專利名稱：鏈霉菌線性質(zhì)粒中抗砷基因簇的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種基因簇，特別是一種鏈霉菌線性質(zhì)粒中抗砷基因簇，屬于生物技術基因領域。
背景技術：
砷化物(主要為砷酸鹽和亞砷酸鹽)作為重金屬鹽的毒害作用日益為人們所重視，由其所引起的環(huán)境問題也應起人們的廣泛關注。1968年，Novick報道了金黃色葡萄球菌由質(zhì)粒介導的砷抗性。1973年，Hedges等人在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)環(huán)形質(zhì)粒R773對砷酸鹽和亞砷酸鹽具有抗性。80年代，Mobley和Chen等確定在環(huán)形質(zhì)粒R773上存在一個抗砷基因操縱子，從而使抗砷基因的概念得以明確。隨著研究的深入，不斷有新的抗砷基因被發(fā)現(xiàn)，它們在介導生物體抗砷的同時，對砷的同族元素銻(Sb)也具有抗性。研究發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌的質(zhì)粒及細菌染色質(zhì)中均存在抗砷基因操縱子。革蘭氏陰性菌抗砷基因操縱子有三個，分別在大腸桿菌質(zhì)粒R773、質(zhì)粒R46和染色質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。大腸桿菌質(zhì)粒R773和R46含有由五個基因組成的抗砷基因操縱子，而大腸桿菌染色質(zhì)僅含三個。他們的基因順序是arsR、arsD、arsA、arsB、arsC，其功能分別為arsR編碼調(diào)節(jié)蛋白，是轉(zhuǎn)錄抑制蛋白；arsD編碼第二個轉(zhuǎn)錄抑制蛋白；arsA、arsB編碼ATP酶結(jié)合泵，泵出亞砷酸鹽；arsC編碼砷酸鹽還原酶，將五價砷還原為三價砷，然后泵出細胞。革蘭氏陽性菌抗砷基因操縱子也有三個，可分為金黃色葡萄球菌型和枯草芽孢桿菌型兩類。在金黃色葡萄球菌環(huán)形質(zhì)粒pSX267和pI258中存在一個arsRBC抗砷基因簇，它們均由arsR、arsB、arsC三個基因組成，其各自功能與質(zhì)粒R773相同?？莶菅挎邨U菌抗砷基因操縱子，是從枯草芽孢桿菌的染色質(zhì)基因組中分離出的抗砷基因操縱子，該操縱子也由arsR、arsB、arsC三個基因組成，其各自功能與質(zhì)粒R773也基本相同。在釀酒酵母質(zhì)粒中也存在一個抗砷基因操縱子，由三個成簇捧列的抗砷基因組成，分別是ACR1、ACR2和ACR3。ACR1是ACR3的正向(順式)調(diào)節(jié)基因。ACR2編碼一個砷還原酶蛋白，可以將五價砷還原為三價砷，作用與ArsC相似。ACR3基因受ACR1基因正向調(diào)節(jié)，編碼一個氧陰離子轉(zhuǎn)運通道，作用與細菌ArsB相似。ACR3蛋白錨定在細胞膜上有10個跨膜區(qū)，與ArsB不同的是它沒有ATP酶結(jié)合位點。它捧出亞砷酸鹽的能量是利用化學滲透作用。當高濃度的砷化物存在時，ACR基因可以介導對砷化物的抗性。這些砷抗性基因都是位于細菌染色質(zhì)或環(huán)形質(zhì)粒中，在線形質(zhì)粒，以及產(chǎn)生抗生素的土壤微生物鏈霉菌中沒有發(fā)現(xiàn)砷抗性基因存在。
具有抗砷基因的細菌也顯示出在環(huán)境保護方面的應用價值。在細胞內(nèi)融合表達ArsR，與沒有過量表達ArsR相比，細胞內(nèi)的砷酸鹽濃度提高了5-60倍。ArsR對砷的高親和性，能夠從污染了50ppb亞砷酸鹽的水中，完全將砷除去。利用抗砷基因賦予宿主砷抗性，可以避免砷對在同時伴有砷污染的環(huán)境進行生物治理的工程菌的的毒性，提高其相應的環(huán)境治理能力。目前，抗砷基因只局限于上述幾種微生物中，這些基因只能在近緣的宿主間轉(zhuǎn)移，因此，豐富抗砷基因的來源，可以賦予多種生物治理工程菌的砷抗性，擴大其應用范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足和需要解決的技術問題，提供一種鏈霉菌線性質(zhì)粒中抗砷基因簇。本發(fā)明使這種鏈霉菌FR-008的sas抗砷基因簇代表了鏈霉菌中所特有的抗砷基因簇的組成和基因捧列方式，并且可用于環(huán)保和一些工程菌的創(chuàng)新和發(fā)展。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明整個線性質(zhì)粒上抗砷基因簇共6個基因及其DNA序列，具體為砷抗性基因sasB和sasC 2個基因，砷抗性調(diào)節(jié)基因sasR和sasR2 2個基因，黃素單加氧酶基因sasO基因，硫氧還蛋白還原酶基因sasT基因；DNA序列為序列1。
所述的6個基因及其DNA序列編碼相應抗砷功能蛋白的氨基酸序列，即序列2-7；包括包含序列1中堿基1-375的基因sasR2，包含序列1中堿基424-1,494的基因sasO，包含序列1中堿基1,491-2,603的基因sasB，包含序列1中堿基2,600-2,884的基因sasR，包含序列1中堿基3,004-3,426的基因sasC，包含序列1中堿基3,423-4,397的基因sasT，編碼了調(diào)節(jié)蛋白，亞砷酸轉(zhuǎn)運蛋白，黃素依賴的單加氧酶，砷酸還原酶，硫氧還蛋白還原酶，并提供這些基因所編碼酶的氨基酸序列。
所述的抗砷基因，其編碼亞砷酸轉(zhuǎn)運蛋白和砷酸還原酶，即sasB和sasC的核苷酸序列或互補序列及其相應的氨基酸序列。
所述的砷抗性的調(diào)節(jié)基因，即sasR和sasR2的核苷酸序列或互補序列及其相應的氨基酸序列。
編碼黃素單加氧酶基因，即sasO的核苷酸序列或互補序列及其相應的氨基酸序列。
編碼硫氧還蛋白還原酶基因，參與砷酸還原酶催化五價砷還原成為三價砷，即sasT的核苷酸序列或互補序列及其相應的氨基酸序列。
所述的序列1的互補序列可依據(jù)DNA堿基互補原則隨時得到，序列1的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通過聚合酶鏈式反應(PCR)或用限制性內(nèi)切酶酶切DNA得到。
所述的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶鏈式反應(PCR)的方法或包含本發(fā)明序列的DNA作為探針進行Southern雜交的方法，從Streptomyces ceolicolor A3(2)，Streptomyces sp.F2得到與鏈霉菌FR-008線性質(zhì)?？股榛虼赝吹幕颉?br> 所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段可以通過轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化、接合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入外源宿主，這些外源宿主包括鏈霉菌，大腸桿菌，芽孢桿菌，酵母，植物，動物和工程菌中，并在外源宿主中表達，賦予宿主亞砷酸鹽和砷酸鹽抗性。
所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆DNA可用來通過轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化、接合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入工程菌中，通過調(diào)節(jié)抗砷基因簇的表達，應用細菌除去砷污染物，達到環(huán)境保護的目的。
所述的核苷酸序列可被修飾或突變，修飾或突變的途徑包括插入或置換，聚合酶鏈式反應，錯誤介導聚合酶鏈式反應，位點特異性突變，不同序列的重新連接，或通過紫外線或化學試劑突變。
本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以用來分離需要的蛋白質(zhì)并可以用于抗體制備，本發(fā)明所提供的基因及其蛋白質(zhì)，抗體可用于環(huán)境保護，工業(yè)應用上構(gòu)建新的工程菌。所涉及的核苷酸序列或部分序列的基因或基因簇在異源宿主中表達并通過DNA芯片技術了解它們在宿主代謝鏈中的功能，所涉及的氨基酸序列或部分序列的多肽可能在去除或替代某個或某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物學活性，或者提高了產(chǎn)量或優(yōu)化蛋白動力學特征。


圖1鏈霉菌FR-008線性質(zhì)粒上抗砷基因簇的組成圖和缺失部分抗砷基因的抗砷性質(zhì)圖1中上半部分顯示鏈霉菌FR-008線性質(zhì)粒上抗砷基因簇，包含sasR2，sasO，sasB，sasR，sasC，和sasT這一系列共6個基因和位于這些基因上的部分限制性酶切位點，以及鏈霉菌FR-008線性質(zhì)粒上抗砷基因簇突變體缺失序列，顯示缺失序列1中從sas R2起始密碼子上游34bp處NruI位點到sasT終止密碼子下游532bp處的PmaCI位點之間4962個堿基，包括了鏈霉菌FR-008線性質(zhì)粒上整個抗砷基因簇，被1.4kb的阿泊拉霉素抗性基因替代。下半部顯示8個包含序列1中不同區(qū)域的亞克隆基因在抗砷基因簇上的位置和8個亞克隆賦予Streptomyces griseus IMRU3570的抗砷性質(zhì)。
圖2鏈霉菌FR-008線性質(zhì)粒上抗砷基因簇的抗砷活性。
圖2A中鏈霉菌FR-008和IMRU3570在分別含有5mM亞砷酸鹽和100mM砷酸鹽的SFM培養(yǎng)基上的生長情況，F(xiàn)R-008具有砷鹽抗性，而IMRU3570則沒有。
圖2B中鏈霉菌FR-008基因文庫中含有抗砷基因簇的兩個科斯質(zhì)粒pHZ1239和pHZ1240導入沒有抗砷基因簇的鏈霉菌IMRU3570中，使含有pHZ1239和pHZ1240的鏈霉菌IMRU3570在分別含有5mM亞砷酸鹽和100mM砷酸鹽的SFM培養(yǎng)基上生長。進一步證實該抗砷基因簇是負責鏈霉菌FR-008的砷抗性。
具體實施例方式
本發(fā)明從鏈霉菌FR-008中分離一種砷抗性的線性質(zhì)粒pHZ227，利用線性質(zhì)粒pHZ227為探針進行Southern雜交，從鏈霉菌FR-008基因文庫中獲得包含有其同源序列的46個陽性科斯質(zhì)粒(cosmid)，對上述陽性克隆進行BamHI+BglII雙酶解發(fā)現(xiàn)，它們大部分都帶有相互重疊的外源片斷。選擇代表不同區(qū)域的8個科斯質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)它們覆蓋了pHZ227除去兩端約120Kb的區(qū)域。從8個科斯質(zhì)粒中挑出4個覆蓋了pHZ227大部分區(qū)域并且相互重疊的科斯質(zhì)粒pHZ1239，pHZ1240，pHZ1244，pHZ1246進行結(jié)合轉(zhuǎn)移進入對砷敏感的Streptomyces griseus IMRU3570，其中pHZ1239和pHZ1240賦予了IMRU3570砷抗性。對pHZ1239和pHZ1240的重疊區(qū)域進行核苷酸序列測定和分析后，獲得一個與砷抗性相關基因同源的一種新穎的sasRBCT型抗砷基因簇，G+C含量達69.9％。包含6個基因，分別是sasR2，sasR，sasB，sasO，sasC，和sasT。6個基因位于3個操縱子，sasR，sasB，和sasO組成一個操縱子，sasB的3’端與sasO的5’端重疊4個堿基(GTGA)；sasC，和sasT組成一個操縱子，并且也有4個重疊堿基(GTGA)；sasR2單獨構(gòu)成一個操縱子。sasB的產(chǎn)物與來自Saccharomyces cerevisiae和Saccharomyces douglasii的Arr3p具有同源性，Arr3p與arsB編碼的ArsB蛋白功能相同，是一個亞砷酸轉(zhuǎn)運蛋白，它是鑲嵌于細胞膜中的離子通道蛋白。在有ArsA存在時能夠利用ArsA水解ATP提供的能量將三價砷泵出細胞外。在沒有ArsA時，也可以單獨利用化學滲透作用將三價砷捧出細胞外。SasC顯示與來自Staphylococcal aereus質(zhì)粒pI258Staphylococcal xylosus質(zhì)粒pSX267 Halobacterium sp.(strain NRC-1)質(zhì)粒pNRC100，Pseudomonas putida KT2440和and Pseudomonas aeruginosa的ArsC具有同源性。ArsC蛋白是砷還原酶，可催化電子轉(zhuǎn)移。五價砷只有通過ArsC還原成為三價砷時，才可以被ArsB泵出胞外，從而使細胞內(nèi)的砷不會蓄積。SasO顯示與來自Burkholderia vietnamiensis G4和Pseudomonas putidaKT2440的黃素單加氧酶具有同源性。SasT顯示與來自Streptomyces coelicolorA3(2)，Streptomyces clavuligerus，和Mycobacterium smegmatis的硫氧還蛋白還原酶具有同源性。SasR和SasR2顯示與來自Staphylococcal xylosus質(zhì)粒pSX267，Pseudomonas putida KT2440，Yersinia enterocolitica質(zhì)粒pYV，Escherichia coli，Chromobacterium violaceum ATCC 12472和Pseudomonasaeruginosa的抗砷基因的阻遏物具有同源性。ArsR與操縱基因的結(jié)合位點結(jié)合，抗砷基因不轉(zhuǎn)錄。在有砷環(huán)境下，操縱基因去阻遏，抗砷基因開始轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明利用在鏈霉菌FR-008中進行抗砷基因簇的定向敲除，檢驗抗砷基因簇的功能；利用不具備砷抗性的鏈霉菌中進行抗砷基因簇的增加，賦予宿主砷抗性。
以下進一步提供實施例，這些實施例只是闡明了得到和應用本發(fā)明所提供序列和要素的優(yōu)選的途徑，僅用做說明而并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1缺失鏈霉菌FR-008線性質(zhì)粒上抗砷基因簇中所有基因如圖1所示，缺失序列1中從sasR2起始密碼子上游34bp的NruI位點到sasT終止密碼子下游532bp的PmaCI位點之間4962個堿基。它包括了鏈霉菌FR-008線性質(zhì)粒上完整的抗砷基因簇。從質(zhì)粒pHGF9827上用SmaI-EcoRV酶切一個1.4kb阿泊拉霉素抗性基因，插入到用NruI和PmaCI酶切的pJTU8后，產(chǎn)生質(zhì)粒pJTU1907，用BglII酶切后，克隆進質(zhì)粒pHZ1358，構(gòu)建成基因置換載體pJTU1908，通過結(jié)合轉(zhuǎn)移將pJTU1908導入鏈霉菌FR-008，通過松弛篩選得到基因置換菌株WL1，由聚合酶鏈式反應(PCR)驗證了基因置換菌株的正確性，經(jīng)過砷抗性實驗證明了所得到的基因置換菌株中抗砷基因簇被阻斷。此基因置換證明分離到的序列(序列1)確實是負責鏈霉菌FR-008的砷抗性。
這提供了一個通過完全敲除鏈霉菌FR-008線性質(zhì)粒上抗砷基因簇，以檢驗鏈霉菌FR-008線性質(zhì)粒上抗砷基因簇的功能。還提供了一種獲得線性質(zhì)粒上大片段DNA敲除的技術手段。
實施例2鏈霉菌中進行抗砷基因簇的增加如圖2所示，鏈霉菌FR-008基因文庫中含有抗砷基因簇的兩個科斯質(zhì)粒pHZ1239和pHZ1240導入突變體WL1中，含有pHZ1239和pHZ1240的抗砷基因簇缺失的突變體WL1，在分別含有5mM亞砷酸鹽和100mM砷酸鹽的SFM培養(yǎng)基上生長。另外，鏈霉菌FR-008基因文庫中含有抗砷基因簇的兩個科斯質(zhì)粒pHZ1239和pHZ1240導入沒有抗砷基因簇的鏈霉菌IMRU3570中，含有pHZ1239和pHZ1240的鏈霉菌IMRU3570在分別含有5mM亞砷酸鹽和100mM砷酸鹽的SFM培養(yǎng)基上生長。進一步證實該抗砷基因簇是負責鏈霉菌FR-008的砷抗性。
這提供了一個通過抗砷基因簇的增加，使沒有砷抗性的宿主獲得了砷抗性的方法。
實施例3
鏈霉菌中進行抗砷基因的增加將含有鏈霉菌FR-008線性質(zhì)粒上抗砷基因簇上不同基因插入整合型質(zhì)粒pSET152，構(gòu)建成一系列帶有不同抗砷基因的質(zhì)粒，整合進沒有抗砷基因簇的鏈霉菌IMRU3570中，證實帶有sasB和sasC基因的質(zhì)粒pJTU91，pJTU92，pJTU94，pJTU96和pJTU1910，轉(zhuǎn)化鏈霉菌IMRU3570后，使鏈霉菌IMRU3570具有亞砷酸鹽和砷酸鹽抗性。帶有sasB，缺失sasC基因的質(zhì)粒pJTU98和pJTU99，轉(zhuǎn)化鏈霉菌IMRU3570后，使鏈霉菌IMRU3570只具有具有亞砷酸鹽抗性，而沒有砷酸鹽抗性。缺失sasB基因的質(zhì)粒pJTU93，轉(zhuǎn)化鏈霉菌IMRU3570后，使鏈霉菌IMRU3570既沒有亞砷酸鹽抗性也沒有砷酸鹽抗性。證實SasB是一個亞砷酸轉(zhuǎn)運蛋白，SasC蛋白是砷還原酶，在單獨有SasB時只有亞砷酸抗性，當兩者同時存在時，才同時具有亞砷酸鹽和砷酸鹽抗性。
這提供了一個通過抗砷基因的增加，使沒有砷抗性的宿主獲得了砷抗性的方法。
以下根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容提供基因序列序列列表SEQUENCE LISTING<110>上海交通大學<120>鏈霉菌線性質(zhì)粒中一個抗砷基因簇<160>7<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>4397<212>DNA<213>鏈霉菌FR-008(Streptomyces sp.FR-008)<400>1atgtgtcaac atagacgtat gtcgaatacg aaggtgctgc cgctgctgga gccggagtcc60gtggcgccgt gctgcccgcc gctgaccgag cggccgttca cggccgagga ggcggagcgg120accgcgaaga tgttcaaggc gctcggcgac ccggtgcggc tgcggctgtt ctcggcggtc180gcctcgcacc ccagcgggga ggcgtgcgtg tgcgacatct ccgacgtcgg cgtttcccag240
ccgaccgtct cccaccacct gaaaaagctc aaggaagccg ggctactcgg ctccgagcgg300cgcgggacgt gggtgtatta ccgggtggag gcgtccgtgc tggccgcgat ggggcagttg360ctcaccgccc ggtgagcaac tgtcccggcg tgacggccgg ccgggctgcg gctcgccgga420ccgtcagcgg gatgcgagca ggtcggcgat ctcgcgggcc gcgtcccggg cggggcggcc480gacgccgatg agggtggcgg aggccgggcc ggtccagtcg ccgtagccga gcaggtgcag540tcgcggctcg tcgaccgcgc gggtgcccgc ggtgggaatg tgtccgcgcg tgccgcgcag600tccgaggggc gcgaggtggg agagggcggg cctgaagccg gtgcaccaga cgacggcgtc660ggcctcggcg cgggtgccgt cggcccagac gacgccgtcg ccttcgaggc gtacgaacat720gggggatgcc ttcagcagcc cggcatcgcg cgcttgccgc accggcggca cggcgacgat780gtcacccagg gaggccaccc cgccggtgtc gctgcggcct tcttcgaggg cgcggcggcg840ggcggtggcg acgtcgaaca gggcgcggcc gtcgatgtcg tcggccagga agcgcggcgg900gcgctgggtc acccaggtca actccacccg tccgtccagg gcgaggtcgg cggcgacctg960ggcaccggag ttcccgccgc cgaccacgat gacgcgctga cccgtgaagt cggccggaga1020gcggtagttg accgtgtgca gctgccgccc agtgaacacc tcgcggccgg ggacggcggg1080gaggaacggc cgcgaccagc tgccggtcgc gctgatcacc gcgcgggccc gccaagtgcc1140ggtgtccgcc tcgaccagga gtcggcctgc gtcgcggcgt acggcgtcca cgcgggtgcc1200gtgctggacg ggcaggtcgt agcgcttctc gtagtcggtg aggtagtcca ccacgtgcct1260ggcatccggg taggtctccc cggcctgggc gggcatgagc cgtccgggca gcgaggagtg1320ctcggccggg gagaacaggt gcagcgagtc ccacatgtgc tgccaggacc cacccggcac1380cggatcggcg tccaggacga cgaagtccag accgccctgg cggcgcaggt agtagccggc1440ggcgagccca gcctggccgc cgccgaccac caccacatcg gcgtgctggt tcacggggcg1500gtcgtcaccg cgcccggggc gaacttccgt cgccaggcga gcgcgacgta gaccaggccg1560atcaggaccg ggacctcgat gagcggtccg acgacgccgg acagcgcctg gccggaggtg1620acgccgaagg tggcgatggc gaccgcgatg gccagctcga agttgttgcc cgccgcggtg1680aacgccaggg tcgtggtgcg gtcgtaggcc aggcccaggc ccttgccgag gaggaaggtg1740ccgaagaaca tgaccgcgaa gtacaccagc agcggcagcg cgatccgcac gacgtccagc1800ggctgcgagg tgatggtctt tccctggagg gcgaagagga tgacgatcgt gaacagcagc1860ccgtacaacg cccacgggcc gatcttcggc aggaacttct gctcgtaacc ctcacgaccc1920atcttcttct caccgacccg gcgggtgagg aagccggcca gcagcgggac gccgaggaag1980atgaccacat tcagcgcgat ctcccacatc gagatgtcca ggttctcgcc gtcgcccagg2040ccgagccagc cgggcagcag gtcgaggtag aaccagccca gcaggccgaa cgcgatgacc2100tggaagacgg agttcagggc gacgaggacg gcggcggcct cgcggtcgcc gcaggcaagg2160tcgttccaga tgatgaccat ggcgatgcag cgggccaggc cgacgatgat caggccggtg2220cggtactcgg gcaggtccgg caggaagatc cacgccagcg cgaacatgac cgcggggccg2280aggatccagt tgatgaccag ggaggagatc atcagcttgc ggtcgccggt gacggcgtcg2340agcttgtcgt agcggacctt ggccaggacc gggtacatca tgatcagcag gccgagcgcg2400atcggcaggg agatcccacc gatctccacc ttcgccagcg cgtcgttcag tcccgggatc2460acccgcccga gcccgaggcc gacggccatg gcgatgagga tccacaccgc gaggtagcgg2520tcgagggtgg agagcttctt gacgatcgag tcgtccccac ccccggctgg agcgggggcg2580gtggtgggct cggtggcggt cacgggcagg ccctcttgtt ctcggcggcg gtacgggcgg2640aggcggccag gtcggcgaac tgctcggaga ggccggtcag gacctcgggc ttgagcttgt2700agtaggtgaa gcggccgcag ggctcggtct ccacgatccc ggcctcgcgc agcaccttca2760tgtggttgga caggttggtc tgcttggctc cggtctcctc gaccaggtgc gtcgtgcaga2820gcgtctcgcg cgccagcagg gtgacgatct ggaggcggag cggatcgccc agcacccgga2880
tcacatcagg atcgactgaa gtcagcatgc actgatactc tcacatcact gtccgctgat 2940accagcgggg gctgaagtca tgggcggctg ggttccgccc tgcgacgaga gagagcgatc 3000accatggccg acaagccgtc cgtcctgttc gtctgcgtcc acaacgccgg ccgctcccag 3060atggccgccg cctggctgac ccacctggcc ggagaccgcc tcgaggtccg ctccgcaggc 3120tccaaccctg gcactgccgt gaacccggcc gccgtcgagg ccatggccga ggtcggcatc 3180gacatctccg ccgagacccc gaagatcctt accgtcgacg cggtcaagga gtccgacgtc 3240tgcatcacga tggggtgcgg cgacacctgc cccgtcttcc ccggcaagcg ctacctggac 3300tggaagctca aggacccggc cggccagggc gttgcagccg tacgcccgat ccgcgacgag 3360atcaagaccc tggtcgaggg cctgattgcc gagatcgctc cggagaagcc ggaggcgacg 3420gcgtgagcga gatacgcgag gtcgtcatca tcggctccgg tcccgccggg tacaccgccg 3480ccctctacac cgcccgcgcg cagctgaggc ccgtgctgtt cggcagctcc atcttcgtcg 3540gcggctcgct gaccaccacg accgaggtgg agaacttccc tggcttcccc gagggcgtcg 3600acggcccggt cctgatggag aacatgcggg cccaagccga gaagttcggc gccgagatga 3660tcgacgacga cattgtggcc gtcgacctga ccggcgacat caagctgctc accgactctg 3720ccggcaccgt ccaccgcgcg aagacggtga tcatcgcgac cggctccggc ttccgcaagc 3780tcggcctgcc gaacgaggac gagctgtccg gccgtggcgt gtcctggtgc gcgacctgcg 3840acgggttctt cttccgcgac cgcgacatcg tcgtggtcgg cggcggcgac accgccatgg 3900aggaagccac cttcctcacc cgcttcgcca agtcggtcac cgttgttcac cgccgctcca 3960ccctgcgcgc ctcgaaggtc atgcaggacc gggcgttctc cgacgacaag atctccttcg 4020ccttcgacag tgagatcgcc gagatcaagg acacaggcgg catgctcggc ggcgtcgtcc 4080tgcgtgatgt cctcaccggc gccacccgcg acttggacgt gacggggctg ttcatcgcca 4140tcggccacga cccgcgcacc gagctgttca ccggccaggt ggagctggac gacgagggct 4200acatcaaggt ggactccccc tccacgcgca ccaacctgcc cggcgtgttc gcagccggtg 4260acgtcgtcga ccacatctac cgccaggcca tcaccgccgc cggcaccggc gcggccgcgg 4320ccctggacgc cgagcgctac ctcgccgccc gcggcgtggc acagaccgaa ccggcgaccg 4380ctgccgtccc tgtctga 4397<210>2<211>124<212>PRT<213>鏈霉菌FR-008<400>2Met Cys Gln His Arg Arg Met Ser Asn Thr Lys Val Leu Pro Leu Leu1 5 10 15Glu Pro Glu Ser Val Ala Pro Cys Cys Pro Pro Leu Thr Glu Arg Pro20 25 30Phe Thr Ala Glu Glu Ala Glu Arg Thr Ala Lys Met Phe Lys Ala Leu35 40 45Gly Asp Pro Val Arg Leu Arg Leu Phe Ser Ala Val Ala Ser His Pro50 55 60Ser Gly Glu Ala Cys Val Cys Asp Ile Ser Asp Val Gly Val Ser Gln65 70 75 80
Pro Thr Val Ser His His Leu Lys Lys Leu Lys Glu Ala Gly Leu Leu85 90 95Gly Ser Glu Arg Arg Gly Thr Trp Val Tyr Tyr Arg Val Glu Ala Ser100 105 110Val Leu Ala Ala Met Gly Gln Leu Leu Thr Ala Arg115 120<210>3<211>356<212>PRT<213>鏈霉菌FR-008<400>3Val Asn Gln His Ala Asp Val Val Val Val Gly Gly Gly Gln Ala Gly1 5 10 15Leu Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Arg Arg Gln Gly Gly Leu Asp Phe Val20 25 30Val Leu Asp Ala Asp Pro Val Pro Gly Gly Ser Trp Gln His Met Trp35 40 45Asp Ser Leu His Leu Phe Ser Pro Ala Glu His Ser Ser Leu Pro Gly50 55 60Arg Leu Met Pro Ala Gln Ala Gly Glu Thr Tyr Pro Asp Ala Arg His65 70 75 80Val Val Asp Tyr Leu Thr Asp Tyr Glu Lys Arg Tyr Asp Leu Pro Val85 90 95Gln His Gly Thr Arg Val Asp Ala Val Arg Arg Asp Ala Gly Arg Leu100 105 110Leu Val Glu Ala Asp Thr Gly Thr Trp Arg Ala Arg Ala Val Ile Ser115 120 125Ala Thr Gly Ser Trp Ser Arg Pro Phe Leu Pro Ala Val Pro Gly Arg130 135 140Glu Val Phe Thr Gly Arg Gln Leu His Thr Val Asn Tyr Arg Ser Pro145 150 155 160Ala Asp Phe Thr Gly Gln Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly Asn Ser165 170 175Gly Ala Gln Val Ala Ala Asp Leu Ala Leu Asp Gly Arg Val Glu Leu180 185 190Thr Trp Val Thr Gln Arg Pro Pro Arg Phe Leu Ala Asp Asp Ile Asp195 200 205Gly Arg Ala Leu Phe Asp Val Ala Thr Ala Arg Arg Arg Ala Leu Glu210 215 220Glu Gly Arg Ser Asp Thr Gly Gly Val Ala Ser Leu Gly Asp Ile Val225 230 235 240
Ala Val Pro Pro Val Arg Gln Ala Arg Asp Ala Gly Leu Leu Lys Ala245 250 255Ser Pro Met Phe Val Arg Leu Glu Gly Asp Gly Val Val Trp Ala Asp260 265 270Gly Thr Arg Ala Glu Ala Asp Ala Val Val Trp Cys Thr Gly Phe Arg275 280 285Pro Ala Leu Ser His Leu Ala Pro Leu Gly Leu Arg Gly Thr Arg Gly290 295 300His Ile Pro Thr Ala Gly Thr Arg Ala Val Asp Glu Pro Arg Leu His305 310 315 320Leu Leu Gly Tyr Gly Asp Trp Thr Gly Pro Ala Ser Ala Thr Leu Ile325 330 335Gly Val Gly Arg Pro Ala Arg Asp Ala Ala Arg Glu Ile Ala Asp Leu340 345 350Leu Ala Ser Arg355<210>4<211>370<212>PRT<213>鏈霉菌FR-008<400>4Val Thr Ala Thr Glu Pro Thr Thr Ala Pro Ala Pro Ala Gly Gly Gly1 5 10 15Asp Asp Ser Ile Val Lys Lys Leu Ser Thr Leu Asp Arg Tyr Leu Ala20 25 30Val Trp Ile Leu Ile Ala Met Ala Val Gly Leu Gly Leu Gly Arg Val35 40 45Ile Pro Gly Leu Asn Asp Ala Leu Ala Lys Val Glu Ile Gly Gly Ile50 55 60Ser Leu Pro Ile Ala Leu Gly Leu Leu Ile Met Met Tyr Pro Val Leu65 70 75 80Ala Lys Val Arg Tyr Asp Lys Leu Asp Ala Val Thr Gly Asp Arg Lys85 90 95Leu Met Ile Ser Ser Leu Val Ile Asn Trp Ile Leu Gly Pro Ala Val100 105 110Met Phe Ala Leu Ala Trp Ile Phe Leu Pro Asp Leu Pro Glu Tyr Arg115 120 125Thr Gly Leu Ile Ile Val Gly Leu Ala Arg Cys Ile Ala Met Val Ile130 135 140Ile Trp Asn Asp Leu Ala Cys Gly Asp Arg Glu Ala Ala Ala Val Leu145 150 155 160
Val Ala Leu Asn Ser Val Phe Gln Val Ile Ala Phe Gly Leu Leu Gly165 170 175Trp Phe Tyr Leu Asp Leu Leu Pro Gly Trp Leu Gly Leu Gly Asp Gly180 185 190Glu Asn Leu Asp Ile Ser Met Trp Glu Ile Ala Leu Asn Val Val Ile195 200 205Phe Leu Gly Val Pro Leu Leu Ala Gly Phe Leu Thr Arg Arg Val Gly210 215 220Glu Lys Lys Met Gly Arg Glu Gly Tyr Glu Gln Lys Phe Leu Pro Lys225 230 235 240Ile Gly Pro Trp Ala Leu Tyr GIy Leu Leu Phe Thr Ile Val Ile Leu245 250 255Phe Ala Leu Gln Gly Lys Thr Ile Thr Ser Gln Pro Leu Asp Val Val260 265 270Arg Ile Ala Leu Pro Leu Leu Val Tyr Phe Ala Val Met Phe Phe Gly275 280 285Thr Phe Leu Leu Gly Lys Gly Leu Gly Leu Ala Tyr Asp Arg Thr Thr290 295 300Thr Leu Ala Phe Thr Ala Ala Gly Asn Asn Phe Glu Leu Ala Ile Ala305 310 315 320Val Ala Ile Ala Thr Phe Gly Val Thr Ser Gly Gln Ala Leu Ser Gly325 330 335Val Val Gly Pro Leu Ile Glu Val Pro Val Leu Ile Gly Leu Val Tyr340 345 350Val Ala Leu Ala Trp Arg Arg Lys Phe Ala Pro Gly Ala Val Thr Thr355 360 365Ala Pro370<210>5<211>94<212>PRT<213>鏈霉菌FR-008<400>5Val Ile Arg Val Leu Gly Asp Pro Leu Arg Leu Gln Ile Val Thr Leu1 5 10 15Leu Ala Arg Glu Thr Leu Cys Thr Thr His Leu Val Glu Glu Thr Gly20 25 30Ala Lys Gln Thr Asn Leu Ser Asn His Met Lys Val Leu Arg Glu Ala35 40 45Gly Ile Val Glu Thr Glu Pro Cys Gly Arg Phe Thr Tyr Tyr Lys Leu50 55 60
Lys Pro Glu Val Leu Thr Gly Leu Ser Glu Gln Phe Ala Asp Leu Ala65 70 75 80Ala Ser Ala Arg Thr Ala Ala Glu Asn Lys Arg Ala Cys Pro85 90<210>6<211>140<212>PRT<213>鏈霉菌FR-008<400>6Met Ala Asp Lys Pro Ser Val Leu Phe Val Cys Val His Asn Ala Gly1 5 10 15Arg Ser Gln Met Ala Ala Ala Trp Leu Thr His Leu Ala Gly Asp Arg20 25 30Leu Glu Val Arg Ser Ala Gly Ser Asn Pro Gly Thr Ala Val Asn Pro35 40 45Ala Ala Val Glu Ala Met Ala Glu Val Gly Ile Asp Ile Ser Ala Glu50 55 60Thr Pro Lys Ile Leu Thr Val Asp Ala Val Lys Glu Ser Asp Val Cys65 70 75 80Ile Thr Met Gly Cys Gly Asp Thr Cys Pro Val Phe Pro Gly Lys Arg85 90 95Tyr Leu Asp Trp Lys Leu Lys Asp Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Ala100 105 110Val Arg Pro Ile Arg Asp Glu Ile Lys Thr Leu Val Glu Gly Leu Ile115 120 125Ala Glu Ile Ala Pro Glu Lys Pro Glu Ala Thr Ala130 135 140<210>7<211>324<212>PRT<213>鏈霉菌FR-008<400>7Val Ser Glu Ile Arg Glu Val Val Ile Ile Gly Ser Gly Pro Ala Gly1 5 10 15Tyr Thr Ala Ala Leu Tyr Thr Ala Arg Ala Gln Leu Arg Pro Val Leu20 25 30Phe Gly Ser Ser Ile Phe Val Gly Gly Ser Leu Thr Thr Thr Thr Glu35 40 45
Val Glu Asn Phe Pro Gly Phe Pro Glu Gly Val Asp Gly Pro Val Leu50 55 60Met Glu Asn Met Arg Ala Gln Ala Glu Lys Phe Gly Ala Glu Met Ile65 70 75 80Asp Asp Asp Ile Val Ala Val Asp Leu Thr Gly Asp Ile Lys Leu Leu85 90 95Thr Asp Ser Ala Gly Thr Val His Arg Ala Lys Thr Val Ile Ile Ala100 105 110Thr Gly Ser Gly Phe Arg Lys Leu Gly Leu Pro Asn Glu Asp Glu Leu115 120 125Ser Gly Arg Gly Val Ser Trp Cys Ala Thr Cys Asp Gly Phe Phe Phe130 135 140Arg Asp Arg Asp Ile Val Val Val Gly Gly Gly Asp Thr Ala Met Glu145 150 155 160Glu Ala Thr Phe Leu Thr Arg Phe Ala Lys Ser Val Thr Val Val His165 170 175Arg Arg Ser Thr Leu Arg Ala Ser Lys Val Met Gln Asp Arg Ala Phe180 185 190Ser Asp Asp Lys Ile Ser Phe Ala Phe Asp Ser Glu Ile Ala Glu Ile195 200 205Lys Asp Thr Gly Gly Met Leu Gly Gly Val Val Leu Arg Asp Val Leu210 215 220Thr Gly Ala Thr Arg Asp Leu Asp Val Thr Gly Leu Phe Ile Ala Ile225 230 235 240Gly His Asp Pro Arg Thr Glu Leu Phe Thr Gly Gln Val Glu Leu Asp245 250 255Asp Glu Gly Tyr Ile Lys Val Asp Ser Pro Ser Thr Arg Thr Asn Leu260 265 270Pro Gly Val Phe Ala Ala Gly Asp Val Val Asp His Ile Tyr Arg Gln275 280 285Ala Ile Thr Ala Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ala Ala Leu Asp Ala Glu290 295 300Arg Tyr Leu Ala Ala Arg Gly Val Ala Gln Thr Glu Pro Ala Thr Ala305 310 315 320Ala Val Pro Val
權(quán)利要求
1.一種鏈霉菌線性質(zhì)粒中抗砷基因簇，其特征在于，整個線性質(zhì)粒上抗砷基因簇共6個基因及其DNA序列，具體為砷抗性基因sasB和sasC2個基因，砷抗性調(diào)節(jié)基因sasR和sasR22個基因，黃素單加氧酶基因sasO基因，硫氧還蛋白還原酶基因sasT基因；DNA序列為序列1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏈霉菌線性質(zhì)粒中抗砷基因簇，其特征是，所述的6個基因及其DNA序列編碼相應抗砷功能蛋白的氨基酸序列，即序列2-7；包括包含序列1中堿基1-375的基因sasR2，包含序列1中堿基424-1,494的基因sasO，包含序列1中堿基1,491-2,603的基因sasB，包含序列1中堿基2,600-2,884的基因sasR，包含序列1中堿基3,004-3,426的基因sasC，包含序列1中堿基3,423-4,397的基因sasT，編碼了調(diào)節(jié)蛋白，亞砷酸轉(zhuǎn)運蛋白，黃素依賴的單加氧酶，砷酸還原酶，硫氧還蛋白還原酶，并提供這些基因所編碼酶的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏈霉菌線性質(zhì)粒中抗砷基因簇，其特征是，所述的抗砷基因，其編碼亞砷酸轉(zhuǎn)運蛋白和砷酸還原酶，即sasB和sasC的核苷酸序列或互補序列及其相應的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏈霉菌線性質(zhì)粒中抗砷基因簇，其特征是，所述的砷抗性的調(diào)節(jié)基因，即sasR和sasR2的核苷酸序列或互補序列及其相應的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏈霉菌線性質(zhì)粒中抗砷基因簇，其特征是，所述的編碼黃素單加氧酶基因，即sasO的核苷酸序列或互補序列及其相應的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏈霉菌線性質(zhì)粒中抗砷基因簇，其特征是，所述的編碼硫氧還蛋白還原酶基因，參與砷酸還原酶催化五價砷還原成為三價砷，即sasT的核苷酸序列或互補序列及其相應的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的鏈霉菌線性質(zhì)粒中抗砷基因簇，其特征是，所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段通過轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化、接合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入外源宿主，這些外源宿主包括鏈霉菌，大腸桿菌，芽孢桿菌，酵母，植物，動物和工程菌中，并在外源宿主中表達，賦予宿主亞砷酸鹽和砷酸鹽抗性。
全文摘要
一種基因技術領域的鏈霉菌線性質(zhì)粒中抗砷基因簇。本發(fā)明整個線性質(zhì)粒上抗砷基因簇共6個基因及其DNA序列，具體為砷抗性基因sasB和sasC 2個基因，砷抗性調(diào)節(jié)基因sasR和sasR22個基因，黃素單加氧酶基因sasO基因，硫氧還蛋白還原酶基因sasT基因；DNA序列為序列1。本發(fā)明提供一種鏈霉菌FR－008線性質(zhì)粒上抗砷基因簇，所提供的基因及其蛋白質(zhì)，抗體可用于環(huán)境保護，工業(yè)應用上構(gòu)建新的工程菌。
文檔編號C07K14/36GK1793368SQ200510030980
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月3日
發(fā)明者鄧子新, 王連榮, 陳實, 由德林, 周秀芬, 肖湘, 黃曦 申請人:上海交通大學