭和生物降解接頭。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的異型雙功能接頭含有一末端和相對(duì)末端，該一末端具有特異性連接第一分子的第一反應(yīng)官能團(tuán)，該相對(duì)末端具有特異性連接第二分子的第二反應(yīng)官能團(tuán)。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)很明顯，可以將多種單功能、雙功能、和多功能試劑(如那些在thePierceChemicalCo.目錄中描迷的，Rockford，III.)用作本發(fā)明中的接頭。根據(jù)待連接分子、進(jìn)行連接的條件、以及給藥時(shí)預(yù)期的藥代動(dòng)力學(xué)等因素，所述接頭在長(zhǎng)度和組成上可以不同，從而優(yōu)化如下屬性生物活性和功能的保持、穩(wěn)定性、對(duì)某些化學(xué)物質(zhì)和/或溫度參數(shù)的耐受性、體內(nèi)裂解的易感性、和充分的立體選擇性或大小。術(shù)語(yǔ)"大分子載體"，當(dāng)被用于本說(shuō)明書和權(quán)利要求的目的時(shí)，指連接、結(jié)合、或融合(例如化學(xué)地或通過(guò)使用基因表達(dá)的重組方式)本發(fā)明的一種或多種肽的分子，因而相對(duì)于沒有該分子的一種或多種肽，該分子引起一種或多種如下屬性對(duì)一種或多種肽穩(wěn)定、增加一種或多種肽的生物活性、或延長(zhǎng)一種或多種肽的血漿半衰期(例如，延長(zhǎng)一種或多種肽在體內(nèi)的存留)。這種大分子載體為現(xiàn)有技術(shù)公知，包括但不限于血清蛋白、聚合物、碳水化合物、和脂質(zhì)-脂肪酸結(jié)合物。典型用作大分子載體的血清蛋白包括但不限于鐵傳遞蛋白、白蛋白(優(yōu)選人)、免疫球蛋白(優(yōu)選人IgG或其一種或多種li)、或激素。典型用作大分子載體的聚合物包括但不限于聚賴氨酸或聚(D-L-丙氨酸)-聚(L-賴氨酸)、或多幾基化合物。優(yōu)選的多幾基化合物包括水溶性聚(環(huán)氧烷)聚合物，且可具有直鏈或支鏈。優(yōu)選的聚合物為支鏈多羥基化合物(如PEG,具有多(例如3或更多)鏈，每個(gè)鏈可直接或通過(guò)接頭連接到HIV融合抑制肽上)；更優(yōu)選在體內(nèi)條件下可生物降解的、和/或隨時(shí)間而被裂解的支鏈多羥基化合物。適合的多鞋基化合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、和PEG-PPG共聚物。優(yōu)選的多羥基化合物包括具有平均分子大小約1,000道爾頓到20,000道爾頓之間的PEG。通常分子量大于20,000道爾頓的其它類型可用大分子載體為公知技術(shù)。術(shù)語(yǔ)"化學(xué)保護(hù)基"或"CPG"，當(dāng)被用于本說(shuō)明書和權(quán)力要求的目的時(shí)，指用于阻斷包含胺基的反應(yīng)官能團(tuán)與另一種反應(yīng)官能團(tuán)的化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)部分。在肽合成中公知的化學(xué)保護(hù)基包括但不限于tBu(叔丁基)、trt(三苯曱基(trity))、OtBu(叔丁氧基)、Boc或t-Boc(叔丁氧羰基)、Fmoc(9-芴甲氧羰基)、Aoc(叔戊氧基-羰基)、TEOC((3-三甲基乙氧基羰基)、CLIMOC(2-氯-l-節(jié)滿基甲氧基羰基)、BIMOC(苯-[f]-茚-3-甲氧基羰基)、PBF(2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-璜?；?、2-Cl-Z(氯千基-氧羰基)、Alloc(烯丙氧羰基)、Cbz(千氧基羰基)、Adoc(金剛氧基-羰基)、Mcb(l-甲基環(huán)丁氧基羰基)、Bpoc(2-(p-連苯基)丙基-2-氧羰基)、Azoc(2-(p-苯基偶氮苯基)丙基-2-氧羰基)、Ddz(2,2—二甲基-3,5-二甲氧基千基-氧羰基)、MTf(4-甲氧基-2,3，6-三甲氧苯磺?；?、PMC(2,2,5,7,8-五甲基色滿-6-璜?；?、Tos(對(duì)甲苯璜酰基)、Hmb(2-羥基-4-甲氧基卡基)、Poc(2畫苯丙基-2畫氧羰基)、Dde(l-(4,4-二甲基畫2,6畫二氧代環(huán)己基隱l-亞基)乙基)、^^6(1-(4,4-二甲基畫2,6-二氧代陽(yáng)環(huán)己基畫1-亞基)-3-甲基丁基)、千基、丹磺?；?、對(duì)-硝基千酯等等。用于本發(fā)明時(shí)，術(shù)語(yǔ)"去保護(hù)"，當(dāng)被用于本說(shuō)明書和權(quán)利要求的目的時(shí)，指本領(lǐng)域公知的從含有一個(gè)或多個(gè)化學(xué)保護(hù)基的分子中去除一個(gè)或多個(gè)化學(xué)保護(hù)基的過(guò)程，其中該分子包括氨基酸、肽片斷、或者本發(fā)明中的fflV融合抑制肽。通常，該去保護(hù)過(guò)程包括將被一個(gè)或多個(gè)化學(xué)保護(hù)基保護(hù)的分子與去除該化學(xué)保護(hù)基的化學(xué)試劑反應(yīng)。例如，被化學(xué)保護(hù)基保護(hù)的N末端a氨基可與堿反應(yīng)以去除堿敏感化學(xué)保護(hù)基(例如Fmoc等等)?；瘜W(xué)保護(hù)基(例如Boc、TEOC、Aoc、Adoc、Bopc、Ddz、Cbz等)通過(guò)酸去除。其它化學(xué)保護(hù)基，尤其是那些衍生自羧酸的化學(xué)保護(hù)基，可通過(guò)酸或堿去除。術(shù)i吾"第一"、"第二"、"第三"等等在本文中可用于(a)表明順序；或(b)區(qū)別多個(gè)分子或分子的多個(gè)反應(yīng)官能團(tuán)；或者(c)(a)和(b)的組合。然而，該術(shù)語(yǔ)"第一"、"第二"、"第三"等不能解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。術(shù)語(yǔ)"肽片斷"和"中間體"在本文中意思相同，當(dāng)涉及到本發(fā)明的fflV融合抑制肽且被用作說(shuō)明書和權(quán)利要求書的目的時(shí)，指含有不少于約5個(gè)氨基酸和不多于約30個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度的氨基酸序列的肽，且包括fflV融合抑制肽的氨基酸序列的至少一部分(作為鄰接氨基酸)。參見實(shí)施例4-7和本文的表格4、5、7和8，其示例了用于制備SEQIDNO:9和10的肽片段。進(jìn)一步地，盡管在優(yōu)選實(shí)施方案中，合成肽片^(單獨(dú)地或組合成一組以形成fflV融合抑制肽)使得氨基酸殘基之間形成肽鍵，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的反應(yīng)(例如亞胺基、酯、酰肼、偶氮、氨基脲等)可以形成非肽鍵，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。術(shù)語(yǔ)"藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)"，當(dāng)被用于本說(shuō)明書和權(quán)利要求的目的時(shí)，指在隨時(shí)間而^f皮系統(tǒng)地利用的藥物組合物中活性成分(例如本發(fā)明的fflV融合抑制肽)的總量。藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)可通過(guò)測(cè)量體內(nèi)給藥后fflV融合抑制肽隨時(shí)間的總系統(tǒng)濃度來(lái)確定。例如，藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)可表達(dá)成曲線下面積(AUC)、生物半衰期、和/或清除率。AUC是系統(tǒng)活性成分濃度隨時(shí)間的積分測(cè)量值，以質(zhì)量-時(shí)間/體積為單位。在給予一定劑量的活性成分后，從給藥時(shí)到體內(nèi)沒有活性成分時(shí)的AUC為個(gè)體暴露于活性成分(和/或活性成分代謝產(chǎn)物)的測(cè)量值。當(dāng)本發(fā)明的fflV融合抑制肽與不是本發(fā)明的fflV融合抑制肽的HIV融合抑制肽相比具有(a)延長(zhǎng)("增加")的生物(最終消除相)半衰期("ti/2"),和(b)生物(全身)清除率(C1)降低中的一種或多種時(shí)，則其具有"改進(jìn)的"或"增加的"藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(參見例如本文實(shí)施例2中的表1和2)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，改善的藥代動(dòng)力學(xué)可意味著相對(duì)于比較肽清除率降低，如通常降低2倍到10倍。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，改善的藥代動(dòng)力學(xué)可以意味著相對(duì)于用于比較的肽其生物半衰期增加約10%到約60%。改善的藥代動(dòng)力學(xué)也可包括清除率的降低和生物半衰期的增加。用于計(jì)算血漿濃度對(duì)時(shí)間曲線下的面積(AUC)、全身清除率(C1)、和最終消除相半衰期(t！,2)的公式在本文實(shí)施例1中有描述。術(shù)語(yǔ)"溶液中"，作為本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)在涉及溶解了一種或多種固體的水溶液并用于本說(shuō)明書和權(quán)利要求的目的時(shí)，指含fflV融合抑制肽的水溶液，該HIV融合抑制肽在本文所詳細(xì)描述的和本領(lǐng)域已知用于注射用藥物配方標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)際使用濃度和溫度條件下溶解于其中。相對(duì)于配制懸浮液，本領(lǐng)域中有多種公知的方式來(lái)區(qū)分配制的溶液，如檢查視覺澄清度(溶液透明而懸浮液混濁)、光傳遞等。"溶解度"通過(guò)存在于溶液的水性流體中的fflV融合抑制肽的量(例如重量百分比)來(lái)確定，該溶液沒有觀察到析出溶液的沉淀或含有所述HIV融合抑制肽的水性流體產(chǎn)生膠凝。"穩(wěn)定性"通過(guò)溶液中隨時(shí)間降解的HIV融合抑制肽的量來(lái)確定。術(shù)語(yǔ)"處理"或"治療"當(dāng)可交換的用于HIV感染，為了說(shuō)明書和權(quán)利要求的目的時(shí)，指mv融合抑制肽(或者含有該Hiv融合抑制肽作為活性藥物成分的藥物組合物)可用于影響與HIV感染相關(guān)的一種或多種過(guò)程，或者影響用作指征以作為確定這種處理或治療(例如"治療應(yīng)用")的治療效果的一種或多種參數(shù)或終點(diǎn)。例如，該fflV融合抑制肽可用于抑制下述一種或多種過(guò)程對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的HIV傳播；HIV與目標(biāo)細(xì)胞的融合("HIV融合")；病毒進(jìn)入(在感染過(guò)程中HIV或其遺傳物質(zhì)進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞的過(guò)程)；和合胞體形成(例如HIV感染細(xì)胞和目標(biāo)細(xì)胞的融合)。在評(píng)價(jià)藥物在處理和治療HIV感染的功效時(shí)，病毒抑制(通過(guò)本領(lǐng)域公知的測(cè)定體液或組織中的HIV病毒載量方法確定)是常用的主要終點(diǎn)，血液中循環(huán)CD4+細(xì)胞數(shù)量的增加為常用的次要終點(diǎn)；每個(gè)均是抑制HIV向目標(biāo)細(xì)胞傳播的可測(cè)效果。因而，本發(fā)明的HIV融合抑制肽可用于實(shí)現(xiàn)治療應(yīng)用，包括病毒抑制和/或循環(huán)CD4+細(xì)胞相對(duì)數(shù)量增加。本發(fā)明涉及HIV融合抑制肽，該HIV融合抑制肽的氨基酸序列與基本氨基酸序列SEQIDNO:5相似，不同之處在于，與該基本氨基酸序列相比，該fflV融合抑制肽氨基酸序列具有(a)在其氨基酸序列中的多個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序；和(b)除形成亮氨酸拉鏈樣基序所需的亮氨酸外的至少一個(gè)額外的亮氨酸(即除在亮氨酸拉鏈樣基序的位置1或8處外)；其中該fflV融合抑制肽表現(xiàn)出一種或多種生物性質(zhì)的改進(jìn)。更具體地，本發(fā)明涉及以SEQIDNO:9、10、14和15示例的肽的氨基酸序列，或者與SEQIDNO:9、10、14和15中的任一相比具有一至三個(gè)氨基酸差異的HIV融合抑制肽；它們作為HIV融合抑制肽和在藥物組合物中的用途；和肽片斷以及獲得上述HIV融合抑制肽的合成方法。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及fflV融合抑制肽，該fflV融合抑制肽的氨基酸序列與基本氨基酸序列SEQIDN0:5相似，不同之處在于與該基本氨基酸序列相比，該fflV融合抑制肽氨基酸序列在其氨基酸序列中具有多于兩個(gè)的亮氨酸拉鏈樣基序；其中該fflV融合抑制肽表現(xiàn)出一種或多種生物性質(zhì)的改進(jìn)。更具體地，本發(fā)明涉及以SEQIDNO:11-13示例的肽的氨基酸序列，或者與SEQIDNO:11-13中任一相比含有一至三個(gè)氨基酸差異的HIV融合抑制肽；它們作為HIV融合抑制肽和在藥物組合物中的用途；和肽片斷以及獲得上述fflV融合抑制肽的合成方法。實(shí)施例1在下述實(shí)施例中，評(píng)價(jià)了各種生物物理參數(shù)和生物學(xué)參數(shù)。確定這些參數(shù)的一般方法如下所述。肽，包括本發(fā)明的HIV融合抑制肽和基本序列，在肽合成儀上用標(biāo)準(zhǔn)固相合成技術(shù)和用標(biāo)準(zhǔn)FMOC肽化學(xué)法，或本文實(shí)施例4所詳細(xì)描述的固相合成與液相合成的組合來(lái)合成。在該實(shí)施例中，該HIV融合抑制肽可進(jìn)一步包含反應(yīng)官能團(tuán)，即大多數(shù)在N末端用乙?；?或在C末端用氨基阻斷。從樹脂上裂解后，將該肽沉淀并凍干該沉淀物。然后用反相高效液相層析純化該肽；該肽的身份通過(guò)電噴霧質(zhì)譜確認(rèn)。生物物理參數(shù)的評(píng)價(jià)包括測(cè)量螺旋度和熱穩(wěn)定性。螺旋度通過(guò)如下的圓二色譜("CD")評(píng)價(jià)。簡(jiǎn)要地，CD光譜采用裝有熱電溫度控制器的光譜儀獲得。該光譜在25t下獲得，從200nm到260nm，步長(zhǎng)為0.5納米(nm)，帶寬1.5nm，且典型的平均時(shí)間為4秒/步長(zhǎng)。在減去細(xì)胞/緩沖空白后，用具有保守窗口尺寸(conservativewindowsize)的三次最小平方多項(xiàng)式擬合#會(huì)出隨機(jī)殘差來(lái)平滑光譜。原始橢圓度值用標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化為平均殘基橢圓率，并以波長(zhǎng)(從200到260nm)對(duì)[e]X10-3(度數(shù)cm"dmol)作圖。然后用標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算百分比螺旋度值(通常表示為在10[iM、25。C下的百分比螺旋度)。熱穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)通過(guò)監(jiān)測(cè)當(dāng)溫度以2r步長(zhǎng)上升，平衡時(shí)間為1分鐘時(shí)CD信號(hào)在222nm的改變來(lái)進(jìn)行。以Tm值表示的每個(gè)樣本(例如HIV融合抑制肽)的穩(wěn)定性，為對(duì)應(yīng)于熱相變一階導(dǎo)數(shù)最大值的溫度。生物學(xué)性質(zhì)的評(píng)價(jià)包括測(cè)量抗fflV-l毒抹的抗病毒活性。在確定本發(fā)明的HIV融合抑制肽的抗病毒活性(如，一種測(cè)量是抑制fflV向目標(biāo)細(xì)胞傳播的能力)中，使用已經(jīng)表明可通過(guò)衍生自HlVgp41的HR區(qū)的肽所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)來(lái)預(yù)測(cè)體內(nèi)觀察到的抗病毒活性的體外試驗(yàn)。更具體地，已經(jīng)表明用體外感染試驗(yàn)("Magi-CCR5感染試驗(yàn)"，參見美國(guó)專利6,258,782號(hào))觀察的抗病毒活性與相同HlVgp41衍生肽在體內(nèi)的抗病毒活性合理相關(guān)(參見Kilby等，1998，NatureMed.4:1302-1307)。這些試驗(yàn)使用表達(dá)衍生的cMAGI的指示細(xì)胞系MAGI或CCR5對(duì)感染病毒滴度的減少評(píng)分。兩種細(xì)胞系都具有HIV-1tat的反式激活所述fflV-LTR驅(qū)動(dòng)的(3-半乳糖香酶報(bào)告基因的表達(dá)的能力。該P(yáng)-gal報(bào)告子已被修飾而定位在細(xì)胞核內(nèi)且能夠在感染幾天內(nèi)用X-gal底物進(jìn)行強(qiáng)核染色而檢測(cè)。因而，如果在染色之前僅有一輪感染，則染色的核數(shù)可認(rèn)為與用于感染的接種體中的感染病毒粒子數(shù)相等。感染細(xì)胞用CCD-成像儀計(jì)數(shù)，初始和實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)后的分離抹均顯示出病毒輸入與成像4義顯示的感染細(xì)胞數(shù)量的線性關(guān)系。在MAGI和cMAGI試驗(yàn)中，感染滴度50。/。減少(Vn/Vo=0.5)是顯著的，且^是供了評(píng)估抗病毒活性初始臨界值("IC50"定義為導(dǎo)致感染病毒滴度減少50%的活性成分的濃度)。將測(cè)試抗病毒活性的肽稀釋成不同的濃度，一式兩份或一式三份地測(cè)試其對(duì)抗在48孔微量滴定板上調(diào)節(jié)成約1500-2000感染細(xì)胞/孔的fflV接種體。將該肽(在各自的濃度下)加入到cMAGI或MAGI細(xì)胞中，隨后進(jìn)行病毒接種，24小時(shí)后，加入感染和細(xì)胞-細(xì)胞融合抑制劑(例如T20(SEQIDNO:2;恩夫韋地))，以防止第二輪HIV感染和細(xì)胞-細(xì)胞病毒傳播。將該細(xì)胞再培養(yǎng)2天，然后固定并用X-gal底物染色以測(cè)量fflV感染細(xì)胞。每個(gè)對(duì)照組以及肽稀釋液中感染細(xì)胞的數(shù)量用CCD-成像儀確定，然后計(jì)算IC50(以嗎/ml表達(dá))。對(duì)基本序列組成的肽的抗病毒活性有耐受力的病毒可用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法制備?；旧?，在計(jì)算IC50和IC90后，將細(xì)胞與病毒和所述肽(例如以接近IC90的濃度)在培養(yǎng)基中混合(包括將細(xì)胞在此后分開)。保持和監(jiān)控培養(yǎng)直至合胞體產(chǎn)生。從第一輪培養(yǎng)中收獲的病毒用于在第二輪培養(yǎng)中感染細(xì)胞，且肽濃度比第一輪培養(yǎng)中所用的肽濃度更高(2到4倍)。保持和監(jiān)控第二輪培養(yǎng)以得到對(duì)所述肽的抗病毒活性有耐受力的病毒。還可需要隨后輪次的培養(yǎng)以最終產(chǎn)生對(duì)所述肽的抗病毒活性有耐受力的病毒分離抹(以所述肽抗這種分離抹的預(yù)定IC50水平)。為確定藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，對(duì)食蟹猴(Afocaca/w/cM/anX)靜脈給予HIV融合抑制肽或衍生fflV融合抑制肽的基本序列(如本領(lǐng)域公知，其它動(dòng)物模型也可用于確定藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì))。在給藥后的不同時(shí)間點(diǎn)，抽取血液樣品并通過(guò)離心分離血漿。將血漿樣品凍存直至在電噴霧、陽(yáng)離子模式中進(jìn)行LC-MS分析(液相色譜/質(zhì)譜)。用pH6.8，lOmM醋酸銨緩沖液中的乙腈梯度液將fflV融合抑制肽或基本序列從C18或C8HPLC柱中洗脫。分析時(shí)，血漿樣品用兩體積或三體積的含0.5%甲酸的乙腈去蛋白。與樣品同時(shí)準(zhǔn)備后進(jìn)行分析。藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)用單指數(shù)或雙指數(shù)數(shù)學(xué)模型從血漿濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)計(jì)算得到。模型用非線性最小平方優(yōu)化導(dǎo)出。1/d濃度權(quán)重被使用。下述方程式用于計(jì)算血漿濃度對(duì)時(shí)間曲線下的面積(AUC)、全身清除率(C1)和最終消除半衰期(tm)。AUC=A/-a+B/陽(yáng)b其中A和B為截距，a和b分別是描述傳播階段和消除階段指數(shù)方程的速度常數(shù)。當(dāng)用單指數(shù)模型時(shí)，"A"和"a"性質(zhì)被消除。Cl=劑量/AUC(以L/K/hr表示)11/2=-0.6903/03(以hr表示)實(shí)施例2為了說(shuō)明本發(fā)明的目的，所述基本序列具有如下氨基酸序列(SEQIDNO:5)TTWEAWD認(rèn)AEYAARIEALIRAAQEQQEKNEAALREL在一個(gè)實(shí)施方案中，與衍生該fflV融合抑制肽的基本序列相比，本發(fā)明的fflV融合抑制肽含有多于2個(gè)的亮氨酸拉鏈樣基序。這種HIV融合抑制肽的例子包括但不限于SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13;或者與SEQIDNO:11、SEQIDNO:12或SEQIDNO:13任一相比具有一至三個(gè)氨基酸差異(至少92%的一致性)的氨基酸序列；每個(gè)fflV融合抑制肽具有3到5個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序的氨基酸序列。下述圖示(I)顯示了本發(fā)明的HIV融合抑制肽的氨基酸序列，其具有氨基酸差異(與基本序列相比較)，該差異在基本序列氨基酸位置的下方(用T對(duì)齊)用單字母氨基酸代碼("L"代表亮氨酸，"r，代表異亮氨酸)表示，且具有亮氨酸拉鏈樣基序相關(guān)的異亮氨酸和亮氨酸(在同一亮氨酸拉鏈樣基序的位置1或8處，或者在亮氨酸拉鏈樣基序的位置8和相鄰的亮氨酸拉鏈樣基序的位置1處)，如下劃線所示。亮氨酸拉鏈的位置1或8處還可作為序列中另一亮氨酸拉鏈樣基序的相對(duì)末端位置，即作為一基序的位置8和另一相鄰基序的位置1。TTWEA葡,AEYAAR復(fù)EAIJRAAQEQQEKNEAALREIS狂QID陵5LLSEQ纖D陽(yáng):11LSECHDNO:12LiSEQ際NO:13在另一個(gè)實(shí)施方案中，與衍生該fflV融合抑制肽的基本序列相比，本發(fā)明的HIV融合抑制肽含有多于一個(gè)的亮氨酸拉鏈樣基序，和與形成亮氨酸拉鏈樣基序不相關(guān)的額外的亮氨酸。這些HIV融合抑制肽的例子包括但不限于SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:14、和SEQIDNO:15;或者與SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:14、和SEQIDNO:15任一相比具有一至三個(gè)氨基酸差異(至少92%的一致性)的氨基酸序列；每個(gè)HIV融合抑制肽不同于SEQIDNO:5的基本序列，因?yàn)槠浜卸嘤谝粋€(gè)的亮氨酸拉鏈樣基序和與亮氨酸拉鏈樣基序形成不相關(guān)的額外的亮氨酸(即在亮氨酸拉鏈樣基序的位置1或8處之外)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，非亮氨酸拉鏈樣基序亮氨酸替代取代了SEQIDNO:5基本序列氨基酸21位置處的異亮氨酸。下述圖示(II)顯示了本發(fā)明的HIV融合抑制肽的氨基酸序列，其具有氨基酸差異(與基本序列相比較)，該差異在其基本序列氨基酸位置的下方(用T對(duì)齊)用單字母氨基酸代碼("L"代表亮氨酸，"r'代表異亮氨酸)表示，且具有亮氨酸拉鏈樣基序相關(guān)的異亮氨酸和亮氨酸(在同一亮氨酸拉鏈樣基序的位置l或8處，或者在亮氨酸拉鏈樣基序的位置8和相鄰的亮氨酸拉鏈樣基序的位置1處)，如下劃線所示。斜體指與亮氨酸拉鏈樣基序不相關(guān)的亮氨酸。B3《DNO:§SEQIDNO:10SEQDNO:14SEQiONO:,5圖示(III)顯示了"基本序列"SEQIDNO:5和SEQIDNO:9-15的全序列。SEQIDNO:9-15中的每一個(gè)相對(duì)于SEQIDNO:5堿基序列的氨基酸替代加下劃線且加4且。(III)SEQiDNO:5TTWEAWDRA!AEYAARIEAL!RAAQ￡C3QEKNEAALRELSEQ，DSEQ,DNO:10TTWEAWDRA!AEYAARIEA丄LRAAQE賤gKJagAALRELSEQ匿D40:11TTWEAWDRA!AEYAARIEAL，RALQ￡QQ￡KI_EAALREI_SEQIDNO:12*"*—TTWeAWDR/UAEYAARIEAURAIOEQOEKI^AALRELSEQ歐13TTWEAWDRA，AEYAAFUEAURALQEQQEKIEAALRELSEQNO:14""TTWEAWDRAIAEY.AAmgALlRAIQEQQEKN￡AALRELS￡QDMO:15TTWEAWC3RAIAEYAAFUEALfcRAAQEQQEiqEAAl關(guān)L參見表l,將本發(fā)明中的HIV融合抑制肽與具有相同基本序列，但氨基酸序列不同(與SEQIDNO:9-15相比較)且具有抗fflV活性的合成肽相比較。該比較包括用本文實(shí)施例1中描述的方法確定的生物物理參數(shù)和生物抑TTWEA葡RAiAEYAARiEAURAAQEQ鵬NEAALRELII1活性參數(shù)。在通過(guò)抗病毒活性評(píng)估來(lái)確定生物活性時(shí)，使用對(duì)一些對(duì)已知抑制fflV介導(dǎo)的融合的肽的抗病毒活性有耐受力的病毒分離抹(有耐受力的病毒分離株在表格l中稱為"Res")。表1:生物物理和生物學(xué)(抗病毒活性)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>SEQIDNO:6在位置24處有單一替代而與SEQIDNO:5不同。SEQIDNO:7在位置31處有單一替代而與SEQIDNO:5不同。這些替代導(dǎo)致半衰期的提高(參見下表2)。SEQIDNO:6與本發(fā)明具有SEQIDNO:9的HIV融合抑制肽相似，不同之處在于該SEQIDNO:9的氨基酸序列在氨基酸位置21處還具有一個(gè)氨基酸差異，即亮氨酸(而SEQIDNO:6在氨基酸位置21處為異亮氨酸)。參見表l,與SEQIDNO:6相比，SEQIDNO:9中亮氨酸替代異亮氨酸導(dǎo)致螺旋度的降低(從97%到61%)，但保持了抗病毒活性，包括良好的耐藥性(對(duì)抗耐藥性病毒分離抹"Res"的活性)。相似地，SEQIDNO:7是與本發(fā)明具有SEQIDNO:10的HIV融合抑制肽相似的氨基酸序列，不同之處在于SEQIDNO:10的氨基酸序列在氨基酸位置21處還具有一個(gè)氨基酸差異，即亮氨酸(而SEQIDNO:7在氨基酸位置21處為異亮氨酸)。參見表l,與SEQIDNO:7相比，SEQIDNO:10中亮氨酸替代異亮氨酸導(dǎo)致螺旋度的降低(從84%到77%)，但保持了抗病毒活性，包括良好的耐藥性(對(duì)抗耐藥性病毒分離抹"Res"的活性)。因而，表1表明了SEQIDNO:9和10相對(duì)于SEQIDNO:6-7具有改善的屬性。本實(shí)施方案闡述了與基本氨基酸序列相比本發(fā)明的HIV融合抑制肽的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。所用的評(píng)價(jià)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的方法如實(shí)施例1所詳細(xì)表述，表2顯示了SEQIDNO:5-10肽的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>如表2所示，每個(gè)SEQIDNO:6、7、9和10顯示出增加的生物半衰期("t1/2")。SEQIDNO:8，其在氨基酸位置21處含有亮氨酸，但在氨基酸位置24或31處不含亮氨酸，沒有顯示出如SEQIDNOS:6、7、9和10的肽所顯示出的半衰期的顯著增加。為了將HIV融合抑制肽配制到藥學(xué)上可接受的載體中而制備藥物組合物，在水性溶液中的穩(wěn)定性是重要的參數(shù)，尤其是在該藥物組合物是通過(guò)腸胃外給藥時(shí)。需要注意的是本發(fā)明的fflV融合抑制肽在生理pH下在水性溶液中顯示出穩(wěn)定性提高。例如，分別測(cè)定具有氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:5的合成肽，和具有氨基酸序列SEQIDNO:9的HIV融合抑制肽的溶解性，測(cè)定方法如下向磷酸鹽緩沖液(PBS)中加入濃度為10mg/ml的肽，并在約pH7.3到pH7.5,37°C下在一周期間(168小時(shí))內(nèi)的不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量保留在溶液中的肽的含量。含有SEQIDNO:2的溶液在僅僅幾小時(shí)后就變得不穩(wěn)定了(在溶液中測(cè)到少量的肽)。相反，在一周時(shí)在溶液中仍可檢測(cè)到大于等于卯％的具有氨基酸序列SEQIDNO:9的HIV融合抑制肽，在一周時(shí)在溶液中仍可檢測(cè)到少于80%的具有氨基酸序列SEQIDNO:5的肽。實(shí)施例3已將本發(fā)明的HIV融合抑制肽的生物學(xué)性質(zhì)與其它公知的、有效的抗病毒劑，包括SEQIDNO:2(恩夫韋地)進(jìn)行了比較。具體地，體外抗性比較研究在新的SEQIDNO:9目標(biāo)化合物與確定的抗病毒劑SEQIDNO:2之間進(jìn)行，詳細(xì)描述如下MT2細(xì)胞用病毒分離抹(IIIB、030、060和098)感染，并在漸增濃度的SEQIDNO:2(恩夫韋地)或SEQIDNO:9中培養(yǎng)以進(jìn)行抗性選擇。初始肽濃度大約為每種肽對(duì)抗相應(yīng)的野生型分離祙的IC5()的2倍。每1-3天加入新鮮肽以維持肽的濃度。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基中的細(xì)胞病理效應(yīng)(CPE),且當(dāng)獲得最大CPE時(shí)，將小份的病毒用于下一輪感染。當(dāng)與野生型病毒的生長(zhǎng)速率相比時(shí)肽的濃度根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)度增加了2到4倍。在選擇過(guò)程中，也收集不含肽的病毒儲(chǔ)備物。該不含肽的病毒儲(chǔ)備物通過(guò)雙脫氧測(cè)序化學(xué)法對(duì)gp41基因型改變進(jìn)行表征，并用cMAGI感染測(cè)定確定表型易感性。用SEQIDNO:2和SEQIDNO:9進(jìn)行體外選擇的比較結(jié)果如表3所示。這些數(shù)據(jù)表明在培養(yǎng)基中的SEQIDNO:9選擇平均比SEQIDNO:2選擇長(zhǎng)3倍，因而具有較低倍數(shù)的ICso改變(與SEQIDNO:9的24倍相比，SEQIDNO:2為42倍)。SEQIDNO:9選擇(幾何均數(shù)3.6)比SEQIDNO:2(幾何均數(shù)1.7)需要更多的突變以獲得上述較低倍數(shù)的改變。在培養(yǎng)基中的天數(shù)更久、倍數(shù)變化更小且需要更多數(shù)量的突變來(lái)實(shí)現(xiàn)更低倍數(shù)的改變，所有這些均顯示與SEQIDNO:2相比SEQIDNO:9對(duì)體外形成抗性具有更大的阻礙。也就是說(shuō)，HIV對(duì)SEQIDNO:9比對(duì)SEQIDNO:2需要花更長(zhǎng)的時(shí)間才能形成抗性?；谥皩?duì)其它肽，例如SEQIDNO:2和T1249進(jìn)行的fflV抗性形成研究，可以預(yù)期此處所示的體外結(jié)果應(yīng)該與體內(nèi)結(jié)果合理相關(guān)。(例如參見Melby等，2006,AIDSResearchandHumanRetroviruses22(5》375-385;Greenberg&Cammack,2004,J.AntimicrobialChemotherapy54:333-340;Sista等，2004，AIDS18:1787-1794)。表3:SEQIDNO:2(恩夫韋地)和SEQIDNO:9的體外選擇比較<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實(shí)施例4通常，本發(fā)明的HIV融合抑制肽可以通過(guò)兩種方法中的任意一種合成。第一種方法是用標(biāo)準(zhǔn)固相合成技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)Fmoc肽化學(xué)或其它標(biāo)準(zhǔn)肽化學(xué)(用CPGs)線性合成。更優(yōu)選的合成本發(fā)明的HIV融合抑制肽的方法為通過(guò)片斷縮合方法。簡(jiǎn)要地，合成2個(gè)或多個(gè)片段，每個(gè)片斷含有待制備的fflV融合抑制肽的完整氨基酸序列的各個(gè)部分。如果需要，在片斷合成時(shí)，可以插入其游離胺(例如側(cè)鏈胺)被化學(xué)保護(hù)劑化學(xué)地保護(hù)的氨基酸。然后裝配這些片斷(以一定的方式和順序共價(jià)連接)從而制備得到該HIV融合抑制肽(具有正確的氨基酸序列)。關(guān)于肽合成，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的肽序列合成技術(shù)各自制備各個(gè)肽片段本身，和組合一組本發(fā)明的肽片段而制備的本發(fā)明的HIV融合抑制肽。例如，在優(yōu)選的方法中，肽片段可在固相中合成，然后在液相中組合，經(jīng)過(guò)組裝過(guò)程從而制備得到最終的HIV融合抑制肽。在另一方法中，可以使用液相合成法來(lái)制備肽片段，然后在固相中組合，經(jīng)過(guò)組裝過(guò)程從而制備得到HIV融合抑制肽。在另一方法中，每個(gè)肽片段可用固相合成法合成，然后在固相中組合，經(jīng)過(guò)組裝過(guò)程從而制備得到完整氨基酸序列的HIV融合抑制肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)肽片段用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的固相合成法合成。在優(yōu)選實(shí)施方案中，具有氨基酸序列SEQIDNO:9的HIV融合抑制肽使用本發(fā)明的一組肽片段通過(guò)使用組裝過(guò)程來(lái)制備，該組裝過(guò)程組合了固相和液相技術(shù)。例如，一組肽片段包括2到4個(gè)肽片段，其被合成，然后裝配以完成本發(fā)明的fflV融合抑制肽的合成?；诒菊f(shuō)明書的教導(dǎo)，這種片斷裝配的方法可以用于而且已經(jīng)用于具有SEQIDNO:9-16中任一氨基酸序列的一些HIV融合抑制肽對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。為描述通過(guò)片斷縮合方法制備本發(fā)明的HIV融合抑制肽，在合成具有氨基酸序列SEQIDNO:9的HIV融合抑制肽的方法中，將一組肽片斷中的肽片斷在裝配該肽片斷過(guò)程中共價(jià)結(jié)合。本發(fā)明中的肽片斷可包括但不限于具有下表4中描述的氨基酸序列的片斷。優(yōu)選的肽片斷可用于本發(fā)明中以排除優(yōu)選肽片斷之外的肽片斷。還顯示了每個(gè)肽片斷在SEQIDNO:9中相應(yīng)的氨基酸；因而，這表明每個(gè)肽片斷是由SEQIDNO:9氨基酸序列的多個(gè)相鄰氨基酸組成。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>本發(fā)明還包括在合成具有氨基酸序列SEQIDNO:9的fflV融合抑制肽的方法中用作中間體的具體肽片段組。本發(fā)明的該肽片斷組包括組1-16，如表5中所示(對(duì)組的編號(hào)僅為了描述方便)。優(yōu)選的肽片斷組可用于本發(fā)明中以排除優(yōu)選肽片斷組之外的肽片斷組。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>因而，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及可用于合成具有氨基酸序列SEQIDNO:9的fflV融合抑制肽的方法、肽片斷、和肽片斷組。通過(guò)本文的描述，很清楚這些方法、肽片斷、和肽片斷組可用于合成具有氨基酸序列SEQIDNO:9的HIV融合抑制肽，其中該HIV融合抑制肽含有一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>其中一個(gè)或多個(gè)氨基末端、羧基末端、或者側(cè)鏈自由反應(yīng)基團(tuán)(例如內(nèi)部賴氨酸的s胺)被化學(xué)基團(tuán)(B、U、Z;其中B、U和Z可以是相同的化學(xué)基團(tuán)或不同的化學(xué)基團(tuán))修飾，該化學(xué)基團(tuán)可以包括但不限于一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)官能團(tuán)、化學(xué)保護(hù)基(CPG)和接頭。用于向肽片斷N末端、或肽片斷C知的。涉及具有氨基酸序列SEQIDNO:9的HIV融合抑制肽的制備的保護(hù)版片斷的說(shuō)明性例子(具有一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)的肽片斷)包括但不限于列于表6中的肽片斷。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>脈3Ac-乙?；?、NH2-酰胺基(也可以是本文"定義"部分詳細(xì)描迷的其它化學(xué)基團(tuán))；CPG為化學(xué)保護(hù)基團(tuán)(例如Fmoc或其它N端化學(xué)保護(hù)基，如在本文"定義"部分詳細(xì)描述)；U為如上定義。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>實(shí)施例5參照表5(組1或組2)和圖3,說(shuō)明了合成具有氨基酸序列SEQIDNO:9的fflV融合抑制肽的方法，該方法使用3種特定的肽片斷(例如SEQIDNO:17-19+Leu;或SEQIDNO:17、18和20)，并采用包括組合該3種肽片斷的肽縮合方法，從而制備該mv融合抑制肽。這些肽片斷的每一種具有的物理性質(zhì)和溶解性質(zhì)使之成為合成高產(chǎn)率和高純度的具有氨基酸序列SEQIDNO:9的HIV融合抑制肽的優(yōu)選肽片斷(相對(duì)于兩片斷方法)，并且還只需要一種加載樹脂作為起始原料(簡(jiǎn)化了合成方法)。具有氨基酸序列SEQIDNO:17,并包含SEQIDNO:9的前12個(gè)氨基酸的肽片斷(參見圖3，"AA(1-12)")通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)固相合成方法合成(用超酸敏感樹脂；例如4-鞋甲基-3-甲氧基苯氧基-丁酸樹脂、或者2-氯三苯甲基氯樹脂-"CTC"，圖3)，其中N末端被乙?；?"Ac",—種化學(xué)基團(tuán))，而在C末端有羥基(-OH)(參見圖3,"Ac-AA(l-12)-OH")。具有氨基酸序列SEQIDNO:18，并包含SEQIDNO:9的第13-26個(gè)氨基酸(參見圖3,"AA(13-26)")的肽片斷通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)固相合成方法合成，其在N末端有Fmoc(作為化學(xué)保護(hù)基團(tuán))，在C末端有-OH(參見圖3，"Fmoc-AA(13-26)-OH")。具有氨基酸序列SEQIDNO:19，并包含SEQIDNO:9的第27-37個(gè)氨基酸(參見圖3，"AA(27-37)")的肽片斷通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)固相合成方法合成，其在N末端有Fmoc(作為化學(xué)保護(hù)基團(tuán))，在C末端有-0風(fēng)參見圖3，"Fmoc-AA(27-37)-OH")。每種肽片斷通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的裂解試劑、溶劑和技術(shù)從用于其固相合成的樹脂上裂解。然后每種肽片段通過(guò)蒸餾除去大部分上述溶劑并在加入或不加含乙醇的助溶劑下加入水析出該肽片斷而分離。所得的固體通過(guò)過(guò)濾分離、洗滌、在水或乙醇/水中再漿化、再過(guò)濾，并在真空電爐中干燥。如圖3所示，通過(guò)液相合成法制備肽片斷，其中具有氨基酸序列SEQIDNO:19的肽片斷(參見圖3，"Fmoc-AA(27-37)-OH")化學(xué)偶聯(lián)到Leu，SEQIDNO:9的氨基酸38上，該Leu已在液相中酰胺化，從而得到具有氨基酸序列SEQIDNO:20的肽片斷(包含SEQIDNO:9的氨基酸27-38)，其中C末端被酰胺化(作為化學(xué)基團(tuán))(參見圖3，"Fmoc-AA(27-38)-NH2")。在優(yōu)選的合成方法中，本發(fā)明的酰胺化的肽片斷，包括但不限于肽片斷H-AA(27-38)-NH2，可用酰胺樹脂直接合成。簡(jiǎn)述上述液相反應(yīng)，在DIEA(二異丙基乙胺)和亮氨酰胺(例如偶合試劑和外消旋抑制劑的組合)存在下，分離的肽片斷Fmoc-AA(27-37)-OH的羧基末端分別用HBTU(O-苯并三唑-l陽(yáng)基-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽)、或TBTU(O-苯并三唑-l-基-N,N，N',N'-四甲基脲四氟硼酸鹽)和HOBT、6-C1HOBT、或HOAT轉(zhuǎn)化為HOBT(l-羥基苯并三唑水合物)6-ClHOBt、或HOAT(l-羥基-7-氮雜苯并三唑)的活性酯。該反應(yīng)在0到30。C在極性、非質(zhì)子溶劑，如DMF(二甲基甲酰胺)或NMP(N-甲基吡咯烷酮)中進(jìn)行。偶聯(lián)反應(yīng)完成后，在有或沒有額外的助溶劑下向反應(yīng)中加入哌啶、碳酸鉀、DBU或其它本領(lǐng)域公知的堿以實(shí)現(xiàn)末端Fmoc保護(hù)基的去除。該反應(yīng)完成后，加入醇或水溶性溶劑和/或水析出C末端酰胺化的具有氨基酸序列SEQIDNO:20的肽片斷(H-AA(27-38)-NH2)。如在圖3所示，為了在液相方法中用肽片斷Fmoc-AA(27-37)-OH與亮氨酰胺(參見圖3，"H-Leu-NH2-")組合制備肽片斷H-AA(27-38)-NH2時(shí)，將肽片斷Fmoc-AA(27-37)-OH(571g，205mmo1，1當(dāng)量)、H-Leu-NH2(32.0g，246mmol,1.2當(dāng)量)、和6隱C1HOBT(41.7g，246mmol，1.2當(dāng)量)加入到DMF中(4568ml，8體積)，用DIEA(53.6ml，307.5mmol，1.5當(dāng)量)處理并在室溫下攪拌直至溶解(約20分鐘)。冷卻該溶液并加入TBTU(79.0g,246mmol,1.2當(dāng)量)。Ot下攪拌反應(yīng)物，然后在25。C下攪拌。當(dāng)HPLC分析顯示該反應(yīng)結(jié)束時(shí)，加入哌啶(81ml，820mmo1，4當(dāng)量)以除去肽片斷Fmoc-AA(27-38)-NH2的Fmoc保護(hù)基(其它堿如石炭酸鉀、DBU等也可使用)。反應(yīng)在3(TC下攪拌直到HPLC顯示結(jié)束。然后將反應(yīng)混合物冷卻至5°C以下，并緩慢加入預(yù)冷卻水(8體積，4568mL)保持所得的料漿的溫度低于10卩。攪拌該懸浮液30分鐘，然后過(guò)濾并用25。/。的乙醇/水洗滌兩次(2284mL，每次4體積)。殘留的哌啶和哌啶二千基富烯通過(guò)在乙醇/水(有或沒有稀酸)終制備出分離肽片斷H-AA(27-38)-NH2。如圖3顯示，隨后進(jìn)行液相反應(yīng)，其中將肽片斷H-AA(27-38)-NH2(SEQIDNO:20)與肽片斷Fmoc-AA(13-26)-OH(SEQIDNO:18)組合，并去保護(hù)，從而得到肽片斷H-AA(13-38)-NH2(在每個(gè)N末端和C末端均有化學(xué)基團(tuán)的SEQIDNO:35)。將肽片斷Fmoc-AA(13-26)醒OH(460g,167mmol，1當(dāng)量)、肽片斷H-AA(27-38)-NH2(460g，172mmol,1.03當(dāng)量)和6國(guó)C1HOBT(34g，200mmol,1.2當(dāng)量)力口入到DMF(6900ml,15體積)中,用DIEA(47mL，267mmol,1.6當(dāng)量)處理，并攪拌溶解所有固體。所得溶液冷卻至5。C下。向反應(yīng)中加入TBTU(64g,200mmol,1.2當(dāng)量)，在0。C，然后在25。C下攪拌該反應(yīng)。一旦HPLC分析顯示反應(yīng)完成，加入派咬(58ml，668mmol，4當(dāng)量)以除去Fmoc，然后攪拌該反應(yīng)直到HPLC顯示完成。該溶液冷卻至5"C下并以溫度不超過(guò)1(TC的速度緩慢加入水(6900mL，15體積)。攪拌所得的懸浮液30分鐘后，固體通過(guò)過(guò)濾收集、用水洗滌(兩次，2300mL,每次5體積)并干燥。殘留的哌啶和哌啶二千基富烯通過(guò)在乙醇/水(有或沒有稀酸)和/或MTBE/庚烷或其它類似的溶劑混合物中再漿化去除。所述固體通過(guò)過(guò)濾收集、洗滌、并干燥，從而得到H-AA(13-38)-NH2(SEQIDNO:35),用高效液相色譜(HPLC)純度分析測(cè)定為基本純的白色固體。如圖3顯示，隨后肽片斷H-AA(13-38)-NH2(SEQIDNO:35)在液相反應(yīng)中與肽片斷Ac-(l-12)-OH(SEQIDNO:17)裝配，從而得到具有氨基酸序列SEQIDNO:9的HIV融合抑制肽(例如參見圖3，Ac-(l-38)-NH2)。將肽片斷Ac-AA(l-12)-OH(130g，58.5mmol，1當(dāng)量)磨成細(xì)粉并與肽片斷H-AA(13-38)-NH2(303g，58.5mmol，1當(dāng)量)混合。將該混合物緩慢加入到2:1DCM/DMF(20體積，2600mL)和DIEA(25.5mL,146mmo1,2.5當(dāng)量)的熱溶液中。加入HOAT(15.9g，117mmo1，2.0當(dāng)量)并且攪拌該混合物以溶解所有固體。將所得溶液冷卻至5°C以下并加入TBTU(28,2g，87.8mmol，1.5當(dāng)量)。該溶液在0'C，然后在25°C下攪拌30分鐘，直到HPLC顯示反應(yīng)結(jié)束。加熱該溶液至30-35。C并加入額外的DCM(13體積，1740mL)，接著加入水(1820mL，14體積)。攪拌該混合物5分鐘后進(jìn)行分層。去除水層并用新鮮H2O(1820mL,14體積)替換。該分離共重復(fù)5次。將有機(jī)層蒸餾至約1/3初始體積并加入異丙醇(IPA;1820mL,14體積)。繼續(xù)蒸餾除去殘留的DCM。將所得的漿料冷卻至5。C下并緩慢加入水(1820mL,14體積)。形成的固體通過(guò)過(guò)濾收集，用H20洗滌兩次(520ml，每次4體積)并干燥，從而得到分離的HIV融合抑制肽Ac-AA(l-38)-NH2(SEQIDNO:9)的制品，純度用HPLC分析測(cè)定。如圖3所示，HIV融合抑制肽Ac-AA(l-38)-NH2的側(cè)鏈化學(xué)保護(hù)基可通過(guò)酸解或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的通過(guò)去除側(cè)鏈化學(xué)保護(hù)基來(lái)去除肽保護(hù)的方法去除。在本實(shí)施例中，fflV融合抑制肽Ac-AA(l-38)-NH2(60g，8.1mmol)用TFA(三氟醋酸)DTT(二硫蘇糖醇)水(90:10:5;570ml)處理并在室溫下攪拌6小時(shí)。將該溶液冷卻至l(TC以下，并以溫度保持在IO°C以下的速度緩慢加入預(yù)冷卻的MTBE(25體積，1500ml)。所得的固體通過(guò)過(guò)濾收集，用MTBE洗滌，并干燥。然后將所得粉末在乙腈(ACN;10體積，600mL)中漿化并用DIEA和醋酸調(diào)節(jié)pH值到4至5以脫除該肽的羧基。一旦通過(guò)HPLC確定完成，固體通過(guò)過(guò)濾收集，用ACN洗滌，并干燥，從而得到去保護(hù)和去羧基肽的制品，其然后通過(guò)HPLC或其它適合的層析技術(shù)提純，得到具有氨基酸序列SEQIDNO:9的分離的fflV融合抑制肽制品。實(shí)施例6對(duì)于表5(組3和組4)以及圖4,說(shuō)明了合成具有氨基酸序列SEQIDNO:9的fflV融合抑制肽的方法，該方法使用2個(gè)特定的肽片斷(例如SEQIDNO:29和30+Leu;或SEQIDNO:29和31),并采用包括組合2個(gè)肽片斷并使它們化學(xué)耦合("裝配")的片斷裝配方法，從而制備出具有氨基酸序列SEQIDNO:9的fflV融合抑制肽。這些肽片斷中的每一個(gè)具有的物理性質(zhì)和溶解性質(zhì)使之成為用2個(gè)肽片斷來(lái)高產(chǎn)率和高純度地合成具有氨基酸序列SEQIDNO:9的fflV融合抑制肽的優(yōu)選肽片斷。在選擇用于兩肽裝配方法的肽片斷時(shí)，發(fā)現(xiàn)在待裝配到一起的兩肽之間的結(jié)合點(diǎn)處(如具有氨基酸序列SEQIDNO:29的肽片段的C末端氨基酸，和具有氨基酸序列SEQIDNO:31的肽片段的N末端氨基酸)具有亮氨酸和/或谷氨酸殘基有利于獲得高產(chǎn)量和高純度的裝配。具有氨基酸序列SEQIDNO:29,并含有SEQIDNO:9前20個(gè)氨基酸("AA(l-20)")的肽片斷通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)固相合成法制備，其N末端被乙?；?"Ac"，作為化學(xué)基團(tuán))，而在C末端具有羥基(-OH)(參見表6，也稱為"Ac-AA(l-20)-OH")。具有氨基酸序列SEQIDNO:30，并包含SEQIDNO:9第21-37個(gè)氨基酸("AA(21-37)")的肽片斷通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)固相合成法合成，其在N末端有Fmoc(作為化學(xué)保護(hù)基)，在C末端有-OH(參見表6;也稱為"Fmoc-AA(21隱37)陽(yáng)OH")。如表5、組3和組4、和圖4所示，通過(guò)液相合成法制備肽片斷，其中肽片斷Fmoc-AA(21-37)-OH化學(xué)偶聯(lián)到Leu，SEQIDNO:9的氨基酸38上，該Leu已在液相中酰胺化，從而得到具有氨基酸序列SEQIDNO:31的肽片斷(包含SEQIDNO:9的氨基酸21-38)，其中C末端被酰胺化(作為化學(xué)基團(tuán))("Fmoc-AA(21-38)-NH2")。為了用肽片斷Fmoc-AA(21-37)-OH與亮氨酸("H-LeuNH2")在液相方法中組合制備肽片斷Fmoc-AA(21-38)-NH2,將肽片斷Fmoc-AA(21-37)-OH(30g，7.43mmo1,1,0當(dāng)量)、H-Leu-NH2*HCl(1.36g，8.16mmol，1.2當(dāng)量)、和HOAT(1.52g，11.2mmo1,1.5當(dāng)量)溶解于DMF(450ml，15體積)中，用D正A(6.5ml，37.3mmo1,5當(dāng)量)處理，并在室溫下攪拌直至溶解(約30分鐘)。冷卻該溶液至0士5。C，并加入TBTU(2.86g，8.91mmol，1.2當(dāng)量)，在0±5°C下攪拌5分鐘，然后在25士5。C下反應(yīng)2小時(shí)或直到HPLC顯示反應(yīng)完成。然后在分離所述片斷H-AA(21-38)-NH2之前去除肽片斷Fmoc-AA(21-38)-NH2的Fomc化學(xué)保護(hù)基。加入派咬(7.3mL,73.8mmol，10當(dāng)量)并在25士5。C下攪拌1小時(shí)或直至HPLC分析顯示絕大多數(shù)Fmoc已從該肽片斷中去除。冷卻反應(yīng)器，并加入7jc(1000ml，30體積)，將該自由流動(dòng)漿料在低于1(TC下攪拌30分鐘，然后過(guò)濾分離。收集的固體用l:lEtOH/水洗滌并在35±5°C下用真空電爐干燥。然后將該肽片斷在1:1EtOH/水(450mL,15體積)中再漿化3小時(shí)。收集固體并干燥。然后將該肽片斷在3:l的己烷MTBE(450mL，15體積)中漿化一夜，然后過(guò)濾分離并再干燥。如果需要去除額外的哌啶可以重復(fù)MTBE再漿化。所得為分離的肽片斷H-AA(21-38)-NH2(參見圖4)的制品。然后進(jìn)行液相反應(yīng)，其中將肽片斷H-AA(21-38)-NH2(SEQIDNO:31)與肽片斷Ac-AA(1-20)-OH(SEQIDNO:29)結(jié)合以產(chǎn)生具有氨基酸序列SEQIDNO:9的fflV融合抑制肽(參見圖4，Ac-(l-38)-NH2)。將肽片斷H-AA(21-38)-NH2(3.40g，0.86mmol，1當(dāng)量)、肽片斷Ac-AA(1-20)-OH(3.00g，0.86mmol，1.0當(dāng)量)、和HOAT(0.177g,1.3mmol，1.5當(dāng)量)以及DIEA(0.599ml，3.44mmol,4當(dāng)量)溶解于DMAc(二甲基乙酰胺；100ml,33體積)中，冷卻至0士5。C。向該反應(yīng)中加入TBTU(0.331g，1.03mmol,1.2當(dāng)量)。該反應(yīng)在0士5。C下攪拌5分鐘并在25士5。C下攪拌3小時(shí)或直到HPLC顯示該反應(yīng)完成。冷卻該反應(yīng)器，并緩慢加入7]c(200ml，66體積)。形成漿料并在低于1(TC下攪拌至少30分鐘。固體通過(guò)過(guò)濾分離并用額外的水洗滌。收集的固體用真空爐在35士5。C下干燥。所得到的為完全保護(hù)的、分離的fflV融合抑制肽Ac-AA(l-38)-NH2(SEQIDNO:9),其純度通過(guò)HPLC分析測(cè)定。然后用實(shí)施例5中描述的方法，或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何其它去保護(hù)和脫羧基的方法對(duì)該fflV融合抑制肽進(jìn)行去保護(hù)(通過(guò)除去側(cè)鏈化學(xué)保護(hù)基)和脫羧(在色氨酸殘基處)，然后提純(例如通過(guò)HPLC)。所得到的為具有SEQIDNO:9(在該說(shuō)明中，N末端被乙?；?，C末端被酰胺化)的氨基酸序列的HIV融合抑制肽的制品(去保護(hù)和脫羧的)。用相似的技術(shù)和條件，另外的片斷裝配方法，包括2片斷裝配或3片斷裝配法已被用于制備具有氨基酸序列SEQIDNO:9的HIV融合抑制肽(參見，例如表4和5)。根據(jù)本文描述可以知道，用于本發(fā)明方法制備具有氨基酸序列SEQIDNO:9的HIV融合抑制肽的優(yōu)選肽片斷可用于排除優(yōu)選肽片斷之外的肽片斷。同樣，用于本發(fā)明方法制備具有氨基酸序列SEQID肽片斷組。實(shí)施例7本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及可用于合成具有氨基酸序列SEQIDNO:10的fflV融合抑制肽的方法、肽片斷、和肽片斷組。通過(guò)本文描述也非常明顯上述方法、肽片斷、和肽片斷組可用于合成具有氨基酸序列SEQIDNO:10的HIV融合抑制肽，其中該fflV融合抑制肽含有一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基I其中氨基端和羧基端其中之一或全部通過(guò)化學(xué)基修飾(B、U、Z;其中B、U、和Z可以是相同的化學(xué)基或不同的化學(xué)基)，該化學(xué)基包括但不限于一種或多種反應(yīng)官能團(tuán)、化學(xué)保護(hù)基(CPG)和接頭。涉及制備具有氨基酸序列SEQIDNO:10的HIV融合抑制肽的肽片斷、肽片斷組、和保護(hù)肽片斷(具有一-7、8和9中的那些，表7<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>本發(fā)明還包括在合成具有氨基酸序列SEQIDNO:10的HIV融合抑制狀方法中用作中間體的肽片斷組。本發(fā)明的上述肽片斷組包括組1-14，如表8中所示(對(duì)組的編號(hào)僅僅為了描述方便)。優(yōu)選的肽片斷組可用于本發(fā)明中排除優(yōu)選肽片斷組之外的肽片斷組。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表9<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>參見表8(組3和組4)，說(shuō)明了合成具有氨基酸序列SEQIDNO:10的HIV融合抑制肽的方法，該方法使用2個(gè)特定的肽片斷(例如SEQIDNO:29和48+Leu;或者SEQIDNOS:29和49)，并采用包括組合2個(gè)肽片斷并使它們化學(xué)耦合("裝配")的片斷裝配方法，從而制備出具有氨基酸序列SEQIDNO:10的HIV融合抑制肽。為了在液相反應(yīng)中采用具有氨基酸序列SEQIDNO:48的肽片斷("Fmoc-AA(21-37)-OH，，)組合亮氨酸("H-LeuNH2")來(lái)制備具有氨基酸序列SEQIDNO:49的肽片斷("Fmoc-AA(21-38)-NH2"),將肽片斷Fmoc陽(yáng)AA(21-37)-OH(30.01g,7.98mmol,1.0當(dāng)量)、H-Leu-NH2*HC1(1.48g,8.78mmol，1.1當(dāng)量)、和HOAT(l.63g,11.97mmol,1.5當(dāng)量)溶解于DMF(450ml，15體積)中，用DIEA(7.0ml，39.91mmol，5當(dāng)量)處理并在室溫下攪拌直至溶解(約30分鐘)，將該溶液冷卻至0±5°C,并加入TBTU(3.09g，9.58mmol，1.2當(dāng)量)，在0±5°C下攪拌5分鐘，然后在25士5。C下反應(yīng)2小時(shí)或直到HPLC顯示反應(yīng)完成。在分離片斷H-AA(21-38)-NH2前去除肽片斷Fmoc-AA(21-38)-NH2的Fomc化學(xué)保護(hù)基。加入派咬(8.0mL,79.8mmol,10當(dāng)量)并在25士5°C下攪拌1.5小時(shí)或直至HPLC分析顯示所有Fmoc已完全從肽片斷中去除。冷卻反應(yīng)器，加入水(1000ml，30體積)，將該自由流動(dòng)的漿料在低于l(TC下攪拌30分鐘，然后過(guò)濾分離。收集的固體用l:3EtOH/水洗滌并用真空爐在35±5°C下干燥。然后將該肽片斷在1:3EtOH/水(400mL，13體積)中再漿化3小時(shí)。收集固體并干燥，然后該肽片斷在3:1的己烷MTBE(400mL，13體積)中漿化一夜，過(guò)濾分離，并干燥。如果需要除去額外的哌啶可重復(fù)進(jìn)行MTBE再漿化。所得到的為分離的肽片斷H-AA(21-38)-NH2制品(參見表9，SEQIDNO:49)。然后進(jìn)行液相反應(yīng)，其中肽片斷H-AA(21-38)-NH2(SEQIDNO:49)與肽片斷Ac-AA(1-20)-OH(SEQIDNO:29，表9)組合，從而產(chǎn)生具有氨基酸序列SEQIDNO:10的fflV融合抑制肽(參見，例如Ac-(l-38)-NH2)。將肽片斷H-AA(21-38)-NH2(3.14g，0,86mmol，1當(dāng)量)、肽片斷Ac-AA(l隱20)-OH(3.00g，0.86mmol，1.0當(dāng)量)、和HOAT(0.18g，1.3mmol,1.5當(dāng)量)以及DIEA(0.599ml，3.44mmol，4當(dāng)量)溶解于DMAc(100ml，33體積)中，冷卻至0士5。C。向反應(yīng)中加入TBTU(0.331g,1.03mmol，1.2當(dāng)量)。該反應(yīng)在0士5。C下攪拌5分鐘并在25土5。C下攪拌3小時(shí)或直到HPLC顯示反應(yīng)完成。冷卻反應(yīng)器，緩慢加入水(250ml，83體積)。形成漿料并在低于1(TC下攪拌至少30分鐘。固體通過(guò)過(guò)濾分離并用額外的水洗滌。收集的固體用真空爐在35±5°C下干燥。所得到的為完全保護(hù)的、分離的HIV融合抑制肽Ac-AA(l-38)-NH2(SEQIDNO:10)制品，其純度通過(guò)HPLC分析測(cè)定。然后用實(shí)施例4中描述的方法，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的去保護(hù)和脫羧的其它任何方法對(duì)HIV融合抑制肽Ac-AA(l-38)-NH2進(jìn)行去保護(hù)(通過(guò)除去側(cè)鏈化學(xué)保護(hù)基)和脫羧(在色氨酸殘基處)。提純之后，所得的為HPLC確定的具有氨基酸序列SEQIDNO:10的分離fflV融合抑制肽(N末端4皮乙酰化而C末端被酰胺化)制品(去保護(hù)和脫羧的)。用相似的技術(shù)和條件，另外的片斷裝配方法，包括2片斷裝配或3片斷裝配法可用于制備具有氨基酸序列SEQIDNO:10的fflV融合抑制肽(參見，例如表8和9)。根據(jù)本文描述可以知道，用于本發(fā)明方法制備具有氨基酸序列SEQIDNO:10的HIV融合抑制肽的優(yōu)選肽片斷可用于排除優(yōu)選肽片斷之外的肽片斷。同樣，用于本發(fā)明方法制備具有氨基酸序列SEQIDNO:10的片斷組。實(shí)施例8本發(fā)明l是供了在處理、治療fflV感染和/或AIDS中，或作為fflV感染和/或AIDS的治療方案的部分給予本發(fā)明的fflV融合抑制肽自身，或作為本發(fā)明藥物組合物的活性藥物成分給予的方法。HIV融合抑制肽的抗病毒活性可用于抑制fflV向目標(biāo)細(xì)胞傳」潘的方法中，該方法包括向病毒和細(xì)胞中加入抑制該細(xì)胞^皮HIV感染有效量的，優(yōu)選地，抑制病毒和目標(biāo)細(xì)胞之間的fflV介導(dǎo)融合有效量的本發(fā)明的HIV融合抑制肽。該方法可用于治療HIV感染的個(gè)體(治療性)或治療與HIV新接觸或處于高接觸風(fēng)險(xiǎn)中(例如通過(guò)藥物使用或高風(fēng)險(xiǎn)性行為)的個(gè)體(預(yù)防性)。因而，例如在個(gè)體感染HIV-1的情況下，有效量的HIV融合抑制肽(單獨(dú)使用和/或與一種劑量方案結(jié)合)將是減少所治療個(gè)體中的病毒載量的足夠劑量。如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，有多種測(cè)量fflV病毒載量的標(biāo)準(zhǔn)方法，包括但不限于通過(guò)外周血單核細(xì)胞的定量培養(yǎng)和通過(guò)血漿HIVRNA測(cè)定。本發(fā)明的fflV融合抑制肽可以單次給藥、間歇給藥、周期給藥或連續(xù)給藥，這可以由醫(yī)師，如通過(guò)監(jiān)測(cè)病毒載量來(lái)決定。根據(jù)包含HIV融合抑制肽的配方，和該配方是否還包含藥學(xué)上可接受的載體和/或大分子載體等因素，本發(fā)明的HIV融合抑制肽可以從幾天到幾周甚至可能更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)周期地給藥。進(jìn)一步的，在抗病毒治療中，當(dāng)組合使用或用于治療方案中時(shí)，本發(fā)明的HIV融合抑制肽可與其它用于治療HIV的抗病毒藥物或預(yù)防藥物一起使用(例如同時(shí)使用，或在循環(huán)開始時(shí)用一種藥物而循環(huán)結(jié)束時(shí)用另一種)。已知一種涉及抗病毒劑組合的常用治療是HAART(高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療)。HAART通常組合三種或更多具有抗fflV抗病毒活性的藥物，并通常涉及多類藥物("類"是指作用機(jī)理、或所述藥物靶定的病毒蛋白或者過(guò)程)。因而，本發(fā)明的治療方法、fflV融合抑制肽和藥物組合物可以單獨(dú)給藥(例如作為單一療法)或在治療方案中給藥、或是涉及與治療fflV感染和/或AIDS的額外的治療劑組合的共給藥，這在本文中有詳細(xì)描述。例如，在一優(yōu)選實(shí)施方案中，在治療中可以將一種或多種治療劑與本發(fā)明的fflV融合抑制肽(本身、或在藥物組合物中)組合。典型地，該組合包括兩種或多種抗病毒劑，以通過(guò)例如降低病毒對(duì)該治療中所使用的抗病毒劑形成耐受性的能力(相比于單一療法)來(lái)增加療效。這種組合物可用有效量的現(xiàn)已批準(zhǔn)或?qū)?lái)會(huì)批準(zhǔn)的抗病毒劑(對(duì)治療HIV感染有用的)來(lái)制備，該抗病毒劑包括但不限于一種或多種選自下列的治療劑逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，包括但不限于阿巴卡韋、AZT(齊多夫定)、ddC(扎西他濱)、奈韋拉平、ddl(去羥肌香)、FTC(恩曲他濱)、(+)和(-)FTC、reverset、3TC(拉米夫定)、GS840、GW-1592、GW隱8248、GW-5634、HBY09、delaviridine、施多寧、d4T(司他夫定)、FLT、TMC125、阿德福韋、替諾福韋、和阿洛夫定；蛋白酶抑制劑，包括但不限于安普那韋、CGP-73547、CGP-61755、DMP-450、茚地那韋、奈非那韋、PNU-140690、利托那韋、沙查那韋、替利那韋、tipranovir、atazanavir、洛匹那韋；病毒進(jìn)入抑制劑，包括但不限于融合抑制劑(恩夫韋地、T1249、其它融合抑制肽和小分子)、趨化因子受體拮抗劑(例如CCR5拮抗劑，例如ONO-4128、GW-873140、AMD-887、CMPD-167、maraviroc(UK-427857);CXCR4拮抗劑，如AMD-070)、影響病毒結(jié)合相互作用的試劑(例如影響gpl20和CD4受體相互作用，如BMS806、BMS-488043;和/或PR0542、PRO140;抗CD4抗體；或脂質(zhì)和/或膽固醇相互作用，如鹽酸普魯卡因(SP-Ol和SP-01A));整合酶抑制劑，包括但不限于L-870、和810;RNAseH抑制劑;rev或REV抑制劑;vif抑制劑(例如vif衍生的脯氨酸富集肽、fflV-l蛋白酶N端衍生肽)；病毒處理抑制劑，包括但不限于白樺脂醇、和二氫白樺脂醇衍生物(例如PA-457);和免疫調(diào)節(jié)劑，包括但不限于AS-lOl、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、IL-2、丙戊酸、和胸月泉五肽。fflV感染和/或AIDS治療領(lǐng)域技術(shù)人員知道，組合藥物治療可包含兩個(gè)或多個(gè)具有相同作用機(jī)理(作為靶的病毒蛋白或過(guò)程)的治療劑、或包含兩個(gè)或多個(gè)具有不同作用機(jī)理的治療劑。可用于與本發(fā)明的HIV融合抑制肽、或藥物組合物組合的這些說(shuō)明性的額外治療劑的有效劑量為本領(lǐng)域公知技術(shù)。這種組合可包含許多抗病毒劑或治療劑，該抗病毒劑或治療劑可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)途徑給藥，根據(jù)給藥途徑和期望的藥理作用可順序或同時(shí)給藥，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。本發(fā)明的HIV融合抑制肽或藥物組合物的有效給藥劑量可通過(guò)本領(lǐng)域公知程序確定；例如通過(guò)測(cè)定效力、生物半衰期、生物利用度和毒性來(lái)確定。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明mv融合抑制肽的有效量和其劑量范圍由本領(lǐng)域技術(shù)人員用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)體外和體內(nèi)研究數(shù)據(jù)確定。例如，如本文所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員能從抗病毒活性的體外感染試驗(yàn)中確定所述化合物的平均抑制濃度(ic),其是作為唯一的活性成分或與其它活性成分的組合來(lái)抑制預(yù)定量的病毒感染(例如50%抑制作用，IC5q;或90%抑制作用，IC90)或病毒復(fù)制所必需的。然后本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)模型得到的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)選擇適當(dāng)?shù)膭┝浚瑥亩@得該活性成分的最小血漿濃度(C[min])，其等于或超過(guò)抑制病毒感染或病毒復(fù)制的預(yù)定值。由于劑量范圍通常取決于給藥時(shí)所選擇的給藥途徑和劑型，本發(fā)明的化合物作為活性成分的示例性劑量范圍可以為約1mg/kg體重到約100mg/kg體重；優(yōu)選不少于1mg/kg體重且不超過(guò)10mg/kg體重，所述給藥途徑包括但不限于皮下給藥、腸胃外給藥、皮內(nèi)給藥或口服。(能被mv感染的細(xì)胞)的任何方式對(duì)個(gè)體給藥。因而，本發(fā)明的fflV融合抑制肽可以通過(guò)任何合適的技術(shù)給藥，包括口服、腸胃外給藥(例如肌內(nèi)內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、或皮下注射或輸注、皮內(nèi)、或植入)、鼻腔、肺部、陰道、直腸、舌下、或局部途徑給藥，并可制備成適合各種給藥途徑的劑型。特定的給藥途徑取決于，例如個(gè)體的用藥史，包括這種給藥中任何預(yù)知的或預(yù)期的副作用，以及給予的HIV融合抑制肽的配方(例如藥物載體和/或大分子載體的性質(zhì))。更優(yōu)選地，通過(guò)注射給藥(例如采用靜脈或皮下方式)，也可通過(guò)連續(xù)輸注給藥(例如采用緩釋設(shè)備或如滲透泵的微泵，等等)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的HIV融合抑制肽還可以包含藥學(xué)上可接受的載體；并可以取決于所需的配方、傳送地點(diǎn)、給藥方法、給藥方案、以及醫(yī)師公知的其它因素。因而，本發(fā)明提供了抑制HIV向細(xì)胞傳播的方法，該方法包括施用抑制所述細(xì)胞被fflV感染有效量的本發(fā)明的fflV融合抑制肽、或含fflV融合抑制肽的藥物組合物。該方法還包括通過(guò)對(duì)個(gè)體施用包含有效量的本發(fā)明的fflV融合抑制肽或藥物組合物的治療劑組合(同時(shí)或順序給藥，或作為治療方案的一部分)，從而給予該個(gè)體本發(fā)明的HIV融合抑制肽或藥物組合物與其它用于治療HIV感染和/或AIDS的治療劑的組合。還提供了抑制fflV進(jìn)入的方法，該方法包括對(duì)需要治療的個(gè)體給予抑制病毒進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞有效量的本發(fā)明的HIV融合抑制肽或藥物組合物。該方法還包括給予有效量的本發(fā)明的HIV融合抑制肽或藥物組合物與一種或多種有效量的用于治療HIV感染的病毒進(jìn)入抑制劑的組合。為說(shuō)明性的目的，前文對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方案進(jìn)行了詳細(xì)描述。針對(duì)該描述和說(shuō)明，本領(lǐng)域其它技術(shù)人員應(yīng)用現(xiàn)有知識(shí)在不背離其基本理念的情況下可輕易地對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改和/或改變以用于各種應(yīng)用，因而，這些修改和/或改變也包括在所附權(quán)利要求書的含義和范圍內(nèi)。權(quán)利要求1、分離的肽，其包含下列任一氨基酸序列SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14和SEQIDNO15。2、如權(quán)利要求l所述的肽，其還包含選自下列的組成一種或多種反應(yīng)官能團(tuán)、藥學(xué)上可接受的載體、大分子載體、和其組合。3、如權(quán)利要求l所述的肽，其中該肽至多60個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。4、分離的核酸分子，其包含編碼如權(quán)利要求l所述的肽的核苷酸序列。5、包含如權(quán)利要求4所述的核酸分子的載體。6、如權(quán)利要求5所述的載體，其中該載體為表達(dá)載體。7、含有如權(quán)利要求5或6所述的載體的分離細(xì)胞。8、含有如權(quán)利要求2所述的肽的組合物。9、如權(quán)利要求2所述的組合物，其中該組合物是無(wú)菌的。10、治療方案，其包括治療fflV-l的抗病毒劑的組合，該組合包含如權(quán)利要求1所述的肽和一種或多種抗病毒劑，該抗病毒劑選自fflV進(jìn)入抑制劑、HIV整合酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、vif-抑制劑、病毒特異性轉(zhuǎn)錄抑制劑、病毒處理抑制劑、HIV成熟抑制劑，和其組合。11、抑制fflV向細(xì)胞傳播的方法，該方法包括在細(xì)胞存在下使病毒接觸抑制該細(xì)胞被fflV感染有效量的如權(quán)利要求1的所述肽。12、抑制fflV融合的方法，該方法包括在細(xì)胞存在下使病毒接觸抑制HIV融合有效量的如權(quán)利要求1的所述肽。13、治療fflV感染個(gè)體的方法，該方法包括向該個(gè)體給予在該治療個(gè)體中產(chǎn)生治療效果有效量的如權(quán)利要求l所述的肽，該治療效果選自HIV病毒載量降低、循環(huán)CD4+細(xì)胞群增加，和其組合。14、合成SEQIDNO:9肽的方法，其中通過(guò)固相或液相合成法合成三肽片斷組，該組包括(a)SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19和亮氨酸殘基；或(b)SEQIDNO:17、SEQIDNO:18和SEQIDNO:20，其中該組的成員然后采用片段縮合方法而被組合，從而制備出SEQIDNO:9肽。(o乙onaibas)13^nvvaN:s3bb、0乙onaiDas)3Divirnv腦vv入3v、(￡乙onaibas)訓(xùn)OAVvmi工(!)(0乙ONaib3S)13^nVV3N^3bD、(乙乙ONaiDas)30waTW3ravv入3、(i乙onai加s)v腦aAVv蘊(yùn)工工q):(6i:omai加s)3>nwa>cmbb、(s乙onaiDas)3biv^mv3ravv入3viv、(/z:onaiDas)MaAvv3AV工丄(q)((61:ONaiD3S)3^nwaNDI3DD、(9Z:OM(31D3S)3blVaTlV3raVV入3VI、(S乙ONaib3S)V^OMV3AV丄丄:(61:ONai加S)3^1VWN:S3bb、(W:OMaib3S)3DlV^TIV3raVV入3V、(￡乙onaib3S)iv^a叢V3AV丄丄(j):(61:om(31加s)3>nW3>Ci3DD、(乙乙onaibas)3bT^mv3raw入3、(u:onaiDas)viv^clwv3AV工jl0)Kl￡:ONai。3S)la^nw3腦3b。3biv^1、(6乙onaib3S)1V3raW入3VIV^OAVVaM丄工(P)f(oe:(Maibas)a^nw3N:s3bb3biv^1、(6乙ONaiD3S)1V3raVV入3VIV^aAVV3AV工丄0)f(0乙ONaib3S)13>ilW3N^mbb、(81:0NaiDas)3bT^rnv3ravv入、(n:onaibas)3viv^a叢v3M丄工(q):(6i:onaibas)a^iwaNraaOb、(81:onaibas)3bT^mv3raw入、(厶i:onai加s)av訓(xùn)aAVV3AV工丄0)(k)TTWEAWDRA(SEQIDNO:25)、IAEYAARIEALLRALQE(SEQIDNO:26)、QQEKNEAALREL(SEQIDNO:20);(I)TTWEAWDR(SEQIDNO:27)、AIAEYAARIEALLRALQE(SEQIDNO:28)、QQEKNEAALREL(SEQIDNO:20);(m)TTWEAWDRAIAEYAARIE(SEQIDNO:32)、ALLRALQEQQEKNEAALRE(SEQIDNO:33);(n)TTWEAWDRAIAEYAARIE(SEQIDNO:32)、ALLRALQEQQE認(rèn)EAALREL(SEQIDNO:34);(o)TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQE(SEQIDNO:40)、QQEKNEAALRE(SEQIDNO:19);或者(p)TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQE(SEQIDNO:40)、QQEKNEAALREL(SEQIDNO:20)o15.16、如權(quán)利要求15所述的肽組，其中至少一個(gè)肽的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈用保護(hù)基保護(hù)。17、如權(quán)利要求16所述的肽組，其中該保護(hù)基選自9-貧甲氧-羰基(Fmoc)、叔丁基(t-Bu)、三苯甲基(trt)、叔丁氧羰基(Boc)、碳苯氧羰基、丹磺?；蛯?duì)硝基千酯基。全文摘要提供了具有SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、或SEQIDNO15中任一氨基酸序列的HIV融合抑制肽。還提供了含有HIV融合抑制肽和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和大分子載體的藥物組合物，以及這些組合物的用途和治療方法。文檔編號(hào)C07K5/00GK101415723SQ200780011992公開日2009年4月22日申請(qǐng)日期2007年2月2日優(yōu)先權(quán)日2006年2月2日發(fā)明者保羅·E·弗雷德里希,尼古萊·A·特維爾摩斯,布萊恩·L·布雷,張湖宜,斯蒂芬·E·施耐德,約翰·德懷爾,芭芭拉·E·約翰斯頓申請(qǐng)人:特里梅里斯公司