專利名稱：從分支桿菌中提取的用于刺激免疫功能，治療免疫相關(guān)性疾病，過敏性皮炎和/或保護(hù)正 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從分支桿菌中提取的用于操縱免疫反應(yīng)的寡核苷酸，根據(jù)治療用途該寡核苷酸可刺激免疫反應(yīng)并維持免疫反應(yīng)平衡并且對如過敏性皮炎等的各種與免疫相關(guān)的疾病有治療效果。特別地，本發(fā)明涉及參與刺激免疫反應(yīng)的寡核苷酸，該寡核苷酸具有三個CpG基序，其功效依據(jù)DNA序列的修飾而變化，并且該寡核苷酸通過形成磷酸二酯的寡脫氧核苷酸刺激免疫反應(yīng)(輔助劑)，并維持Th1/Th2免疫反應(yīng)的平衡用于治療各種免疫相關(guān)疾病和過敏性皮炎，并在放射治療時，還具有增加細(xì)胞存活率的作用。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)，通常通過先天的免疫系統(tǒng)起始，應(yīng)當(dāng)?shù)玫骄傻目刂埔跃S持其平衡。也就是說，在免疫和耐受之間，在第一型輔助性T細(xì)胞(Th1)和第二型輔助性T細(xì)胞(Th2)免疫反應(yīng)之間，以及在炎癥和無應(yīng)答之間的該平衡必須得到精巧的控制。然而，不幸的是，如與自體免疫性相關(guān)的疾病，過敏性疾病，慢性炎癥等，由于迄今為止開發(fā)的治療免疫相關(guān)疾病的許多藥物不能充分地調(diào)控免疫系統(tǒng)而使其得以傳播。然而，先天性的免疫系統(tǒng)的機(jī)制是當(dāng)病原體入侵時，免疫細(xì)胞通過識別外來物質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異(病原體相關(guān)分子模式，PAMP)被激活，并隨后傳遞信號以起始免疫系統(tǒng)的級聯(lián)反應(yīng)，從而消滅病原體。因而，在準(zhǔn)確理解了應(yīng)用先天免疫系統(tǒng)的有益和有害機(jī)制后，所研發(fā)的治療免疫相關(guān)疾病的藥劑必須能減少有害機(jī)制。
18世紀(jì)90年代，威廉.B.葛雷(William.B.Coley)觀察到一個令人驚奇的結(jié)果，病原微生物的感染可以對癌癥病人產(chǎn)生抗癌效果，因此發(fā)現(xiàn)如果將其施用到900例癌癥病人中，改進(jìn)的細(xì)菌療法具有約40％的療效。19世紀(jì)80年代，日本研究人員從一個新的不同方面驗證了葛雷毒素的有效性，證明卡介苗(BCG)的一個活性片段表現(xiàn)出抗癌效果，并確認(rèn)BCG的抗癌活性來自于DNA序列的固有特性。1995年柯瑞格(Kreig)等人在研究反義寡核苷酸抑制B細(xì)胞基因期間，證明一段特定的包括未甲基化的胞嘧啶和鳥嘌呤的合成寡脫氧核苷酸(ODNs)的DNA序列可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的活化。從柯瑞格的觀點來看，首次提出日本研究人員在其文獻(xiàn)中證明的BCG的抗癌效果源于其未甲基化的BCG DNA的特性，而且這種細(xì)菌DNA的免疫激活使脊椎動物的免疫系統(tǒng)能識別自身DNA和非自身的DNA。
細(xì)菌免疫激活和調(diào)控的早期研究集中于誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的葛雷毒素一類的蛋白抗原。然而，許多研究報導(dǎo)到在微生物的組分中存在更有力的免疫激活誘發(fā)劑。同時也證明細(xì)菌DNA易于誘導(dǎo)產(chǎn)生有力的免疫激活，以及對每一種抗原(6，7)產(chǎn)生確切的免疫應(yīng)答。包括兩種核酸序列的CpG二核苷酸是免疫激活和調(diào)控的關(guān)鍵所在，并且近期的研究顯示脊椎動物也可以識別自身的DNA和細(xì)菌的DNA以激活免疫細(xì)胞。這種CpG基序大量存在于細(xì)菌中，但不存在于脊椎動物中。很顯然，包含這種CpG基序的寡脫氧核苷酸(CpG-寡脫氧核苷酸，CpG-ODN)可以激活宿主的各種防御機(jī)制，包括先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答(Akdis，CA.Curr Opin Immunol.，12641-646，2000)。
近來，人們開發(fā)出一種CpG-ODN，其主鏈被修飾以增加CpG-ODN的可用性。這種具有磷酸二酯主鏈，稱為DNA基鏈的CpG-ODN，因為對核酸酶敏感，很容易在體內(nèi)分解。因而，這種CpG-ODN在體內(nèi)誘導(dǎo)毒性的風(fēng)險較低。但是，顯示具有這種磷酸二酯主鏈的CpG-ODN的活性低于其它主鏈的CpG-ODN(Kwon，HJ.等人.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，311129-138，2003)。另一方面，具有硫代磷酸酯主鏈的CpG-ODN是通過修飾其結(jié)構(gòu)可被人工合成，以使其在體內(nèi)不能被核酸酶分解。同磷酸二酯主鏈的CpG-ODN相比，硫代磷酸酯主鏈的CpG-ODN在體內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性和很好的激活B細(xì)胞的能力。因而，修飾成硫代磷酸酯主鏈的CpG-ODN近來得到廣泛的應(yīng)用。然而，由于這種ODN對許多蛋白的非特異性結(jié)合的增加，因此硫代磷酸酯主鏈的CpG-ODN不容易在體內(nèi)分解而誘發(fā)毒性。并且，有報告指出，硫代磷酸酯主鏈的CpG-ODN能誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎并加劇其癥狀(Deng GM等人.，Arthritis & Rheumatism，43(2)356-364，2000)，還可引發(fā)如SLE(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)之類的自體免疫相關(guān)疾病(Tanaka，T.等人.，J Exp.Med.175597-607，1992)。
通過在疫苗中加入作為輔劑的各種物質(zhì)制成制劑，自本世紀(jì)初以來，將這種制劑設(shè)計成使疫苗的效果最大化。但現(xiàn)在只有鋁鹽(礬，Al2O3)被認(rèn)可用作輔劑加入疫苗中。近期的研究發(fā)現(xiàn)，和僅單獨采用礬做輔劑相比，將重組肝炎表面抗原和礬及CpG-ODN共同混合后用藥于小白鼠，疫苗的有效性極大提高(Davis H L.等人.，J.Immunol.160870-876，1998)。顯然礬通過誘導(dǎo)Th2免疫反應(yīng)能輕微誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，而CpG-ODN通過誘導(dǎo)Th1細(xì)胞因子的表達(dá)強(qiáng)烈誘導(dǎo)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。然而，問題是這個例子中使用的CpG-ODN由于具有硫代磷酸酯主鏈會引起副作用。
同時，皮膚疾病是指動物包括人類在內(nèi)的皮膚上出現(xiàn)的所有不正常癥狀。其中，過敏性皮炎具有選自于包括嚴(yán)重的皮膚瘙癢癥、干皮癥和濕疹皮炎組中的如慢性/皮膚炎癥疾病的典型主要癥狀(Rudikoff，D.等人.，Lancet.3511715-1721，1998)。一般說來，過敏性皮炎傾向于具有遺傳性，依據(jù)個體的不同，往往伴有過敏性哮喘，過敏性鼻炎，過敏性結(jié)膜炎或蕁麻疹。據(jù)報道過敏性皮炎的患者中會出現(xiàn)一系列的變態(tài)免疫反應(yīng)，包括增加IgE的產(chǎn)量，減少CD8+抑制型/毒殺型T淋巴細(xì)胞(CD8+suppressor/cytotoxicT lymphocytes)的數(shù)量和破壞其功用，減少分泌IFN-gamma的Th1(第一型輔助性T細(xì)胞)細(xì)胞的數(shù)量等。同時，在過敏性皮炎的異常皮膚中，具有組織學(xué)的CD4+表型的T淋巴細(xì)胞，浸潤性單細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目增加，并且在過敏性皮炎的異常皮膚中，樹突細(xì)胞(DCs)和表皮的朗格罕氏細(xì)胞也增加了(Imokawa，G.，et al.，J.Invest.Dermatol.，96523-526，1991)。
許多研究人員開發(fā)出用X-射線殺死癌細(xì)胞治療癌癥的方法。但是在用放射療法治療癌癥時，癌組織和相鄰的免疫細(xì)胞都不可避免地受到輻射的傷害，結(jié)果降低了患者的免疫功能。據(jù)報道免疫細(xì)胞如B細(xì)胞(Ashwell JD等人.，J.Immunol.1363649-3656，1986)，T細(xì)胞(Prosser JS Int.J.Radiat.Biol.Relat.Stud.Phys.Chem.Med.30459-465，1976)和巨噬細(xì)胞(Yoshihisa K等人.，J.Radiat Res.45205-211，2004)等都會被輻射殺死(凋亡)。因而，在用放射療法治療癌癥一類的疾病時，需要癌細(xì)胞以外的正常免疫細(xì)胞得以存活以維持正常的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明涉及從牛分支桿菌卡介苗中提取寡核苷酸用于操縱免疫反應(yīng)。該寡核苷酸可以通過刺激免疫反應(yīng)(輔劑)和維持免疫反應(yīng)平衡用于治療各種免疫相關(guān)疾病，并且該寡核苷酸還具有治療過敏性皮炎和在放射時能提高細(xì)胞存活率的效果。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供一種從牛分支桿菌BCG(MB-ODN)中分離的CpG寡脫氧核苷酸，其存在于以下的通式中，所構(gòu)成的DNA序列包含至少兩段未甲基化的CpG基序，其中所述CpG寡脫氧核苷酸可用于刺激免疫反應(yīng)(輔劑)，維持Th1/Th2免疫反應(yīng)的平衡，從而治療各種免疫相關(guān)疾病，并且在用放射療法治療癌癥等疑難疾病時，保護(hù)正常的免疫細(xì)胞，還提供了一種治療或預(yù)防皮膚疾病的方法。
HKCGTTCRTGTCSGM(SEQ ID NO1)其中，R表示A或G；S表示C或G；H表示A，T或C；K表示G或T；M表示C或A。
在本發(fā)明中，寡核苷酸進(jìn)一步優(yōu)選在5’-末端和3’-末端包含五個核苷酸，被表示在下面通式中[通式]DKMHKCGTTCRTGTCSGMYK(SEQ ID NO2)其中，R表示A或G；S表示C或G；H表示A，T或C；K表示G或T；D表示A，G或T；M表示C或A；M表示C或A；以及Y表示C或T。
在本發(fā)明中，術(shù)語“CpG基序”是指一段包含由磷酸二酯鍵(磷酸鍵)連接的未甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸(稱作未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸)的DNA序列，并可活化免疫反應(yīng)。同時，術(shù)語“CpG寡脫氧核苷酸(以下稱為‘CpG-ODN’)”是指一種包含至少兩段CpG基序的寡脫氧核苷酸。
同樣在本發(fā)明中，術(shù)語“受試者”指哺乳動物，特別是包括人在內(nèi)的動物。受試者可以是一個需要治療的病人。
在本發(fā)明中，寡核苷酸優(yōu)選選自包括下列的組5’-AGCAGCGTTCGTGTCGGCCT-3’(SEQ ID NO3)，5’-AGCAGCGTTCGTGTGCGCCT-3’(SEQ ID NO4)，5’-AGCAGCGTTCATGTCGGCCT-3’(SEQ ID NO5)，5’-AGCAGCGTTCGTGTCCGCCT-3’(SEQID NO6)，5’-GTATTCGTTCGTGTCGTCCT-3’(SEQ ID NO7)，以及5’-TGACTCGTTCGTGTCGCATG-3’(SEQ ID NO8)。
本發(fā)明的MB-ODN可以從自然資源(如牛分支桿菌BCG染色體DNA)中分離出來，也可化學(xué)合成或重組制備。本發(fā)明的MB-ODN可以用本領(lǐng)域中所知的各種合成核酸的技術(shù)和設(shè)備進(jìn)行合成(Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Chs 2.and 4(Wiley Interscience，1989)；Maniatis，等人，Molecular CloningALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab.，New York，1982)；and U.S Patent No.4,458,066)。
本發(fā)明的MB-ODN優(yōu)選具有磷酸二酯主鏈。這種磷酸二酯主鏈，又稱DNA基鏈誘導(dǎo)體內(nèi)毒性的風(fēng)險較低，因為其可以容易地被體內(nèi)核酸酶所分解。本發(fā)明的MB-ODN的特征在于，和其它常規(guī)的CpG-ODNs不同，盡管具有磷酸二酯主鏈，但在體內(nèi)和體外其具有極好的免疫活性。本發(fā)明的MB-ODN也可以包括修飾過的主鏈。已經(jīng)證實在CpG-ODN給活體用藥時，對寡核苷酸主鏈進(jìn)行修飾可使CpG ODN活性和/或穩(wěn)定性增加。在本發(fā)明的MB-ODN中，對主鏈的修飾優(yōu)選包括將主鏈修飾成硫代磷酸酯，阻止其分解。可以將末端修飾成硫代磷酸酯，如5’或3’末端的最后的兩或三個核苷酸可以用硫代磷酸鍵連接。而且，可將本發(fā)明的MB-ODN修飾成具有二級結(jié)構(gòu)(如莖-環(huán)結(jié)構(gòu))以阻止其分解。優(yōu)選的，可將本發(fā)明的MB-ODN修飾成具有部分硫代磷酸酯-修飾的主鏈。硫代磷酸酯可以通過使用化學(xué)方法由磷酰胺或H-磷酸酯自動技術(shù)合成(S.E.Beaucage等人.，Tetrahedron Lett.，221859，1981；Froehler et al.，Nucl.Acid.Res.，145399-54)。另一個修飾的實例是芳基和烷基磷酸酯可采用如美國專利No.4,469,863所公開的方法合成，烷基磷酸三酯(美國專利No.5,023,243和歐洲專利No.092,574公開的一種帶電氧殘基被烷基化)可以使用商業(yè)可獲得的試劑自動固相合成制成。還有另一個使MB-ODN對分解的敏感性降低的修飾實例，包括乙?；?和硫化-以及對腺苷、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷及非典型堿基如次黃苷和quesine進(jìn)行的類似的修飾。具有二醇的CpG-ODN，如末端有四乙二醇(tetraethylglycol)和六乙二醇也有較強(qiáng)的抗分解性。更進(jìn)一步說，本發(fā)明的CpG-ODN還包含磷酸二酯和硫代磷酸酯的組合，磷酸三酯，磷酰胺，磷酸甲酯，硫代磷酸甲酯，二硫代磷酸酯及其組合物(Khorana等人.，J.Molec.Biol.，72209，1972；Goodchild，J.Bioconjugate Chem.，4165，1990)。如上所述，主鏈被修飾過的CpG-ODN通過提高抗核酸酶，增加細(xì)胞和蛋白質(zhì)的攝取和/或改變細(xì)胞間定位等而具有更強(qiáng)的免疫效果。
本發(fā)明的MB-ODN的主鏈優(yōu)選磷酸二酯(以下稱為O-型)或硫代磷酸酯(以下稱為S-型)主鏈，并且最優(yōu)選的主鏈?zhǔn)荗-型主鏈，它不容易在活體內(nèi)分解而誘發(fā)副作用。
顯然本發(fā)明的MB-ODN可通過誘導(dǎo)Th1細(xì)胞因子表達(dá)而強(qiáng)烈誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，并具有改善疫苗效果的輔助活性。其特定的生理活性如下1)從小鼠和小鼠脾臟提取的免疫細(xì)胞中的IL-12產(chǎn)量增加。
2)樹突狀細(xì)胞被激活而誘導(dǎo)IL-12的表達(dá)。
3)當(dāng)HEL和MB-ODN分別用作抗原和輔劑時，抗體的產(chǎn)量增加。同時證實當(dāng)CFA用作抗原時，作為Th1免疫反應(yīng)的結(jié)果，IgG2a的產(chǎn)量有更大的增加。
通過上述的活性，本發(fā)明的MB-ODN具有改善疫苗功效的作用。與現(xiàn)有技術(shù)所知的常規(guī)的CpG-ODNs不同，本發(fā)明的MB-ODN的特點在于，與主鏈的型式無關(guān)，其具有幾乎相同的活性。在本發(fā)明中，證實修飾成O-型主鏈的本發(fā)明CpG-ODN和修飾成S-型主鏈的CpG-ODN具有幾乎相同的活性。并且，由于已經(jīng)證實可以通過誘導(dǎo)Th1細(xì)胞因子表達(dá)而強(qiáng)烈誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，因此本發(fā)明的CpG-ODN可以作為一種有效的疫苗輔劑。
本發(fā)明的MB-ODN通過抑制Th2細(xì)胞因子(如IL-4)，和/或誘導(dǎo)Th1細(xì)胞因子(如IL-12)具有調(diào)控Th1/Th2免疫反應(yīng)的平衡的生理活性。其特定的生理活性如下1)巨噬細(xì)胞被激活從而激活I(lǐng)L-12啟動子；2)樹突狀細(xì)胞被激活從而誘導(dǎo)IL-12表達(dá)；3)小鼠體內(nèi)的IL-12產(chǎn)量增加；4)小鼠脾臟內(nèi)的免疫細(xì)胞中的IL-12產(chǎn)量增加；5)由Th2淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子(IL-4和IL-10)的表達(dá)得到抑制；6)在過敏性皮炎的損傷部位，CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量減少；7)血清中的IgE水平降低。
本發(fā)明的MB-ODN通過上述的活性而具有治療皮膚疾病或改善其癥狀的效果。與現(xiàn)有技術(shù)所知的常規(guī)的CpG-ODNs不同，本發(fā)明的CpG-ODN的特點在于，與主鏈的型式無關(guān)，其具有幾乎相同的活性。在本發(fā)明中，證實修飾成O-型主鏈的本發(fā)明CpG-ODN和修飾成S-型主鏈的CpG-ODN具有幾乎相同或更優(yōu)越的活性。因而本發(fā)明的MB-ODN可用于治療或預(yù)防各種皮膚疾病。另外，由于可以通過誘導(dǎo)Th1細(xì)胞因子表達(dá)而維持Th1/Th2免疫反應(yīng)的平衡，因此本發(fā)明的CpG-ODN可以作為一種有效的藥物治療因Th1/Th2免疫反應(yīng)失衡導(dǎo)致的免疫相關(guān)疾病(如，哮喘病)。
本發(fā)明的MB-ODN具有增加免疫細(xì)胞存活率的效果。MB-ODN具有刺激巨噬細(xì)胞從而增加Bcl-xs/L表達(dá)的作用，從而抑制因放射造成的細(xì)胞凋亡。MB-ODN還具有抑制因放射造成的B細(xì)胞的凋亡的作用。因而在采用放射療法治療癌癥之類的疑難疾病時，本發(fā)明的MB-ODN通過增加正常免疫細(xì)胞的存活率有效地使免疫功能正?；?。MB-ODN特定的生理活性如下1)巨噬細(xì)胞的Bcl-xs/L表達(dá)增加；2)使用放射時，巨噬細(xì)胞的存活率增加；以及3)使用放射時，B-細(xì)胞的存活率增加。
附圖概述本發(fā)明的上述和其他的特點，以及優(yōu)選實施例的優(yōu)點將通過結(jié)合附圖在下面詳細(xì)描述中得到更充分的說明，通過參考將其整體在此合并。附圖中

圖1是用計算機(jī)程序?qū)Υ竽c桿菌(E.coli)和牛分枝桿菌BCG染色體DNA序列的分析結(jié)果。對在兩個末端為CG二核苷酸的所有DNA序列(CpG基序)進(jìn)行了分析。如圖1所示，分析結(jié)果確認(rèn)，有更大數(shù)量的CpG基序存在于牛分枝桿菌BCG的染色體中。
圖2是在DNA序列中在20個堿基對中有三段CpG基序的DNA序列的分析結(jié)果，其中所述的DNA序列存在于牛分枝桿菌BCG染色體DNA中。在這些CpG基序中，寡核苷酸在堿基C和C(-CGXXCGXXXCG-，MB-ODN 4/5)之間有4和5個堿基空位以及每5個堿基空位處于堿基C和C(-CGXXXCGXXXCG-，MB-ODN 5/5)之間。已經(jīng)證實在牛分枝桿菌BCG的染色體DNA中有395個寡核苷酸以(-CGXXCGXXXCG-)型式存在，354個寡核苷酸以(-CGXXXCGXXXCG-)型式存在。
圖3的表列出了選用的并合成的用于調(diào)控免疫反應(yīng)的71個候選寡核苷酸用于檢測候選序列。
圖4表示用調(diào)控免疫反應(yīng)的71寡核苷酸處理RAW264.7細(xì)胞，細(xì)胞中IL-8和IL-12啟動子激活的情況，所述71寡核苷酸是在圖3中所示的以磷酸二酯鍵的形式合成的。圖4a是比較MB-ODN4/5形式的35個合成的寡核苷酸激活巨噬細(xì)胞中IL-8啟動子的倍數(shù)的結(jié)果。圖4b是比較MB-ODN4/5形式的35個合成的寡核苷酸激活巨噬細(xì)胞中IL-8啟動子的結(jié)果。圖4c是比較MB-ODN5/5形式的35個合成的寡核苷酸激活巨噬細(xì)胞的IL-8啟動子的倍數(shù)的結(jié)果。
圖5列出了選出的17個寡核苷酸的結(jié)果，這17個寡核苷酸存在于牛分枝桿菌BCG染色體DNA中，在DNA序列的20個堿基對中具有MB-ODN4/5#31的核心鏈CGTTCGTGTC，并且在核心鏈CGTTCGTGTC的5’端和3’端都具有5個不同的DNA序列(圖5a)。然后合成具有磷酸二酯主鏈的寡核苷酸以比較這17個寡核苷酸激活巨噬細(xì)胞中IL-8啟動子的倍數(shù)(圖5b)。
圖6列出了寡核苷酸MB-ODN4/5#31(M)，#31-CG和#31-A，B，C，D激活巨噬細(xì)胞中IL-8啟動子的倍數(shù)的比較結(jié)果(圖6b)。其中所述的MB-ODN4/5#31的堿基數(shù)減少到15個堿基對，所述的#31-CG中的CG序列替換為GC序列，所述的#31-A，B，C，D中CG序列的G分別獨立被A，T或C(圖6a)取代。
圖7表示MB-ODN4/5#31和#31.14的主鏈?zhǔn)且粤姿岫ズ土虼姿狨サ男问胶铣傻?，以比較它們對小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中的IL-8和IL-12啟動子激活的影響程度。圖7a和圖7b表示以磷酸二酯和硫代磷酸酯形式合成的MB-ODN4/5#31的主鏈激活I(lǐng)L-8啟動子與濃度有關(guān)。圖7c和圖7d的圖表表示MB-ODN4/5#31和#31.14的主鏈?zhǔn)且粤姿岫ズ土虼姿狨バ问胶铣傻囊员容^它們對IL-8和IL-12啟動子激活的影響程度。
圖8表示當(dāng)RAW264.7細(xì)胞系被磷酸二酯和硫代磷酸酯主鏈的MB-ODN4/5#31激活時，NF-κB被激活的情況。圖8a是一張共焦顯微鏡照片，顯示了RAW264.7細(xì)胞經(jīng)過MB-ODN4/5#31(10μg/ml)處理和固定30分鐘后，接著使用NF-κB p65特異抗血清進(jìn)行間接免疫螢光分析(EMSA)，確定了NF-κB的位置。圖8b顯示的是電泳遷移率變動分析(EMSA)的結(jié)果，其中RAW264.7細(xì)胞經(jīng)過MB-ODN4/5#31(10μg/ml)處理30分鐘后，分離核蛋白以確定NF-κB結(jié)合到NF-κB的共有結(jié)合部位。
圖9表示MB-ODN4/5#31的主鏈?zhǔn)且粤姿岫ズ土虼姿狨バ问胶铣傻囊员容^它們對經(jīng)雞蛋溶菌酶(HEL)進(jìn)行腹部免疫的Balb/c小鼠體液免疫反應(yīng)的影響程度。
圖10是電泳圖，比較了本發(fā)明的MB-ODN4/5#31和常規(guī)的1826CpG-ODN及無-CpG-ODN(2041)對樹突狀細(xì)胞中IL-12表達(dá)的影響。
圖11比較了本發(fā)明的MB-ODN4/5#31的修飾過的主鏈和常規(guī)的1826CpG-ODN及無-CpG-ODN(2041)的修飾過的主鏈對IL-12 p40產(chǎn)生的影響。圖11a確定了用MB-ODN4/5#31對Balb/c小鼠進(jìn)行腹部免疫后，血清中產(chǎn)生IL-12 p40的量。圖11b表示了從Balb/c小鼠中分離出來的脾臟免疫細(xì)胞用MB-ODN4/5#31處理后，所產(chǎn)生的IL-12p40水平。
圖12的照片顯示了給動物模型1施用本發(fā)明的O-型MB-ODN4/5#31.14治療過敏性皮炎。
圖12a的照片顯示了NC/Nga小鼠背部的過敏性皮炎傷害部位用本發(fā)明的O-型MB-ODN4/5#31處理后，在第5和第7天肉眼觀察到的結(jié)果。圖12b的照片顯示的是將O-型MB-ODN4/5#31施用到NC/Nga小鼠背部皮膚，其中所述背部皮膚上的過敏性皮炎已經(jīng)消退(break out)，被切下來，并用H&E染色后的照片。圖中，“”棘皮癥的損害部位，“→”表示過度角化的損害部位。
圖13是一張組織化學(xué)分析結(jié)果的顯微照片，顯示了NC/Nga小鼠的背部皮膚用本發(fā)明O-型的MB-ODN4/5#31給藥后，在皮膚上觀察到的細(xì)胞因子(IL-2和INF-gamma)表達(dá)的水平。圖中，箭頭表示細(xì)胞因子表達(dá)的位點。
圖14是一張組織化學(xué)分析結(jié)果的顯微照片，顯示了NC/Nga小鼠的背部皮膚用本發(fā)明O-型MB-ODN4/5#31給藥后，在皮膚上觀察到的CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞的數(shù)目。
圖15顯示了NC/Nga小鼠用本發(fā)明O-型MB-ODN4/5#31給藥后，其血清中IgE的水平。圖中“AD”表示未用藥組。
圖16表示了用蛋白質(zhì)印跡法顯示的用本發(fā)明O-型MB-ODN4/5#31處理后，巨噬細(xì)胞系的RAW264.7的Bcl-xs/L表達(dá)增加。
圖17顯示了用MTT分析法表示的用MB-ODN4/5#31預(yù)先處理RAW264.7細(xì)胞后，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)射線照射時，RAW264.7細(xì)胞的存活率增加。
圖18顯示了用PI染色后，用流式細(xì)胞分析表示的用MB-ODN4/5#31預(yù)先處理RPMI8226細(xì)胞后，RPMI8226細(xì)胞經(jīng)射線照射時，RPMI8226細(xì)胞的存活率增加。
圖19顯示了用Annexin v染色后，用流式細(xì)胞分析表示的用MB-ODN4/5#31處理RPMI8226細(xì)胞后，B細(xì)胞系RPMI8226經(jīng)射線照射時RPMI8226細(xì)胞存活率增加。
本發(fā)明的最佳實施例以下參考附圖將詳細(xì)描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
因此，在此公開的描述僅僅是優(yōu)選的實施例僅用于說明的目的，不能限制本發(fā)明的范圍。
實施例1大腸桿菌(E.coli)和牛分枝桿菌卡介苗(M.bovis BCG)染色體DNAs的DNA序列分析<1-1>大腸桿菌(E.coli)和牛分枝桿菌卡介苗(M.bovis BCG)染色體DNAs中CpG基序的DNA序列分析本發(fā)明人采用計算機(jī)程序分析了大腸桿菌和牛分枝桿菌染色體DNA序列。對存在于大腸桿菌和牛分枝桿菌卡介苗染色體DNAs中的包括6種核苷酸的DNA序列的頻率用計算機(jī)程序進(jìn)行計算。發(fā)現(xiàn)，在染色體DNA中，DNA序列XXCGXX出現(xiàn)的理論概率是1/46，而實際上在大腸桿菌和牛分枝桿菌卡介苗染色體DNAs中序列XXCGXX出現(xiàn)的概率要大的多。同時還證實序列XXCGXX出現(xiàn)在牛分枝桿菌卡介苗染色體DNA中的頻率大大高于其在大腸桿菌染色體DNA出現(xiàn)的頻率(圖1)。
<1-2>牛分枝桿菌卡介苗染色體DNA中的CpG ODN的DNA序列的分析從牛分枝桿菌卡介苗染色體DNA中隨機(jī)選擇包括20個堿基對的寡核苷酸，然后挑選出其中包含三個XXCGXX基序的寡核苷酸。
如，GACGTTGAGTCGTTAACGAG對在C和C(-CGXXCGXXXCG-，MB-ODN 4/5，圖2a)之間有4和5個堿基空位的寡核苷酸，以及在堿基C和C(-CGXXXCGXXXCG-，MB-ODN 5/5圖2b)之間都具有5個堿基空位寡核苷酸進(jìn)行分析，其結(jié)果如圖2所示。顯示有395個寡核苷酸以-CGXXCGXXXCG-型式，354個寡核苷酸以-CGXXXCGXXXCG-型式存在于牛分枝桿菌卡介苗的染色體DNA中。如圖1所示，包括20個堿基對的寡核苷酸按照其包含基序XXCGXX的頻率高得分高的次序列出。將CG出現(xiàn)在包括20個堿基對的寡核苷酸的5’或3’末端的寡核苷酸排除在外，然后選出71個候選寡核苷酸用于調(diào)控免疫反應(yīng)，將其合成后用于探測候選物質(zhì)。
實施例2具有免疫活性的MB-ODN的檢測<2-1>被合成的候選MB-ODNs的免疫反應(yīng)檢驗實施例<1-2>中制備的MB-ODNs和其各種替代物能否激活巨噬細(xì)胞中IL-8和IL-12啟動子。
a)小鼠巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)將RAW264.7細(xì)胞(ATCC，Manassas，VA)在含有10％FBS(Gibco，BRL)的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞的培養(yǎng)是在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱(Forma)中進(jìn)行的。
b)IL-8和IL-12啟動子Luc報道質(zhì)粒的設(shè)計為擴(kuò)增IL-8啟動子區(qū)(從-135bp到+46bp)，采用人類基因組DNA作模板，采用下列引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。

將擴(kuò)增的IL-8啟動子區(qū)的片段插入到能被限制酶BglII和HindIII.消化的pGL3-Basic質(zhì)粒(Promega)中。因此構(gòu)建了IL-8啟動子Luc報道質(zhì)粒(Wu G.D.等人，J.Biol.Chem.，2722396-2403，1997)。
與此同時，為擴(kuò)增IL-12啟動子區(qū)(從-373bp到+52bp)，采用人類基因組DNA作模板，采用下列引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。

將擴(kuò)增的IL-12啟動子區(qū)的片段插入到能被限制酶Sac I和Xho I消化的pGL3-Basic質(zhì)粒(Promega)中。因此，構(gòu)建了IL-12啟動子Luc報道質(zhì)粒(Wu G.D.etal.，J.Biol.Chem.，2722396-2403，1997)。
c)啟動子活性分析螢光素酶活性分析將RAW264.7細(xì)胞(ATCC，Rockviller，MID)以5×104細(xì)胞/孔的濃度加入到12孔板中并在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育24小時。這些細(xì)胞用在b)中構(gòu)建的IL-8啟動子Luc報道質(zhì)?；騃L-12啟動子Luc報道質(zhì)粒以及pRL-null質(zhì)粒(Promega)共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育24小時。每個孔用圖3所示的MB-ODNs(10μg/孔)處理，并在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育6-12小時。與此同時，對照組用PBS處理。然后，將雙螢光素酶報告檢測系統(tǒng)的PLB裂解液(passive lysis buffer)以100μl/孔的濃度加入到每個孔中使細(xì)胞勻化。將細(xì)胞溶解產(chǎn)物進(jìn)行離心分離，將所得到的上清液(15μl)用于進(jìn)行螢光素酶分析。螢光素酶的活性用TD-20/20(Turner公司設(shè)計)熒光光度計進(jìn)行檢測。每個經(jīng)MB-ODNs處理過的啟動子的活性用對照組的相對活性來表示。也就是說，如果對照組的活性設(shè)為1，實驗組的活性用對照組活性的倍數(shù)表示。
結(jié)果證實MB-ODN4/5#31的DNA序列激活了IL-8啟動子，如圖4所示。
<2-2>與MB-ODN4/5#31同源的寡核苷酸對IL-8啟動子的激活對存在于牛分枝桿菌卡介苗染色體DNA中并與MB-ODN4/5#31同源的包括20個堿基對的寡核苷酸進(jìn)行了分析。除了具有MB-ODN4/5#31DNA序列所具有的，可激活I(lǐng)L-8啟動子的CGTTCGTGTCG序列外，這些同源的寡核苷酸具有不同的DNA序列，如實施例<2-1>中所示。結(jié)果表明存在17個與MB-ODN4/5#31同源的寡核苷酸，如圖5a所示。然后，重復(fù)實施例<2-1>中相同的方法，以檢測IL-18啟動子的活性。
結(jié)果顯示激活I(lǐng)L-8啟動子的能力依DNA序列而變化，如圖5b所示。由此可見除了本發(fā)明的MB-ODN4/5#31外，MB-ODN4/5#31.14也有高活性。
<實施例3>
寡核苷酶MB-ODN4/5#31 DNA序列的修飾和免疫反應(yīng)<3-1>寡核苷酸MB-ODN4/5#31DNA序列的修飾將寡核苷酸MB-ODN4/5#31的DNA進(jìn)行修飾以合成圖6所示的DNA序列。將MB-ODN4/5#31中的每個CG序列換為GC序列(#31-CG-1，#31-CG-2，#31-CG-3)。此外，將第一CG和第二CG換為GC序列(#31-CG-4)。將第二CG和第三CG換為GC序列(#31-CG-5)。以及將第一CG和第三CG改變?yōu)镚C序列(#31-CG-5)。將CG序列中的每個G堿基分別改為A，T和C，如圖6a所示。此外，將第一和第二CG改為CA序列，并且將第二和第三CG改為CA序列，以及將第一和第三CG改為CA序列。
<3-2>對MB-ODN4/5#31修飾得到的寡核苷酸的免疫反應(yīng)測定將5×104細(xì)胞/孔的RAW264.7細(xì)胞分布在12孔板中，在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育24小時。共轉(zhuǎn)染IL-8啟動子報道質(zhì)粒和pRL-null質(zhì)粒后，在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育24小時。每孔用合成的寡核苷酸以10μg/孔處理，并在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育6小時。然后重復(fù)實施例<2-1>中的相同方法，以測定IL-18啟動子的活性。
螢光素酶分析法用來測定具有任何修飾過的DNA序列的合成的寡核苷酸激活巨噬細(xì)胞中IL-8啟動子的程度。結(jié)果表明，IL-8啟動子被寡核苷酸5’-AGCAGCGTTCGTGTGCGCCT-3’，5’-AGCAGCGTTCATGTCGGCCT-3’，5’-AGCAGCGTTCGTGTCCGCCT-3’高度激活(圖6b)。其它合成的寡核苷酸和對照組相比，顯示出較低的激活I(lǐng)L-8啟動子的活性。在激活I(lǐng)L-8啟動子的的寡核苷酸中，甚至檢測到具有第二CpG基序TTCGTG的變體的“TTCATG”的寡核苷酸對IT-8啟動子的激活活性，其中TTCATG不是CpG基序。顯示出當(dāng)對第三CpG基序“GTCGGC”進(jìn)行修飾時，重復(fù)出現(xiàn)在CpG基序中的序列GTGCGC和GTCCGC可能激活I(lǐng)L-8啟動子(圖6)<實施例4>
主鏈修飾過的MB-ODN4/5#31和MB-ODN4/5#31.14寡核苷酸的免疫反應(yīng)檢測<4-1>主鏈修飾的MB-ODN4/5#31和MB-ODN4/5#31.14對RAW264.7細(xì)胞的激活用在實施例<2-1>步驟b中構(gòu)建的IL-8-Luc啟動子報道載體或IL-12-Luc啟動子報道載體和pRL-null質(zhì)粒(Promega)共轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用O型(磷酸二酯主鏈)和S-型(硫代磷酸酯主鏈)的MB-ODN4/5#31和MB-ODN4/5#31.14處理(0或10μg/ml)，并分別孵育8小時。然后，重復(fù)實施例<2-1>中相同的方法，檢測IL-8啟動子和IL-12啟動子的活性。檢測結(jié)果如圖7所示，與主鏈的型式(O-型和S-型)無關(guān)，本發(fā)明的MB-ODN4/5#31和MB-ODN4/5#31.14具有最高的活性。
<4-2>主鏈修飾的MB-ODN4/5#31和MB-ODN4/5#31.14對NF-κB的激活將玻璃罩蓋在24孔板上，RAW264.7細(xì)胞以5×105個細(xì)胞/ml的濃度加入孔板中。在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育24小時。每孔用5μg/孔的MB-ODN4/5#31和MB-ODN4/5#31.14的寡核苷酸處理。30分鐘后，細(xì)胞用3.7％的甲醛固定，而后用包含0.2％的Triton-X100的PBS緩沖液透析。細(xì)胞在加入了1％驢血清包的含有0.2％的Tween-20的PBS(PBST)緩沖液中阻斷30分鐘，然后將0.5μl/孔的鼠抗-p65(滴度1∶500)抗體加入PBST中，室溫保存2小時。細(xì)胞用PBST洗滌后，用驢-抗鼠-IgG-FITC抗體(滴度1∶250)處理2小時。用共焦顯微鏡觀察NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核的過程(Lee，Y.，et.al.，(2002)Blood 99，4307-4317)。
圖8a是一張照片，顯示NF-κB用免疫染色法染色和用共焦顯微鏡觀察NF-κB轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核的過程。NF-κB存在于未經(jīng)處理的對照組或無CpG基序的對照組(無-CpG-ODN 2041)的細(xì)胞質(zhì)中。巨噬細(xì)胞用MB-ODN4/5#31和MB-ODN4/5#31.14處理時，NF-κB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。本發(fā)明的MB-ODN4/5#31和MB-ODN4/5#31.14寡核苷酸都轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，而與主鏈的型式(O-型和S-型)無關(guān)。
圖8b是電泳圖，顯示了用電泳遷移改變分析法(EMSA)分析的用MB-ODN4/5#31和MB-ODN4/5#31.14處理的RAW264.7細(xì)胞系中的NF-κB被激活的情況。將5×105個細(xì)胞/孔的RAW264.7細(xì)胞加入每一個6孔板中，并在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育24小時。每一孔用5μg/孔的MB-ODN4/5#31和MB-ODN4/5#31.14寡核苷酸處理。30分鐘后，細(xì)胞在細(xì)胞核萃取緩沖液中反應(yīng)，然后離心分離獲取核蛋白用于進(jìn)行ESMA。具有NF-κB結(jié)合位點的探針(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’)(SEQ ID NO13)用32P標(biāo)記以進(jìn)行EMSA。32P標(biāo)記的探針和20μg的核蛋白在緩沖液(10mM HEPES，pH 7.9，65mM NaCl，1mM二硫代蘇糖醇，0.2mM EDTA，0.02％NP-40，50mg/ml聚(dIdC)聚(dIdC)and8％甘油)中混合，然后在室溫下反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)溶液在含有0.5xTBE(1xTBE是89mMTris硼酸鹽和1mM EDTA，ph8.0)和2.5％的甘油的4％的。聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。將探針(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’)(SEQ ID NO13)(Santa Cruz生物技術(shù)公司，Santa Cruz，加拿大)用作NF-κB的競爭劑，并將細(xì)胞預(yù)處理50次以進(jìn)行ESMA。NF-κB抗體膠移動檢驗通過預(yù)處理的細(xì)胞和1μg的NF-κB抗體在4℃下反應(yīng)30分鐘來進(jìn)行，然后進(jìn)行EMSA。在圖8中，從EMSA看出，RAW264.7細(xì)胞中的MB-ODN4/5#31和MB-ODN4/5#31.14激活了NF-κB。通過EMSA證實了本發(fā)明的MB-ODN4/5#31和MB-ODN4/5#31.14激活了NF-κB，而與主鏈型式(O-型和S-型)無關(guān)。
<實施例5>
MB-ODN4/5#31對體液免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)<5-1>免疫將雞卵溶菌酶(HEL，50mg/頭)和MB-ODN4/5#31(100mg/頭)的混合物對4周齡的Balb/c小鼠腹腔給藥。一周后，將HEL和MB-ODN4/5#31的混合物以相同的劑量再次對其給藥。一周后，用心臟穿刺的方法抽取血液，離心使紅細(xì)胞沉淀以獲得血清。用ELISA實驗檢測所得到的血清中抗-HEL抗體(所有的IgG，IgG1，IgG2a)的滴度。
<5-2>ELISA實驗將所得到的血清用按1∶10用PBS/0.2％疊氮鈉稀釋，并-20℃下儲存。將HEL(10μg/ml碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6)加入到96孔酶標(biāo)板中(Nunc)，并在4℃保存16小時以固定酶標(biāo)板的底部的HEL。酶標(biāo)板用PBST(PBS/0.05％Tween-20)洗滌，并加入1％牛血清蛋白(BSA)以阻斷細(xì)胞，并在室溫保存1小時。血清連續(xù)用PBS以1∶3的比例稀釋，順序加入酶標(biāo)板中，4℃保存16小時，再用PBST洗滌。堿性磷酸酶偶聯(lián)探測抗體和PBST混合后加入酶標(biāo)板中，并在室溫下保存2小時。將1∶2000的山羊抗鼠Ig(H+L)(南方生物技術(shù)協(xié)會)抗體用于檢測Ig的總量。加入1-StepTM ABTS(PIERCE)用于固定顏色，用多功能酶標(biāo)儀(Labsystems)測量450nm處的吸收(Chu，R.S.，et.al.，(1997)J.Exp.Med.186，1623-1631)。
將MB-ODN4/5#31和雞蛋溶菌酶(HEL)共同給Balb/c小鼠腹腔用藥以檢測體液免疫反應(yīng)。證實MB-ODN4/5#31片段在體液免疫反應(yīng)方面具有輔助作用，因為同單獨使用HEL給藥的小鼠相比，HEL和MB-ODN4/5#31共同給藥的小鼠體內(nèi)抗體水平有較高的增加(圖9)。Frenund輔劑是用石蠟油和分歧桿菌提取物的混合物制成的試劑，作為一種典型的輔劑已應(yīng)用了60余年，但是這種輔劑具有不能顯示細(xì)胞介導(dǎo)的免疫刺激作用的問題，并且不能用于人類。發(fā)現(xiàn)MB-ODN4/5#31可能會用作一種新型輔劑，因為其作為輔劑不僅可以刺激體液免疫反應(yīng)，而且還可以刺激免疫細(xì)胞從而誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。還顯示MB-ODN4/5#31可以有效地用于產(chǎn)生Th1免疫反應(yīng)的特異的IgG2a抗體。
<實施例6>
MB-ODN4/5#31誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子<6-1>樹突狀細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)a)樹突狀細(xì)胞的分離和用MB-ODN4/5#31對它的處理祖細(xì)胞是從4周齡的Balb/c小鼠的大腿骨髓中分離出來的。使分離后的祖細(xì)胞與RBC裂解液(150mMNH4Cl，10mM的碳酸鉀，0.1mM的EDTA，pH7.4)反應(yīng)，然后將其收集。將細(xì)胞以2×106個細(xì)胞/孔的密度分到在6孔板(Nunc)中。向含有10％PBS的RPMI培養(yǎng)基中分別加入密度為10ng/ml的IL-4和GM-CSF(BioSonrce)，將所得到的混合物加入每個孔中以使骨髓祖代細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞(Ghosh，M.，J Immunol.1705625-5629，2003)。細(xì)胞在37℃、5％CO2的培育箱中孵育6天，同時每兩天用新鮮的培養(yǎng)基更換使用過的培養(yǎng)基。然后細(xì)胞用本發(fā)明的O型MB-ODN4/5#31，CpG-ODN1826和無-CpG-ODN2041以10μg/ml的量進(jìn)行處理。
b)樹突狀細(xì)胞中IL-12的表達(dá)經(jīng)本發(fā)明的O-型MB-ODN4/5#31處理過的樹突狀細(xì)胞中的IL-12表達(dá)水平用RT-PCR實驗進(jìn)行檢測。
首先，在實施例<6-1a>中從Balb/c小鼠中分離出來的樹突狀細(xì)胞在一定時間(0，0.5，1，2，4和8小時)用O型MB-ODN4/5#31處理。對照組分別用O-型CpG-ODN1826和無-CpG-ODN 2041處理。
接下來，樹突狀細(xì)胞的全部RNA用TRIzol試劑(Invitrogen)分離出來。然后，全部的RNA(5μg)用M-MLV逆轉(zhuǎn)酶(Invitrogen)處理以構(gòu)建cDNA。將所得到的cDNA作為模板，用下列特異的引物進(jìn)行PCR。

PCR擴(kuò)增通過在95℃、使DNA變性重復(fù)25個循環(huán)，時間為30秒得以實現(xiàn)，引物在57℃下退火40秒，然后在72℃下延伸1分鐘。PCR擴(kuò)增完成后，在1％的瓊脂糖凝膠中鑒定所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。結(jié)果表明，僅本發(fā)明的O-型MB-ODN4/5#31誘導(dǎo)了IL-12的表達(dá)(圖10)。與此同時，與S型1826CpG-ODN高度誘導(dǎo)IL-12表達(dá)的報告(Lee，KW.等人，Mol.Immunol.41955-964，2004)相反，S型1826CpG-ODN未能誘導(dǎo)IL-12的表達(dá)。
<6-2>MB-ODN4/5#31處理后小鼠中IL-12的表達(dá)免疫后，進(jìn)行ELISA實驗以檢驗用本發(fā)明MB-ODN4/5#31處理后小鼠體內(nèi)IL-12p40的表達(dá)水平。
a)免疫對4周齡的Balb/c小鼠分別用O型和S型的MB-ODN4/5#31和無-CpG-ODN2041(以100μg/鼠)腹腔給藥。24小時后采用心臟穿刺的方法提取血液，離心使血細(xì)胞沉淀以獲得血清。
b)EILSA檢驗首先，如實施例<5-2>中所述，進(jìn)行EILSA實驗以檢測用MB-ODN4/5#31免疫過的Balb/c小鼠中分離出來的血清中的抗-IL-12p40和抗-IL-4抗體的滴度。
對Balb/c小鼠用MB-ODN4/5#31腹腔給藥，以比較IL-12p40和IL-4的產(chǎn)生水平。結(jié)果表明，本發(fā)明的MB-ODN4/5#31誘導(dǎo)IL-12p40的產(chǎn)生，但不影響IL-4的產(chǎn)生水平，見圖11a。以及，S型的MB-ODN4/5#31使IL-12p40的產(chǎn)生水平增加到一個更高的水平。由此可見，本發(fā)明的MB-ODN4/5#31通過誘導(dǎo)IL-12p40的產(chǎn)生具有改善Th1免疫反應(yīng)的作用。
<6-3>MB-ODN4/5#31在小鼠脾臟免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)IL-12的表達(dá)從小鼠脾臟中提取免疫細(xì)胞，并以5×105細(xì)胞/孔的密度分配到孔板的每個孔中。然后，每個孔用O型或S型的MB-ODN4/5#31及無-CpG-ODN2041(0或10μg/ml)處理，并孵育24個小時。孵育完成后，對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行分離。為檢測細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞因子的水平，如實施例<5-2>所述，使用每一種商購的抗-IL-12P40和IL4抗體(R&Dsystem，Minneapolis，Minn.)進(jìn)行夾心酶聯(lián)免疫吸附測試法(sandwich ELISA)實驗。
結(jié)果表明，如圖11b所示，本發(fā)明的MB-ODN4/5#31，不管其主鏈型式如何，都高度增加脾臟免疫細(xì)胞中的IL-12p40的表達(dá)水平。并且，本發(fā)明的MB-ODN4/5#31不影響IL-4的表達(dá)水平。特別地，誘導(dǎo)Th1/Th2免疫反應(yīng)中的Th1免疫反應(yīng)的代表性細(xì)胞因子IL-12被本發(fā)明的MB-ODN4/5#31所誘導(dǎo)，因此證明了本發(fā)明的MB-ODN4/5#31可以誘導(dǎo)Th1免疫反應(yīng)。
<實施例7>
體內(nèi)分析檢驗治療過敏性皮炎的能力<7-1>本發(fā)明含有MB-ODN4/5#31的軟膏的應(yīng)用將六只NC/Nga小鼠分成兩組，MB-ODN4/5#31處理組和未處理組。將含有所制備的MB-ODN4/5#31的軟膏(0.2mg/頭)施用到處理組小鼠背部患有過敏性皮炎的5個損傷部位上，用藥兩周(共4次)。未處理組小鼠用不含本發(fā)明CpG-ODN的凡士林以上述同樣方式用藥。
<7-2>損傷部位的觀察在施用了包含本發(fā)明的MB-ODN4/5#31的軟膏后，肉眼觀察過敏性皮炎的患處5-7天。結(jié)果表明，同未處理組小鼠相比，應(yīng)用了O型的MB-ODN4/5#31的小鼠背部皮膚的患處消失，如圖12b所示。并且，取自小鼠背部的皮膚用H&E染色技術(shù)檢驗MB-ODN4/5#31對過敏性皮炎的治療效力。結(jié)果證實，施用了本發(fā)明的MB-ODN4/5#31的小鼠患處的表皮過度角化癥和棘皮癥明顯減少，并且在真皮中淋巴細(xì)胞的浸潤也減少，這顯示了小鼠患處的過敏性皮炎得到了治療。
<7-3>組織學(xué)分析a)細(xì)胞因子的表達(dá)在施用含有本發(fā)明的MB-ODN4/5#31軟膏后的5、7和14天，取下三塊面積為1.5×1.5cm2的皮。然后，將取下的皮在4％的福爾馬林溶液中固定至少一天。固定后的皮膚組織用石蠟處理并以5μm的厚度切片。石蠟去除后，按照KASB+Kit(DAKO，Denmark)手冊的方法進(jìn)行如下實驗。所得到的皮膚組織用3％的H2O2處理10分鐘。然后加入用TBS(Tris-緩沖的生理鹽水，Ph7.4)稀釋的10％的普通山羊血清使皮膚組織阻斷，其中TBS中包含0.1％的BSA。然后皮膚組織用山羊抗鼠IL-10抗體、山羊抗鼠-IL-4抗體(Santa Cruz，USA)和鼠抗鼠-INF抗體(Pierce，USA)之類的初級抗體進(jìn)行處理，并在4℃下反應(yīng)至少12小時。而后，皮膚組織與有生物素標(biāo)記的二級抗體在室溫下反應(yīng)至少30分鐘后，向其中加入過氧化酶標(biāo)記的鏈霉親和素并在室溫下反應(yīng)大約30分鐘。最后用DAB底物顯色系統(tǒng)(DAKO，Denmark)使皮膚組織染色，然后用顯微鏡觀察染色后的皮膚組織。
結(jié)果表明，IL-4的表達(dá)減少，但是在施用了含有本發(fā)明的MB-ODN4/5#31的軟膏后5天所取下來的小鼠表皮內(nèi)INF-gamma表達(dá)增強(qiáng)，如圖13所示。由此可見，本發(fā)明的O型MB-ODN4/5#31抑制了由Th2表型T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的IL-4細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其中Th2表型T淋巴細(xì)胞在過敏性皮炎中特別地多。而本發(fā)明的O型MB-ODN4/5#31通過增加由Th1表型T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的IFN-gamma細(xì)胞因子的產(chǎn)生而改善和治療過敏性皮炎的癥狀。
b)CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目的測定在施用含有本發(fā)明的O-型MB-ODN4/5#31軟膏后的5、7和14天，取下三塊面積為1.5×1.5cm2的皮。將所得到的皮膚組織用液氮冷凍。然后用Tissue-TekOCT(SakuraFinetek USA，INC)復(fù)合物將皮膚組織插入樣本阻斷劑中，并使用恒冷箱切片機(jī)以5μm的厚度切片。皮膚組織切片與如鼠抗-鼠CD4mAb(BD phamingen，USA)或鼠抗-鼠CD8mAb(Serotec，UK)之類的一級抗體在4℃下反應(yīng)12小時。然后，使得到的皮膚組織與有生物素標(biāo)記的二級抗體在室溫下反應(yīng)至少30分鐘后，向其中加入過氧化酶標(biāo)記的鏈霉親和素并在室溫下反應(yīng)30分鐘左右。用DAB底物顯色系統(tǒng)(DAKO，Denmark)使皮膚組織染色，然后用顯微鏡觀察染色后的皮膚組織。在放大100倍的情況下拍攝照片。
結(jié)果顯示，應(yīng)用了本發(fā)明的O型MB-ODN4/5#31的小鼠皮膚中的CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞減少，見圖14。這說明正是過敏性皮炎患處的CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞的減少使本發(fā)明的MB-ODN4/5#31非常有效地治療過敏性皮炎(Christian V.，等人，J Clin Invest.1041097-1105，1999)。
<7-4>血清中的IgE水平分析從每組小鼠中提取血漿，使用前一直在保存-20℃溫度下?？偟腎gE水平采用鼠IgE BD OptEIA試劑盒(BD phamingen，USA)進(jìn)行測定。為檢測血漿中的IgE抗體(BDphamingen，USA)水平，如實施例<5-2>中所述，采用商購的生物素標(biāo)記的IgE抗體(BDphamingen，USA)進(jìn)行夾心酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)實驗。
結(jié)果表明，應(yīng)用了含有本發(fā)明的MB-ODN4/5#31軟膏的小鼠血清中的IgE水平顯著減少，如圖15所示。
從上述結(jié)果看出本發(fā)明的O型MB-ODN4/5#31增加了由Th1淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)，同時通過抑制由Th2淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)減少血清中IgE水平而具有很好的治療過敏性皮炎的效果。
<實施例8>
MB-4/5#31對放射治療后免疫細(xì)胞存活率的影響<8-1>MB-ODN4/5#31處理后的Bcl-xs/L表達(dá)將1×104細(xì)胞/孔的RAW264.7細(xì)胞分布在6孔板上并在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育24小時。每個細(xì)胞用密度為10μg/孔的合成的寡核苷酸處理，并在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育5小時。加入100μl/孔的裂解緩沖液使RAW264.7細(xì)胞均質(zhì)化。將細(xì)胞溶解物離心得到上清夜(15μl)用于進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。將所得到的上清液用山羊抗-鼠-Bcl-xs/L抗體處理，并與過氧化物酶標(biāo)記的二級抗體反應(yīng)，然后用增強(qiáng)化學(xué)螢光試劑(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ，USA)觀察Bcl-xs/L。
結(jié)果表明，本發(fā)明的MB-ODN4/5#31通過刺激RAW264.7細(xì)胞中的Bcl-xs/L的表達(dá)具有增加細(xì)胞存活率的功能。
<8-2>用MB-ODN4/5#31處理后巨噬細(xì)胞的存活率提高的觀察將3×104/孔的RAW264.7細(xì)胞分布在4孔腔室載玻片中(Lab-TEK Chamber slid，Nalge Nunc international，Inc)并在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育24小時。每一個細(xì)胞用10μg/孔的合成寡核苷酸處理6小時并用γ-射線器以10Gy輻射，然后在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育48小時。將3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四氮唑(MTT)溶液(5x，2μg/ml)直接加入被孵育的RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)基中(最終的濃度是0.4μg/ml)，并在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中反應(yīng)4小時。當(dāng)每孔中培養(yǎng)基完全移除后，加入0.5ml的DMSO后在37°下反應(yīng)10分鐘以使所得到的formazan結(jié)晶溶解。得到100μg的反應(yīng)溶液并用于測定其在570nm處的吸收。
結(jié)果表明用本發(fā)明的MB-ODN4/5#31對RAW264.7細(xì)胞的處理，可以防止其被輻射殺死，如圖17所示。就主鏈的型式而言，O型MB-ODN4/5#31具有更高的活性。
<8-3>用MB-ODN4/5#31處理后B細(xì)胞存活率提高的觀察將1×105細(xì)胞/孔的RPMI8226細(xì)胞分布在6孔板上，并用密度為10μg/孔的合成寡核苷酸處理6小時，用γ-射線器以10Gy輻射，然后在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育48小時。將50μg/mg的碘化丙啶(PI)加入到孵育后的細(xì)胞中，在冰浴上反應(yīng)10分鐘，然后用流式細(xì)胞分析法測定用碘化丙啶染色后的細(xì)胞水平。
另外，孵育后的細(xì)胞用冷的PBS洗滌兩次，并加入5μl的Annexin V-PE，然后室溫下反應(yīng)15分鐘。將0.4ml的Annexin V粘結(jié)緩沖液加入其中使用采用流式細(xì)胞分析儀測定與Annexin V結(jié)合的細(xì)胞水平。
結(jié)果表明，本發(fā)明的MB-ODN4/5#31對RPMT8226細(xì)胞的處理可以防止其被輻射殺死，如圖18、19所示。
綜合以上的結(jié)果，可以確認(rèn)，用放射療法治療癌癥之類的疑難疾病時，本發(fā)明的MB-ODN4/5#31通過提高正常免疫細(xì)胞的存活率，具有極好的使免疫功能正?；男Ч?br> 工業(yè)應(yīng)用性如上所述可見，本發(fā)明從牛分枝桿菌卡介苗中得到的寡核苷酸片段通過作為形成HEL抗體的輔劑參與到體液免疫反應(yīng)中，并且通過激活巨噬細(xì)胞的IL-8和IL-12啟動子的級聯(lián)激活反應(yīng)中的IL-8啟動子參與到先天免疫細(xì)胞的激活反應(yīng)中。還證實了由于可以作為輔劑刺激體液免疫反應(yīng)，也可以刺激免疫細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，因此本發(fā)明的寡核苷酸可以用作為一種新的輔劑。并且揭示出本發(fā)明的MB-ODN提高了作為過敏性皮炎的動物模型的NC/Nga小鼠體內(nèi)的由Th1淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子的表達(dá)，同時，通過抑制由Th2淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子的表達(dá)以降低血清中IgE的水平而有極好的治療過敏性皮炎的效果。
此外，證實了在用放射療法治療癌癥之類的疑難疾病時，通過提高正常免疫細(xì)胞的存活率，本發(fā)明的MB-4/5#31有著極好的使免疫細(xì)胞功能正?；男Ч?。
權(quán)利要求
1.用于刺激輔劑或治療免疫相關(guān)疾病的寡脫氧核苷酸，其通式為[通式]HKCGTTCRTGTCSGM(SEQ ID NO1)其中，R表示A或G；S表示C或G；H表示A，T或C；K表示G或T；和M表示C或A。
2.如權(quán)利要求1所述的用于刺激輔劑或治療免疫相關(guān)疾病的寡脫氧核苷酸，其特征在于所述的寡脫氧核苷酸還包括5個核苷酸，所述的核苷酸位于下列通式的5′末端和3′末端[通式]DKMHKCGTTCRTGTCSGMYK(SEQ ID NO2)其中，R表示A或G；S表示C或G；H表示A，T或C；K表示G或T；D表示A，G，或T；M表示C或A；M表示C或A；以及Y表示C或T。
3.如權(quán)利要求1或2所述的寡脫氧核苷酸，其特征在于，所述的寡脫氧核苷酸保護(hù)放射療法時的正常免疫細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1或2所述的寡脫氧核苷酸，其特征在于，所述的寡脫氧核苷酸治療和預(yù)防皮膚疾病。
5.如權(quán)利要求1或2所述的寡脫氧核苷酸，其特征在于，所述的寡脫氧核苷酸維持各種Th1/Th2免疫反應(yīng)的平衡。
6.如權(quán)利要求1或2所述的寡脫氧核苷酸，其特征在于，所述的寡脫氧核苷酸在核苷酸之間具有磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵。
7.如權(quán)利要求1或2所述的寡脫氧核苷酸，其特征在于，所述的寡脫氧核苷酸是從包括下列的組中選出的，5’-AGCAGCGTTCGTGTCGGCCT-3’(SEQ ID NO3)，5’-AGCAGCGTTCGTGTGCGCCT-3’(SEQ ID NO4)，5’-AGCAGCGTTCATGTCGGCCT-3’(SEQ ID NO5)，5’-AGCAGCGTTCGTGTCCGCCT-3’(SEQ ID NO6)，5’-GTATTCGTTCGTGTCGTCCT-3’(SEQ ID NO7)和5’-TGACTCGTTCGTGTCGCATG-3’(SEQ ID NO8).
全文摘要
本發(fā)明公開了用于操縱免疫反應(yīng)的寡核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸可用于刺激免疫功能，治療免疫相關(guān)性疾病和過敏性皮炎，以及保護(hù)正常的免疫細(xì)胞。
文檔編號C07H21/00GK1926145SQ200580006447
公開日2007年3月7日 申請日期2005年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月28日
發(fā)明者權(quán)瀅周, 金泰潤, 金斗植 申請人:權(quán)瀅周, 金泰潤