專利名稱：新型可局部施用的抗表情皺紋和與年齡相關(guān)的皺紋的活性物質(zhì)的制作方法
皺紋主要由肌肉強(qiáng)烈收縮或由肌肉很長(zhǎng)時(shí)間保持在強(qiáng)烈收縮位置而引起。
現(xiàn)今，為了治療這種表情皺紋(mimische Falten)和與年齡相關(guān)的皺紋，通常采用Botox(肉毒桿菌毒素A)。將Botox注射入肌肉中從而使肌肉麻痹。由此，位于眼或額頭的肌肉不能再活動(dòng)，使得不可能出現(xiàn)額頭皺紋。然而，使用皮下注射的Botox的治療必須由醫(yī)生來實(shí)施，與之相關(guān)的高費(fèi)用及其非常高的毒性構(gòu)成了Botox的相當(dāng)大的不利之處。它的作用持續(xù)3-6個(gè)月，之后必須重復(fù)該治療。
Botox的作用機(jī)制在于選擇性地阻斷乙酰膽堿在神經(jīng)肌肉突觸處的釋放，由此出現(xiàn)肌肉麻痹。這通過一種被稱為SNAP-25的蛋白質(zhì)的裂解而實(shí)現(xiàn)。
SNAP-25的N-末端氨基酸序列(H-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2)也抑制在突觸中Ca++依賴性神經(jīng)遞質(zhì)釋放，并導(dǎo)致肌肉松弛(EP1 180524)。由此開發(fā)的、可局部施用的化合物Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2(“產(chǎn)品A”)比Botox的作用弱5000倍，從而能更好地按劑量給藥并且?guī)缀鯚o毒性。然而，它的松弛肌肉的作用太弱且太不恒定，以至于不能達(dá)到滿意的減少皺紋的效果。另一缺點(diǎn)是其不足的蛋白水解穩(wěn)定性。
除了由Botox抑制神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放之外，還存在兩種其他類型的在神經(jīng)肌肉突觸處的乙酰膽堿活性的抑制劑乙酰膽堿受體的抑制劑(例如抗組胺劑，阿托品)和乙酰膽堿酯酶的抑制劑(例如殺蟲的磷酸酯)。
本發(fā)明目的是尋找松弛肌肉的化合物，其可用作抗表情皺紋和與年齡相關(guān)的皺紋的活性物質(zhì)，所述化合物的作用基于抑制乙酰膽堿受體，并且該化合物不具有Botox和產(chǎn)品A的缺點(diǎn)。
令人驚訝的是，現(xiàn)在成功地提供了用于治療表情皺紋和與年齡相關(guān)的皺紋的新型三肽、三肽型化合物及其衍生物(在下文中稱為“本發(fā)明化合物”)以及可局部施用的組合物，它們迅速地并且以足夠的濃度到達(dá)其作用位點(diǎn)(神經(jīng)肌肉突觸)，阻斷神經(jīng)肌肉突觸，并從而引起肌肉松弛效果。
在此顯示出，相對(duì)于產(chǎn)品A，本發(fā)明化合物在松弛肌肉的活性方面具有明顯更好的作用特性譜以及具有更高的蛋白水解穩(wěn)定性。由于它們相對(duì)低的分子量和合適的水/正辛醇分配系數(shù)logP，因而它們可以局部施用。
本發(fā)明涉及作為外消旋物或以其對(duì)映體純的形式的通式(I)的三肽、三肽型化合物及其衍生物，以及它們的鹽 其中X表示鍵或NH-CH(C＝O)-(CH2)3+n-NH-R5，n表示0、1或2，R1、R4和R5彼此獨(dú)立地表示氫、任選經(jīng)取代的C1-C6-烷基、脒基或四-C1-C6-烷基脒，R2表示氫或任選經(jīng)取代的C1-C6-烷基，或者R1和R2與它們所結(jié)合的殘基一起表示5-至7-元的飽和環(huán)，R3表示C1-C12-烷氧基、C1-C12-烷基氨基、任選經(jīng)取代的芳基-C1-C6-烷基氨基、任選經(jīng)取代的雜芳基-C1-C6-烷基氨基、任選經(jīng)取代的芳基-C1-C6-烷氧基或任選經(jīng)取代的雜芳基-C1-C6-烷氧基，并且
R6表示氫，或者當(dāng)n是1時(shí)，也表示氨基，或者與R1以及R6和R1所結(jié)合的殘基一起表示5-至7-元的飽和環(huán)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及前面定義的化合物和鹽作為可局部施用的活性物質(zhì)或用于制備可局部施用的制劑的用途，以及涉及含有至少一種前面定義的化合物或其鹽的可局部施用的制劑。
上面使用的通用術(shù)語如下定義“烷基”自身作為基團(tuán)和作為含烷基的基團(tuán)的結(jié)構(gòu)元件，表示線性以及支化的、飽和的烴殘基。實(shí)例為不支化的甲基、乙基、丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、正十六烷基、正十七烷基、正十八烷基和正十九烷基，以及支化的異丙基、叔丁基、異丁基、仲丁基和異戊基。
“芳基”表示芳族的烴殘基，例如苯基和萘基，優(yōu)選為苯基。
“雜芳基”指由一個(gè)或兩個(gè)環(huán)組成的5-至11-元芳族環(huán)體系，其中1至3個(gè)成員是選自氧、硫和氮的雜原子；1至2個(gè)苯環(huán)可以縮合在雜環(huán)上。實(shí)例為吡啶基、嘧啶基、噠嗪基、吡嗪基、1，3，5-三嗪基、喹啉基、異喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、酞嗪基、吡咯基、吡唑啉基、咪唑啉基、1，2，4-三唑啉基、四唑啉基、呋喃基、噻吩基、唑啉基、噻唑啉基、異噻唑啉基、苯并唑基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基和苯并噻唑基，其中連接可以發(fā)生在雜環(huán)部分(Heteroteil)或苯環(huán)部分(Benzoteil)，并且在π-過剩雜芳族化合物的情況下發(fā)生在氮或任何碳上。
由R1和R2或者R1和R6與它們所結(jié)合的殘基一起可以形成的5-至7-元飽和環(huán)的實(shí)例為吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、氮雜?；?、唑烷基、噻唑烷基和1，2，3，4-四氫喹啉基。
任選經(jīng)取代的烷基殘基和含有這些殘基的基團(tuán)的取代基是，例如鹵素、氨基、胍基、羥基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、羧基、氨基甲?；?、任選經(jīng)取代的苯基、任選經(jīng)取代的芐基、咪唑基甲基、吲哚基甲基和氰基。
任選經(jīng)取代的芳基和雜芳基基團(tuán)的取代基是例如鹵素、C1-C6-烷基、羥基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷氧基羰基、CN、氨基、C1-C6-烷基氨基、二-C1-C6-烷基氨基、氨基羰基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-C1-C6-烷基氨基羰基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基硫?；?、C1-C6-烷基磺?；⑷芜x經(jīng)取代的芐基、任選經(jīng)取代的苯基、任選經(jīng)取代的苯氧基或任選經(jīng)取代的苯基羰基，其中上述芳族環(huán)可以由1至3個(gè)相同或不同的選自鹵素、氰基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、羥基、氨基、C1-C6-烷基氨基、二-C1-C6-烷基氨基和C1-C6-烷氧基羰基的取代基取代。
“鹵素”指氟、氯、溴和碘，優(yōu)選氟和氯。
在式I中，R1優(yōu)選表示氫，R2優(yōu)選表示氫或甲基，R3優(yōu)選表示芳基-C1-C6-烷基氨基并且n優(yōu)選表示0或1。特別優(yōu)選的是這樣的式I化合物，其中R1表示氫，R2表示氫或甲基，R3表示芳基-C1-C6-烷基氨基并且n表示0或1。
特別優(yōu)選的本發(fā)明化合物是-H-Ala-Pro-Arg-Arg-NH-芐基；-H-(β-Ala)-Pro-Dab-NH-芐基；-H-Dap-Pro-Arg-NH-芐基；-H-Ala-Pro-Arg-NH-(CH2)2-苯基；-H-(β-Ala)-Pro-Gab-NH-芐基；-N-[雙(二甲基氨基)亞甲基]-Ala-Pro-Arg-NH-芐基；以及這些化合物的酸加成鹽。
在下面表1-3中的單個(gè)化合物舉例說明了本發(fā)明。
表1式(I)化合物，其中X表示鍵
表2式(I)化合物，其中R6如果存在的話表示氫
表3式(I)化合物，其中n表示1
式(I)化合物可以與酸形成單價(jià)或多價(jià)的、均質(zhì)或混合的鹽，例如與無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸或磷酸；或者與合適的羧酸，例如脂族的一元或二元羧酸如甲酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、富馬酸、丙二酸、馬來酸、草酸、鄰苯二甲酸、檸檬酸、乳酸或酒石酸；或者與芳族羧酸如苯甲酸或水楊酸；或者與芳族-脂族羧酸如扁桃酸或肉桂酸；或者與雜芳族羧酸如煙酸；或者與脂族或芳族磺酸如甲磺酸或甲苯磺酸。優(yōu)選的為皮膚病學(xué)適合的鹽。特別優(yōu)選的為與乙酸和/或三氟乙酸和/或乳酸形成的鹽。
通式(I)化合物及其鹽可以以光學(xué)純的異構(gòu)體形式或者以不同異構(gòu)體的混合物形式(例如作為外消旋物)和/或以旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的混合物形式存在。
根據(jù)本發(fā)明，通式I化合物及其鹽可以如下制備通過使用在肽化學(xué)領(lǐng)域中本身已知的方法來完整地形成式(I)的化合物，任選裂解剩余的保護(hù)基團(tuán)，任選使游離的氨基進(jìn)行烷基化或?qū)⑵滢D(zhuǎn)變成胍基官能團(tuán)和/或使游離的羧基酯化或酰胺化和/或?qū)⒌玫降膲A性化合物轉(zhuǎn)化成酸加成鹽和/或?qū)@得的酸加成鹽轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的共軛堿或轉(zhuǎn)化成另一種鹽。
本發(fā)明的式I化合物及其鹽可以根據(jù)一般常用方法加工成可局部施用的制劑。在此，通式I化合物及其鹽在可局部施用的終產(chǎn)物中可以以0.5-5,000ppm(w/w)，優(yōu)選1-1000ppm(w/w)的濃度使用，所述濃度按本發(fā)明化合物或其鹽和載體材料的重量計(jì)算。
本發(fā)明的式I化合物及其鹽的使用形式為溶液、混懸液、乳狀液，或者包囊在載體如大膠囊、微膠囊或納米膠囊中，包囊在脂質(zhì)體或乳糜微粒中，或者包封于大顆粒、微顆?；蚣{米顆粒中或包封于微海綿體(Mikroschwmme)中，或者吸收在粉末狀的有機(jī)聚合物、滑石、膨潤(rùn)土和/或其他礦物載體上。
本發(fā)明的式I化合物及其鹽可以以任何適合于可局部施用的制劑的形式使用，例如O/W和W/O乳狀液，乳劑，洗液，軟膏劑，膠凝性的和粘稠的、表面活性的(spannungsaktive)和乳化性的聚合物，潤(rùn)發(fā)脂，香波，肥皂，凝膠，粉劑，棒狀物(Sticks)和筆，噴霧劑，身體護(hù)理油(Krperl)，敷面劑和硬膏劑。
本發(fā)明的式I化合物及其鹽可以與可局部施用的組合物的任何其他通常使用的成分一起使用，所述的其他通常使用的成分是例如提取脂質(zhì)和/或合成脂質(zhì)，膠凝性的和粘稠的、表面活性的和乳化性的聚合物，水或脂溶性活性成分，植物提取物，組織提取物，海洋提取物(Meeresextrakte)、防曬品，抗氧化劑，保濕劑和遮蔽劑(Barrieremittel)以及使皮膚回復(fù)活力的活性物質(zhì)(Hautrevitalisierende Wirkstoffe)。
本發(fā)明化合物可以與任何其他通常使用的、可局部施用的皮膚護(hù)理活性物質(zhì)一起使用。另外的皮膚護(hù)理活性物質(zhì)可以是例如抗皺紋的活性物質(zhì)/抗萎縮的活性物質(zhì)本發(fā)明的組合物可含有安全且有效量的一種或多種抗皺紋的活性物質(zhì)或抗萎縮的活性物質(zhì)。適合于在本發(fā)明組合物中使用的抗皺紋/抗萎縮的活性物質(zhì)的例子包括含硫的D-和L-氨基酸及其衍生物和鹽，特別是N-乙酰基衍生物，其中優(yōu)選的實(shí)例是N-乙?；?L-半胱氨酸；硫醇例如乙硫醇；羥酸、肌醇六磷酸、脂酮酸、溶血磷脂酸(Lysophosphatidinsure)；換膚劑(Haut-Peelingmittel)(例如苯酚等)；維生素B3-化合物和類視黃醇，其提高本發(fā)明的式I化合物及其鹽在去皺方面的優(yōu)點(diǎn)。
在下文中將更詳細(xì)地討論三類這樣的通常使用的、可局部施用的皮膚護(hù)理物質(zhì)，即維生素B3-化合物、類視黃醇和羥酸。
a)維生素B3-化合物本發(fā)明的組合物可包含安全及有效量的維生素B3-化合物。維生素B3-化合物特別可用于調(diào)控皮膚狀態(tài)，如WO 97/39733 A1(公開于1997年10月30日)中所描述的。所述的維生素B3-化合物的衍生物的實(shí)例包括煙酸酯類，包括煙酸的非血管擴(kuò)張性酯(例如煙酸生育酚酯)、煙酰氨基酸、羧酸的煙醇酯、煙酸-N-氧化物和煙酰胺-N-氧化物。
b)類視黃醇本發(fā)明的組合物還可以含有類視黃醇。在此所使用的“類視黃醇”包括所有天然的和/或合成的維生素A類似物或在皮膚中具有維生素A的生物效用的視黃醇型化合物，以及這些化合物的幾何異構(gòu)體和立體異構(gòu)體。類視黃醇優(yōu)選為視黃醇、視黃醇酯(例如視黃醇的C2-至C22-烷基酯，包括棕櫚酸視黃醇酯、乙酸視黃醇酯和丙酸視黃醇酯)、視黃醛和/或視黃酸(包括全反式視黃酸和/或13-順-視黃酸)，特別是與視黃酸不同的類視黃醇。其他合適的類視黃醇是視黃酸生育酚酯[視黃酸(反式或順式)的生育酚酯]、Adaptalen{6-[3-(1-金剛烷基)-4-甲氧基苯基]-2-萘甲酸}和Tazaroten(乙基-6-[2-(4，4-二甲硫基色滿-6-基)-乙炔基]煙酸酯)。優(yōu)選的類視黃醇是視黃醇、棕櫚酸視黃醇酯、乙酸視黃醇酯、丙酸視黃醇酯、視黃醛及其組合。本發(fā)明的組合物可以含有安全且有效量的類視黃醇，從而得到的組合物可安全且有效地用于調(diào)節(jié)角質(zhì)組織的狀態(tài)，優(yōu)選用于調(diào)節(jié)可見的和/或可感覺的皮膚不連續(xù)性，特別是用于調(diào)節(jié)皮膚老化的征候，十分特別用于調(diào)節(jié)與皮膚老化相關(guān)的可見的和/或可感覺的皮膚表面性質(zhì)的不連續(xù)性。
(c)羥酸本發(fā)明的組合物可以含有安全且有效量的羥酸。用于本發(fā)明組合物中的優(yōu)選的羥酸包括α-羥酸，例如乳酸和乙醇酸，或者β-羥酸，例如水楊酸和水楊酸衍生物如它的辛?；苌铩?br> 此外，可以以安全且有效的量向本發(fā)明的組合物中加入另外的肽(包括但不限于二、三、四、五和六肽及其衍生物)。在這里，“肽”涉及天然存在的肽以及合成肽，并且還包括擬肽(Peptidomimetika)和“肽”的金屬絡(luò)合物。在此也可以使用含有肽的天然存在和可商業(yè)獲得的組合物。
對(duì)于用于本發(fā)明的制劑來說，合適的二肽包括肌肽(β-Ala-His)，以及合適的三肽包括Gly-His-Lys、Arg-Lys-Arg和His-Gly-Gly。優(yōu)選的三肽及其衍生物包括可作為Biopeptide CLTM(100ppm的棕櫚酰-Gys-His-Lys，可從法國(guó)的Sederma公司商購(gòu)獲得)獲得的棕櫚酰-Gly-His-Lys、肽CK(Arg-Lys-Arg)、肽CK+(Ac-Arg-Lys-Arg-NH2)以及可作為L(zhǎng)amin從Sigma(St.Louis，Mo.，USA)商購(gòu)獲得的Gly-His-Lys或His-Gly-Gly的銅絡(luò)合物。適合用于本發(fā)明制劑的四肽包括肽E、Arg-Ser-Arg-Lys。五肽的實(shí)例是Matrixyl(棕櫚酰-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser)，可從法國(guó)的Sederma公司獲得，以及在WO03/037933中描述的那些。適合用于本發(fā)明組合物的六肽是Argireline(Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2)，由西班牙的Lipotec公司生產(chǎn)。
將本發(fā)明化合物以及含有本發(fā)明化合物的可局部施用的組合物添加入皮膚護(hù)理產(chǎn)品中，特別用于治療表情皺紋和與年齡相關(guān)的皺紋。
下面的實(shí)施例將解釋本發(fā)明而不限制它的范圍。使用的縮寫是NMR 核磁共振MS 質(zhì)譜法Fmoc9-芴基甲氧基羰基Boc 叔丁氧基羰基Z 芐氧基羰基Dab 2，4-二氨基丁酸Dap 2，3-二氨基丙酸Gab 2-氨基-4-胍基-丁酸Pro 脯氨酸[(-)-吡咯烷-2-羧酸]β-Ala β-丙氨酸(3-氨基丙酸)EtOAc 乙酸乙酯DCM 二氯甲烷DMF 二甲基甲酰胺TBTUO-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲-四氟硼酸鹽DIPEA 二異丙基乙胺NMM N-甲基嗎啉HOBt1-羥基苯并三唑DCC N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺TFA 三氟乙酸GF/A玻璃纖維微過濾器ACN 乙腈RT 室溫HPLC高壓液相色譜THF 氫呋喃MEM 最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基M199培養(yǎng)基199(TECOmedical AG)
Bzl 芐基實(shí)施例1本發(fā)明化合物的制備在下面的實(shí)施方案1.1中描述了本發(fā)明的式(I)化合物的代表和這些化合物的鹽的制備。對(duì)根據(jù)實(shí)施例獲得的洗脫物和產(chǎn)物所進(jìn)行的分析是用質(zhì)子-NMR光譜、HPLC-電噴射MS或借助于元素分析來實(shí)施的。所述化合物可以根據(jù)在下文中描述的已知方法(M Bodanszky一般用法“The Practie of Peptide Synthesis”，Springer出版社，第二版，1994)來制備。相應(yīng)地，衍生化在羧基末端的P1-氨基酸，除去α-氨基保護(hù)基團(tuán)(例如Boc基團(tuán))，并使用肽合成中的常規(guī)試劑逐步地形成肽，直至獲得完整的所期望的序列。隨后裂解側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)(例如Z或Boc官能團(tuán))。
1.1化合物No.4.5(見下面的表4)1.1.1Boc-Dab(Z)-NHBzl將1.4g的Boc-Dab(Z)-OH溶解于10ml的ACN和5ml的DMF中，加入1.35g的TBTU和1.43ml的DIPEA，隨后加入0.88ml的芐胺，并在RT下攪拌1小時(shí)。蒸發(fā)掉溶劑，將殘余物吸收在EtOAc中，并將該溶液用10％Na2CO3、10％檸檬酸和飽和NaCl溶液洗滌3次。在Na2SO4上干燥、蒸發(fā)掉溶劑并在40℃下于真空干燥箱中干燥過夜后，分離出1.8g的油狀產(chǎn)物。
1.1.2H-Dab(Z)-NHBzl×TFA將1.8g的化合物1.1.1溶解于15ml的DCM中，加入5ml的TFA，并在RT下攪拌該溶液30分鐘。蒸發(fā)掉溶劑后，將粗產(chǎn)物通過制備型HPLC進(jìn)行純化，從而分離出0.60g期望的化合物。用342的實(shí)測(cè)值證實(shí)了342的理論質(zhì)量。
1.1.3Boc-Pro-Dab(Z)-NHBzl將0.42g的Boc-Pro-OH溶解于8ml的THF和16ml的ACN中，加入0.63g的TBTU和0.66ml的DIPEA，并在RT下攪拌。3分鐘后加入由在10ml THF和2ml DMF中的0.60g化合物1.1.2和0.143mlNMM組成的溶液。在RT下攪拌1小時(shí)后，蒸發(fā)掉溶劑，并將殘余物吸收在EtOAc中，并且用10％Na2CO3溶液、10％檸檬酸和飽和NaCl溶液洗滌3次。在Na2SO4上干燥、蒸發(fā)掉溶劑并在40℃下于真空干燥箱中干燥過夜后，分離出0.8g的油狀粗產(chǎn)物。
1.1.4H-Pro-Dab(Z)-NHBzl×HCl將0.8g上述化合物1.1.3溶解于6ml在二烷中的4M HCl溶液之中，并在RT下攪拌1小時(shí)。蒸發(fā)掉溶劑后，通過制備型HPLC對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行色譜分離。在此得到0.69g期望的化合物。用439的實(shí)測(cè)值證實(shí)了439的理論質(zhì)量。
1.1.5Z-β-Ala-Pro-Dab(Z)-NHBzl將0.34g的Z-β-Ala-OH溶解于10ml的THF中，并在冰浴中冷卻至5℃，向其中加入0.17g的HOBt和0.31g的DCC。45分鐘后加入由在10ml THF和0.14ml NMM中的0.6g化合物1.1.4組成的溶液。在RT下攪拌18小時(shí)后過濾出形成的、沉淀的脲衍生物，蒸發(fā)掉溶劑，并將殘余物吸收在EtOAc中，并且用10％Na2CO3溶液、10％檸檬酸和飽和NaCl溶液洗滌3次。在Na2SO4上干燥并蒸發(fā)掉溶劑后，通過制備型HPLC對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行色譜分離。分離出0.5g無色油狀的所期望的化合物。用644的實(shí)測(cè)值證實(shí)了644的理論質(zhì)量。
1.1.6H-β-Ala-Pro-Dab-NHBzl×2TFA將0.5g化合物1.1.5溶解于20ml乙酸和1ml TFA中，并向該溶液中摻入100mg 10％鈀碳在5ml水中的懸浮液。導(dǎo)入氫氣直至飽和，在常壓下進(jìn)行氫化直至完全轉(zhuǎn)化(約12小時(shí))。通過GF/A-過濾器過濾上述懸浮液，并蒸發(fā)掉溶劑。獲得的粗產(chǎn)物通過制備型HPLC進(jìn)行純化，并且在蒸發(fā)掉溶劑后將其溶解于水中并凍干。得到了0.34g期望的化合物。用376的實(shí)測(cè)值證實(shí)了376的理論質(zhì)量。
表4中的其他化合物可以類似地制備。
表4
實(shí)施例2藥用測(cè)試2.1材料-第三次傳代中的正常的人肌細(xì)胞(成肌細(xì)胞)-具有“背根神經(jīng)節(jié)”的13天大的大鼠胚胎的脊髓外植體-培養(yǎng)基2/3MEM和1/3M199、2mM L-谷氨酰胺、50UI/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素、5％胎牛血清培養(yǎng)條件37℃，5％CO22.2測(cè)試描述為了測(cè)試本發(fā)明化合物的效用，建立了人肌細(xì)胞(一方面)和來自大鼠胚胎的脊髓的神經(jīng)元(另一方面)的共培養(yǎng)模型。
在用明膠包被的24孔平板中培養(yǎng)正常的人肌細(xì)胞(成肌細(xì)胞)直到形成單層的肌原纖維(來自融合的肌細(xì)胞)。然后，將具有背根神經(jīng)節(jié)的13天大的大鼠胚胎的脊髓外植體置于所述肌細(xì)胞單層上。共培養(yǎng)1天后，可見從外植體生長(zhǎng)出第一個(gè)神經(jīng)突與肌細(xì)胞接觸。5天后發(fā)生第一次收縮。共培養(yǎng)3周后，形成了具有完全成熟的神經(jīng)肌肉接頭(相當(dāng)于具有運(yùn)動(dòng)終板)的、充分分化的橫紋肌纖維模型(神經(jīng)和肌肉的連接)。在這一成熟階段，肌原纖維進(jìn)行規(guī)則收縮，并將該模型用于測(cè)試。
使用連接至錄像機(jī)的倒置顯微鏡觀察收縮頻率30秒，然后加入相應(yīng)濃度的待研究的化合物，其中將所述化合物預(yù)先在培養(yǎng)基中進(jìn)行稀釋。在加入上述物質(zhì)后1分鐘和2小時(shí)，再次對(duì)收縮進(jìn)行計(jì)數(shù)30秒。在48小時(shí)的培養(yǎng)期和目視控制共培養(yǎng)后，在加入葡萄糖(終濃度為1g/L)之前和之后再次對(duì)收縮進(jìn)行計(jì)數(shù)，以便也將由于葡萄糖不足而帶來的影響排除。
2.3結(jié)果(見表5)
表5與產(chǎn)品溫育之前的收縮次數(shù)(各3次測(cè)量的平均數(shù))相比較，產(chǎn)品溫育后1分鐘、2小時(shí)和48小時(shí)的肌肉收縮次數(shù)(各測(cè)量30秒)的變化百分?jǐn)?shù)Δ[％]
n.d.＝未測(cè)定實(shí)施例3軟膏劑的配制(含有下面表6中給出的成分)步驟將成分1-5(A)加熱至70℃。將成分6-7(B)加熱至75℃。在攪拌下將B加入至A中，冷卻至50℃，均化并冷卻至30℃。然后，依次加入成分8-9(C)和成分10(D)并冷攪拌。
表6
實(shí)施例4凝膠的配制(含有下面表7中給出的成分)步驟將成分2-6依次溶解于去離子水(1)中(A)。用成分7(B)調(diào)節(jié)pH至6.0，然后加入成分8(C)。
表權(quán)利要求
1.通式(I)的化合物 其中X表示鍵或NH-CH(C＝O)-(CH2)3+n-NH-R5，n表示0、1或2，R1、R4和R5彼此獨(dú)立地表示氫、任選經(jīng)取代的C1-C6-烷基、脒基或四-C1-C6-烷基脒，R2表示氫或任選經(jīng)取代的C1-C6-烷基，或者R1和R2與它們所結(jié)合的殘基一起表示5-至7-元的飽和環(huán)，R3表示C1-C12-烷氧基、C1-C12-烷基氨基、任選經(jīng)取代的芳基-C1-C6-烷基氨基、任選經(jīng)取代的雜芳基-C1-C6-烷基氨基、任選經(jīng)取代的芳基-C1-C6-烷氧基或任選經(jīng)取代的雜芳基-C1-C6-烷氧基，并且R6表示氫，或者當(dāng)n是1時(shí)，也表示氨基，或者與R1以及R6和R1所結(jié)合的殘基一起表示5-至7-元的飽和環(huán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R1表示氫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其特征在于，R2表示氫或甲基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的化合物，其特征在于，R3表示芳基-C1-C6-烷基氨基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的化合物，其特征在于，n表示0或1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的化合物，其特征在于，R1表示氫，R2表示氫或甲基，R3表示芳基-C1-C6-烷基氨基，并且n表示0或1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一所述的化合物，其特征在于，式(I)的化合物以與酸形成的、單價(jià)或多價(jià)的、均質(zhì)或混合的鹽形式存在。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的化合物，其特征在于，其以與無機(jī)和/或有機(jī)酸形成的鹽形式存在。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物，其特征在于，其以與脂族的飽和和/或不飽和的一元和/或二元羧酸，和/或與芳族羧酸，和/或與芳族-脂族羧酸，和/或與雜芳族羧酸，和/或與脂族和/或芳族磺酸形成的鹽形式存在。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9之一所述的化合物，其特征在于，其以與鹽酸和/或氫溴酸和/或硫酸和/或磷酸和/或甲酸和/或乙酸和/或三氟乙酸和/或三氯乙酸和/或丙酸和/或乙醇酸和/或琥珀酸和/或富馬酸和/或丙二酸和/或馬來酸和/或草酸和/或鄰苯二甲酸和/或檸檬酸和/或乳酸和/或酒石酸和/或苯甲酸和/或水楊酸和/或扁桃酸和/或肉桂酸和/或煙酸和/或甲磺酸和/或甲苯磺酸形成的鹽形式存在。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的化合物，其特征在于，其以與乙酸和/或三氟乙酸和/或乳酸形成的鹽形式存在。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11之一所述的化合物，其特征在于，其以光學(xué)純的異構(gòu)體形式或者以不同異構(gòu)體的混合物形式和/或以旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的混合物形式存在。
13.H-Ala-Pro-Arg-Arg-NH-芐基。
14.H-(β-Ala)-Pro-Dab-NH-芐基。
15.H-Dap-Pro-Arg-NH-芐基。
16.H-Ala-Pro-Arg-NH-(CH2)2-苯基。
16.H-(β-Ala)-Pro-Gab-NH-芐基。
17.N-[雙(二甲基氨基)亞甲基]-Ala-Pro-Arg-NH-芐基。
18.一種或多種根據(jù)權(quán)利要求13-17之一所述的化合物的酸加成鹽。
19.用于制備根據(jù)權(quán)利要求1-18之一所述的化合物的方法，其特征在于，通過使用在肽化學(xué)領(lǐng)域中本身已知的方法來完整地形成式(I)的化合物，任選裂解剩余的保護(hù)基團(tuán)，任選使游離的氨基進(jìn)行烷基化或?qū)⑵滢D(zhuǎn)變成胍基官能團(tuán)和/或使游離的羧基酯化或酰胺化和/或?qū)⒌玫降膲A性化合物轉(zhuǎn)化成酸加成鹽和/或?qū)@得的酸加成鹽轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的共軛堿或轉(zhuǎn)化成另一種鹽。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-18之一所述的化合物作為可局部施用的活性物質(zhì)或用于制備可局部施用的組合物的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用途，其特征在于，所述化合物用于皮膚護(hù)理或用于制備皮膚護(hù)理產(chǎn)品。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其特征在于，所述化合物或皮膚護(hù)理產(chǎn)品用于治療人皮膚中的表情皺紋和/或與年齡相關(guān)的皺紋。
23.可局部施用的組合物，其特征在于，所述組合物含有至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-18之一所述的化合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-18之一所述的化合物，所述化合物的量為0.5ppm至5,000ppm(w/w)，按所述化合物和載體材料的重量計(jì)算。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-12之一所述的化合物，所述化合物的量為1ppm至1000ppm(w/w)，按所述化合物和載體材料的重量計(jì)算。
26.根據(jù)權(quán)利要求23-25之一所述的組合物，其作為可局部施用的皮膚護(hù)理產(chǎn)品。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其用于治療人皮膚中的表情皺紋和/或與年齡相關(guān)的皺紋。
28.根據(jù)權(quán)利要求23-27之一的組合物，其特征在于，所述組合物含有通常在可局部施用的組合物中使用的其他成分，所述其他成分選自提取脂質(zhì)和/或合成脂質(zhì)，膠凝性的和粘稠的、表面活性的和乳化性的聚合物，水或脂溶性活性成分，植物提取物，組織提取物，海洋提取物，合成產(chǎn)品，防曬品，抗氧化劑，保濕劑和遮蔽劑和/或使皮膚回復(fù)活力的活性物質(zhì)。
29.可局部施用的組合物，其特征在于，所述組合物含有a)至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-18之一所述的化合物，以及b)安全且有效量的至少一種另外的皮膚護(hù)理活性物質(zhì)，其選自抗皺紋的活性物質(zhì)或抗萎縮的活性物質(zhì)。
30.根據(jù)權(quán)利要求23-29之一所述的組合物，其特征在于，其存在形式為溶液，混懸液，乳狀液，乳劑，洗液或軟膏劑，膠凝性的和粘稠的、表面活性的和乳化性的聚合物，潤(rùn)發(fā)脂，香波，肥皂，凝膠，粉劑，棒狀物，筆，噴霧劑或身體護(hù)理油，或者包囊于載體中。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的組合物，其特征在于，它的存在形式為位于大膠囊、微膠囊或納米膠囊中，位于脂質(zhì)體或乳糜微粒中，或者包封于大顆粒、微顆?；蚣{米顆粒中或包封于微海綿體中，或者吸收在粉末狀的有機(jī)聚合物、滑石、膨潤(rùn)土和/或其他礦物載體上。
32.用于治療人皮膚中的表情皺紋和/或與年齡相關(guān)的皺紋的方法，其特征在于，在皮膚上施用根據(jù)權(quán)利要求1-18之一所述的化合物或根據(jù)權(quán)利要求23-31之一所述的組合物。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述方法作為美容治療來實(shí)施。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)的新型化合物，其中X表示鍵或NH－CH(C＝O)－(CH
文檔編號(hào)C07K5/06GK101061134SQ200580039359
公開日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2005年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月2日
發(fā)明者D·伊姆費(fèi)爾德, H·齊格勒, P·維克斯特倫 申請(qǐng)人:彭特法姆股份公司