專利名稱：適用于產(chǎn)生和制備重組雙鏈rna核殼的細(xì)菌包裝菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了適用于產(chǎn)生重組雙鏈RNA核殼(rdsRNs)的細(xì)菌包裝菌株，其可用于產(chǎn)生在真核細(xì)胞或組織中編碼疫苗抗原，生物活性蛋白，免疫調(diào)節(jié)蛋白的RNA，反義RNA以及催化RNA。特別地，本發(fā)明還提供了細(xì)菌包裝菌株，可向其中導(dǎo)入重組ssRNA并進(jìn)行包裝從而以從頭合成的方式形成rdsRN，所述rdsRN可在所述包裝菌株內(nèi)復(fù)制并由此制備目的RNA。
背景技術(shù)：
病毒核殼，即病毒的核蛋白核心，具有諸多特征，這些特征可以使其具有在生物系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)異源基因序列的價(jià)值。由于缺乏完整病毒的外膜和粘附素，核殼是非感染性的顆粒，由病毒核心的蛋白和遺傳物質(zhì)構(gòu)成，其保留了殼體化和復(fù)制核酸序列的能力。因此，可以通過去除親代病毒的編碼膜，粘附素，蛋白酶，以及其他感染性或細(xì)胞溶解性因子的序列來減輕傳染或環(huán)境散播的風(fēng)險(xiǎn)。通過對(duì)在其復(fù)制循環(huán)中不表現(xiàn)出DNA階段的病毒前體進(jìn)行選擇，RNA核殼還可進(jìn)一步增強(qiáng)這些基因表達(dá)系統(tǒng)的安全性，由此降低在導(dǎo)入時(shí)，外源核苷酸序列整合入所述細(xì)胞或有機(jī)體基因組的風(fēng)險(xiǎn)。通過在這些核殼表達(dá)系統(tǒng)設(shè)計(jì)中利用雙鏈RNA(在本文中為“dsRNA”)，可以克服RNA的內(nèi)在不穩(wěn)定性。此外，非核殼序列的去除以及dsRNA病毒基因組的典型片段化使得利用人工基因組片段來替換缺失序列和編碼異源RNA的設(shè)計(jì)成為了頗具吸引力的方法，采用該方法可以表達(dá)目的基因或者將目的RNA遞送入生物系統(tǒng)中。由此可設(shè)計(jì)出重組核殼表達(dá)系統(tǒng)，因而其可含有僅編碼產(chǎn)生其他核殼所必需的序列，目的異源序列，以及其在細(xì)胞中進(jìn)行增殖和制備所必需的序列。
囊病毒(cystoviridae)科的雙鏈RNA噬菌體(在本文中為“dsRP”)是原型(prototypical)dsRNA病毒(Sinclair等，J Virol.16685；1975)；(Mgraw等，J Virol.58142；1986)；(Gottlieb等，Virology 163183；1988)；(Mindich等，J Virol.621180；1988)；(Mindich，Microbiol.MoI.Biol.Rev.63，149；1999)。囊病毒科dsRP的區(qū)別性特征是由三種雙鏈RNA片段(Mcgraw等，上文所述的，1986)；(Gottlieb等，上文所述的，1988)；(Mindich等，上文所述的，1988)指定的片段-L，片段-M和片段-S構(gòu)成的基因組，以及含脂的膜被(membrane coat)(Sands andLowlicht，Can J Microbiol，22154；1976)；(Bamford，and Palva，Biochim Biophys Acta，601245；1980)?；蚪M片段包含于核殼核心之內(nèi)，其包括蛋白P1，P2，P4和P7，并且由編碼dsRNA片段-L的基因(例如GenBank Accession#AF226851)所制備。正鏈RNA(在本文中為“mRNA”)的合成發(fā)生在核殼之內(nèi)，并且是由在片段-L上的基因-2部分編碼的RNA-依賴的RNA聚合酶所完成(Mindich等，上文所述的，1988)；(Van Etten等，J Virol，12464；1973)；片段-L上的基因-7也在mRNA合成的過程中發(fā)揮了作用(Mindich，等，上文所述的，1999)。
DsRP phi-6，dsRNA噬菌體這一科的原祖型(archetype)，通常會(huì)感染丁香假單胞桿菌(Pseudomonas syringae)(Mindich，等，上文所述的，1999)，然而，最近分離到的dsRP phi-8，phi-11，phi-12和phi-13可以感染大腸桿菌菌株JM109(美國典藏中心(在本文中為“ATCC”)#53323)，以及腸炎沙門氏菌鼠傷寒血清型(Salmonella enterica)serovarTyphimurium)的O-抗原陰性突變體(在本文中指定為“鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium”))并在其中進(jìn)行某種程度的復(fù)制(Mindich等，上文所述的，1999)；(Mindich等，J.Bacteriol，1814505；1999)；(Hoogstraten等，Virology，272218；2000)；(Qiao等，Virology 275218；2000)。
原祖型dsRP phi-6在細(xì)菌中的生活周期早已公開(Mindich，AdvVirus Res，35137；1988)；(Mindich，等，上文所述的，1999)。Phi-6通過結(jié)合于鞭毛從而允許與宿主細(xì)胞膜接觸進(jìn)而感染宿主，由此導(dǎo)致了融合，與此同時(shí)核殼被導(dǎo)入周質(zhì)。核殼隨后被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中，這是一個(gè)需要蛋白P5的內(nèi)肽酶活性以及蛋白P8的轉(zhuǎn)移性質(zhì)的事件。有意思的是，具有完整P8殼的核殼能夠自發(fā)地進(jìn)入細(xì)菌的原生質(zhì)體，從而導(dǎo)致了細(xì)菌菌株的自發(fā)轉(zhuǎn)染，由此制備出原生質(zhì)體(Qiao等，Virology227103；1997)；(Olkkonen等，Proc.Natl.Acad.Sci.879173；1990)。
在進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)時(shí)，P8會(huì)脫殼，而剩余的核殼，其含有三種dsRNA片段并具有RNA-依賴的RNA聚合酶活性，則開始合成dsRNA片段L，M和S的mRNA拷貝。由片段-L產(chǎn)生的蛋白主要與前衣殼制備相關(guān)；片段-M則主要涉及附著蛋白的合成，而片段-S則產(chǎn)生前衣殼的殼蛋白(P8)，溶解性內(nèi)肽酶(P5)，以及涉及脂包膜生成的蛋白(P9和P12)(Johnson and Mindich，J Bacteriol，1764124；1994)。dsRNA片段的包裝是順序進(jìn)行的，其中片段-S被識(shí)別并被空的前衣殼所容納；含有了片段-S的前衣殼不再結(jié)合這一片段但現(xiàn)在能夠結(jié)合并容納片段-M；含有了片段S和M的前衣殼不再結(jié)合這些片段但現(xiàn)在能夠結(jié)合并容納片段-L，從而產(chǎn)生核殼。一旦核殼含有了全部的三種單鏈RNA(在本文中為“ssRNA”)片段，那么負(fù)RNA鏈的合成就開始了從而制備出dsRNA片段。核殼隨后與蛋白5和8相連，并最終被包含于脂膜內(nèi)，從而完成了噬菌體的裝配。一般認(rèn)為宿主細(xì)胞的裂解是由于膜裂解蛋白P10，片段-M的產(chǎn)物積累而發(fā)生的，并且需要內(nèi)肽酶P5(Mindich等，上文所述的，1999)。
dsRP前衣殼中的裝配和RNA聚合酶活性并不需要宿主蛋白，因?yàn)閺哪軌虮磉_(dá)片段-L cDNA拷貝的大腸桿菌JM109衍生物純化得到的前衣殼能夠包裝純化的ssRNA片段L，M和S(Mindich等，上文所述的，1999)；(Qiao等，上文所述的，1997)。在上述體外系統(tǒng)中，在吸收了ssRNA片段之后，核糖核苷酸的加入導(dǎo)致了負(fù)鏈合成以及成熟dsRNA片段的產(chǎn)生。此外，在dsRNA合成完成之后，P8會(huì)與核殼相連，并且，如上所述，所得產(chǎn)物能夠進(jìn)入細(xì)菌原生質(zhì)體并產(chǎn)生有效感染；(Qiao等，上文所述的，1997)。
以往的研究描述了重組dsRP(在本文中被稱為“rdsRP”)的產(chǎn)生(Mindich，Adv Virus Res 53341；1999)；(Onodera等，J Virol 66190；1992)?？赏ㄟ^向dsRP phi-6的片段-M中插入卡那霉素抗性等位基因從而構(gòu)建簡單的rdsRP?？赏ㄟ^感染攜帶有表達(dá)含野生型dsRPphi-6重組片段-M的質(zhì)粒的JM109來分離含有所述重組片段的rdsRP。通過這種方法，可以在宿主細(xì)胞中建立起一種載體狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，可通過載體菌株連續(xù)地制備感染性的rdsRP(Onodera等，上文所述的，1992)；(Mindich，Adv Virus Res 53341；1999)。由載體菌株所產(chǎn)生的噬菌體噬菌斑形成能力可以保持3-5次平板傳代；然而，在額外傳代之后，新生的噬菌體不會(huì)在載體菌株上形成噬菌斑，但依然會(huì)產(chǎn)生低水平的感染性噬菌體(Onodera等，上文所述的，1992)。在一些情況下，有明顯數(shù)量的載體菌株一起喪失了產(chǎn)生感染性噬菌體的能力；來自于這些細(xì)菌菌株的dsRNA表現(xiàn)出了一個(gè)或多個(gè)片段的缺失(Onodera等，上文所述的，1992)。在某種情況下，可以從喪失了產(chǎn)生噬菌體能力的一種這樣的載體菌株中分離出缺乏片段-S的突變噬菌體。但在任何情況之下卻都不能以出于使系統(tǒng)適應(yīng)在真核細(xì)胞或組織中起作用的直接目的構(gòu)建rdsRN。因此，通過這種方法制備的rdsRP是內(nèi)在不穩(wěn)定的，并且不能夠用于噬菌體裝配和復(fù)制的分析；而通過現(xiàn)有技術(shù)提供的rdsRP也不能夠滿足生物技術(shù)應(yīng)用和大規(guī)模生產(chǎn)。
近來認(rèn)為可以對(duì)能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)mRNA的rdsRP進(jìn)行開發(fā)，并且這些rdsRP還可用于在真核細(xì)胞或組織中表達(dá)疫苗抗原，生物活性蛋白，免疫調(diào)節(jié)蛋白，反義RNA，以及催化RNA(Hone的美國專利申請(qǐng)第20040132678號(hào)，在此將其全文引用作為參考，此后為20040132678)。20040132678提供了關(guān)于rdsRP有用性的廣泛信息，描述了模式rdsRP，并提出了產(chǎn)生并使用所述rdsRP的方法。然而，20040132678并未提供任何啟動(dòng)以從頭合成方式合成的rdsRP的指導(dǎo)，也沒有提供關(guān)于如何產(chǎn)生和分離含有和復(fù)制rdsRP的穩(wěn)定載體菌株的指導(dǎo)。在20040132678的一個(gè)實(shí)施例中，提出了可以通過在攜帶有質(zhì)粒的細(xì)菌轉(zhuǎn)化子中復(fù)制親代dsRP來產(chǎn)生批量rdsRP的方法，由此可表達(dá)目的重組片段。從這一公開中并不能清楚地知道是否這些這些rdsRP擁有四種dsRNA片段(即，三種野生型片段和重組片段)，或者是否這些rdsRP擁有三種dsRNA片段，兩種野生型片段和重組片段。在任何一種情況下，都并不清楚為了進(jìn)行增殖rdsRP對(duì)野生型輔助噬菌體的依賴有多大；同樣不清楚的是如何將rdsRP與野生型的dsRP分離。此外，20040132678也并未提供具體的方法來穩(wěn)定地將重組片段整合入dsRP之內(nèi)，對(duì)rdsRP后續(xù)復(fù)制和穩(wěn)定制備的具體方法涉及甚少。而且，20040132678也沒有提供同時(shí)缺乏野生型片段-M和片段-S的rdsRP組合物。最終，20040132678也沒有提供表達(dá)片段-L和產(chǎn)生前衣殼的包裝菌株，以及由此產(chǎn)生的能夠以從頭合成方法啟動(dòng)rdsRP并穩(wěn)定產(chǎn)生resRP的菌株。
因此，20040132678并未提供足夠的信息使得本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員來產(chǎn)生包裝菌株并且穩(wěn)定地產(chǎn)生rdsRP。而且，20040132678也沒有討論或建議新的rdsRN組合物，或包裝菌株，或?qū)胍约胺€(wěn)定制備和使用rdsRN的方法，而這些正是本發(fā)明的主題。
發(fā)明概述如本發(fā)明所述，重組雙鏈RNA核殼(rdsRN)包括至少一種編碼功能性雙鏈RNA病毒或細(xì)菌噬菌體核殼蛋白的dsRNA片段，以及包括有至少編碼功能性產(chǎn)物的至少一種基因的一種或多種重組dsRNA片段，所述功能性產(chǎn)物彌補(bǔ)了宿主(例如，細(xì)菌)細(xì)胞中選擇性表現(xiàn)突變，例如營養(yǎng)缺陷型突變，細(xì)胞壁合成突變，或防止在冷凍溫度以上生長的突變。優(yōu)選地，所述dsRN片段包括有RNA，其編碼目的異源基因，例如免疫原，具有或不具有佐劑，其可允許將本發(fā)明用于引起免疫反應(yīng)的疫苗中，盡管由這種rdsRN所產(chǎn)生的mRNA的功能并不僅限于此功能。由此所產(chǎn)生的RNA可以編碼佐劑，免疫調(diào)節(jié)蛋白，治療性蛋白，其他生物活性蛋白，或者所述RNA本身就可作為siRNA或催化RNA而行使功能。與rdsRP相比，rdsRN的益處在于穩(wěn)定性和操作性以及安全性等等。rdsRN被包含于含有選擇性表型突變的細(xì)菌包裝菌株中，從而允許在所述細(xì)菌包裝菌株中對(duì)rdsRN進(jìn)行選擇和維持。
在

圖1-3中描述了本發(fā)明的示例性實(shí)施方案。在圖1-3的每一幅圖中，10代表細(xì)菌細(xì)胞；20代表所述細(xì)菌細(xì)胞10的基因組DNA；30代表核殼(包括具有包裝活性和RNA聚合酶活性的蛋白)；而31(在核殼30之內(nèi)的三條波浪線)則代表包含于核殼30之內(nèi)的dsRNA。類似地，在圖1-3的每一幅圖中，21代表在基因組DNA 20之內(nèi)的選擇性表現(xiàn)型突變。
正如在圖1-3的每一幅圖中可以看到的，兩種元素，40和41，都始終與dsRNA 30相關(guān)。40代表編碼彌補(bǔ)選擇性表現(xiàn)型突變21的基因產(chǎn)物的核酸序列，而41代表編碼目的RNA的核酸序列。
第三種元素，42，也可以在圖1-3的每一幅圖中找到，但其位置卻不同。42代表編碼核殼產(chǎn)生所必需基因的核酸序列(例如，編碼具有包裝活性和RNA聚合酶活性蛋白的基因)。圖1所示為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，其中核酸序列42定位于核殼30內(nèi)部的dsRNA序列31內(nèi)。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，如圖2所示，核酸序列42定位于細(xì)菌基因組DNA 20內(nèi)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，如圖3所示，細(xì)菌細(xì)胞10也可含有質(zhì)粒(70)，且核酸序列42定位于在質(zhì)粒70上。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供細(xì)菌包裝菌株，在所述菌株中含有編碼dsRP前衣殼的序列，以及對(duì)表達(dá)彌補(bǔ)所述菌株中突變的功能性基因的rdsRN進(jìn)行選擇和維持的突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了適用于包裝，制備和/或遞送基因或RNA的細(xì)菌菌株，所述菌株含有a)含有至少一種選擇性表型突變的基因組DNA；b)具有RNA包裝和RNA聚合酶活性蛋白的一種或多種核殼；c)在所述一種或多種核殼內(nèi)部含有的dsRNA序列，所述dsRNA序列編碼至少i)彌補(bǔ)所述至少一種選擇性表型突變的基因產(chǎn)物，以及ii)可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA；以及d)編碼產(chǎn)生核殼所必需基因的核酸序列。
本發(fā)明的又一目的是提供產(chǎn)生rdsRN的方法，其中向細(xì)菌包裝菌株中導(dǎo)入重組RNA片段，進(jìn)行包裝從而形成含有真核翻譯表達(dá)盒的重組核殼，由此以從頭合成的方式啟動(dòng)rdsRN。
本發(fā)明的又一目的是提供能夠在細(xì)菌菌株中穩(wěn)定復(fù)制的rdsRN。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組雙鏈RNA核殼(rdsRN)包括a)具有RNA包裝和RNA聚合酶活性的蛋白，以及b)dsRNA序列，其編碼至少i)基因產(chǎn)物，以及ii)可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA。
本發(fā)明的再一目的是提供這樣的細(xì)菌菌株，其能夠穩(wěn)定產(chǎn)生rdsRN，所述rdsRN含有一種或多種編碼陽性選擇等位基因的rdsRNA片段和功能性真核翻譯表達(dá)盒。
本發(fā)明的另一目的是提供這樣的細(xì)菌菌株，其能夠穩(wěn)定產(chǎn)生rdsRN，所述rdsRN攜帶有α病毒表達(dá)盒，例如，但不僅限于西門利克森林病毒(Semliki forest virus)(Berglund等，Vaccine 17497；1999)或委內(nèi)瑞拉馬腦炎(Venezuelan equine encephalitis(在本文中指定為“VEE”))病毒(Davis等，J Virol 703781；1996)；(Caley等，J Virol713031；1997)。
本發(fā)明的另一目的是提供向真核細(xì)胞和組織給藥rdsRN的方法，以及rdsRN在靶細(xì)胞類群中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)或引起生物學(xué)效應(yīng)的用途。
本發(fā)明的另一目的是提供能夠包裝rdsRN的活細(xì)菌載體。
本發(fā)明的又一目的是提供能夠穩(wěn)定維持rdsRN的活性細(xì)菌載體。
本發(fā)明的又一目的是提供能夠在細(xì)菌載體菌株中復(fù)制的rdsRN。
本發(fā)明的再一目的是提供向哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織遞送rdsRN的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供使用所述攜帶有rdsRN的細(xì)菌載體在靶細(xì)胞或組織中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)或引起生物學(xué)效應(yīng)的方法。
由本發(fā)明宿主細(xì)胞所含有的選擇性表現(xiàn)型突變，在優(yōu)選實(shí)施方案中，是不可回復(fù)的選擇性表現(xiàn)型突變。
本發(fā)明的又一目的是提供含有所述細(xì)菌和/或所述dsRN的電穿孔介質(zhì)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供了編碼dsRNA成分的各種氟化RNA。
本發(fā)明的這些和其他目的會(huì)因本說明書中所提供的詳細(xì)描述而變得顯而易見。如示例性的實(shí)施方案所示，其描述了含有編碼dsRP phi-8片段-L序列的細(xì)菌包裝菌株，所述序列能夠在所述菌株中表達(dá)前衣殼以及含有能夠?qū)υ谒鼍曛斜磉_(dá)功能性asd基因的rdsRN進(jìn)行選擇和維持的asd突變。此外，還描述了編碼疫苗抗原和報(bào)導(dǎo)物的原型rdsRN，還證明了所述rdsRN能夠在哺乳動(dòng)物環(huán)境中影響所編碼抗原和報(bào)導(dǎo)物表達(dá)的能力。
附圖的詳細(xì)描述圖1是含有核殼的細(xì)菌細(xì)胞的示意圖，其中編碼產(chǎn)生核殼所必需基因的核酸序列位于核殼內(nèi)的dsRNA序列中。
圖2是含有核殼的細(xì)菌細(xì)胞的示意圖，其中編碼產(chǎn)生核殼所必需基因的核酸序列位于所述細(xì)胞的基因組DNA中。
圖3是含有核殼的細(xì)菌細(xì)胞的示意圖，其中編碼產(chǎn)生核殼所必需基因的核酸序列位于質(zhì)粒中。
圖4所示為各種phi-8重組片段-S和片段-M的表達(dá)盒(分別為rS，rS2和rM)。如下文實(shí)施例部分所述，陽性選擇等位基因是asd基因且所述目的基因編碼的是候選結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原以及Hc-紅色熒光蛋白。將rS和rS2克隆入pT7/T3-18的PstI位點(diǎn)。通過將作為KpnI/PstI片段的rM導(dǎo)入pcDNA3.1ZEO的相應(yīng)位點(diǎn)對(duì)進(jìn)行克隆。將全部重組片段放置于T7啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
圖5所示為含有α病毒(Semliki Forest Virus)自我擴(kuò)增復(fù)制子(nsp1-4和復(fù)制酶結(jié)合序列)的rS表達(dá)盒。
圖6所示為細(xì)菌包裝菌株發(fā)育和功能的示意圖。
圖7所示為所述包裝菌株和親本菌株的侵入性特征。
圖8所示為在變性前后對(duì)S.flexneri MPC51pLM2653的全細(xì)胞裂解液用前衣殼特異性抗血清探測的雜交印跡，顯示了前衣殼的體內(nèi)裝配。
圖9所示為S.flexneri MPC51pLM2653的電子顯微照片，顯示了裝配的前衣殼。
圖10所示為含有rdsRN指定LSMtb4的包裝的S.flexneriMPC51pLM2653的RT-PCT，顯示了第二鏈合成的(-)鏈和(+)cDNA的存在。
圖11所示為含有自我復(fù)制核殼LSMtb4的S.flexneriMPC51pLM2653的電子顯微照片。
圖12所示為含有野生型細(xì)菌噬菌體phi-8的丁香假單胞桿菌(Pseudomonas syringae)的電子顯微照片，其是采用含有編碼野生型片段-S，-M和-L的RNA對(duì)所述菌株進(jìn)行電穿孔之后重建的。
圖13所示為在采用含有命名為LSMtb4的rdsRN的S.flexneriMPC51侵入HeLa細(xì)胞14小時(shí)之后用抗原85A特異的抗血清探測的熒光顯微照片，顯示了抗原85A是由真核細(xì)胞表達(dá)的。
圖14所示為在采用含有命名為LSMHc-Red的rdsRN的S.flexneriMPC51侵入HeLa細(xì)胞12小時(shí)之后的熒光顯微照片，顯示了在所述真核細(xì)胞內(nèi)從LSMHc-Red所產(chǎn)生mRNA翻譯出來Hc-Red蛋白的直接熒光。
圖15所示為在采用含有命名為LSMHc-Red的rdsRN的S.flexneriMPC51侵入HeLa細(xì)胞12小時(shí)之后用Hc-Red特異性抗血清探測的熒光顯微照片，顯示了真核細(xì)胞中Hc-Red蛋白的表達(dá)。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述1、細(xì)菌包裝菌株的構(gòu)建本發(fā)明提供了這樣的細(xì)菌包裝菌株，其含有能在所述菌株中編碼并表達(dá)功能性雙鏈RNA噬菌體/病毒(dsRP)前衣殼蛋白的DNA序列，允許前衣殼的裝配和dsRNA的包裝從而在所述包裝菌株中形成雙鏈RNA核殼(dsRN)。除此之外，可對(duì)dsRNA進(jìn)行遺傳工程化從而含有能夠編碼和表達(dá)目的功能基因例如轉(zhuǎn)基因的序列。所述dsRNA由此成為了重組dsRNA(rdsRNA)，而核殼成為了重組dsRN(rdsRN)。包裝菌株還含有能夠在所述菌株中構(gòu)建選擇性、致死缺陷的遺傳突變?？蓪?duì)rdsRN進(jìn)行遺傳工程化從而編碼和表達(dá)彌補(bǔ)由所述突變所引起選擇性缺陷的功能性基因，由此使得可在所述細(xì)菌包裝菌株之內(nèi)對(duì)rdsRN進(jìn)行選擇和維持。
以下的dsRNA噬菌體元素都包括在rdsRN之內(nèi)片段-L；片段-Spac序列；片段-S RNA依賴的RNA聚合酶識(shí)別序列；片段-M pac序列；片段-M RNA依賴的RNA聚合酶識(shí)別序列?？砂聪挛乃鰧㈥栃赃x擇等位基因遺傳工程化導(dǎo)入噬菌體可將陽性選擇等位基因連接至，例如，片段-S上的基因-8核糖體結(jié)合位點(diǎn)，或者片段-M上的基因-10核糖體結(jié)合位點(diǎn)，或二者皆可?？赏ㄟ^替換產(chǎn)生功能性dsRN非必需的S和M片段區(qū)域向S和/或M片段中遺傳工程化導(dǎo)入其他的目的基因。或者，可將S和M片段完全去除并以目的序列替換。在本文中，“重組片段”是指遺傳工程化的S和/或M片段，或替換了所述S和/或M片段的目的序列。
雖然可以使用任意的雙鏈RNA噬菌體或病毒使得本文所述的系統(tǒng)起作用，但在實(shí)施例部分中所述的示例性的phi-8 rdsRN系統(tǒng)還是優(yōu)選地利用囊病毒基因組的以下元素來行使功能
1.片段-L及其上的全部基因，2.片段-S和-M的pac序列，3.片段-S和-M的3’末端聚合酶結(jié)合序列，4.片段-S的基因8。
在phi-8實(shí)施例中，不為rdsRN系統(tǒng)行使功能所必需的，片段-S和-M上的全部編碼序列都被缺失，除了基因8。此外，可以在重組片段中包括其他表達(dá)目的基因所必需或希望的外源序列，例如分別在真核和原核生物中啟動(dòng)翻譯的IRES元素，Kozak和Shine-Dalgaro序列，聚腺苷酸化序列，啟動(dòng)子序列，增強(qiáng)子，轉(zhuǎn)錄終止子，引導(dǎo)肽序列，以及蛋白純化的分子標(biāo)簽，例如His標(biāo)簽。
按照本發(fā)明的實(shí)施，可以染色體外表達(dá)載體或整合入細(xì)菌染色體的方式將片段-L導(dǎo)入細(xì)菌包裝菌株，并通過電穿孔將重組片段導(dǎo)入細(xì)菌包裝菌株內(nèi)，如下文的詳細(xì)描述。
在本發(fā)明中，從中獲得包裝菌株的細(xì)菌菌株并非至關(guān)重要，其包括但不限于彎曲桿菌亞種(Campylobacter spp)，奈瑟菌亞種(Neisseriaspp)，嗜血桿菌亞種(Haemophilus spp)，氣單胞菌亞種(Aeromonas spp)，弗朗西斯菌亞種(Francisella spp)，耶爾森氏菌亞種(Yersinia spp)，克雷伯桿菌亞種(Klebsiella spp)，博代氏桿菌亞種(Bordetella spp)，軍團(tuán)桿菌亞種(Legionella spp)，棒狀桿菌亞種(Corynebacterium spp)，檸檬酸細(xì)菌亞種(Citrobacter spp)，衣原體(Chlamydia spp)，布魯氏菌亞種(Brucellaspp)，假單胞菌亞種(Pseudomonas spp)，螺桿菌亞種(Helicobacter spp)或弧菌亞種(Vibrio spp)。
所應(yīng)用的特定彎曲桿菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的彎曲桿菌菌株的例子包括但不限于空腸彎曲桿菌(C.jejuni)(ATCC Nos.43436，43437，43438)，豬腸彎曲桿菌(C.hyointestinalis)(ATCC No.35217)，胎兒彎曲菌(C.fetus)(ATCC No.19438)糞彎曲菌(C.fecalis)(ATCC No.33709)，C.doylei(ATCC No.49349)和大腸彎曲桿菌(C.coli)(ATCC Nos.33559，43133)。
所應(yīng)用的特定耶爾森氏菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要。可應(yīng)用于本發(fā)明的耶爾森氏菌菌株的例子包括小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)(ATCC No.9610)或鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)(ATCC No.19428)，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)Ye03-R2(al-Hendy等，Infect.Immun.，60870；1992)或小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)aroA(O′Gaora等，Micro.Path.，9105；1990)。
所應(yīng)用的特定克雷伯桿菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的克雷伯桿菌菌株的例子包括肺炎克雷伯桿菌(K.pneumoniae)(ATCC No.13884)。
所應(yīng)用的特定博代氏桿菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要。可應(yīng)用于本發(fā)明的博代氏桿菌菌株的例子包括百日咳博代氏桿菌(B.pertussis)，支氣管敗血性博德特氏菌(B.bronchiseptica)(ATCC No.19395)。
所應(yīng)用的特定奈瑟菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要。可應(yīng)用于本發(fā)明的奈瑟菌菌株的例子包括腦膜炎萘瑟菌(N.meningitidis)(ATCCNo.13077)和淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)(ATCC No.19424)，淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)，MS11 aro突變體(Chamberlain等，Micro.Path.，1551-63；1993)。
所應(yīng)用的特定氣單胞菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的氣單胞菌菌株的例子包括A.salminocida(ATCC No.33658)，A.schuberii(ATCC No.43700)，嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)，A.eucrenophila(ATCC No.23309)。
所應(yīng)用的特定弗朗西斯菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的弗朗西斯菌菌株的例子包括土拉熱弗朗西斯菌(F.tularensis)(ATCC No.15482)。
所應(yīng)用的特定棒狀桿菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要。可應(yīng)用于本發(fā)明的棒狀桿菌菌株的例子包括假結(jié)核棒狀桿菌(C.pseudotuberculosis)(ATCC No.19410)。
所應(yīng)用的特定檸檬酸細(xì)菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要。可應(yīng)用于本發(fā)明的檸檬酸細(xì)菌菌株的例子包括弗羅因德氏檸檬酸菌(C.freundii)(ATCC No.8090)。
所應(yīng)用的特定衣原體菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的衣原體菌株的例子包括肺炎衣原體(C.pneumoniae)(ATCC No.VR1310)。
所應(yīng)用的特定嗜血桿菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的嗜血桿菌菌株的例子包括流感嗜血桿菌(H.influenzae)(Lee等，J.Biol.Chem.27027151；1995)，睡眠嗜血桿菌(H.somnus)(ATCCNo.43625)。
所應(yīng)用的特定布魯氏菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的布魯氏菌菌株的例子包括流產(chǎn)布魯氏菌(B.abortus)(ATCCNo.23448)。
所應(yīng)用的特定軍團(tuán)桿菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要。可應(yīng)用于本發(fā)明的軍團(tuán)桿菌菌株的例子包括肺炎軍團(tuán)桿菌(L.pneumophila)(ATCC No.33156)，或肺炎軍團(tuán)桿菌(L.pneumophila)mip突變體(Ott，F(xiàn)EMS Micro.Rev.，14161；1994)。
所應(yīng)用的特定假單胞菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的假單胞菌菌株的例子包括銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)(ATCC No.23267)。
所應(yīng)用的特定螺桿菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要。可應(yīng)用于本發(fā)明的螺桿菌菌株的例子包括幽門螺桿菌(H.pylori)(ATCC No.43504)，雪貂螺桿菌(H.mustelae)(ATCC No.43772)。
所應(yīng)用的特定弧菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的弧菌菌株的例子包括霍亂弧菌(Vibrio cholerae)(ATCC No.14035)，辛辛那提弧菌(Vibrio cincinnatiensis)(ATCC No.35912)，霍亂弧菌(V.cholerae)RSI毒力突變株(Taylor et at，J.Infect.Dis.，1701518-1523；1994)和霍亂弧菌(V.cholerae)ctxA，ace，zot，cep突變株(Waldor Jetal，Infect Dis.，170278-283；1994)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，在本發(fā)明中開發(fā)的產(chǎn)生包裝菌株的細(xì)菌菌株包括了擁有可作為包裝菌株和作為疫苗載體潛力的細(xì)菌，例如腸桿菌(Enterobacteriaceae)，包括但不限于埃希桿菌亞種(Escherichia spp.)，志賀菌亞種(Shigella spp.)，和沙門氏菌亞種(Salmonella spp.)?？梢詮膯魏思?xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)或分支桿菌亞種(Mycobacterium spp)類似地構(gòu)建革蘭氏陽性和耐酸性的包裝和載體菌株。
所應(yīng)用的特定埃希氏菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的埃希氏菌菌株的例子包括大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α，HB 101，HS-4，4608-58，1184-68，53638-C-17，13-80和6-81(參見，例如Sambrook等，上文所述的；Grant等，上文所述的；Sansonetti等，Ann.Microbiol.(Inst.Pasteur)，132A351；1982)，腸毒性的大腸桿菌(參見，例如，Evans等，Infect.Immun.，12656；1975)，致腸病的大腸桿菌(參見，例如，Donnenberg等.，J.Infect.Dis.，169831；1994)，腸侵染性大腸桿菌(參見，例如，Small等，Infect Immun.，551674；1987)和腸出血性大腸桿菌(參見，例如，McKee and O′Brien，Infect.Immun.，632070；1995)。
所應(yīng)用的特定沙門氏菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的沙門氏菌菌株的例子包括傷寒沙門氏菌(S.typhi)(參見，例如，ATCC No.7251)，鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)(參見，例如，ATCC No.13311)，雞沙門氏菌Salmonella galinarum(ATCC No.9184)，腸炎沙門氏菌Salmonella enteriditis(參見，例如，ATCC No.4931)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)(參見，例如，ATCC No.6994)，傷寒沙門氏菌(S.typhi)aroC，aroD雙突變體(參見，例如，Hone等，Vacc，9810-816；1991)，鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)aroA突變體(參見，例如，Mastroeni等，Micro.Pathol.，13477-491；1992)。
所應(yīng)用的特定志賀菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的志賀菌菌株的例子包括弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)(參見，例如，ATCC No.29903)，弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)CVD1203(參見，例如，Noriega等，Infect.Immun.625168；1994)，弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)15D(參見，例如，Sizemore等，Science 270299；1995)，索氏志賀氏菌(Shigella sonnei)(參見，例如，ATCC No.29930)，和痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)(參見，例如，ATCC No.13313)。
所應(yīng)用的特定分支桿菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要。可應(yīng)用于本發(fā)明的分支桿菌菌株的例子包括結(jié)核分支桿菌(Mtuberculosis)CDC 1551菌株(參見，例如，Griffith等，Am.J.Respir.Crit.Care Med.Aug；152(2)808；1995)，結(jié)核分支桿菌(M tuberculosis)北京株(Soolingen等，1995)，H37Rv菌株(ATCC#25618)，結(jié)核分支桿菌(M tuberculosis)泛酸營養(yǎng)缺陷型菌株(Sambandamurthy，Nat.Med.2002 8(10)1171；2002)，結(jié)核分支桿菌(M tuberculosis)rpoV突變體菌株(Collins等，Proc Natl Acad Sci USA.92(17)8036；1995)，結(jié)核分支桿菌(M tuberculosis)亮氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(Hondalus等，Infect.Immun.68(5)2888；2000)，BCG丹麥菌株(ATCC#35733)，BCG日本菌株(ATCC#35737)，BCG，芝加哥菌株(ATCC#27289)，BCG哥本哈根菌株(ATCC#27290)，BCG巴斯德菌株(ATCC#35734)，BCGGlaxo菌株(ATCC#35741)，BCG Connaught菌株(ATCC#35745)，BCG蒙特利爾株(ATCC#35746)。
所應(yīng)用的特定單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要。可應(yīng)用于本發(fā)明的單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)菌株的例子包括單核細(xì)胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)菌株10403S(例如，Stevens等，J.Virol 788210-8218；2004)或單核細(xì)胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)突變株，例如(i)actA plcB雙突變體(Peters等，F(xiàn)EMS Immunology andMedical Microbiology 35243-253；2003)；(Angelakopoulous等，Infectand Immunity 703592-3601；2002)；(ii)對(duì)于丙氨酸消旋酶基因和D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因的dal dat雙突變體(Thompson等，Infect andImmunity 663552-3561；1998)。
在選定了能夠用作包裝菌株親本的菌株之后，可對(duì)所述菌株進(jìn)行遺傳工程化從而向所述菌株導(dǎo)入表達(dá)dsRP前衣殼的DNA序列，并導(dǎo)入rdsRN進(jìn)行選擇和維持的突變，該rdsRN能夠表達(dá)彌補(bǔ)所述菌株內(nèi)突變的功能性基因。
通常，片段-L內(nèi)的基因編碼的是產(chǎn)生具有完全功能性前衣殼所必需的蛋白，包括編碼殼的蛋白基因8。然而，對(duì)phi-8噬菌體而言，基因8位于片段S上，而基因8產(chǎn)物也并非為phi-8前衣殼的裝配所必需，phi-8核殼有效的自我復(fù)制需要功能性的基因8產(chǎn)物。因此，當(dāng)在實(shí)施本發(fā)明時(shí)使用phi-8噬菌體的時(shí)候，片段S的基因8會(huì)被優(yōu)選地包括在構(gòu)建體中。對(duì)其他噬菌體而言，基因8活性是在片段L上編碼的，因此表達(dá)片段-L mRNA的能力足以產(chǎn)生功能性的核殼。獲得片段-L的特定dsRP對(duì)本發(fā)明并非至關(guān)重要，且其包括但不限于Phi-6片段L(Genbank登錄號(hào)M17461)，Phi-13片段-L(Genbank登錄號(hào)AF261668)，或Phi-8片段-L(Genbank登錄號(hào)AF226851)，并可以從紐約州，紐約市，公共健康研究院，微生物系的L.Mindich博士那里得到。
或者，可使用Applied Biosystems ABITM3900高通量DNA合成儀(Foster City，CA 94404 U.S.A.)合成地產(chǎn)生編碼片段-L的cDNA序列，其方法由制造商所提供。為了合成片段-L以及重組片段-S和/或-M的cDNA拷貝，可通過PCR產(chǎn)生所述全長序列的一系列部分片段并使用本領(lǐng)域公知的方法將其連接起來形成全長片段(Ausubel等，上文所述的，1990)。簡言之，使用自動(dòng)化DNA合成儀(例如，Applied BiosystemsABITM3900高通量DNA合成儀(Foster City，CA 94404 U.S.A.))制備長度為100-200核苷酸的合成的寡核苷酸(即，優(yōu)選為其5’和3’端與編碼相鄰序列寡核苷酸的5’和3’端相匹配)。使用相同的方法，可以合成互補(bǔ)的寡核苷酸，并與互補(bǔ)的配對(duì)物退火從而形成雙鏈寡核苷酸。可通過連接將雙鏈寡核苷酸對(duì)(即，那些編碼相鄰序列的)結(jié)合從而形成更大的片段。可通過瓊脂糖凝膠電泳隊(duì)這些較大片段進(jìn)行純化，并使用凝膠純化試劑盒進(jìn)行分離(例如，The QIAEXII Gel Extraction System，Qiagen，Santa Cruz，CA，Cat.No.12385)。重復(fù)這一程序直到構(gòu)建出全長DNA分子。在每一輪連接之后，可通過PCR擴(kuò)增這些片段從而提高產(chǎn)率。以從頭合成基因構(gòu)建體的方法是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，并在他處已有描述(Andre等，上文所述的，1998)；(Haas等.，上文所述的，1996)；或者，可以從，例如，Midland Certified Reagent Co.(Midland，TX)商業(yè)性地購買合成的基因。
雖然本發(fā)明詳細(xì)說明了未改變的片段-L序列的應(yīng)用，但對(duì)本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員顯而易見的是，能夠?qū)е滤鲂蛄械慕囟袒蛲蛔冄苌锏男揎棽⒉粫?huì)防止功能性前衣殼的形成，因而可以在不偏離此述本發(fā)明意圖的條件下進(jìn)行使用。
用于表達(dá)片段-L的特定啟動(dòng)子對(duì)本發(fā)明而言并非十分重要，且其可以是在靶菌株中起作用的任意啟動(dòng)子，例如但不僅限于可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，例如PBAD(Genbank登錄號(hào)X81838)和PpagC(Genbank登錄號(hào)M55546)或組成型啟動(dòng)子例如Plpp(Genbank登錄號(hào)V00302)和PompA(Genbank登錄號(hào)X02006)。
可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)(例如，PCR，DNA純化，限制性內(nèi)切酶消化，瓊脂糖凝膠電泳，連接)在表達(dá)載體，例如pT7/T3-18(Ambion，Austin，TX5 Cat.No.7201)中，將片段-L導(dǎo)入所述包裝菌株，或通過等位基因交換整合入染色體中。染色體整合的位置對(duì)本發(fā)明并不重要，盡管在優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼片段-L表達(dá)盒的DNA被整合入染色體從而失活基因并在限定的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生了選擇性的表現(xiàn)型(例如，aroA(Genbank登錄號(hào)X00557)，aroC(Genbank登錄號(hào)AY142231)，leuD(Genbank登錄號(hào)L06666)asd(Genbank登錄號(hào)V00262)，murI(Genbank登錄號(hào)AY520970)kdsA(Genbank登錄號(hào)AY174101)，和htrB(Genbank登錄號(hào)AF401529)。染色體整合的程序以及培養(yǎng)所述突變體的方法都有詳細(xì)記載(Hamilton等，J.Bacteriol.1714617；1989)；(Blomfield等，MoI.Microbiol.51447；1991)。
被導(dǎo)入包裝菌株的特定突變對(duì)本發(fā)明并非至關(guān)重要，其可以是能夠在限定培養(yǎng)條件下產(chǎn)生選擇性表現(xiàn)型的任意突變，例如但不僅限于營養(yǎng)缺陷型突變，例如aroA(Genbank登錄號(hào)X00557)，aroC(Genbank登錄號(hào)AY142231)，leuD(Genbank登錄號(hào)L06666)或?qū)?xì)胞壁合成至關(guān)重要基因的突變，例如asd(Genbank登錄號(hào)V00262)或murI(Genbank登錄號(hào)AY520970)，或防止在溫度高于32℃生長的突變，例如htrB(Genbank登錄號(hào)AF401529)。
可使用任意公知的遺傳技術(shù)向細(xì)菌中導(dǎo)入突變。這些技術(shù)包括但不僅限于，使用化學(xué)試劑諸如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍，吖啶橙，溴化乙錠，或非致死性暴露于紫外光的非特異性誘變(Miller(Ed)，1991，InA short course in bacterial genetics，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，NY)?；蛘撸墒褂脴?biāo)準(zhǔn)遺傳技術(shù)引入突變，例如Tn10誘變，細(xì)菌噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，λ噬菌體介導(dǎo)的等位基因交換，或接合轉(zhuǎn)移(Miller(Ed)，上文所述的，1991)；(Hone，等，J.Infect.Dis.156167；1987)；(Noriega，等，Infect.Immun.，625168；1994)；(Hone，等，Vaccine，9810；1991)；(Chatfield，等，Vaccine 1053；1992)；(Pickard，等，Infect.Immun.，623984；1994)；(Odegaard，等，J BiolChem 27219688；1997)；(Lee，等，J.Biol.Chem.，27027151；1995)；(Garrett，等，J.Biol.Chem.，27312457；1998)。突變可以是點(diǎn)突變，密碼子替換，或者，優(yōu)選地，不可回復(fù)的缺失突變。缺失突變可以是單堿基突變直至全部編碼序列的缺失。在大規(guī)模突變中，缺失突變的優(yōu)點(diǎn)在于這些突變使得所述產(chǎn)物具有更佳的穩(wěn)定性。
突變可以是組成型表達(dá)的，或者是在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，例如溫度敏感性熱休克家族的啟動(dòng)子，或厭氧誘導(dǎo)nirB啟動(dòng)子(Harborne等，MoI.Micro.，62805；1992)或可阻抑啟動(dòng)子，例如uapA(Gorfinkiel等，J.Biol.Chem.，26823376；1993)或gcv(Stauffer等，J.Bact，1766159；1994)控制之下的。適當(dāng)方法學(xué)的選擇依賴于靶菌株且為本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所熟知。
對(duì)穩(wěn)定含有rdsRN的細(xì)菌載體菌株的生長而言，特定的培養(yǎng)條件對(duì)本發(fā)明并非至關(guān)重要。出于說明性的目的，突變體可以生長在液體培養(yǎng)基中，例如TS培養(yǎng)基(Difco，Detroit，MI，Cat.No.244620)，營養(yǎng)肉湯(Difco，Detroit，MI，Cat.No.233000)，胰蛋白酶大豆肉湯(Difco，Detroit，MI，Cat.No.211822)，使用適于細(xì)菌菌株生長的常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)(Miller，上文所述的，1991)來培養(yǎng)。或者，細(xì)菌也可以培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基上，例如營養(yǎng)瓊脂(Difco，Detroit，MI，Cat.No.212000)，胰蛋白酶大豆瓊脂(Difco，Detroit，MI，Cat.No.236920)，或M9基本瓊脂(Difco，Detroit，M，Cat.No.248510)。
分支桿菌疫苗載體菌株培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基，例如Middlebrook7H9(Difco，Detroit，MI，Cat.No.271310)或Saulton合成培養(yǎng)基中，優(yōu)選為在37℃。菌株可維持在靜止或搖動(dòng)培養(yǎng)。此外，可通過加入油酸(0.06％ v/v；Research Diagnostics Cat.No.01257)和諸如Tyloxapol(0.05％ v/v；Research Diagnostics Cat.No.70400)的去污劑增強(qiáng)分支桿菌的生長速率?？赏ㄟ^均勻地將100μl測定量的純分支桿菌培養(yǎng)物在磷酸緩沖鹽水(在本文中稱為PBS)中連續(xù)稀釋(例如，以10倍稀釋法從從純培養(yǎng)物稀釋至10-8)至含有25-30ml固體培養(yǎng)基，例如Middlebrook 7H10(BD Microbiology，Cockeyesville，MD，Cat.No.221174)的3.5英寸培養(yǎng)平板上。
收獲細(xì)菌的600nm下的光密度并非至關(guān)重要，其可以從0.1-5.0并依賴于所采用的具體菌株，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
2.rdsRNA片段的構(gòu)建正如之前所強(qiáng)調(diào)過的，美國專利20040132678依賴于輔助噬菌體(即，野生型dsRP)來啟動(dòng)rdsRP的產(chǎn)生。在這些條件下，20040132678所提供方法產(chǎn)生了含有野生型片段-S或野生型片段-M的resRP。即使在片段-S和-M中含有dsRP的裂解功能，但不可能清楚是否這些配置能夠在大規(guī)模制備中保持穩(wěn)定。同樣不清楚的是這一方法如何能夠?qū)⒁吧蚫sRP從rdsRP中分離出來。此外，20040132678并未提供如何以從頭合成方式啟動(dòng)rdsRP，以及如何產(chǎn)生并分離含有并復(fù)制rdsRN的穩(wěn)定載體菌株的任何指導(dǎo)。相反，本發(fā)明與rdsRN的穩(wěn)定制備相關(guān)。
通常，高至約10％的病毒基因組大小變異是可以耐受的，其使得在重組病毒載體中基因組大小具有一定程度的靈活性(Domingo andHolland，Annu.Rev.Microbiol.51151；1997)。在本發(fā)明的實(shí)施中，rdsRN中rdsRNA的大小等于片段-S-M和-L的總和加上或減去約10％。為了說明這一點(diǎn)，可使用phi-8作為示例。phi-8的基因組大小為14,984bp，因此，為了在包裝菌株中產(chǎn)生的表達(dá)phi-8片段-L的穩(wěn)定rdsRN，在這樣的rdsRN中，重組片段的大小為約7933±1500bp。
如下文所述，這一規(guī)則并非嚴(yán)格適用，因?yàn)橛锌赡軓膬H含有片段-L以及一個(gè)4.5kb rdsRNA片段-S的phi-8中獲得rdsRN(Sun等.，Virology，308354；2003)。這說明rdsRN能夠具有令人驚異的基因組靈活性。在以上示例中，重組片段-S包括得自于野生型片段-S和野生型片段-M的序列。在這一特定的文字性示例中，“得自”(例如“得自野生型片段-S”)是指存在于這一重組rdsRNA構(gòu)建體中的序列來源于野生型噬菌體的基因組序列并且是根據(jù)其野生型基因或編碼特征順序進(jìn)行重排的?？赏ㄟ^RT-PCR對(duì)來自野生型噬菌體的這些序列進(jìn)行擴(kuò)增和克隆，或根據(jù)在野生型噬菌體中出現(xiàn)的已知序列進(jìn)行化學(xué)合成。
還可以提供這樣的組合物，其所含有的基因組大小接近于野生型基因組大小。在一個(gè)方法中，可產(chǎn)生大小為7933±1500bp的重組片段-S。另一種方法利用的是兩種rdsRNA片段，一種含有片段-S包裝序列而另一種則含有片段-M包裝序列，其中重組片段的總大小為7933±1500bp(圖4)。在兩種方法中，至少有一種片段含有陽性選擇等位基因，與此同時(shí)有一種或兩種重組片段攜帶有真核表達(dá)盒。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，例如，可通過將以下cDNA和DNA序列結(jié)合起來，對(duì)rdsRNA片段的成分進(jìn)行裝配，(圖4)rdsRNA片段-S1.φ-8片段-S序列和基因8(Hoogstraten等，上文所述的，2000)。
2.連接于野生型片段-S基因8 orf核糖體結(jié)合位點(diǎn)的陽性選擇等位基因?；?編碼的是膜蛋白，其能夠與核殼保持相連并且是野生型片段-S的第一個(gè)開放閱讀框。
3.在IRES序列3’端具有HpaI，EcoRI，SalI和NotI限制性內(nèi)切酶(RE)位點(diǎn)的IRES序列，因而HpaI(鈍末端RE)提供了功能性地連接于IRES的ATG起始密碼子4.牛聚腺苷酸化序列(得自pcDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA，Cat.No.V860-20))5.φ-8片段-S RNA依賴的RNA聚合酶識(shí)別序列(Hoogstraten等，上文所述的，2000)rdsRNA片段-M6.φ-8片段-M序列和基因8(Hoogstraten等，上文所述的，2000)。
7.連接于基因10核糖體結(jié)合位點(diǎn)的陽性選擇等位基因。基因10是野生型片段-M的第一個(gè)開放閱讀形式且編碼φ-8的膜蛋白。
8.在IRES序列3’端具有HpaI，EcoRI，SalI和NotI限制性內(nèi)切酶(RE)位點(diǎn)的IRES序列，因而HpaI(鈍末端RE)提供了功能性地連接于IRES的ATG起始密碼子9.牛聚腺苷酸化序列(得自pcDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA，Cat.No.V860-20))10.φ-8片段-M RNA依賴的RNA聚合酶識(shí)別序列(Hoogstraten等，上文所述的，2000)雖然并不希望在理論上對(duì)范圍有所限制，但在很大程度上當(dāng)rdsRNA片段-S的大小大于7900±1500bp時(shí)，rdsRNA片段-M就不再被包裝，因?yàn)榇笥?900±1500bp的rdsRNA片段-S會(huì)誘導(dǎo)前衣殼中的構(gòu)象變化從而能夠識(shí)別并容納片段-L，由此產(chǎn)生了基因組大小是野生型基因組大小±10％的rdsRN。
可使用Applied Biosystems ABITM3900高通量DNA合成儀(FosterCity，CA)以及制造商提供的方法合成產(chǎn)生編碼rdsRNA片段的cDNA序列。為了合成片段-L及重組片段的cDNA拷貝，可通過PCR產(chǎn)生一系列的全長序列片段，并使用本領(lǐng)域公知的方法將其連接起來形成全長片段(Ausubel等，上文所述的，1990)。簡言之，可使用自動(dòng)化DNA合成儀(例如，Applied Biosystems ABITM3900高通量DNA合成儀(Foster City，CA 94404 U.S.A.))制備長度為100-200核苷酸的合成性寡核苷酸(即，優(yōu)選為其5’和3’端與編碼相鄰序列寡核苷酸的5’和3’端相匹配)。使用相同的方法，可以合成互補(bǔ)的寡核苷酸，并與互補(bǔ)的配對(duì)物退火從而形成雙鏈寡核苷酸。可通過連接將雙鏈寡核苷酸對(duì)(即，那些編碼相鄰序列的)結(jié)合從而形成更大的片段?？赏ㄟ^瓊脂糖凝膠電泳隊(duì)這些較大片段進(jìn)行純化，并使用凝膠純化試劑盒進(jìn)行分離(例如，TheQIAEXII Gel Extraction System，Qiagen，Santa Cruz，CA，Cat.No.12385)。重復(fù)這一程序直到構(gòu)建出全長DNA分子。在每一輪連接之后，可通過PCR擴(kuò)增這些片段從而提高產(chǎn)率。以從頭合成基因構(gòu)建體的方法是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，并在他處已有描述(Andre等，上文所述的，1998)；(Haas等.，上文所述的，1996)；或者，可以從，例如，Midland Certified Reagent Co.(Midland，TX)商業(yè)性地購買合成基因。
陽性選擇等位基因整合入rdsRNA片段的特定陽性選擇等位基因?qū)Ρ景l(fā)明而言并非至關(guān)重要，并且可以是在包裝菌株中能夠重新恢復(fù)顯性陰性突變的任意等位基因，例如但不僅限于彌補(bǔ)營養(yǎng)缺陷型突變的基因，例如aroA(Genbank登錄號(hào)X00557)，aroC(Genbank登錄號(hào)AY142231)，leuD(Genbank登錄號(hào)L06666)，或彌補(bǔ)對(duì)細(xì)胞壁合成至關(guān)重要基因突變的基因，例如asd(Genbank登錄號(hào)V00262)，或murI(Genbank登錄號(hào)AY520970)，或彌補(bǔ)對(duì)細(xì)胞分裂至關(guān)重要基因突變的基因，例如ftsZ(Genbank登錄號(hào)AF401529)。
IRES序列的來源缺乏5’帽子修飾物的mRNA分子在真核細(xì)胞中很難被翻譯，所述5’帽通常在細(xì)胞核內(nèi)被加入到核mRNA轉(zhuǎn)錄本中并增強(qiáng)核糖體識(shí)別，除非在目的基因的上游存在IRES序列。用于本發(fā)明中的特定IRES并非至關(guān)重要并且可以選自含有IRES序列的任意商業(yè)可獲得載體或選自任意可獲得的不受阻礙的序列。因此，IRES序列是可以廣泛獲得的，并可以使用對(duì)pIRES2-EGFP中位于核苷酸位點(diǎn)665-1251 IRES的5’和3’末端具有特異性的引物，通過PCR從質(zhì)粒pIRES2-EGFP(Clontech，Palo Alto，CA，Cat.No.63206)商業(yè)性地獲得。質(zhì)粒pIRES2-EGFP的序列可以從制造商處獲得(參見www.clontech.com)。還可以使用對(duì)質(zhì)粒pCITE4a(Novagen，Madison，WI5 Cat.No.69913；還可參見美國專利第4,937,190號(hào))中位于核苷酸位點(diǎn)16-518的CITE的5’和3’末端具有特異性的引物，通過PCR從質(zhì)粒pCITE4a(pCITE4a的完整序列可從位于novagen.com/docs/NDIS/69913-000.HTM處的網(wǎng)站獲得)中獲得類似的IRES，在質(zhì)粒pCITE4a-c；(美國專利第4,937,190號(hào))；pSLIRES11(AccessionAF171227)；pPV(Accession # Y07702)；pSVIRES-N(Accession #AJOOO1 56)；(Creancier等，J.Cell Biol.，10275-281；2000)；(Ramos and Martinez-Sala，RNA，101374-1383；1999)；(Morgan等，Nucleic Acids Res.，201293-1299；1992)；(Tsukiyama-Kohara等，J.Virol.，661476-1483；1992)；(Jang andWimmer等，Genes Dev.，41560-1572；1990)，或在雙順反子反轉(zhuǎn)錄病毒載體(Accession #D88622)中獲得類似的IRES；或發(fā)現(xiàn)于真核細(xì)胞的例如適用于嚴(yán)謹(jǐn)型組織特異性調(diào)節(jié)的成纖維細(xì)胞生長因子2IRES(Creancier，等，上文所述的，2000)或者針對(duì)于線粒體H+-ATP合酶β亞單位mRNA3’-非翻譯區(qū)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Izquierdo andCuezva，Biochem.J.，346849；2000)中發(fā)現(xiàn)類似的IRES。由于在HCV IRES中沒有IP，可將質(zhì)粒pIRES-G(Hobbs，S.M.CRC Centre forCancer Therapeutics，Institute of Cancer Research，Block F，15，CotswoldRoad，Belmont，Sutton，Surrey SM2 5NG，UK)用作IRES的來源，并且該質(zhì)粒的序列是可獲得的(Genebank登錄號(hào)Y1 1034)。
此外，使用位于ncbi.nlm.nih.gov的NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫和使用搜索參數(shù)“IRES not patent”進(jìn)行互聯(lián)網(wǎng)檢索可以得到140個(gè)含有IRES序列的文件。最終，可使用Applied Biosystems ABITM3900高通量DNA合成儀(Foster City，CA)，使用制造商提供的程序合成制備IRES cDNA。為了合成較大的IRES序列，例如pCITE4a中502bp的IRES，可通過PCR產(chǎn)生一系列片段并使用本領(lǐng)域公知的方法連接起來從而形成全長序列(Ausubel等，上文所述的，1990)。也可以使用Applied BiosystemsABITM3900高通量DNA合成儀(Foster City，CA)和制造商提供的程序在一個(gè)輪次中合成性地制備較小的IRES序列，例如在丙型肝炎病毒中的53bp IRES(Genebank登錄號(hào)1KH6A)。
可插入rdsRN中的目的異源基因的例子在本發(fā)明中，被導(dǎo)入真核翻譯表達(dá)盒進(jìn)入rdsRN的目的基因可以編碼免疫原，而所述resRN也因此可發(fā)揮疫苗的功能從而引起針對(duì)于免疫原的免疫反應(yīng)。免疫原可以是來自病毒、細(xì)菌和寄生性病原體的外源免疫原，也可以是內(nèi)源免疫原，例如，但不僅限于自身免疫抗原或腫瘤抗原。免疫原可以是全長的天然蛋白，外源免疫原和內(nèi)源蛋白之間的嵌合融合蛋白，或者是源自于病毒、細(xì)菌或寄生性病原體免疫原的模擬物、單個(gè)片段或多個(gè)片段。
在本說明書中，“外源免疫原”是指并非在受體動(dòng)物細(xì)胞或組織中正常表達(dá)的蛋白或其部分，例如，但不僅限于，病毒蛋白，細(xì)菌蛋白，寄生性蛋白，細(xì)胞因子，趨化因子，免疫調(diào)節(jié)劑或治療劑。
“內(nèi)源免疫原”是指在受體動(dòng)物細(xì)胞或組織中天然存在的蛋白或其部分，例如，但不僅限于，內(nèi)源細(xì)胞蛋白，免疫調(diào)節(jié)劑，或治療劑。
凋亡是程序化的細(xì)胞死亡，就其誘導(dǎo)和后果而言，與壞死性細(xì)胞死亡大相徑庭。已知含有外源抗原的細(xì)胞凋亡是針對(duì)于這些抗原的強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫刺激。由含有抗原的細(xì)胞凋亡引起的細(xì)胞免疫過程有時(shí)被稱為交叉-致敏過程(cross-priming)(Heath，W.R.，et ah，Immunol Rev1999；2004，Gallucci，S.M et ah，Nature Biotechnology.51249；1999，Albert，M.L et ah，Nature 39286；1988)?，F(xiàn)有若干凋亡的誘導(dǎo)機(jī)理能夠?qū)е律叩目乖禺愋约?xì)胞介導(dǎo)的免疫。caspase8介導(dǎo)的凋亡導(dǎo)致了抗原特異性的細(xì)胞免疫保護(hù)(Heath，W.R.，et ah，Immunol Rev1999；2004)。由rdsRN在細(xì)胞質(zhì)中引起的caspase8表達(dá)是一種有效的方法，其能夠在由rdsRN導(dǎo)致高水平外源抗原表達(dá)過程中誘導(dǎo)程序性的細(xì)胞死亡，導(dǎo)致抗原特異性的細(xì)胞免疫。死亡受體-5(DR-5)也可稱為TRAIL-R2(TRAIL受體2)或TNFR-SF-10B(腫瘤壞死因子-超家族成員10B)，其同樣能夠介導(dǎo)由caspase8介導(dǎo)的凋亡(Sheridan，J.P.，等.，Science 277818；1997)。呼腸孤病毒病毒誘導(dǎo)的凋亡是由TRAOL-DR5所介導(dǎo)的，導(dǎo)致隨后的病毒清除(Clarke，P.S.et ah，J.Virol；2000)。由rdsRN引起的DR-5表達(dá)可以為針對(duì)于rdsRN表達(dá)抗原的抗原特異性細(xì)胞免疫誘導(dǎo)提供強(qiáng)烈的佐劑效果。還可以對(duì)表達(dá)抗原的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)從而通過Fas連接而經(jīng)歷凋亡，其是誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的強(qiáng)烈刺激(Chattergoon，M.A.et at，Nat Biotechnology 18974；2000)。表達(dá)Fas或Fas細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域/CD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域融合蛋白的rdsRN能夠誘導(dǎo)凋亡以及針對(duì)于由rdsRN表達(dá)的抗原的抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。
以上所述的由rdsRN介導(dǎo)的凋亡所引起的細(xì)胞免疫的增強(qiáng)并不僅限于由rdsRN本身特異性編碼的抗原，而是包括了在rdsRN表達(dá)特異性凋亡介導(dǎo)物的細(xì)胞中的任意抗原。例如，如果將rdsRN遞送至誘導(dǎo)了凋亡的腫瘤細(xì)胞中，那么將可以利用腫瘤和/或腫瘤轉(zhuǎn)移的消除，降低或預(yù)防而進(jìn)行誘導(dǎo)針對(duì)于重要腫瘤抗原的細(xì)胞免疫力。
在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，如果將rdsRN遞送至腫瘤內(nèi)部或其他細(xì)胞中，這些rdsRN可以具有或缺乏誘導(dǎo)凋亡的能力并且具有編碼和產(chǎn)生外源抗源的能力，則可以產(chǎn)生比那些細(xì)胞更強(qiáng)烈的細(xì)胞反應(yīng)，所述外源抗原將產(chǎn)生強(qiáng)烈細(xì)胞免疫反應(yīng)。這些細(xì)胞反應(yīng)能夠產(chǎn)生免疫介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞破壞，進(jìn)一步交叉致敏以及誘導(dǎo)針對(duì)于腫瘤或其他重要抗原的的細(xì)胞免疫力，隨后清除、降低或預(yù)防腫瘤和/或腫瘤轉(zhuǎn)移的后。這種外源抗原的例子之一就是HLA抗原，其與宿主細(xì)胞HLA有所不同，能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈異源細(xì)胞反應(yīng)。
能夠誘導(dǎo)凋亡和遞送特異性腫瘤抗原的重組rdsRN能夠誘導(dǎo)針對(duì)于這些腫瘤抗原的強(qiáng)烈抗原特異性細(xì)胞反應(yīng)，包括在無需將所述rdsRN直接遞送入腫瘤本身的情況下，打破對(duì)這些抗原的耐受，導(dǎo)致消除、降低或預(yù)防腫瘤和/或腫瘤轉(zhuǎn)移。
在DNA損傷之后的凋亡或caspase9能夠誘導(dǎo)對(duì)某些抗原的耐受(Hugues，S.E.，et ah，Immunity 16169；2002)。耐受的誘導(dǎo)對(duì)控制或預(yù)防諸如但不限于糖尿病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，克羅恩病，炎性腸病和多發(fā)性硬化的自身免疫性疾病而言至關(guān)重要。caspase9的產(chǎn)生或由rdsRN在諸如但不僅限于β胰腺細(xì)胞，結(jié)腸直腸細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中產(chǎn)生的其他凋亡介導(dǎo)的耐受誘導(dǎo)蛋白能夠產(chǎn)生限制性的凋亡，其能夠在那些細(xì)胞中誘導(dǎo)針對(duì)于具有自身免疫能力抗原靶位的耐受，從而治療或預(yù)防自身免疫疾病。對(duì)涉及自身免疫反應(yīng)特異抗原的鑒定能夠允許通過rdsRN產(chǎn)生這些抗原和caspase9以及能其他能夠誘導(dǎo)凋亡介導(dǎo)的耐受的分子來誘導(dǎo)針對(duì)于這些自身免疫靶抗原的耐受，導(dǎo)致對(duì)這些自身免疫疾病的治療和/或預(yù)防。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，因此，提供了這樣的rdsRN，其編碼在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中至少一種基因，該基因表達(dá)凋亡促進(jìn)蛋白，例如但不限于沙門氏菌SopE(Genbank登錄號(hào)AAD54239，AAB51429或AAC02071)，志賀氏菌IpaB(Genbank登錄號(hào)AAM89553或AAM89536)，caspase-8(Genbank登錄號(hào)AAD24962或AAH06737)等，并在由所述rdsRN表達(dá)抗原的條件下提供了有效的誘導(dǎo)程序性的細(xì)胞死亡的方法，從而產(chǎn)生了針對(duì)于靶抗原的高水平T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力。或者，可以制備編碼至少一種基因的rdsRN，其表達(dá)DR-5，例如人DR-5(Genbank accession # BAA33723)，皰疹病毒-6(HHV-6)DR-5同源物(Genbank accession # CAA58423)等，從而為針對(duì)于靶抗原的抗原特異性細(xì)胞免疫力誘導(dǎo)提供強(qiáng)烈的佐劑效果。
換言之或除此之外，可通過合成基因編碼免疫原以及使用常規(guī)的重組DNA方法構(gòu)建免疫原(參見上文)。
外源免疫原可以是任意病毒、細(xì)菌或寄生性病原體在進(jìn)入動(dòng)物宿主、在動(dòng)物宿主中集落或復(fù)制的之前或過程中由病毒、細(xì)菌或寄生性病原體表達(dá)的任意分子；所述rdsRN可以表達(dá)源自病毒、細(xì)菌和寄生性病原體的免疫原或其部分。這些病原體可以感染人類，家畜或野生的動(dòng)物宿主。
從中可產(chǎn)生病毒抗原的病毒性病原體包括，但不限于正粘液病毒，例如流感病毒(分類ID59771；逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如RSV，HTLV-1(分類ID39015)，和HTLV-II(分類ID11909)，乳頭瘤病毒，例如HPV(分類ID337043)，皰疹病毒，例如EBV分類ID10295)；CMV(分類ID10358)或單純皰疹病毒(ATCC #VR-1487)；慢病毒，例如HIV-1(分類ID12721)和HTV-2分類ID11709)；棒狀病毒，例如狂犬病毒；微小RNA病毒，例如脊髓灰質(zhì)炎病毒(分類ID12080)；痘病毒，例如牛痘病毒(分類ID10245)；輪狀病毒(分類ID10912)；和細(xì)小病毒，例如腺相關(guān)病毒1(分類ID85106)。
病毒抗原的示例可在以下組中找到，其包括但不限于人免疫缺陷性病毒抗原Nef(National Institute of Allergy and Infectious Disease HTVRepository Cat.# 183；Genbank accession # AF238278)，Gag，Env(National Institute of Allergy and Infectious Disease HTV RepositoryCat.# 2433；Genbank accession # U39362)，Tat(National Institute ofAllergy and Infectious Disease HIV Repository Cat.# 827；Genbankaccession # M1 3137)，Tat突變體衍生物，例如Tat-Δ31-45(Agwale等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9910037；2002)，Rev(National Institute ofAllergy and Infectious Disease HIV Repository Cat.# 2088；Genbankaccession # L14572)，和Pol(National Institute of Allergy and InfectiousDisease HIV Repository Cat.# 238；Genbank accession # AJ237568)和gp120的T細(xì)胞和B細(xì)胞表位(Hanke and McMichael，AIDS ImmunolLett.，66177；1999)；(Hanke，等，Vaccine，17589；1999)；(Palker等，J.Immunol.，1423612-3619；1989)HTV-1 Env和gp120的嵌合體衍生物，例如但不限于gp120和CD4的融合體(Fouts等，J.Virol.2000，7411427-11436；2000)；HIV-1 env截短或修飾的衍生物，例如但不限于gp140(Stamatos等，J Virol，729656-9667；1998)或HIV-IEnv的衍生物和/或gp140的衍生物(Binley，等，J Virol，762606-2616；2002)；(Sanders，等，J Virol，745091-5100(2000)；(Binley，等.J Virol，74627-643；2000)，乙型肝炎病毒表面抗原(Genbank accession #AF043578)；(Wu等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，864726-4730；1989)；輪狀病毒抗原，例如VP4(Genbank accession # AJ293721)；(Mackow等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，87518-522；1990)和VP7(GenBank accession # AY003871)；(Green等，J.Virol.，621819-1823；1988)，流感病毒抗原，例如紅血球凝聚素或(GenBankaccession # AJ404627)；(Pertmer and Robinson，Virology，257406；1999)；核蛋白(GenBank accession # AJ289872)；(Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.，979654-9658；2000)單純皰疹病毒抗原，例如胸苷激酶(Genbank accession # AB047378；(Whitley等，InNew GenerationVaccines，pages 825-854)。
從中可產(chǎn)生細(xì)菌抗原的細(xì)菌性病原體包括但不限于分支桿菌亞種(Mycobacterium spp)，螺桿菌亞種(Helicobacter spp)，沙門氏菌亞種(Salmonella spp)，志賀氏菌亞種(Shigella spp)，大腸桿菌，立克次體亞種(Rickettsia spp)，李斯特菌亞種(Listeria spp)，肺炎軍團(tuán)桿菌(Legionella pneumoniae spp)，假單孢桿菌亞種(Pseudomonas spp)，弧菌亞種(Vibrio spp)，炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis spp)和伯氏疏螺旋體(Borellia burgdorferi spp)。
細(xì)菌病原體保護(hù)性抗原的示例包括腸毒性大腸桿菌的菌體抗原，例如CFA/I菌毛抗原(Yamamoto等，Infect.Immun.，50925-928；1985)以及不耐熱毒素的非毒性B亞基(Klipstein等，Infect.Immun.，40888-893；1983)；百日咳桿菌(Bordetella pertussis)的百日咳桿菌粘附素(pertactin)(Roberts等，Vacc，1043-48；1992)，百日咳桿菌的腺苷酸環(huán)化酶溶血素(Guiso等，Micro.Path.，11423-431；1991)，破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)破傷風(fēng)毒素的片段C(Fairweather等，Infect.Immun.，581323-1326；1990)，伯氏疏螺旋體(Borellia burgdorferi)的OspA(Sikand等，Pediatrics，108123-128；2001)；(Wallich等，Infect Immun，692130-2136；2001)，普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)和斑疹傷寒立克次體(Rickettsia typhi)的保護(hù)性次晶體-表層蛋白(Carl等.，Proc Natl Acad Sci USA，878237-8241；1990)，李斯特菌溶胞素(也被稱為″Llo″和″Hly″)和/或單核細(xì)胞增多性里斯特菌(Listeriamonocytogenes)的超氧化物歧化酶(也被稱為″SOD″和″p60″)(Hess，J.，等.，Infect.Immun.651286-92；1997)；Hess，J.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.931458-1463；1996)；(Bouwer等，J.Exp.Med.1751467-71；1992)，幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)的脲酶(Gomez-Duarte等，Vaccine 16，460-71；1998)；(Corthesy-Theulaz，等，Infection & Immunity66，581-6；1998)，以及炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)保護(hù)性抗原和致死因子受體結(jié)合蛋白(Price，等，Infect.Immun.69，4509-4515；2001)。
從中產(chǎn)生寄生性抗原的寄生性病原體包括但不限于瘧原蟲亞種(Plasmodium spp.)，例如鐮狀瘧原蟲(Plasmodium falciparum)(ATCC#30145)；錐形蟲亞種(Trypanosome spp.)，例如克氏錐蟲亞種(Trypanosoma cruzi)(ATCC#50797)；賈第蟲亞種(Giardia spp.)，例如腸賈第蟲(Giardia intestinalis)(ATCC#30888D)；牛蜱亞種(Boophilusspp.)，巴貝蟲亞種(Babesia spp.)，例如果氏巴貝蟲(Babesiamicroti)(ATCC#30221)；內(nèi)變形蟲亞種(Entamoeba spp.)，例如溶組織內(nèi)變形蟲(Entamoeba histolytica)(ATCC#30015)；艾美球蟲亞種(Eimeria spp.)，例如巨型艾美球蟲(Eimeria maxima)(ATCC#40357)；利什曼原蟲亞種(Leishmania spp.)(分類ED38568)；血吸蟲亞種(Schistosome spp.)，布魯絲蟲亞種(Brugia spp.)，片吸蟲亞種(Fascidaspp.)，惡絲蟲亞種(Dirofilaria spp.)，吳策線蟲亞種(Wuchereria spp.)和(Onchocerea spp.)。
寄生性病原體保護(hù)性抗原的示例包括瘧原蟲亞種的環(huán)孢子體抗原(Sadoff等，Science，240336-337；1988)，例如伯杰氏瘧原蟲(P.bergerii)的環(huán)孢子體抗原或鐮狀瘧原蟲的環(huán)孢子體抗原；瘧原蟲亞種(Plasmodium spp.)的裂殖子表面抗原(Spetzler等，Int.J.Pept.Prot.Res.，43351-358；1994)；溶組織內(nèi)變形蟲(Entamoeba histolytica)的半乳糖特異性凝集素(Mann等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，883248-3252；1991)，利什曼原蟲亞種(Leishmania spp.)的gp63(Russell等，J.Immunol.，1401274-1278；1988)；(Xu and Liew，Immunol.，84173-176；1995)，碩大利什曼原蟲(Leishmania major)的gp46(Handman等，Vaccine，183011-3017；2000)；馬來絲蟲(Brugia malayi)的副肌球蛋白(Li ef al，MoI.Biochem.Parasitol.，49315-323；1991)，曼森血吸蟲(Schistosoma mansoni)的磷酸丙糖異構(gòu)酶，(Shoemaker等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，891842-1846；1992)；蛇形毛圓線蟲(Trichostrongylus colubriformis)的分泌性球蛋白樣蛋白(Frenkel等，MoI.Biochem.Parasitol.，5027-36；1992)；Frasciola hepatica(Hillyer等，Exp.Parasitol.，75176-186；1992)，牛血吸蟲(Schistosoma bovis)和日本血吸蟲(S.japonicum)(Bashir等，Trop.Geog.Med.，46255-258；1994)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶；以及牛血吸蟲(Schistosoma bovis)和日本血吸蟲(S.japonicum)的KLH(Bashir等，上文所述的，1994)。
如本文之前所提及的，rdsRN疫苗可以編碼內(nèi)源性免疫原，所述內(nèi)源性免疫原可以是任意的細(xì)胞蛋白，免疫調(diào)節(jié)劑，或治療劑或其部分，其可以在受體細(xì)胞，包括但不限于腫瘤，移植和自身免疫性免疫原，或腫瘤，移植和自身免疫性免疫原的片段和衍生物中進(jìn)行表達(dá)。因此，在本發(fā)明中，dsRP可以編碼腫瘤，移植或自身免疫性免疫原，或其部分或衍生物?；蛘?，dsRP可以編碼合成的基因(如上文所述制備)，其腫瘤編碼特異性的，移植的或自身免疫性抗原或其部分。
腫瘤特異性抗原的示例包括前列腺特異性抗原(Gattuso等，人Pathol.，26123-126；1995)，TAG-72和CEA(Guadagni等，Int.J.Biol.Markers，953-60；1994)，MAGE-1和酪氨酸酶(Coulie等，J.Immunothera.，14104-109；1993)。近來，在小鼠中已表明，用表達(dá)腫瘤抗原的非惡性細(xì)胞進(jìn)行免疫提供了疫苗的效果，且還幫助動(dòng)物產(chǎn)生了免疫反應(yīng)從而清除了表現(xiàn)出相同抗原的惡性腫瘤(Koeppen等，Anal.N.Y.Acad.Sci.，690244-255；1993)。
移植抗原的示例包括T細(xì)胞上的CD3分子(Alegre等，Digest.Dis.Sci.，4058-64；1995)。用CD3受體的抗體處理證明了循環(huán)T細(xì)胞的快速清除并逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞介導(dǎo)的移植排斥(Alegre等，上文所述的，1995)。
自身免疫性抗原的示例包括IASβ鏈(Topham等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，918005-8009；1994)。用具有來自IASβ鏈的18個(gè)氨基酸的肽對(duì)小鼠進(jìn)行免疫被證明可以對(duì)具有實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的小鼠提供保護(hù)和治療(Topham etal，上文所述的，1994)。
此外，rdsRNA片段可被構(gòu)建成用于編碼佐劑，并可用于增強(qiáng)宿主對(duì)免疫原的免疫反應(yīng)。由rdsRNA編碼的特定佐劑對(duì)本發(fā)明并非至關(guān)重要，且其可以是霍亂毒素的A亞基(即CtxA；GenBank登錄號(hào)X00171，AF175708，D30053，D30052，)，或其部分和/或突變體衍生物(例如，霍亂毒素A亞基的A1結(jié)構(gòu)域(即CtxA1；GenBank登錄號(hào)K02679)，來自于任意標(biāo)準(zhǔn)的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)(例如，霍亂弧菌(V.cholerae)菌株395，ATCC#39541)或E1 Tor霍亂弧菌(E1 Tor V.cholerae)(例如，霍亂弧菌(V.cholerae)菌株2125，ATCC#39050)菌株?；蛘?，細(xì)菌腺苷二磷酸核糖化外毒素家族成員中的任意細(xì)菌毒素(Krueger andBarbier，Clin.Microbiol.Rev.，834；1995)，都可以用于替代CtxA；例如腸毒性大腸桿菌(GenBank accession#M35581)的不耐熱毒素A亞基(在此稱為EItA)，百日咳毒素S1亞基(例如，ptxS1，GenBank accession#AJ007364，AJ007363，AJ006159，AJ006157，etc.)；又或者，佐劑可以是百日咳桿菌(Bordetella pertussis)(ATCC#8467)，支氣管敗血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)(ATCC#7773)或副百日咳博代氏桿菌(Bordetella parapertussis)(ATCC#15237)的腺苷酸環(huán)化酶溶血素，例如，百日咳桿菌(B.pertussis)(GenBank登錄號(hào)X14199)，副百日咳博代氏桿菌(B.parapertussis)(GenBank登錄號(hào)AJ249835)或支氣管敗血性博德特氏菌(B.bronchiseptica)(GenBank登錄號(hào)Z37112)的cyaA基因。
還可以構(gòu)建編碼細(xì)胞因子的rdsRNA片段。由rdsRNA編碼的特定細(xì)胞因子對(duì)本發(fā)明并非至關(guān)重要，其包括但不限于，白介素-4(在本文中稱為″IL-4″；Genbank登錄號(hào)AF352783(鼠IL-4)或NM_000589(人IL-4)，IL-5(Genbank登錄號(hào)NM_010558(鼠IL-5)或NM_000879(人IL-5)，IL-6(Genbank登錄號(hào)M20572(鼠IL-6)或M29150(人IL-6)，IL-10(Genbank登錄號(hào)NM-010548(鼠IL-10)或AF418271(人IL-10)，IL-12p40(Genbank登錄號(hào)NM_008352(鼠IL-12p40)或AY008847(人IL-12p40)，IL-12p70(Genbank登錄號(hào)NM_008351/NM_008352(鼠IL-12p35/40)或AF093065/AY008847(人IL-12p35/40)，TGFβ(Genbank登錄號(hào)NM_011577(鼠TGFβ1)或M60316(人TGFβ1)，以及TNFαGenbank登錄號(hào)X02611(鼠TNFα)或M26331(人TNFα)。
此外，還可以在rdsRNA片段中編碼小抑制性RNA或反義RNA，以在靶組織中調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)。
還描述重組DNA和RNA方法，其可用于導(dǎo)入功能性表達(dá)盒從而產(chǎn)生能夠在上文中所述的真核細(xì)胞或組織中表達(dá)免疫調(diào)節(jié)抑制劑的rdsRNA。
正如在真核表達(dá)盒中所編碼的示例型疫苗構(gòu)建體那樣，也可以構(gòu)建病毒樣顆粒(在此稱為“VLP”)從而誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)于病毒性病原體的保護(hù)性免疫反應(yīng)。已經(jīng)證明流感VLP能夠在編碼血凝素(HA)，神經(jīng)氨酸酶(NA)和基質(zhì)蛋白(M1和M2)基因序列的質(zhì)粒表達(dá)之后自我裝配(Latham等.，J.Virol，756154-6165；2001)。如此構(gòu)建的VLP還能夠進(jìn)行膜融合以及出芽從而進(jìn)一步在動(dòng)物模型中加強(qiáng)產(chǎn)生抗體的免疫反應(yīng)和保護(hù)性免疫力(Pushko等.，Vaccine.2005 Sep 2；[在書面出版之前的電子出版])。HIV VLP可類似地從編碼衣殼蛋白146-231氨基酸的基本序列進(jìn)行裝配，這是一個(gè)六氨基酸的十四烷基化序列，該序列編碼P2肽，GCN4亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，以及gp160包膜前體(Accola等，J.Virol，745395-5402；2000)。HPV的主要蛋白L1已被證明能夠自我組裝成VLP的各種細(xì)胞系并能夠產(chǎn)生體液免疫力和細(xì)胞免疫力，從而使得編碼這一蛋白的基因成為了令人關(guān)注的免疫原(Shi等，J Virol.，75(21)10139-10148；2001)。
3.攜帶有α病毒表達(dá)盒的rdsRNA片段的構(gòu)建如上文所述，rdsRN可含有哺乳動(dòng)物翻譯表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有來自功能性連接于目的基因的質(zhì)粒pSFV1(Invitrogen Inc.，Carlsbad，CA)的塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)(在本文中稱為″SFV″)自我擴(kuò)增復(fù)制子?？赏ㄟ^PCR擴(kuò)增編碼SFV非結(jié)構(gòu)蛋白1-4的基因(在本文中稱為″nsp1-4″)和pSFV1中的復(fù)制酶識(shí)別位點(diǎn)，并通過鈍端連接插入位于rSeg-S中功能性連接于IRES并緊鄰其下游的HpaI位點(diǎn)，得到rSeg-S::SFV1(圖5)。質(zhì)粒rSeg::SFV1中的SmaI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)可作為任意外源或內(nèi)源目的基因，例如那些上文所提到基因的插入位點(diǎn)。
需要注意的是，在含有含陽性選擇等位基因的rdsRNA片段-S和α病毒nsp1-4以及約8100bp擴(kuò)增子的rdsRN中，當(dāng)目的基因超過800bp時(shí)(即基因組大小超過了野生型基因組大小的10％)，片段-L的吸收受到阻止。需要注意的是，在所有情況下，含有含陽性選擇等位基因的rdsRNA片段-S和α病毒nsp1-4以及擴(kuò)增子的rdsRN并不需要rdsRNA片段-M。
可以通過產(chǎn)生表達(dá)缺乏5’pac序列的片段L的修飾衍生物的包裝菌株來解決容量上的限制。這樣的序列能夠表達(dá)產(chǎn)生前衣殼所必需的蛋白但卻不能在核殼中進(jìn)行包裝，從而在所述菌株所產(chǎn)生的rdsRN中提供了額外的7000bp的容量。
這些構(gòu)建體中的修飾片段-L可以在表達(dá)載體，例如pT7/T3-18(Ambion，Austin，TX，Cat.No.7201)中導(dǎo)入包裝菌株，或通過使用本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的方法通過等位基因交換整合入染色體(Hamilton等，上文所述的，1989)；(Blomfield等，上文所述的，1991)。染色體整合的位置對(duì)本領(lǐng)域而言并不重要，盡管在優(yōu)選實(shí)施方案中，在編碼片段-L表達(dá)盒的DNA被整合入染色體從而失活了基因并且在確定的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生了選擇性的表現(xiàn)型，例如aroA(Genbank登錄號(hào)X00557)，aroC(Genbank登錄號(hào)AY142231)，leuD(Genbank登錄號(hào)L06666)asd(Genbank登錄號(hào)V00262)，murI(Genbank登錄號(hào)AY520970)kdsA(Genbank登錄號(hào)AY174101)和htrB(Genbank登錄號(hào)AF401529)。染色體整合的程序和培養(yǎng)這些突變體的方法都有詳細(xì)的記載(Hamilton等，J.Bacteriol.1714617；1989)；(Blomfield等，MoI.Microbiol.51447；1991)。
4.以從頭合成的方式產(chǎn)生rdsRN的方法在包裝菌株中通過導(dǎo)入編碼產(chǎn)生rdsRNA所必需全部信息的RNA并隨后吸收入前衣殼而產(chǎn)生rdsRN。rRNA可以是直接導(dǎo)入的或者可以是在非復(fù)制型質(zhì)粒上編碼的，其可以共導(dǎo)入包裝菌株。編碼片段-L的基因以及由此產(chǎn)生的前衣殼可以存在于包裝菌株中的質(zhì)粒上或可以整合入包裝菌株的染色體上?；蛘?，編碼片段-L的正鏈RNA可與編碼重組片段-S和-M的正鏈RNA一同被導(dǎo)入包裝菌株。一旦前衣殼整合了片段-S和-M的重組ssRNA(在本文中被稱為ssRNA)，其必需具有足夠的大小并具有適當(dāng)?shù)陌b序列，從而產(chǎn)生吸收片段-L mRNA的信號(hào)，后者隨后被整合且所有包裝的ssRNA都被轉(zhuǎn)化成dsRNA，導(dǎo)致了rdsRN的產(chǎn)生。此時(shí)，rdsRN能夠產(chǎn)生重組片段-S和-M mRNA以及片段-L mRNA；后者能夠表達(dá)組成前衣殼的蛋白，其能夠吸收整合重組片段和片段-L mRNA，然后轉(zhuǎn)變成dsRNA從而產(chǎn)生額外的rdsRN(圖6)。
可通過電穿孔將體外合成的重組片段mRNA導(dǎo)入包裝菌株。優(yōu)選地，可使用氟化的rNTP(Durascribe，Epicentre，Madison，WI)產(chǎn)生氟化RNA從線性DNA模板體外轉(zhuǎn)錄RNA，其是耐受核酸酶的RNA。以每種5mM的終濃度將氟化的dUTP和dCTP整合入反應(yīng)混合物中。雖然fNTP是優(yōu)選地，但具有核酸酶抗性的任意修飾的rNTP，例如巰基或氨基己基取代的rNTP，都可用于本發(fā)明。因此，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可以使用任意修飾的具有核酸酶抗性的NTP取代氟化的NTP。
RNA或優(yōu)選的氟化RNA能夠編碼彌補(bǔ)所述至少一種選擇性表型突變的至少一種基因產(chǎn)物以及可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA。在優(yōu)選實(shí)施方案中，氟化RNA編碼彌補(bǔ)所述至少一種選擇性表型突變，即用于穩(wěn)定產(chǎn)生核殼的基因-8(SEQ ID 7)的至少一種基因產(chǎn)物；以及可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA。
為了在將rdsRN導(dǎo)入所述包裝菌株中，產(chǎn)生了電穿孔介質(zhì)，包含以下成分(i)密度為108-1011cfu/ml用于包裝、導(dǎo)入和產(chǎn)生rdsRN的電感受態(tài)細(xì)菌菌株，含有a)含有至少一種不可回復(fù)選擇性表型突變的基因組DNA；b)編碼產(chǎn)生前衣殼所必需基因的核酸序列；以及c)含有RNA包裝活性和RNA聚合酶活性的蛋白的一種或多種前衣殼；(ii)編碼彌補(bǔ)所述至少一種選擇性表型突變基因產(chǎn)物的1ng-1mg，優(yōu)選為1mcg-100mcg，更優(yōu)選為5mcg-40mcg RNA以及可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，rdsRN被導(dǎo)入所述包裝菌株中，采用的是電穿孔介質(zhì)，包含以下成分(i)密度為108-1011cfu/ml用于包裝、導(dǎo)入和產(chǎn)生rdsRN的電感受態(tài)細(xì)菌菌株，含有
a)含有至少一種不可回復(fù)選擇性表型突變的基因組DNA；b)編碼產(chǎn)生前衣殼所必需基因的核酸序列；以及c)含有RNA包裝活性和RNA聚合酶活性的蛋白的一種或多種前衣殼；(ii)編碼彌補(bǔ)所述至少一種選擇性表型突變，用于穩(wěn)定核殼產(chǎn)生的基因-8(SEQ ID 7)的基因產(chǎn)物的1ng-1mg，優(yōu)選為1mcg-100mcg，更優(yōu)選為5mcg-40mcg RNA以及可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA。
或者，rdsRN被導(dǎo)入所述包裝菌株中，采用的是電穿孔介質(zhì)，包含以下成分(i)密度為108-1011cfu/ml用于包裝、導(dǎo)入和產(chǎn)生rdsRN的電感受態(tài)細(xì)菌菌株，含有a)含有至少一種不可回復(fù)選擇性表型突變的基因組DNA；編碼彌補(bǔ)所述至少一種選擇性表型突變，即產(chǎn)生前衣殼所必需的核酸序列編碼基因，用于穩(wěn)定核殼產(chǎn)生的基因-8(SEQ ID 7)基因產(chǎn)物的1ng-1mg，優(yōu)選為1mcg-100mcg，更優(yōu)選為5mcg-40mcg RNA以及可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA。
在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，rdsRN被導(dǎo)入所述包裝菌株中，采用的是電穿孔介質(zhì)，包含以下成分(i)密度為108-1011cfu/ml用于包裝、導(dǎo)入和產(chǎn)生rdsRN的電感受態(tài)細(xì)菌菌株，含有a)含有至少一種不可回復(fù)選擇性表型突變的基因組DNA；b)編碼產(chǎn)生前衣殼所必需基因的核酸序列；以及c)具有RNA包裝活性和RNA聚合酶活性蛋白的一種或多種前衣殼；(ii)編碼彌補(bǔ)所述至少一種選擇性表型突變，用于穩(wěn)定核殼產(chǎn)生基因-8(SEQ ID 7)基因產(chǎn)物的1ng-1mg，優(yōu)選為1mcg-100mcg，更優(yōu)選為5mcg-40mcg氟化RNA以及可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA。
在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，rdsRN被導(dǎo)入所述包裝菌株中，采用的是電穿孔介質(zhì)，由以下成分構(gòu)成(i)密度為108-1011cfu/ml用于包裝、導(dǎo)入和產(chǎn)生rdsRN的電感受態(tài)細(xì)菌菌株，含有a)含有至少一種不可回復(fù)選擇性表型突變的基因組DNA；(ii)編碼彌補(bǔ)所述至少一種選擇性表型突變，前衣殼產(chǎn)生所必需的核酸序列編碼基因，用于穩(wěn)定核殼產(chǎn)生的基因-8(SEQ ID 7)基因產(chǎn)物的1ng-1mg，優(yōu)選為1mcg-100mcg，更優(yōu)選為5mcg-40mcg氟化RNA；以及可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA。
用于將所述RNA或優(yōu)選的，氟化RNA電穿孔進(jìn)入所述包裝菌株的方法對(duì)本發(fā)明并非至關(guān)重要，并可以使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)程序來完成(Ausubel等，上文所述的，1990；Sambrook，上文所述的)。在電穿孔之后，可將電穿孔介質(zhì)與回復(fù)培養(yǎng)基混合，如文獻(xiàn)所述(Ausubel等，上文所述的，1990；Sambrook，上文所述的)，并在37℃孵育30分鐘-4小時(shí)，優(yōu)選為2小時(shí)。
在只允許攜帶并表達(dá)重組片段中陽性選擇等位基因的菌株生長的條件下，可以在固體培養(yǎng)基上分離到電轉(zhuǎn)化子(例如，胰蛋白酶大豆瓊脂(在本文中稱為TSA)，Difco，Detroit，MI).。
在25℃-44℃的溫度范圍下將含有rdsRN的細(xì)菌分離物培養(yǎng)16-96小時(shí)；然而，優(yōu)選地是先在28℃對(duì)轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)48小時(shí)。隨后通過標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)生長于選擇性固體培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行分離和純化(Ausubel等，上文所述的，1990)；(Sambrook，上文所述的)。為了驗(yàn)證所選擇的分離物攜帶有目的功能性rdsRN，可使用設(shè)計(jì)為特異性擴(kuò)增包括但不限于鏈特異性包裝序列，陽性選擇等位基因，IRES和目的基因的正鏈和負(fù)(第二)鏈RNA序列的引物，通過RT-PCR對(duì)單個(gè)的分離物進(jìn)行篩選。對(duì)RNA制劑進(jìn)行分析的方法是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所公知的，如下文所述?？梢栽谝后w培養(yǎng)基(例如，胰蛋白酶大豆肉糖(在本文中稱為″TSB″)，Difco MO)中培養(yǎng)單獨(dú)的分離物，并在600nm的光密度(OD600)達(dá)到0.001-4.0之后收集所得培養(yǎng)物，以無菌TSB的OD600作為對(duì)照?？墒褂迷谒巿?bào)道過和本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的方法從這些培養(yǎng)物中分離核殼(Gottlieb等，J.Bacterid 1725774；1990)；(Sun等，上文所述的，2003)。使用Clone Manager軟件4.1版本(Scientific andEducational Software Inc.，Durham，NC)或OLIGO 4.0引物分析軟件(Wojciech Rychlik版權(quán)所有)設(shè)計(jì)進(jìn)行分析的PCR引物。這種軟件可使得PCR引物的設(shè)計(jì)與需要進(jìn)行操作的特定DNA片段相匹配。在Bio RadiCycler(Hercules，CA)上進(jìn)行RT-PCR，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序設(shè)定所述RT-PCT中的引物退火，延長和變性時(shí)間(Ausubel等，上文所述的)。隨后使用標(biāo)準(zhǔn)程序通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析(Ausubel等，上文所述的，1990)；(Sambrook，上文所述的)。如果某個(gè)克隆表現(xiàn)出說明rdsRNA片段穩(wěn)定維持于所述菌株的合適的RT-PCR圖譜，則被定義為陽性克隆。可使用標(biāo)準(zhǔn)DNA測序方法對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步測定，如下所述。
在完成對(duì)所希望轉(zhuǎn)化子的鑒定之后，可將單獨(dú)的菌株保存于保存培養(yǎng)基中，其是含有10-30％(v/v)甘油的TS。可以使用無菌的棉簽從固體培養(yǎng)基上收獲細(xì)菌分離物，并以108-109cfu/ml的密度重懸于保存培養(yǎng)基中，并將重懸物保存于-80℃。
可使用本領(lǐng)域公知的方法以及在他處詳細(xì)公開的方法從所述載體菌株中純化得到不同批次的純化rdsRN(Mindich，等，J Virol 66，2605-10；1992)；(Mindich，等，Virology 212213-217；1995)；(Mindich，等，J Bacteriol 1814505-4508；1999)；(Qiao，等，Virology 275218-224；2000)；(Qiao，等，Virology 227103-110；1997)；(Olkkonen，等，Proc Natl Acad Sci USA 879173-9177；1990)；(Onodera，等，J Virol66，190-196；1992)。
5.使用rdsRN進(jìn)行誘導(dǎo)從而在體內(nèi)引起生物學(xué)作用用于制備本文中新型rdsRP表達(dá)系統(tǒng)的具體方法對(duì)本發(fā)明并非至關(guān)重要，并可選自于生理緩沖液(Feigner等，U.S.Patent#5589466(1996)；磷酸鋁或羥基磷酸鋁(aluminum hydroxyphosphate)(例如，Ulmer等，Vaccine，1818；2000)，單磷酸酰脂A(也稱為MPL或MPLA；Schneerson等，J.Immunol.，1472136-2140；1991)；(例如，Sasaki等，Inf.Immunol.，653520-3528；1997)；(Lodmell等，Vaccine，181059-1066；2000)，QS-21皂苷(例如，Sasaki，等，J.Virol.，724931；1998)；地塞米松(dexamethasone)(例如，Malone，等，J.Biol.Chem.26929903；1994)；CpG DNA序列(Davis等，J.Immunol.，15870；1998)；或脂多糖(LPS)拮抗劑(Hone等，上文所述的1997)。
可以通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)和口腔灌注的方式，將rdsRN直接給藥進(jìn)入真核細(xì)胞、動(dòng)物組織或人體組織。本文所述的用于將rdsRN構(gòu)建體導(dǎo)入靶細(xì)胞或組織的特定方法對(duì)本發(fā)明并非至關(guān)重要，并可選自之前所述的免疫方法(Wolff，等，Biotechniques 11474-85；1991)；(Johnston and Tang，Methods Cell Biol 43353-365；1994)；(Yang and Sun，Nat Med 1481-483；1995)；(Qiu，等，Gene Ther.3262-8；1996)；(Larsen，等，J.Virol.721704-8；1998)；(Shata andHone，J.Virol.759665-9670；2001)；(Shata，等，Vaccine 20623-629；2001)；(Ogra，等，J Virol 713031-3038；1997)；(Buge，等，J.Virol.718531-8541；1997)；(Belyakov，等，Nat.Med.7，1320-1326；2001)；(Lambert，等，Vaccine 193033-3042；2001)；(Kaneko，等，Virology2678-16；2000)；(Belyakov，等，Proc Natl Acad Sci USA 964512-4517；1999)。
由本發(fā)明所述覆蓋的特定生物學(xué)作用包括，但不限于，保護(hù)性或調(diào)節(jié)性的免疫反應(yīng)，治療反應(yīng)，以及宿主蛋白表達(dá)的下調(diào)(例如siRNA)或表達(dá)上調(diào)(例如細(xì)胞因子表達(dá))。一開始，以102-109核殼顆粒的劑量，采用適當(dāng)?shù)耐緩浇o藥rdsRN，例如口服，鼻內(nèi)，皮下，肌內(nèi)，或通過侵入性的病毒載體(Sizemore等，Science.1995 Oct 13；270(5234)299-302)。劑量數(shù)目的變化可根據(jù)個(gè)體rdsRN的效價(jià)而變化，并可以是間隔2-4周的單次，兩次或三次劑量給藥療法。每一種表達(dá)研究都包括不含有目的基因的陰性對(duì)照rdsRN，以及可作為陽性對(duì)照的編碼目的基因的DNA疫苗載體。
在生物系統(tǒng)內(nèi)測定rdsRN編碼的基因表達(dá)的生物學(xué)作用的方法是本領(lǐng)域所公知的。例如，為了測定血清IgG和IgA對(duì)gp120的反應(yīng)，可以在免疫之前以及免疫后10，20，30，40，50，60，70，和80天收集血清。從每只小鼠的尾靜脈采集約400-500μl血液病收集至單獨(dú)的試管中，通過在冰上孵育4小時(shí)使其凝固。在離心機(jī)中離心5分鐘之后，將血清轉(zhuǎn)移至新管中并保存于-80℃?？墒褂迷诿庖咧蠖ㄆ谑占募S便顆粒和陰道沖洗物來測定粘膜IgG和IgA對(duì)于由目的基因所表達(dá)抗原的反應(yīng)(Srinivasan等，Biol.Reprod.53462；1995)；(Staats等，J.Immunol.157462；1996)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)ELISA來定量IgG和IgA對(duì)血清和粘膜樣本中g(shù)p120的反應(yīng)(Abacioglu等，ADDS Res.Hum.Retrovir.10371；1994)；(Pincus等，AIDS Res.Hum.Retrovir.121041；1996)。卵清蛋白可包括在每個(gè)ELISA中作為陰性對(duì)照抗原。此外，適當(dāng)?shù)那闆r下每個(gè)ELISA還包括陽性對(duì)照血清，以及糞便顆粒或陰道清洗物樣品。可從用10μg由目的基因表達(dá)的蛋白和混合有10μg霍亂毒素進(jìn)行鼻內(nèi)接種的動(dòng)物中收集到陽性對(duì)照樣本(Yamamoto等，Proc.Natl.Acad.Sci.945267；1997)。通過對(duì)490nm吸收值產(chǎn)生增加的最后一次血清稀釋取倒數(shù)可以計(jì)算出終點(diǎn)滴度，所述吸收值大于陰性對(duì)照列的平均數(shù)加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差值。
為了測定細(xì)胞的免疫力，可使用來自淋巴組織的富集CD4+和CD8+T細(xì)胞懸液通過細(xì)胞因子特異性的ELISPOT分析來測定抗原特異性的T細(xì)胞反應(yīng)(Wu等，AIDS Res.Hum.Retrovir.131187；1997)。這樣的分析可以測定出分泌IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10和IFN-γ的抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量。所有的ELISPOT分析都是使用商業(yè)可獲得的俘獲和檢測mAbs進(jìn)行的(R&D Systems and Pharmingen)，如參考文獻(xiàn)所述(Wu等，Infect.Immun.634933；1995)以及之前用到過(Xu-Amano等，J.Exp.Med.1781309；1993)；(Okahashi等，Infect.Immun.641516；1996)。每一種分析都包括有絲分裂原(Con A)和卵清蛋白對(duì)照。
6.使用攜帶有rdsRN的細(xì)菌載體在靶細(xì)胞或組織中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)或產(chǎn)生生物學(xué)作用可以通過用非致病性或減毒細(xì)菌疫苗載體中攜帶有的rdsRN進(jìn)行接種實(shí)現(xiàn)rdsRN在靶真核細(xì)胞、組織或有機(jī)體中的遞送以及所編碼序列的表達(dá)。目的生物學(xué)反應(yīng)包括，但不限于，保護(hù)性或調(diào)節(jié)性的免疫反應(yīng)，治療反應(yīng)，以及宿主蛋白表達(dá)的下調(diào)(例如siRNA)或表達(dá)上調(diào)(例如細(xì)胞因子表達(dá))。
在本發(fā)明中，從中獲得細(xì)菌疫苗載體的細(xì)菌菌株并非至關(guān)重要，其包括但不限于彎曲桿菌亞種(Campylobacter spp)，奈瑟菌亞種(Neisseria spp)，嗜血桿菌亞種(Haemophilus spp)，產(chǎn)氣單胞菌亞種(Aeromonas spp)，弗朗西斯菌亞種(Francisella spp)，耶爾森氏菌亞種(Yersinia spp)，克雷伯桿菌亞種(Klebsiella spp)，博代氏桿菌亞種(Bordetella spp)，軍團(tuán)桿菌亞種(Legionella spp)，棒狀桿菌亞種(Corynebacterium spp)，檸檬酸細(xì)菌亞種(Citrobacter spp)，衣原體(Chlamydia spp)，布魯氏菌亞種(Brucella spp)，假單胞菌亞種(Pseudomonas spp)，螺桿菌亞種(Helicobacter spp)或弧菌亞種(Vibriospp)。
所應(yīng)用的特定彎曲桿菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的彎曲桿菌菌株的例子包括但不限于空腸彎曲桿菌(C.jejuni)(ATCC Nos.43436，43437，43438)，豬腸彎曲桿菌(C.hyointestinalis)(ATCC No.35217)，胎兒彎曲菌(C.fetus)(ATCC No.19438)糞彎曲菌(C.fecalis)(ATCC No.33709)，C.doylei(ATCC No.49349)和大腸彎曲桿菌(C.coli)(ATCC Nos.33559，43133)。
所應(yīng)用的特定耶爾森氏菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的耶爾森氏菌菌株的例子包括小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)(ATCC No.9610)或鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)(ATCC No.19428)，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌Ye03-R2(al-Hendy等，Infect.Immun.，60870；1992)或小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌aroA(O′Gaora等，Micro.Path.，9105；1990)。
所應(yīng)用的特定克雷伯桿菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的克雷伯桿菌菌株的例子包括肺炎克雷伯桿菌(K.pneumoniae)(ATCC No.13884)。
所應(yīng)用的特定博代氏桿菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要。可應(yīng)用于本發(fā)明的博代氏桿菌菌株的例子包括百日咳博代氏桿菌(B.pertussis)，支氣管敗血性博德特氏菌(B.bronchiseptica)(ATCC No.19395)。
所應(yīng)用的特定奈瑟菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的奈瑟菌菌株的例子包括腦膜炎萘瑟菌(N.meningitidis)(ATCCNo.13077)和淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)(ATCC No.19424)，淋病奈瑟菌MS11 aro突變體(Chamberlain等，Micro.Path.，1551-63；1993)。
所應(yīng)用的特定產(chǎn)氣單胞菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的產(chǎn)氣單胞菌菌株的例子包括A.salminocida(ATCC No.33658)，A.schuberii(ATCC No.43700)，嗜水產(chǎn)氣單胞菌(A.hydrophila)，A.eucrenophila(ATCC No.23309)。
所應(yīng)用的特定弗朗西斯菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的弗朗西斯菌菌株的例子包括土拉熱弗朗西斯菌(F.tularensis)(ATCC No.15482)。
所應(yīng)用的特定棒狀桿菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的棒狀桿菌菌株的例子包括假結(jié)核棒狀桿菌(C.pseudotuberculosis)(ATCC No.19410)。
所應(yīng)用的特定檸檬酸細(xì)菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要。可應(yīng)用于本發(fā)明的檸檬酸細(xì)菌菌株的例子包括弗羅因德氏檸檬酸菌(C.freundii)(ATCC No.8090)。
所應(yīng)用的特定衣原體菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的衣原體菌株的例子包括肺炎衣原體(C.pneumoniae)(ATCC No.VR1310)。
所應(yīng)用的特定嗜血桿菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的嗜血桿菌菌株的例子包括流感嗜血桿菌(H.influenzae)(Lee等，J.Biol.Chem.27027151；1995)，睡眠嗜血桿菌(H.somnus)(ATCCNo.43625)。
所應(yīng)用的特定布魯氏菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的布魯氏菌菌株的例子包括流產(chǎn)布魯氏菌(B.abortus)(ATCCNo.23448)。
所應(yīng)用的特定軍團(tuán)桿菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要。可應(yīng)用于本發(fā)明的軍團(tuán)桿菌菌株的例子包括肺炎軍團(tuán)桿菌(L.pneumophila)(ATCC No.33156)，或肺炎軍團(tuán)桿菌mip突變體(Ott，F(xiàn)EMS Micro.Rev.，14161；1994)。
所應(yīng)用的特定假單胞菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的假單胞菌菌株的例子包括銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)(ATCC No.23267)。
所應(yīng)用的特定螺桿菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的螺桿菌菌株的例子包括幽門螺桿菌(H.pylori)(ATCC No.43504)，雪貂螺桿菌(H.mustelae)(ATCC No.43772)。
所應(yīng)用的特定弧菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的弧菌菌株的例子包括霍亂弧菌(Vibrio cholerae)(ATCC No.14035)，辛辛那提弧菌(Vibrio cincinnatiensis)(ATCC No.35912)，霍亂弧菌RSI毒力突變體(Taylor等，J.Infect.Dis.，1701518-1523；1994)和霍亂弧菌ctxA，ace，zot，cep突變體(Waldor J等，Infect Dis.，170278-283；1994)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，產(chǎn)生本發(fā)明的包裝菌株的細(xì)菌菌株包括了顯示擁有可作為疫苗載體潛力的細(xì)菌的減毒衍生物，例如腸桿菌(Enterobacteriaceae)，包括但不限于埃希桿菌亞種(Escherichia spp.)，志賀菌亞種(Shigella spp.)，和沙門氏菌亞種(Salmonella spp.)?？梢詮膯魏思?xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)或分支桿菌亞種(Mycobacterium spp)類似地構(gòu)建革蘭氏陽性和耐酸性包裝和載體菌株。
所應(yīng)用的特定埃希氏菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的埃希氏菌菌株的例子包括大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α，HB 101，HS-4，4608-58，1184-68，53638-C-17，13-80和6-81(例如Sambrook等，上文所述的2001)；(Sansonetti等，Ann.Microbiol.(Inst.Pasteur)，132A351；1982)，腸毒性的大腸桿菌(Evans等，Infect.Immun.，12656；1975)，致腸病的大腸桿菌(Donnenberg等.，J.Infect.Dis.，169831；1994)，和腸出血性大腸桿菌(McKee and O′Brien，Infect.Immun.，632070；1995)。
所應(yīng)用的特定沙門氏菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的沙門氏菌菌株的例子包括傷寒沙門氏菌(S.typhi)(ATCC No.7251)，鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)(ATCC No.13311)，雞沙門氏菌(Salmonella galinarum)(ATCC No.9184)，腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteriditis)(ATCC No.4931)和鼠傷寒沙門氏菌(ATCC No.6994)，傷寒沙門氏菌aroC，aroD雙突變體(Hone等，Vacc，9810-816；1991)，鼠傷寒沙門氏菌aroA突變體(Mastroeni等，Micro.Pathol.，13477-491；1992)。
所應(yīng)用的特定志賀菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的志賀菌菌株的例子包括弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)(ATCCNo.29903)，弗氏志賀氏菌CVD1203(Noriega等，Infect.Immun.625168；1994)，弗氏志賀氏菌15D(Sizemore等，Science 270299；1995)，索氏志賀氏菌(Shigella sonnei)(ATCC No.29930)，和痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)(ATCC No.13313)。
所應(yīng)用的特定分支桿菌菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的分支桿菌菌株的例子包括結(jié)核分支桿菌(Mtuberculosis)CDC 1551菌株(Griffith等，Am.J.Respir.Crit.Care Med.Aug；152(2)808；1995)，結(jié)核分支桿菌北京株(Soolingen等，1995)H37Rv菌株(ATCC#25618)，結(jié)核分支桿菌泛酸營養(yǎng)缺陷型菌株(Sambandamurthy，Nat.Med.2002 8(10)1171；2002)，結(jié)核分支桿菌rpoV突變體菌株(Collins等，Proc Natl Acad Sci USA.92(17)8036；1995)，結(jié)核分支桿菌亮氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(Hondalus等，Infect.Immun.68(5)2888；2000)，BCG丹麥菌株(ATCC#35733)，BCG日本菌株(ATCC#35737)，BCG，芝加哥菌株(ATCC#27289)，BCG哥本哈根菌株(ATCC#27290)，BCG巴斯德菌株(ATCC#35734)，BCGGlaxo菌株(ATCC#35741)，BCG Connaught菌株(ATCC#35745)，BCG蒙特利爾株(ATCC#35746)。
所應(yīng)用的特定單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)菌株對(duì)本發(fā)明而言并非至關(guān)重要?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的單核細(xì)胞增多性李斯特菌菌株的例子包括單核細(xì)胞增多性李斯特菌菌株10403S(例如，Stevens等，J.Virol 788210-8218；2004)或突變體單核細(xì)胞增多性李斯特菌菌株，例如(i)actA plcB雙突變體(Peters等，F(xiàn)EMS Immunologyand Medical Microbiology 35243-253；2003)；(Angelakopoulous等，Infect and Immunity 703592-3601；2002)；(ii)對(duì)于丙氨酸消旋酶基因和D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因的dal dat雙突變體(Thompson等，Infect andImmunity 663552-3561；1998)。
對(duì)大腸桿菌，沙門氏菌，分支桿菌，志賀氏菌和李斯體菌減毒的方法對(duì)本發(fā)明并非至關(guān)重要，且為本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所公知(Evans等，上文所述的，1975)；(Noriega etal，上文所述的，1994)；(Hone等，上文所述的，1991)。
一旦選定了非致病性或減毒的細(xì)菌疫苗載體菌株，就可對(duì)該菌株進(jìn)行修飾從而用作rdsRN包裝菌株?？梢允褂蒙衔脑敿?xì)描述的策略完成這一過程，即需要將表達(dá)dsRP前衣殼的片段-L序列導(dǎo)入所述菌株，以及引入能夠?qū)Φ膔dsRN進(jìn)行選擇和維持的突變，所述rdsRN表達(dá)的功能性基因彌補(bǔ)所述菌株中突變產(chǎn)生的缺陷。
為了產(chǎn)生包裝和穩(wěn)定維持所希望rdsRN的菌株，可通過電穿孔將體外合成的重組片段RNA導(dǎo)入包裝菌株，并在只允許重組片段中攜帶并表達(dá)陽性選擇等位基因的菌株生長的條件下在固體培養(yǎng)基上分離轉(zhuǎn)化子(例如，當(dāng)時(shí)，胰蛋白酶化大豆瓊脂只能允許asd和murI突變體的生長，而野生型基因彌補(bǔ)基因組缺陷的基因，Difco，Detroit，MI，Cat.No.244520)。上文還提供了產(chǎn)生rdsRNA片段，體外mRNA合成以及電穿孔的全部方法。為了驗(yàn)證分離物攜帶有目的rdsRN，可將個(gè)體分離物培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基(例如，TS，Difco，Detroit，MI，Cat.No.244620)中，并使用他處報(bào)道的方法和本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的方法從所述培養(yǎng)物中分離核殼(Gottlieb等，上文所述的，1990)；(Sun等，上文所述的，2003)?？墒褂蒙虡I(yè)可獲得的RNA提取試劑盒從核殼中分離dsRNA，并使用擴(kuò)增所述重組片段內(nèi)部確定片段的引物，包括但不限于擴(kuò)增陽性選擇等位基因，IRES，以及目的基因的PCR引物，通過RT-PCR進(jìn)行篩選，如上文所詳述。如果某個(gè)克隆表現(xiàn)出說明rdsRNA片段穩(wěn)定維持于所述菌株的適合RT-PCR圖譜，則被定義為陽性克隆。可使用標(biāo)準(zhǔn)DNA測序方法對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步測定，如下所述對(duì)穩(wěn)定含有rdsRN的細(xì)菌疫苗載體菌株的生長而言，特定的培養(yǎng)條件對(duì)本發(fā)明并非至關(guān)重要。出于說明性的目的，突變體可以生長在液體培養(yǎng)基中，例如LB培養(yǎng)基(Difco，Detroit，MI，Cat.No.244620)，營養(yǎng)肉湯(Difco，Detroit，MI，Cat.No.233000)，胰蛋白酶大豆肉湯(Difco，Detroit，MI，Cat.No.211822)，使用的是適于細(xì)菌菌株生長的常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)(Miller，上文所述的，1991)?；蛘?，細(xì)菌也可以培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基上，例如營養(yǎng)瓊脂(Difco，Detroit，MI，Cat.No.212000)，胰蛋白酶大豆瓊脂(Difco，Detroit，MI，Cat.No.236920)，或M9基本瓊脂(Difco，Detroit，M，Cat.No.248510)。
分支桿菌疫苗載體菌株培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基，例如Middlebrook7H9(Difco，Detroit，MI，Cat.No.271310)或Saulton合成培養(yǎng)基中，優(yōu)選為在37℃。菌株可維持靜止或搖動(dòng)培養(yǎng)。此外，可通過加入油酸(0.06％ v/v；Research Diagnostics Cat.No.01257)和諸如Tyloxapol(0.05％ v/v；Research Diagnostics Cat.No.70400)的去污劑增強(qiáng)分支桿菌的生長速率。可通過均勻地將100μl等分的分支桿菌培養(yǎng)物在磷酸緩沖鹽水(在本文中稱為PBS)中連續(xù)稀釋(例如，以10倍稀釋法從從純培養(yǎng)物稀釋至10-8)至含有25-30ml固體培養(yǎng)基，例如Middlebrook 7H10(BD Microbiology，Cockeyesville，MD，Cat.No.221174)的3.5英寸培養(yǎng)平板上，從而評(píng)價(jià)分枝桿菌培養(yǎng)物的純度。
本發(fā)明rdsRN擬進(jìn)行給藥的細(xì)菌疫苗載體量可隨對(duì)象種類的不同，以及需要治療的疾病和不適的不同而變化。一般地，所采用的劑量為約103-1011活的有機(jī)體，優(yōu)選為約103-109具有活性的有機(jī)體。
攜帶有rdsRN的細(xì)菌載體通常都與藥物可接受的載體或稀釋劑一同給藥。所采用的特定藥物可接受的載體或稀釋劑對(duì)本發(fā)明并非至關(guān)重要。稀釋劑的例子包括磷酸緩沖鹽水，用于在胃中緩沖對(duì)抗胃酸的緩沖液，例如含有蔗糖的檸檬酸緩沖液(pH 7.0)，單獨(dú)的碳酸氫鹽緩沖液(pH 7.0)(Levine等，J.Clin.Invest，79888-902；1987)；(Black等，J.Infect.Dis.，1551260-1265；1987)，或含有抗壞血酸，乳酸和可任選的阿斯巴甜的碳酸氫鹽緩沖液(pH 7.0)(Levine等，Lancet，II467-470；1988)。載體的例子包括蛋白，例如脫脂牛奶中發(fā)現(xiàn)的蛋白，糖，例如蔗糖或聚乙烯吡咯烷酮。通常，可以約0.1-90％(w/v)但優(yōu)選為1-10％(w/v)的濃度使用這些載體。
可以在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型(例如，BATS/cJ小鼠，兔子，豚鼠或恒河猴)中測定載體菌株的生物學(xué)活性。一開始，以102-109cfu的劑量給藥rdsRN載體菌株，并采用適當(dāng)?shù)耐緩浇o藥(例如，可通過胃內(nèi)或鼻內(nèi)方式給藥大腸桿菌，沙門氏菌和志賀氏菌，而通過皮下注射給藥rBCG載體)。劑量的數(shù)目可隨著個(gè)體載體菌株的效力，以及所編碼目的重組產(chǎn)物的效價(jià)不同而不同。
測定rdsRN編碼產(chǎn)物的免疫和其他生物學(xué)反應(yīng)的方法是本領(lǐng)域所公知的。為了測定血清IgG和IgA對(duì)gp120的反應(yīng)，可以在免疫之前以及免疫后10，20，30，40，50，60，70，和80天收集血清。從每只小鼠的尾靜脈采集約400-500μl血液病收集至單獨(dú)的試管中，通過在冰上孵育4小時(shí)使其凝固。在離心機(jī)中離心5分鐘之后，將血清轉(zhuǎn)移至新管中并保存于-80℃。可使用在免疫之前或之后定期收集的糞便顆粒和陰道沖洗物來測定粘膜IgG和IgA對(duì)于由目的基因所表達(dá)抗原的反應(yīng)(Srinivasan等，Biol.Reprod.53462；1995)；(Staats等，J.Immunol.157462；1996)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)ELISA來定量血清和粘膜樣品中IgG和IgA對(duì)gp120的反應(yīng)(Abacioglu等，ADDS Res.Hum.Retrovir.10371；1994)；(Pincus等，AIDS Res.Hum.Retrovir.121041；1996)。卵清蛋白可包括在每個(gè)ELISA中作為陰性對(duì)照抗原。此外，適當(dāng)?shù)那闆r下每個(gè)ELISA還包括陽性對(duì)照血清，以及糞便顆?；蜿幍狼逑次飿颖尽？蓮挠?0μg由目的基因表達(dá)的蛋白和混合有10μg霍亂毒素進(jìn)行鼻內(nèi)接種的動(dòng)物中收集到陽性對(duì)照樣本，如文獻(xiàn)所述(Yamamoto等，Proc.Natl.Acad.Sci.945267；1997)。通過對(duì)490nm吸收值產(chǎn)生增加的最后一次血清稀釋取倒數(shù)可以計(jì)算出終點(diǎn)滴度，所述吸收值大于陰性對(duì)照列的平均數(shù)加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差值。
可通過細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(也稱為細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞技術(shù))或通過ELISPOT(Letsch A.等，Methods 31143-49；2003)測定細(xì)胞免疫力。兩種方法都允許對(duì)抗原特異性免疫反應(yīng)進(jìn)行定量，盡管ICS還需要添加對(duì)抗原特異性的CD4+和CD8+T細(xì)胞進(jìn)行在表型上同步表征的能力。這樣的分析可以測定出分泌IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10和IFN-γ的抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量(Wu等，AIDS Res.Hum.Retrovir.131187；1997)?？墒褂蒙虡I(yè)可獲得的俘獲和檢測mAbs進(jìn)行ELISPOT分析(R&D Systems and Pharmingen)，如參考文獻(xiàn)所述(Wu等，Infect.Immun.634933；1995)以及之前所用到的(Xu-Amano等，J.Exp.Med.1781309；1993)；(Okahashi等，Infect.Immun.641516；1996)。每一種分析都包括有絲分裂原(Con A)和卵清蛋白對(duì)照。
7.重組DNA技術(shù)用于購建包裝菌株、細(xì)菌載體和rdsRN的重組DNA方法包括，但不限于，PCR，限制性內(nèi)切酶(在本文中稱為“RE”)消化，DNA連接，瓊脂糖凝膠電泳，DNA純化，以及雙脫氧核苷酸測序，如他處所述(Miller，A Short Course in Bacterial Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；1992)；(Bothwell等，上文所述的)；以及(Ausubel等，上文所述的)，細(xì)菌噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)(deBoer，上文所述的)；(Miller，上文所述的，1992)和(Ausubel等，上文所述的)，或化學(xué)的(Bothwell等，上文所述的)；(Ausubel等，上文所述的)；(Feigner等，上文所述的)；and Farhood，上文所述的)，電穿孔(Bothwell等，上文所述的)；(Ausubel等，上文所述的)；(Sambrook，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY；1992)以及物理轉(zhuǎn)化技術(shù)(Johnston等，上文所述的)；(Bothwell等，上文所述的)?；蚩烧显谑删w上(deEoQretal，Cell，56641-649；1989)，質(zhì)粒載體上(Curtiss等，上文所述的)或剪接入靶菌株的染色體上(Hone等，上文所述的)。
可使用Applied Biosystems ABITM3900高通量DNA合成儀(FosterCity，CA 94404 U.S.A.)合成基因序列，其方法由制造商所提供。為了合成較大的序列，即大于200bp的序列，可通過PCR產(chǎn)生一系列全長序列片段，并使用本領(lǐng)域公知的方法將其連接起來形成全長序列。然而，較小的序列，即小于200bp的序列，可以使用Applied BiosystemsABITM3900高通量DNA合成儀(Foster City，CA 94404 U.S.A.)在一個(gè)輪次中合成，其方法由制造商所提供。
可使用BioRad Gene-Pulser設(shè)置為200Ω，25μF和2.5kV(BioRadLaboratories，Hercules，CA)通過電穿孔將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌菌株[38]?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化測序技術(shù)(Applied Biosystems自動(dòng)化測序儀373A)對(duì)cDNA序列的核苷酸序列進(jìn)行驗(yàn)證?？墒褂肁pplied BiosystemsABITM3900高通量DNA合成儀(Foster City，CA 94404 U.S.A.)合成用于DNA測序和聚合酶鏈反應(yīng)(本文中稱為“PCR”)的DNA引物。
所提供的以下實(shí)施例僅用作說明性的目的，而不應(yīng)對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行任何限制。
實(shí)施例實(shí)施例1重組DNA方法根據(jù)制造商說明使用限制性內(nèi)切酶(本文中為″RE″)；(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)，T4 DNA連接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)和Taq聚合酶(Life Technologies，Gaithersburg，MD)；按照制造商的說明使用小規(guī)模(Qiagen MiniprepR kit，Santa Clarita，CA)或大規(guī)模(Qiagen MidiprepR kit，Santa Clarita，CA)質(zhì)粒DNA純化試劑盒制備質(zhì)粒DNA(Qiagen，Santa Clarita，CA)；無核酸酶，分子生物學(xué)純的去離子水，Tris-HCl(pH 7.5)，EDTA pH 8.0，1M MgCl2，100％(v/v)乙醇，超純瓊脂糖和瓊脂糖凝膠電泳緩沖液均購自Life Technologies，Gaithersburg，MD。按照公知的方法進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化，PCR，DNA連接反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳(Sambrook，等，上文所述的，1989)；(Ausubel，等，上文所述的，1990)。在下述實(shí)施例中，對(duì)每個(gè)所述重組質(zhì)粒DNA序列的核苷酸序列驗(yàn)證是使用Applied Biosystems自動(dòng)化測序儀373A通過常規(guī)的自動(dòng)化DNA測序技術(shù)完成的。
PCR引物購自于Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)或University of Maryland Biopolymer Facility(Baltimore，MD)并且可使用Applied Biosystems DNA合成儀(model 373A)進(jìn)行合成。PCR引物以200μM的濃度進(jìn)行使用，而PCR反應(yīng)的退火溫度則使用Clone manager軟件4.1版本(Scientific and Educational Software Inc.，Durham，NC)或OLIGO引物分析軟件4.0版本進(jìn)行確定。在Bio Rad iCycler(Hercules，CA)上進(jìn)行PCR。用于擴(kuò)增的PCR引物是使用Clone Manager軟件4.1版本(Scientific and Educational Software Inc.，Durham，NC)OLIGO引物分析軟件4.0版本設(shè)計(jì)的。該軟件能夠設(shè)計(jì)PCR引物并且能夠識(shí)別與所操作的特異性DNA相一致的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。PCR是在Bio RadiCycler(Hercules，CA)上完成的，PCR中的引物退火，延伸和變性時(shí)間是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序設(shè)定的(Ausubel等，上文所述的)。隨后使用標(biāo)準(zhǔn)程序通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)限制性內(nèi)切酶消化和PCR進(jìn)行分析(Ausubel等，上文所述的)；(Sambrook，上文所述的)。
大腸桿菌Top10和DH5α購自于Invitrogen(Carlsbad，CA)而菌株SCS110則購自于Stratagene(La Jolla，CA)。其可作為在以下實(shí)施例中所述重組質(zhì)粒的宿主。可使用Gene Pulser(BioRad Laboratories，Hercules，CA)設(shè)定為200Ω，25μF和1.8kV通過電穿孔轉(zhuǎn)化或化學(xué)轉(zhuǎn)化，如文獻(xiàn)所述(Ausubel等，上文所述的)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌。
除非特別說明，細(xì)菌菌株都生長在胰蛋白酶大豆瓊脂(Difco，Detroit，MI)上或胰蛋白酶大豆肉湯(Difco，Detroit，MI)中，在合適的溫度下。按照需要，向培養(yǎng)基中補(bǔ)充100μg/ml氨芐青霉素，50μg/ml卡那霉素和/或氯霉素20μg/ml(Sigma，St.Louis，MO)。細(xì)菌菌株以大約109菌落形成單位(在本文中稱為“cfu”)/ml的濃度懸浮于含有30％(v/v)甘油(Sigma，St.Louis，MO)的胰蛋白酶大豆肉湯(Difco)保存于-80℃。
試劑清單KpnI(New England Biolabs，Beverly，MA，Cat.Nos.R0142S)，PstI(New England Biolabs，Beverly，MA，Cat.No.R0140S)，胰蛋白酶大豆肉湯(Difco，Detroit，MI，Cat.No.211822)，胰蛋白酶大豆瓊脂(Difco，Detroit，MI，Cat.No.236920)，Miniprep質(zhì)粒DNA純化試劑盒(Qiagen，Valencia，CA，Cat.No.27106)，甘油(Sigma，St.Louis，MO，Cat.No.G5516)，HpaI(New England Biolabs，Beverly，MA，Cat.No.R0105S)，小牛腸堿性磷酸酶(New England Biolabs，Beverly，MA，Cat.No.M0290S)，VentRDNA聚合酶(New England Biolabs，Cat.No.M0254S)，QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen，Cat.No.28106，Valencia，CA)，二氨基庚二酸(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，Cat.No.D1377)，BglII(NeW England Biolabs，Beverly，MA，Cat No.RO 144S)，IPTG(Invitrogen，Carlsbad，CA，Cat.No.15529-019)，細(xì)胞培養(yǎng)物裂解試劑(Promega，Madison，WI Cat.No.E1531)，溶菌酶(Sigma，St.Louis，MO，Cat.No.L6876)，磷酸鉀(Sigma，St.Louis，MO，Cat.No.P5379)，氯化鎂(Sigma，St.Louis，MO，Cat.No.M1028)DraIII(NewEngland Biolabs，Beverly，MA，Cat.No.R0510S)，PstI(New EnglandBiolabs，Beverly，MA，Cat.No.V0279S)，蛋白酶K(Ambion，Austin，TX，Cat.No.2542-2548)，Durascribe T7轉(zhuǎn)錄試劑盒(Epicentre，Madison，WI)，Durascribe SP6轉(zhuǎn)錄試劑盒(Epicentre，Madison，WI)，MEGAscriptT7轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion，Austin，TX，Cat.No.1334)，MEGAscriptSP6轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion，Austin，TX，Cat No.1330)，MEGAclear柱子(Ambion，Austin，TX，Cat No.1908)，BrightStar生物素化RNA millennium marker(Ambion，Austin，TX，Cat.No.7170)，BrightStar尼龍膜(Ambion，Austin，TX，Cat.No.10102)，BrightStar生物檢測試劑盒(Ambion，Austin，TX，Cat.No.1930)，Tris-HCl緩沖液(Quality Biological，Gaithersburg，MD，Cat.No.351-007-100)，氯化鎂(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，Cat.No.M 1787)，乙酸銨(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，Cat.No.A2706)，氯化鈉(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，Cat.No.S7653)，氯化鉀(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，Cat.No.P3911)，二硫蘇糖醇(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，Cat.No.D9779)，EDTA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，Cat.No.E8008)，聚乙二醇4000(Fluka，Buchs，Switzerland，Cat.No.95904)，SUPERase RNase抑制劑(Ambion，Austin，TX，cat.No 2694，)，生物素-14-CTP(Invitrogen，Carlsbad，CA，Cat.No.19519-016)，RNase ONE核糖核酸酶(Promega，Madison，WI，Cat.No.M4261)實(shí)施例2彌補(bǔ)asd突變并且表達(dá)熒光報(bào)道物和結(jié)核分支桿菌抗原和LCMV抗原的rdsRNA片段的構(gòu)建本研究的目的是開發(fā)重組片段，其能夠整合入基于phi-8 dsRNA基因組的原型rdsRN(Mindich等，J.Bacterid，1814505；1999)；(Mindich，Microbiol.MoI.Biol.Rev，63149；1999)；(Hoogstraten等，Virology，272218；2000)；(Sun等，Virology，308354；2003)。如上所述，phi-8的基因組由三個(gè)片段S，M和L組成?？蓸?gòu)建原型rdsRN，因此由野生型片段-L(在本文中稱為“wtL”)編碼的RNA依賴的RNA聚合酶表達(dá)的乘客基因(passenger gene)被克隆入重組片段-M和-S(在本文中被分別稱為“rM”和“rS”)。rM和rS都分別編碼連接于基因10和基因8細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)的野生型天冬氨酸半醛脫氫酶基因(在本文中稱為“asd”，GenBank#V00262)(參見圖4)以及功能性連接于丙型肝炎病毒IRES的目的基因(即，熒光蛋白HcRed和分支桿菌抗原TBS)。需要注意的是，在片段-M和-S上的噬菌體結(jié)構(gòu)基因沒有在一開始就整合到rM或rS上，盡管在本發(fā)明的后期具體化過程中使用了野生型片段-S的基因8替換了rS的asd等位基因來穩(wěn)定所述rdsRN。asd等位基因和IRES::HcRed以及Mtb抗原編碼序列的5’和3’側(cè)翼分別為編碼pac的未翻譯序列和負(fù)鏈RNA合成起始序列。換言之，rM上的報(bào)道基因5’側(cè)翼為片段M的pac序列和3’側(cè)翼為片段M的終止序列。類似地，rS由5’側(cè)翼為片段S的pac序列和3’側(cè)翼為片段-S基因的終止序列的報(bào)道基因構(gòu)成(圖5)。需要注意的是，這樣的結(jié)構(gòu)僅允許rdsRN的生成而不會(huì)形成噬菌體或rdsRP顆粒。
可使用合成的DNA和標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)，例如PCR，RT-PCR，位點(diǎn)指導(dǎo)性誘變，限制性酶消化，凝膠電泳，連接，雙脫氧核苷酸測序，以及細(xì)菌轉(zhuǎn)化完成重組片段的構(gòu)建，如實(shí)施例1所述。
可通過Midland Certified Reagent Co.，(Midland，TX)合成重組片段-S(rS)。采用以下所述的修飾從phi-8片段-S的cDNA拷貝(由Dr.Leonard Mindich惠贈(zèng)，GenBank登錄號(hào)AF226853)得到了5’-和3’-序列。在5’到3’的方向，rS(SEQ ID NO1)由以下融合成份組成(圖4)(i)基因8的S pac序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(在本文中稱為″RBS″)是片段-S(GenBank登錄號(hào)AF226853)的前187核苷酸，并且是被前衣殼吸收所必需的(Hoogstraten等，上文所述的，2000)。RBS是原核細(xì)胞中翻譯起始所必需的。
(ii)為了在Δasd大腸桿菌X6212種進(jìn)行陽性選擇的功能性連接于上述RBS的asd基因。所述asd序列來自于GenBank登錄號(hào)V00262的240-1343堿基。
(iii)用于在真核細(xì)胞中啟動(dòng)翻譯的丙型肝炎病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)。該序列跨越了GenBank登錄號(hào)AJ242651的36-341堿基。
(iv)用于摻入旅客基因的多克隆位點(diǎn)(MCS)。
(v)用于rS mRNA多聚腺苷酸化的西門利克森林病毒(SemlikiForest virus)3′非翻譯區(qū)；GenBank accession no.V01398的1-261堿基。
(vi)phi-8片段-S的3’終止序列，即片段-S(GenBank登錄號(hào)AF226853)的3081-3192堿基，其是RNA穩(wěn)定性以及在負(fù)鏈RNA合成起動(dòng)之前與phi-8聚合酶結(jié)合所必需的。
使用T4 DNA連接酶，將由上述成分所構(gòu)成的合成DNA片段連接入PstI-消化的pT7/T3-18 DNA(Cat.No.7201，Ambion，Austin，TX)中，如實(shí)施例1所述。在連接之后，使用電穿孔(實(shí)施例1)將DNA導(dǎo)入大腸桿菌菌株DH5α-E(Invitrogen，Carlsbad，CA，Cat.No.11319-019)，通過在補(bǔ)充有氨芐青霉素(100μg/ml)的TSA上，在37℃培養(yǎng)16-24小時(shí)分離轉(zhuǎn)化子。的可通過從2ml培養(yǎng)物中分離超螺旋DNA來鑒定成功的連接產(chǎn)物，所述培養(yǎng)物用無菌牙簽穿刺所得單克隆并將所述牙簽放入補(bǔ)充有氨芐青霉素(100μg/ml)的無菌TSB中而進(jìn)行接種；培養(yǎng)物在37℃振蕩(200opm)培養(yǎng)16-24小時(shí)。離心之后丟棄液體上清液，并將細(xì)菌沉淀重懸于100μl Miniprep質(zhì)粒DNA純化試劑盒(Qiagen，Valencia，CA，Cat.No.27106)的溶液P1中。然后根據(jù)制造商的指導(dǎo)提取和純化質(zhì)粒DNA(參見Qiagen，Valencia，CA，Cat.no.27106指導(dǎo)手冊)。按照制造商的指導(dǎo)，用限制性內(nèi)切酶PstI(New EnglandBiolabs，Beverly，MA，Cat no.R0140S)消化純化的質(zhì)粒DNA，并使用制造商提供的緩沖液并在37℃孵育1小時(shí)。如前所述通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所得的DNA片段進(jìn)行分部(參見實(shí)施例1)并通過雙脫氧測序?qū)Ρ憩F(xiàn)出適當(dāng)圖譜的質(zhì)粒進(jìn)一步表征(實(shí)施例1)。這個(gè)方法鑒定出4個(gè)獨(dú)立的攜帶編碼rS的DNA的質(zhì)粒pT7/T3-18的分離物。這些分離物中的質(zhì)粒被指定為AF1并且將攜帶有這一質(zhì)粒的四種分離物在補(bǔ)充有氨芐青霉素(100μg/ml)的TSA上劃線并在37℃培養(yǎng)16-24小時(shí)。隨后使用無菌棉簽收集細(xì)菌(Puritan，Guilford，ME，Cat.No.25-8061WC)，以約109cfu/ml的密度懸浮于含有含有30％(v/v)甘油(Sigma，St.Louis，MO，Cat.No.G5516)的TSB中，以1ml的等分量保存于-80℃。
通過對(duì)phi-8野生型片段-S序列(GenBank登錄號(hào)AF226853)的1-1294bp進(jìn)行PCR擴(kuò)增構(gòu)建了第二個(gè)rS(rS2)，該S序列是通過BglII位點(diǎn)連接于丙型肝炎IRES并位于rS(bp1301-2020)序列的下游，如上所述(rS2，SEQ ID NO3)。將該構(gòu)建體連接入pT7T3-18的PstI位點(diǎn)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10。如上所述分析轉(zhuǎn)化子，并將6個(gè)正確的分離物稱為pAF1S2。
除了5’pac和3’終止序列分別來自于野生型片段-M，GenBank登錄號(hào)AF226852的核苷酸1-262以及4677-4741，重組片段-M(rM，SEQID NO2)與rS非常相似。因此，就像rS一樣，rM由phi-85’pac和3’終止序列作為其側(cè)翼的外源序列所構(gòu)成(參見圖4)。將2060bprM(SEQ ID NO2)克隆入質(zhì)粒pcDNA3.1zeo(+)(Invitrogen，Cat.No.V860-20，Carlsbad，CA)的KpnI和PstI位點(diǎn)(分別為New EnglandBiolabs，Beverly，MA，Cat.Nos.R0142S and R0140S)。采用適用于rS的方法對(duì)攜帶有適當(dāng)插入物的重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，并將新質(zhì)粒命名為pAF19。
為了構(gòu)建真核表達(dá)盒，用HpaI和NotI(New England Biolabs，Beverly，MA，Cat.No.R0105S)對(duì)pAF1進(jìn)行消化。這樣的限制性內(nèi)切酶消化導(dǎo)致了多克隆位點(diǎn)之內(nèi)的定向克隆位點(diǎn)，從而使得，一旦得以連接，Hc-Red基因和分支桿菌抗原包裝就可以直接處于HCV IRES的下游并與其功能性連接。在消化之后，可以使用小牛腸堿性磷酸酶(NewEngland Biolabs，Beverly，MA，Cat.No.M0290S)對(duì)線性質(zhì)粒的末端去磷酸化從而防止重新環(huán)化。隨后通過凝膠提取在0.8％瓊脂糖凝膠中通過電泳對(duì)去磷酸化的質(zhì)粒進(jìn)行純化。
2.0kb的分支桿菌抗原融合序列(TBS)是使用Accuprime DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)通過PCR從質(zhì)粒pAdApt35.Bsu.TB.S(Crucell)和包括了HpaI和NotI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物擴(kuò)增得到的。通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證了擴(kuò)增序列的大小，并根據(jù)制造商的指導(dǎo)使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen，Cat.No.28106，Valencia，CA)進(jìn)行了純化。
使用T4 DNA連接酶(New England Biolabs，Cat.No.M0202S)將編碼TB.S的片段連接入去磷酸化的pAF1，并將所得質(zhì)粒指定為pSTB2。
可使用上述的重組DNA技術(shù)，將TBS抗原融合序列和HC-Red編碼序列類似地插入rM所攜帶pAF19上的HpaI位點(diǎn)(圖4)。所得質(zhì)粒被稱為pMTB7和pMHc-Red。
使用限制性內(nèi)切酶SphI和PsiI使質(zhì)粒pSTB2和pLM2775(編碼野生型片段-S)線性化，并通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所得線性化片段進(jìn)行純化和提取。類似地可使用SphI和PsiI對(duì)質(zhì)粒pSTB7和pMHc-Red進(jìn)行線性化。根據(jù)制造商的指導(dǎo)，每一個(gè)來自四種限制性內(nèi)切酶消化的線性化DNA序列都可用作Durascribe T7(Epicentre，Madison，WI)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板，從而產(chǎn)生wtS，編碼抗原TBS的rS、編碼抗原TBS的rM和編碼Hc-Red的rM的氟化RNA轉(zhuǎn)錄本。
類似地，可構(gòu)建表達(dá)淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphocyticchoriomenengitis virus)(在本文中稱為“LCMV”)的糖蛋白抗原GP-1和GP-2的第三組rdsRNA片段?？蓮木幋a位于LCMV基因組大染色體上GP聚蛋白前體的質(zhì)粒pCMV-GP上PCR擴(kuò)增得到1511bp的片段。該序列是使用Accuprime DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)和包括HpaI和NotI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物擴(kuò)增得到的。通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證了擴(kuò)增序列的大小，并根據(jù)制造商的指導(dǎo)使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen，Cat.No.28106，Valencia，CA)進(jìn)行了純化。使用限制性內(nèi)切酶HpaI和NotI(New England Biolabs，Beverly，MA，Cat.No.R0105S)對(duì)質(zhì)粒pAF1S2和pAF19線性化，并使用小牛腸堿性磷酸酶(New England Biolabs，Beverly，MA，Cat.No.M0290S)去磷酸化。類似地，使用HpaI和NotI對(duì)GP編碼序列進(jìn)行消化并連接入線性化的pAF1S2和AF19質(zhì)粒中，得到質(zhì)粒pSGP1和pMGP2。這些質(zhì)粒因此分別編碼了功能性連接于rS2和rM的HCV IRES的GP聚蛋白前體基因。
分別使用RE’s KpnI和PsiI對(duì)pSGP1和pMGP2進(jìn)行消化，從而作為體外轉(zhuǎn)錄的模板。根據(jù)制造商的指導(dǎo)，可使用DurascribeT7(Epicentre，Madison，WI)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒從每種質(zhì)粒中產(chǎn)生氟化RNA轉(zhuǎn)錄本。所得的轉(zhuǎn)錄本由此編碼了在rS2和rM之內(nèi)的GP-1和GP-2抗原序列。
實(shí)施例3原型包裝和遞送菌株的構(gòu)建本研究的目的是構(gòu)建原型細(xì)菌包裝菌株。弗氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)擁有不可回復(fù)的染色體asd標(biāo)記插入缺失突變，從而導(dǎo)致了不能產(chǎn)生天冬氨酸-半醛脫氫酶(在本文中稱為″ASD″)的缺陷，并由此缺乏合成細(xì)胞壁成分二氨基庚二酸(在本文中稱為″DAP″)的能力(Sizemore等，Vaccine.1997 Jun；15(8)804-7)。在缺乏遺傳彌補(bǔ)的條件下生長需要在培養(yǎng)基中補(bǔ)充50μg/ml DAP(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，Cat.No.D1377)。
雖然志賀氏菌僅被選作為示例，但其入侵性特征和對(duì)于粘膜免疫細(xì)胞的天然趨向同樣使其成為了理想的遞送載體。就像asd突變需要通過編碼asd等位基因的rdsRN進(jìn)行彌補(bǔ)一樣，同樣有必要構(gòu)建第二個(gè)染色體損傷來減毒該菌株從而使得其在進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞之后裂解并釋放rdsRN。通過PCR擴(kuò)增了murI基因(編碼谷氨酸鹽消旋酶)上游和下游的約1kb區(qū)域，通過編碼NheI位點(diǎn)的PCR引物連接，并在編碼SstI和XbaI位點(diǎn)引物的幫助下連接入pCVD442(refX)。通過與弗氏志賀氏菌(S.flexneri)接合對(duì)所得質(zhì)粒進(jìn)行了轉(zhuǎn)移。通過抗生素抗性，蔗糖敏感性，和PCR分析對(duì)共整合進(jìn)行了鑒定，并通過本領(lǐng)域所公知的方法進(jìn)行了解析，從而產(chǎn)生了asd，murI菌株MPC51。murI突變使得細(xì)胞不能合成肽聚糖成分D-谷氨酸，并且需要在M9基本生長培養(yǎng)基中補(bǔ)充50μg/ml D-谷氨酸才能獲得正常的生長。HeLa細(xì)胞入侵分析說明所述菌株是具有入侵性的但并不能延長細(xì)胞內(nèi)的存活(圖7)為了確定是否這種營養(yǎng)缺陷型需求可以通過rdsRN中編碼asd的表達(dá)進(jìn)行反式彌補(bǔ)，可使用pLM2653轉(zhuǎn)化弗氏志賀氏菌(S.flexneri)MPC51，pLM2653是能夠在SP6啟動(dòng)子控制下表達(dá)wtL mRNA并且是產(chǎn)生裝配前衣殼所必需和充分的條件phi-8蛋白的質(zhì)粒(Sun等，Virology，308354；2003)。通過電穿孔導(dǎo)入質(zhì)粒pLM2653，并通過加入100μg/ml氨芐青霉素進(jìn)行選擇。
可通過對(duì)天然的和SDS-變性的細(xì)胞裂解物進(jìn)行差異過濾而對(duì)MPC51pLM2653中的前衣殼裝配進(jìn)行測定，其是通過使用前衣殼蛋白特異性的抗血清進(jìn)行免疫印跡進(jìn)行分析的(圖8)。簡言之，因?yàn)槊糠N前衣殼的期望分子量是15MDa，可以說明前衣殼蛋白(87kDa和34Da)不能通過截流值為100kDa的膜，除非用10％SDS對(duì)裂解物進(jìn)行處理，從而說明了裝配發(fā)生(圖8)。此外，薄層切片MPC51pLM2653的透射電鏡照片清楚地表明了大量的約60nM的前衣殼顆粒(圖9)。
實(shí)施例4將編碼rdsRNA片段的ssRNA導(dǎo)入原型包裝菌株并在所述菌株中啟動(dòng)功能性的自我復(fù)制rdsRN本實(shí)施例中的研究目的是開發(fā)一種方法，從而在細(xì)菌包裝菌株中啟動(dòng)和維持rdsRN。所選擇的策略涉及用體外合成的實(shí)施例2中所述編碼rM和rS的ssRNA(+)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化包裝菌株，弗氏志賀氏菌(S.flexneri)MPC51pLM2653(實(shí)施例3)。在進(jìn)入MPC51pLM2653之后，ssRNA(+)被包裝進(jìn)入前衣殼，與此同時(shí)完成負(fù)鏈合成，由此構(gòu)建了rdsRN(圖6)。所述rdsRN隨后合成了編碼wtL，rM，和rS mRNA(即ssRNA(+))的mRNA，該mRNA能夠從所述rdsRN被動(dòng)分泌至載體菌株細(xì)胞之中(圖6)。這些轉(zhuǎn)錄本通過表達(dá)wtL，rM，和rS產(chǎn)生了更多的前衣殼，所述wtL，rM，和rS都攜帶有功能性的asd基因，其彌補(bǔ)MPC51中的asd突變，由此消除了生長所必需的DAP。wtL，rM，和rS mRNA也同樣被包裝入前衣殼中，由此形成了額外的rdsRN。
使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Ausubel等，上文所述的)制備了MPC51pLM2653的電感受態(tài)細(xì)胞。簡言之，將單克隆在37℃生長于補(bǔ)充有氨芐青霉素(100μg/ml)，卡那霉素(50μg/ml)和50μg/ml DAP(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，Cat.No.D1377)的M9基本培養(yǎng)基中。以O(shè)D600＜0.1的50ml培養(yǎng)物開始，在對(duì)數(shù)生長期收集細(xì)胞，在OD6000.3-0.6之間。細(xì)胞用冰冷卻的5mM EDTA，10％甘油(v/v)洗一遍，然后用冰冷卻的10％甘油(v/v)洗三遍，每次洗完之后都以4000xg離心。在最后一次洗滌和旋轉(zhuǎn)之后，將細(xì)胞重懸于10％(v/v)甘油，以200μl進(jìn)行分裝并保存于-80℃。
用于電穿孔MPC51pLM2653的rS和rM的ssRNA(+)是分別使用線性化的pSTB2和pMTB7作為DNA模板體外合成的，如實(shí)施例2所述。用2μg ssRNA(+)(1.0μg rS+1.0μg rM)電穿孔MPC51 pLM2653細(xì)胞。電穿孔是使用Gene-Pulser，設(shè)置為200Ω，25mcF和1.8kV(BioRad，Hercules，CA)進(jìn)行的。允許細(xì)胞在28℃在補(bǔ)充有50μg/mlDAP不含抗生素的SOC培養(yǎng)基(cat#15544-034，Invitrogen，Carlsbad，CA)中恢復(fù)2小時(shí)。之后，在具有適當(dāng)?shù)目股兀a(bǔ)充50μg/ml D-谷氨酸和低于支持MPC51 pLM2653生長所必需的DAP最低濃度的0.1μg/ml DAP的條件下，細(xì)胞被分散在M9瓊脂上。允許細(xì)胞在25-27℃進(jìn)行生長，然后其被轉(zhuǎn)移至M9 Ap/Kn/D-谷氨酸且DAP被補(bǔ)充至0.01μg/ml或取出。在22-25℃培養(yǎng)細(xì)胞，由于pLM2653，所得克隆是氨芐青霉素抗性的，由于在rS和rM上asd基因的表達(dá)，所得克隆是DAP-非依賴的。
為了改進(jìn)生長特征，使用從pMTB7和作為基因8的來源的編碼野生型片段-S的質(zhì)粒pLM2775體外轉(zhuǎn)錄而來的ssRNA對(duì)MPC51pLM2653進(jìn)行電穿孔。如上所述進(jìn)行該程序和隨后的生長步驟，所得的DAP-非依賴型MPC51菌株攜帶有命名為LSMtb4的rdsRN(圖10)。
類似地，可以從作為基因8的來源的編碼野生型片段-S的質(zhì)粒pLM2775和從編碼功能性連接于rM IRES的Hc-Red蛋白的pMHc-Red體外轉(zhuǎn)錄而來的ssRNA電穿孔MPC51pLM2653。如上所述進(jìn)行該程序和隨后的生長步驟，所得的DAP-非依賴型MPC51菌株攜帶有命名為LSMHc-Red的rdsRN。
在第三個(gè)例子中，從編碼LCMV GP抗原的rS2(包括基因-8)構(gòu)建體pSGP1體外轉(zhuǎn)錄而來的ssRNA被用來緩解對(duì)來自wtS的基因-8序列的需求。如以上實(shí)施例所述，可使用從pSGP1和從pMGP2體外轉(zhuǎn)錄而來的RNA電穿孔弗氏志賀氏菌(S.flexneri)MPC51pLM2653。如上所述進(jìn)行隨后的生長步驟，所得的DAP-非依賴型MPC51菌株攜帶有命名為LSgpMgp的rdsRN。通過使用核殼特異性的抗血清對(duì)全細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫印跡以及使用特異于rS2和rM的(+)鏈和(-)鏈的引物進(jìn)行RT-PCR確證了rdsRN的存在。
值得注意的是，除非伴隨有wtL ssRNA或編碼wtL的質(zhì)粒，或者之前用編碼wtL的質(zhì)粒對(duì)靶菌株進(jìn)行過轉(zhuǎn)化，否則的話，以任意組合的rS和rM體外轉(zhuǎn)錄的ssRNA對(duì)MPC51進(jìn)行電穿孔都不會(huì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子。此外，在對(duì)MPC51pLM2653進(jìn)行電穿孔之前，用RNAse A處理體外轉(zhuǎn)錄的ssRNA可導(dǎo)致不能回收到轉(zhuǎn)化子。作為顯示RNA電穿孔用作產(chǎn)生rdsRN的效率和功效的另外的例子，通過與上述完全相同的方法將所有三種野生型片段的體外轉(zhuǎn)錄本電穿孔進(jìn)入丁香假單胞桿菌(Pseudomonas syringae)(phi-8的天然宿主)。這導(dǎo)致了野生型裂解細(xì)菌噬菌體phi-8的重構(gòu)，正如由從電穿孔所得的菌苔中噬菌斑的形成以及從電穿孔所得丁香假單胞桿菌內(nèi)部野生型噬菌體顆粒的透射電鏡視圖所證明的那樣(圖12)。
DAP-非依賴型似乎來自于由不同rdsRN編碼rS和/或rM RNA上asd+基因的擴(kuò)增。事實(shí)上，使用對(duì)負(fù)鏈或正鏈RNA擴(kuò)增特異性的引物，對(duì)攜帶有上述rdsRN菌株的總RNA進(jìn)行的RT-PCR分析導(dǎo)致了rS和rM cDNA的回收?；叵胍幌?，在噬菌體中的負(fù)鏈合成僅發(fā)生在全部三種基因組片段的吸收之后。在提交本說明書之時(shí)，在超過3個(gè)月的連續(xù)培養(yǎng)中，攜帶有rdsRN LSMtb4和LSMHc-Red的弗氏志賀氏菌(S.flexneri)依然保持DAP-非依賴性。最終，這些構(gòu)建體連續(xù)產(chǎn)生由免疫印跡可檢測到的殼蛋白，并通過透射電鏡看到了核殼的組裝(圖11)。
綜上，因此，這些結(jié)果說明在MPC51pLM2653中asd缺失的彌補(bǔ)是RNA吸收和包裝以及在包裝菌株內(nèi)rdsNC自我復(fù)制功能的結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明這些方法產(chǎn)生可以在所得菌株中維持的rdsRN。
實(shí)施例5在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中rdsRN編碼序列的表達(dá)雖然本發(fā)明的范圍并不局限于通過使用細(xì)菌包裝菌株將rdsRN遞送至哺乳動(dòng)物組織或有機(jī)體中，但由于其在眾多組織培養(yǎng)細(xì)胞系和動(dòng)物模型中的天然侵入性，為示例的目的(實(shí)施例3和4)利用減毒侵入性的細(xì)菌-弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)MPC51。如實(shí)施例3所述對(duì)該菌株進(jìn)行工程化從而能夠在侵入真核細(xì)胞之后裂解細(xì)菌細(xì)胞，并避開內(nèi)吞囊泡從而將rdsRN釋放至真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
作為第一線的證據(jù)，選擇的是攜帶有rdsRN LSMtb4的MPC51。這種rdsRN構(gòu)建體編碼的是被稱為TBS的結(jié)核分支桿菌抗原包裝。這種包裝的確切構(gòu)成對(duì)本發(fā)明并非至關(guān)重要，然而，為了解釋性的目的，這種抗原包裝的組分是編碼蛋白抗原85A的序列。如實(shí)施例2所述，將抗原包裝連接于HCV IRES序列，并且處在該序列的翻譯控制之下。在攜帶有這種rdsRN(MPC51+LSMtb4)的細(xì)菌菌株之內(nèi)TBS構(gòu)建體表達(dá)的缺乏可以通過使用多克隆抗血清(Abeam，Cambridge，UK)探測抗原85A的全細(xì)胞裂解物的免疫印跡所證明。
在37℃，5％CO2，在6-孔組織培養(yǎng)瓶的蓋玻片上，將HeLa細(xì)胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)在DMEM+10％胎牛血清(FBS)(Invitrogen，Carlsbad，CA)+1％抗生素/抗真菌溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA)生長至至少60％匯合。與此同時(shí)，在28℃，在振蕩條件下，在50ml M9中將弗氏志賀氏菌(S.flexneri)MPC51+LSMtb4生長至OD600至少為0.6。在進(jìn)行侵入分析之前24小時(shí)，將培養(yǎng)基從HeLa細(xì)胞中去除并使用DMEM+10％FBS進(jìn)行替換。在侵入之前2小時(shí)，使用DMEM替換HeLa細(xì)胞培養(yǎng)基，將細(xì)菌培養(yǎng)物稀釋并在37℃靜置生長。使用N2將組織培養(yǎng)箱內(nèi)的O2濃度降低至1％，將用PBS洗滌過的DMEM中的MPC51+LSMtb4懸液以100的感染復(fù)數(shù)(MOI)加入HeLa培養(yǎng)物，并孵育1小時(shí)。同時(shí)，將類似制備的弗氏志賀氏菌15D(asd)和MPC51pLM2653細(xì)菌懸液以相同的方式加入HeLa細(xì)胞的孔中。
在一小時(shí)的侵入性孵育之后，用PBS洗滌HeLa細(xì)胞兩次，更換培養(yǎng)基(DMEM+FBS)并補(bǔ)充150μg/ml的硫酸慶大霉素(Sigma，St.Louis，MO)1小時(shí)以殺死未侵入且不被HeLa細(xì)胞所保護(hù)的任意殘留的細(xì)菌細(xì)胞。在這一濃度慶大霉素是廣譜的抗菌劑，但并不能穿過真核細(xì)胞膜。一小時(shí)之后，使用新鮮的DMEM+FBS替換培養(yǎng)基，并將組織培養(yǎng)細(xì)胞放置于37℃，5％CO2孵育14小時(shí)。
然后取出具有HeLa細(xì)胞的蓋玻片，用2％多聚甲醛的PBS(pH 7.4)固定，用.1％溶解于PBS的Triton-X100(pH 7.4)進(jìn)行滲透，用3％BSA，5％正常山羊血清，0.05％疊氮化鈉(pH 7.4)的PBS封閉2小時(shí)，使用以1∶100稀釋于1％BSA，3％NGS，0.05％疊氮化鈉(pH 7.4)的PBS的抗原85A特異性抗血清(IgY)(Abeam，Cambridge，MA)進(jìn)行探測。隨后使用以1∶100稀釋于1％BSA，3％NGS，0.05％疊氮化鈉(pH 7.4)的PBS的FITC-偶聯(lián)的兔抗-IgY Abeam，Cambridge，MA)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行反探測(counter-probed)，并使用熒光顯微鏡檢測。未暴露于任何細(xì)菌，弗氏志賀氏菌15D，或MPC51pLM2653的對(duì)照HeLa細(xì)胞組并未表現(xiàn)出抗原85A表達(dá)的指示性熒光。暴露于侵入性MPC51+LSMtb4的HeLa細(xì)胞在細(xì)胞中具有明亮的熒光(圖13)，指示抗原85A表達(dá)作為TBS抗原融合蛋白的部分。再次值得注意的是在志賀氏菌包裝/載體菌株中并未檢測到抗原85A的表達(dá)，且在14小時(shí)孵育之后并未回收到活的志賀氏菌。這是rdsRN所產(chǎn)生重組片段mRNA的哺乳動(dòng)物翻譯的確切證據(jù)。
以類似于上文所述的方式，使用MPC51+LSMHc-Red侵入HeLa細(xì)胞，MPC51+LSMHc-Red具有在其rM片段上所編碼的直接熒光Hc-Red基因序列。在侵入暴露12小時(shí)之后，HeLa細(xì)胞蓋玻片被固定并在熒光顯微鏡下觀察。弗氏志賀氏菌15D，或MPC51pLM2653對(duì)照組并未表現(xiàn)出Hc-Red熒光；而MPC51+LSMHc-Red暴露的HeLa細(xì)胞則具有直接熒光(圖14)。由于該熒光的進(jìn)一步證據(jù)是Hc-Red表達(dá)，所以將HeLa細(xì)胞固定并使用Hc-Red特異性的抗體進(jìn)行探測，并使用次級(jí)抗體結(jié)合物進(jìn)行反探測。再一次地，只有暴露于MPC51+LSMHc-Red的細(xì)胞具有熒光(圖15)。此外，并不能單獨(dú)的使用免疫印跡或MPC51+LSMHc-Red直接熒光顯微鏡分析檢測Hc-Red表達(dá)。通過直接觀察熒光和蛋白的免疫檢測，這些組合的結(jié)果提供了rdsRN編碼的RNA已經(jīng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的證據(jù)。最后，由于沒有或僅有少數(shù)活的志賀氏菌可以在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)被回收，裸露的RNA具有確定的半衰期，且只有(+)鏈或mRNA能夠被翻譯成所編碼的蛋白，很清楚翻譯的信息的來源是在HeLa細(xì)胞內(nèi)部包裝/遞送菌株裂解之后由rdsRN產(chǎn)生的mRNA。
實(shí)施例6重組片段-S和重組片段-S2的示例性序列參照?qǐng)D4，以下是可用于實(shí)施本發(fā)明構(gòu)建重組片段-S(rS)的示例性序列。
PstIctgcag基因-8的細(xì)菌噬菌體phi-8片段-Spac和核糖體結(jié)合位點(diǎn)187(片段-S的1-187堿基，GenBank登錄號(hào)AF226853)gaaattttca aatcttttga ctatttcgct ggcatagctc ttcggagtga agccttccct
gaaaggcgcg aaggtcccca ccagctcggg gtgattcgtg acatttcctg ggatctcggagtcagctttg tctctaggag actgagcgtt cggtctcagg tttaaactga gattgaggataaagaca(SEQ ID NO1)→連接于asd基因大腸桿菌asd(GenBank登錄號(hào)V00262的240-1343堿基)atgaaaaatgt tggttttatc ggctggcgcg gtatggtcgg ctccgttctc atgcaacgcatggttgaaga gcgcgacttc gacgccattc gccctgtctt cttttctact tctcagcttg gccaggctgcgccgtctttt ggcggaacca ctggcacact tcaggatgcc tttgatctgg aggcgctaaaggccctcgat atcattgtga cctgtcaggg cggcgattat accaacgaaa tctatccaaagcttcgtgaa agcggatggc aaggttactg gattgacgca gcatcgtctc tgcgcatgaaagatgacgcc atcatcattc ttgaccccgt caatcaggac gtcattaccg acggattaaataatggcatc aggacttttg ttggcggtaa ctgtaccgta agcctgatgt tgatgtcgtt gggtggtttattcgccaatg atcttgttga ttgggtgtcc gttgcaacct accaggccgc ttccggcggtggtgcgcgac atatgcgtga gttattaacc cagatgggcc atctgtatgg ccatgtggcagatgaactcg cgaccccgtc ctctgctatt ctcgatatcg aacgcaaagt cacaaccttaacccgtagcg gtgagctgcc ggtggataac tttggcgtgc cgctggcggg tagcctgattccgtggatcg acaaacagct cgataacggt cagagccgcg aagagtggaa agggcaggcggaaaccaaca agatcctcaa cacatcttcc gtaattccgg tagatggttt atgtgtgcgtgtcggggcat tgcgctgcca cagccaggca ttcactatta aattgaaaaa agatgtgtctattccgaccg tggaagaact gctggctgcg cacaatccgt gggcgaaagt cgttccgaacgatcgggaaa tcactatgcg tgagctaacc ccagctgccg ttaccggcac gctgaccacgccggtaggcc gcctgcgtaa gctgaatatg ggaccagagt tcctgtcagc ctttaccgtgggcgaccagc tgctgtgggg ggccgcggag ccgctgcgtc ggatgcttcg tcaactggcgtaa(SEQ ID NO2)→連接于IRES丙型肝炎病毒-IRES(GenBank登錄號(hào)AJ242651的36-341堿基)atcactcccc tgtgaggaac tactgtcttc acgcagaaag cgcctagccatggcgttagtatgagtgtcg tgcagcctcc aggacccccc ctcccgggag agccatagtggtctgcggaaccggtgagta caccggaatt gccaggacga ccgggtcctt tcttggatcaacccgctcaatgcctggaga tttgggcgtg cccccgccag actgctagcc gagtagtgtt
gggtcgcgaaaggccttgtg gtactgcctg atagggtgct tgcgagtgcc ccgggaggtctcgtagaccgtgcaccatg(SEQ ID NO3)→連接于多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)和終止密碼子atg gtt aac gcg gcc gct taa tta ata aat aaa taa(SEQ ID NO4)→連接于SFV-3’非翻譯區(qū)西門利克森林病毒3’非翻譯區(qū)(GenBank登錄號(hào)V01398的1-262堿基)gttagggta ggcaatggca ttgatatagc aagaaaattg aaaacagaaa aagttagggtaagcaatggc atataaccat aactgtataa cttgtaacaa agcgcaacaa gacctgcgcaattggccccg tggtccgcct cacggaaact cggggcaact catattgaca cattaattggcaataattgg aagcttacat aagcttaatt cgacgaataa ttggattttt attttatttt gcaattggtttttaatattt cc(SEQ ID NO5)→連接于φ8片段-S 3′RNApol結(jié)合位點(diǎn)Phi-8片段-S 3’聚合酶結(jié)合位點(diǎn)(GenBank登錄號(hào)AF226853的3081-3192堿基)gcttagcggc aatcgaaccc tccg xcataagg aggtttagca aatccgcggc tcttatgagctgtccgaaag gacaacccga aagggggagc gaggacttcg gtcctccgct cc(SEQ ID NO6)PstIctgcag參照?qǐng)D4，以下是可用于實(shí)施本發(fā)明構(gòu)建編碼野生型噬菌體phi-8基因8的重組片段-S2(rS2)的示例性序列。
PstIctgcag
細(xì)菌噬菌體phi-8片段-S pac(GenBank登錄號(hào)AF226853的1-187bp)gaaattttcaaatcttttgactatttcgctggcatagctcttcggagtgaagccttccctgaaaggcgcgaaggtccccaccagctcggggtgattcgtgacatttcctgggatctcggagtcagctttgtctctaggagactgagcgttcggtctcaggtttaaactgagattgaggataaagaca(SEQ ID NO1)片段-S的細(xì)菌噬菌體phi-8基因8(GenBank登錄號(hào)AF226853的bp188-1291)atgggtagaatctttcaactgttgatgcgcttaggcgttaaacagggtgcagcaagtgttggtaaagccgggatcgatgctggtagcaagcgattgctccagcagatcatgtccaaagacggtgctattcagctgtctaaggcactcggtttcaccgctgtggagcagatgtcgagtgaagtgctcgaagcgtatctctatgagatcgttgagcatcttctgctcgtcgacgaggccacgttggccgatgcgcttatggcgtgtatcaccgatgcaggtgatatcgccattgagcgtctgcttccttccgtagaggatgtcgacaaaggcgaggcgcttgccgccacgctgactgtcgtcttggctctcttctcgatgaacaaagaacaagctgaagagcttaaacgttcgatggcatcgaaaggcttgagtccggaccgggttaccctcggaggacagaccctgttgaccgtcaagtccactggtactggcctgacagagtatgacgctcaaggcaagaatggcgtccctcgcgggatgtctgctaacaagcgtactgcattgttcttcgtgctgtacacagtgatcagtacttcctggtccgtatacgatcactatggtgaggttaaagctggtctcgcacgaggcgagctacctcccagtgctgatcgtgttgaattgcgggcccccggttcctccgtaagtgcgatcgagcgtgagacacaacgcgcactgcaagaagaacagccgcgtgcattgccttcgggcagccgcaccgcggaacgggttgctgggccgacgcagggtgatgtccccgtgctcacacctccgccaggtcgattcaccttcaccggtgagggcgaccatcgtcccgatttcgcacaactcgctcgccagaacgacactgatggcgttgtgcggatcattgaactggatcgcattccagatgcaaggaaaatattagtcgatggtgaccatgactacttgctggacgccgctcaacagcgcgtcgctgccgatatcggggtatcgcccgagtcagtaggtcgattcgctgctctggtagccagtatcatcaacgcgaaggagaagcgttcg tgatgc(SEQ ID NO7)BglIIagatct→連接于IRES
丙型肝炎病毒-IRES(GenBank登錄號(hào)AJ242651的36-341bp)atcactcccc tgtgaggaac tactgtcttc acgcagaaag cgcctagccatggcgttagtatgagtgtcg tgcagcctcc aggacccccc ctcccgggag agccatagtggtctgcggaaccggtgagta caccggaatt gccaggacga ccgggtcctt tcttggatcaacccgctcaatgcctggaga tttgggcgtg cccccgccag actgctagcc gagtagtgttgggtcgcgaaaggccttgtg gtactgcctg atagggtgct tgcgagtgcc ccgggaggtctcgtagaccgtgcaccatg(SEQ ID NO3)→連接于多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)和終止密碼子atg gtt aac gcg gcc gct taa tta ata aat aaa taa(SEQ ID NO4)→連接于SFV-3′非翻譯區(qū)西門利克森林病毒3’非翻譯區(qū)(GenBank登錄號(hào)V01398的1-262堿基)gttagggta ggcaatggca ttgatatagc aagaaaattg aaaacagaaa aagttagggtaagcaatggc atataaccat aactgtataa cttgtaacaa agcgcaacaa gacctgcgcaattggccccg tggtccgcct cacggaaact cggggcaact catattgaca cattaattggcaataattgg aagcttacat aagcttaatt cgacgaataa ttggattttt attttatttt gcaattggtttttaatattt cc(SEQ ID NO5)→連接于φ8片段-S 3′RNApol結(jié)合位點(diǎn)Phi-8片段-S 3’聚合酶結(jié)合位點(diǎn)(GenBank登錄號(hào)AF226853的3081-3192堿基)gcttagcggc aatcgaaccc tccg xcataagg aggtttagca aatccgcggc tcttatgagctgtccgaaag gacaacccga aagggggagc gaggacttcg gtcctccgct cc(SEQ ID NO6)PstIctgcag實(shí)施例7重組片段-M的示例性序列參照?qǐng)D4，以下是可用于實(shí)施本發(fā)明構(gòu)建重組片段-M的示例性序列。
KpnIggtacc→連接于片段M pac基因10的片段M pac序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(GenBank登錄號(hào)AF226852的1-262bp)gaaattttcaaagtctttcggcaataagggtggaaatttcaaagagggtcgagccgacgaacctctgtagaaccgggaagtgcctgtctttacttgcgagagcaattgaactagggcagcaccgggggtcgataagcgcagaagtgaggcgcggggattgaagcaaatcacctaagcgtaaacgacggacctcgagggtggcggagt ctacataggatcccctagctactagacagaaaccattcctaacaaggagatgcac(SEQ ID NO8)→連接于BgI IIBglIIagatct→連接于asd基因大腸桿菌asd(GenBank登錄號(hào)V00262的240-1343bp)atgaaaaatgt tggttttatc ggctggcgcg gtatggtcgg ctccgttctc atgcaacgcatggttgaaga gcgcgacttc gacgccattc gccctgtctt cttttctact tctcagcttg gccaggctgcgccgtctttt ggcggaacca ctggcacact tcaggatgcc tttgatctgg aggcgctaaaggccctcgat atcattgtga cctgtcaggg cggcgattat accaacgaaa tctatccaaagcttcgtgaa agcggatggc aaggttactg gattgacgca gcatcgtctc tgcgcatgaaagatgacgcc atcatcattc ttgaccccgt caatcaggac gtcattaccg acggattaaataatggcatc aggacttttg ttggcggtaa ctgtaccgta agcctgatgt tgatgtcgtt gggtggtttattcgccaatg atcttgttga ttgggtgtcc gttgcaacct accaggccgc ttccggcggtggtgcgcgac atatgcgtga gttattaacc cagatgggcc atctgtatgg ccatgtggcagatgaactcg cgaccccgtc ctctgctatt ctcgatatcg aacgcaaagt cacaaccttaacccgtagcg gtgagctgcc ggtggataac tttggcgtgc cgctggcggg tagcctgattccgtggatcg acaaacagct cgataacggt cagagccgcg aagagtggaa agggcaggcg
gaaaccaaca agatcctcaa cacatcttcc gtaattccgg tagatggttt atgtgtgcgtgtcggggcat tgcgctgcca cagccaggca ttcactatta aattgaaaaa agatgtgtctattccgaccg tggaagaact gctggctgcg cacaatccgt gggcgaaagt cgttccgaacgatcgggaaa tcactatgcg tgagctaacc ccagctgccg ttaccggcac gctgaccacgccggtaggcc gcctgcgtaa gctgaatatg ggaccagagt tcctgtcagc ctttaccgtgggcgaccagc tgctgtgggg ggccgcggag ccgctgcgtc ggatgcttcg tcaactggcgtaa(SEQ ID NO9)→連接于AscIAscIggcgcgcc-＞→連接于HCV-IRES丙型肝炎病毒-IRES(GenBank登錄號(hào)AJ242651的36-341bp)atcactcccc tgtgaggaac tactgtcttc acgcagaaag cgcctagcca tggcgttagtatgagtgtcg tgcagcctcc aggacccccc ctcccgggag agccatagtg gtctgcggaaccggtgagta caccggaatt gccaggacga ccgggtcctt tcttggatca acccgctcaatgcctggaga tttgggcgtg cccccgccag actgctagcc gagtagtgtt gggtcgcgaaaggccttgtg gtactgcctg atagggtgct tgcgagtgcc ccgggaggtc tcgtagaccgtgcacc(SEQ ID NO10)→連接于多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)atg gtt aac gcg gcc gct taa tta ata aat aaa taa(SEQ ID NO11)→連接于SFV 3’非翻譯序列西門利克森林病毒3’非翻譯區(qū)(GenBank登錄號(hào)V01398的1-262堿基)gttagggta ggcaatggca ttgatatagc aagaaaattg aaaacagaaa aagttagggtaagcaatggc atataaccat aactgtataa cttgtaacaa agcgcaacaa gacctgcgcaattggccccg tggtccgcct cacggaaact cggggcaact catattgaca cattaattggcaataattgg aagcttacat aagcttaatt cgacgaataa ttggattttt attttatttt gcaattggtt
tttaatattt cc(SEQ ID NO12)→連接于Phi-8的3’聚合酶結(jié)合位點(diǎn)Phi-8片段M 3’聚合酶結(jié)合位點(diǎn)(GenBank登錄號(hào)AF226852的4677-4741bp)actgttgataaacaggacccggaagggtaacccgagagggggagtgaggcttcggcctccacttc(SEQ ID NO13)→連接于PstIPstIctgcag實(shí)施例8rdsRN的提取和純化為了證明菌株MPC51 LSMtb4產(chǎn)生了核殼，可將單克隆在28℃生長于補(bǔ)充有氨芐青霉素(100μg/ml)，卡那霉素(50μg/ml)和D-谷氨酸(50μg/ml)的M9培養(yǎng)基中。以O(shè)D600＜0.1開始培養(yǎng)，在對(duì)數(shù)生長期收集細(xì)胞，在OD6000.6-0.8之間。在8000rpm離心5分鐘收集細(xì)胞。為了裂解細(xì)胞，將細(xì)菌重懸于5ml PBS，并在弗氏細(xì)胞壓碎器(Thermo Electron)中以20,000psi裂解細(xì)胞。將裂解物在8,000xg離心5分鐘，并將上清液用于含有10mM磷酸鉀(pH 7.3；Sigma，St.Louis，MO，Cat.No.P5379)和1mM氯化鎂(Sigma，St.Louis，MO，Cat.No.M1 028)的10-30％(w/v)蔗糖梯度。將所述梯度放置于Avanti J-30i離心機(jī)(Beckman Coulter，F(xiàn)ullerton，CA，Cat.No.363118)的JS24.15轉(zhuǎn)子中。在23℃，在23,000rpm離心90分鐘之后，核殼形成了明顯的帶，將其收集并分別保存在-80℃。將管中的剩余內(nèi)容分裝成1ml可分量并保存于-80℃?？赏ㄟ^使用殼特異性的抗血清進(jìn)行免疫印跡和使用設(shè)計(jì)擴(kuò)增(+)鏈和(-)鏈LSMtb4 RNA的引物通過RT-PCR證實(shí)在這些可分量中rdsRN的存在。
下文中設(shè)計(jì)了對(duì)rdsRN純化方法進(jìn)行的改進(jìn)。在28℃將攜帶有rdsRN LSMtb4的弗氏志賀氏菌MPC51的500ml培養(yǎng)物生長至OD600＝0.8，并將細(xì)胞沉淀?？墒褂枚嗖竭^濾和離心過程純化rdsRN。首先使用Invensys APV Microfluidyzer(Lake Wills，WI)裂解細(xì)胞沉淀，并通過離心進(jìn)行澄清。然后使用具有0.45μm孔徑元件(Millipore#P2HVMPC 05，或等價(jià)物)的Pellicon系統(tǒng)(Millipore Inc.，Billerica，MA)通過正切流動(dòng)過濾(TFF)對(duì)澄清的上清液進(jìn)行處理。使用Benzonase(25℃ 30分鐘)消化游離的核酸。
然后使用第二個(gè)過濾步驟來濃縮rdsRN并洗掉培養(yǎng)基成分，消化的核酸以及核酸酶?？梢允褂?00kDa螺旋狀纏繞超濾模塊(Millipore#CDUF 006 LH，或等價(jià)物)的正切流動(dòng)過濾來濃縮所述產(chǎn)物，并將緩沖液交換為磷酸緩沖鹽水或其他可選擇的客戶特定的緩沖液中。在正切流動(dòng)過濾之后，可通過加入NaCl或PEG將一半的部分純化rdsRN沉淀下來，然后重懸于小體積的磷酸緩沖液中(Hoogstraten等，Virology，272218-224，2000)。隨后可使用部分(10-25％)的PEG沉淀和重懸的材料進(jìn)行兩種小型分析規(guī)模的梯度純化。重懸的rdsRN可以被放置在已處理的蔗糖和opti-prep梯度上并離心過夜。收集rdsRN帶(由免疫印跡和RT-PCR分析所鑒定)，并通過對(duì)簽約的實(shí)驗(yàn)室指定的緩沖液進(jìn)行透析去除梯度材料。然后使用Q-離子交換層析和/或ActicleanEtoxTM(Sterogene，Carlsbad，CA)對(duì)純化的材料(包括梯度前和梯度后的)進(jìn)行處理從而去除殘留的內(nèi)毒素(如果需要的話)。最后對(duì)純化的rdsRN進(jìn)行等分并保存于4℃。
在純化過程的每個(gè)階段都取等分量，并通過免疫印跡和RT-PCR進(jìn)行分析。
實(shí)施例9rdsRN在小鼠中的免疫原性已知本發(fā)明是基于細(xì)菌噬菌體的RNA依賴的RNA聚合酶，還是應(yīng)該確定是否phi-8聚合酶在真核生物中具有功能?？墒褂眉兓暮藲?duì)6-8周齡的BALB/c小鼠(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，Cat.No.000651)進(jìn)行免疫，從而測定所純化的核殼能夠產(chǎn)生針對(duì)在rS和rM上所編碼的分支桿菌抗原包裝TBS的抗體的能力。共5組，每組5只小鼠，進(jìn)行以下免疫10μg空前衣殼，10ng核殼，100ng核殼，1μg核殼以及10μg核殼。小鼠在0天接受初次免疫，在14天和42天接受兩次加強(qiáng)免疫。所有免疫都是通過將核殼肌內(nèi)注射入每只小鼠的后腿。
為了測定對(duì)于TBS抗原的體液反應(yīng)，在每次免疫之前收集血清和之后以10天的間隔收集血清。以每只小鼠約100μl的量從每只小鼠的尾靜脈采集血液，并在冰上孵育4小時(shí)至凝塊。在離心機(jī)中離心5分鐘之后，將血清轉(zhuǎn)移至新管中并保存于-20℃。
可使用固相ELISA來定量IgG對(duì)于TBS抗原的反應(yīng)。以2μg/ml的濃度將純化的可溶性分支桿菌抗原懸浮于PBS并用來包被96-孔微滴定ELISA板。將所述板在4℃孵育過夜然后用0.05％(v/v)TBS-Tween溶液洗四次。然后在室溫使用blotto(5％(w/v)脫脂干奶粉的PBS)對(duì)板封閉1小時(shí)。然后如上所述，使用TBS-Tween溶液洗板。在blotto中稀釋血清，從1∶30開始的三倍連續(xù)稀釋被以二份重復(fù)的形式加入到板中，因此每個(gè)小孔的體積是100μl。在每次ELISA之前都將免疫前血清包括作為陰性對(duì)照。在室溫將板孵育2小時(shí)，然后用TBS-Tween溶液洗四次。為了進(jìn)行測定，次級(jí)抗體是堿性磷酸酶標(biāo)記的親和純化的山羊抗小鼠IgG(重鏈特異性的)(Accurate Chemical and ScientificCorporation，Westbury，NY，Cat.No.SBA103004)。次級(jí)抗體在TBS，2％(w/v)脫脂干奶粉，和5％(v/v)羊血清中以1∶2000進(jìn)行稀釋，向每個(gè)小孔中加入100μl并在室溫孵育1小時(shí)。通過在100μl底物中連續(xù)15分鐘的孵育進(jìn)行顯色，然后通過Invitrogen的ELISA擴(kuò)增系統(tǒng)(Cat No.19589-019)的100μl擴(kuò)增器進(jìn)行擴(kuò)增。使用SpectraMax微滴定板分光光度計(jì)(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在490nm測定吸光度。通過對(duì)490nm吸收值產(chǎn)生增加的最后一次血清稀釋取倒數(shù)可以計(jì)算出終點(diǎn)滴度，其大于陰性對(duì)照列的平均數(shù)加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差值。
可通細(xì)細(xì)胞內(nèi)過細(xì)胞因子染色(也稱為細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞技術(shù))或通過ELISPOT(Letsch A.等，Methods 31143-49；2003)測定細(xì)胞免疫力。兩種方法都允許對(duì)抗原特異性免疫反應(yīng)進(jìn)行定量，盡管ICS還需要添加在表型上對(duì)抗原特異性的CD4+和CD8+T細(xì)胞進(jìn)行表征的同步能力。這樣的分析可以測定出分泌IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10和IFN-的抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量(Wu等，AIDS Res.Hum.Retrovir.131187；1997)。可使用商業(yè)可獲得的俘獲和檢測mAbs進(jìn)行ELISPOT分析(R&D Systems and Pharmingen)，如參考文獻(xiàn)所述(Wu等，Infect.Immun.634933；1995)以及之前所用到的文獻(xiàn)所述(Xu-Amano等，J.Exp.Med.1781309；1993)；(Okahashi等，Infect.Immun.641516；1996)。每一種分析都包括有絲分裂原(Con A)和卵清蛋白對(duì)照。
實(shí)施例10片段-L表達(dá)如上文的實(shí)施例3和4所述，片段-wtL是被作為染色體外復(fù)制質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌包裝菌株的。很明顯，可通過將其整合入細(xì)菌染色體獲得更穩(wěn)定的表達(dá)wtL的方法?？蓪⑷狈ac序列的wtL的截短拷貝整合入染色體，從而構(gòu)建產(chǎn)生前衣殼的菌株，在這種情況下，全長野生型或重組片段-L RNA必須隨后與rM和rS RNA一起被電穿孔進(jìn)入整合體從而完成全部三種片段的包裝。或者，全長wtL可整合入染色體，從而消除隨后通過電穿孔引入wtL RNA的需要。
可使用溫度敏感性質(zhì)粒(在本文中稱為“TS”)通過同源重組實(shí)現(xiàn)染色體整合，該質(zhì)粒能夠僅在可容許的溫度(30℃)下復(fù)制，而不能再非容許的溫度(42℃或以上)下復(fù)制(Kretschmer等.，J.Bacterid.124225；1975)；(Hashimoto and Sekiguchi，J.Bacterid.1271561；1976)。TS質(zhì)粒的例子包括pMAK705，pTSA29，pTSC29，pTSK29，其全部都是pSC101的衍生物(Hamilton等.，J.Bacterid.1714617；1989)；(Phillips，Plasmid 4178；1999)。
關(guān)于TS質(zhì)粒在等位基因交換中的使用已在他處有詳細(xì)描述(Hashimoto and Sekiguchi，J.Bacteriol.1271561；1976)；(Hamilton等.，J.Bacteriol.1714617；1989)；(Phillips，Plasmid 4178；1999)。簡言之，將wtL序列克隆入TS質(zhì)粒從而使得其側(cè)翼為待缺失的基因序列。然后將攜帶有所克隆基因的質(zhì)粒電穿孔進(jìn)入靶細(xì)菌，并將細(xì)胞在42℃生長從而允許共整合形成，即，在染色體和質(zhì)粒同源序列之間的初始重組事件。通過將細(xì)胞生長于補(bǔ)充有所述質(zhì)粒上攜帶有抗生素標(biāo)記的培養(yǎng)基上對(duì)共聯(lián)體進(jìn)行篩選。由于所述質(zhì)粒在42℃不復(fù)制，則只有共整合體(cointegrates)才具有抗生素抗性。共聯(lián)體攜帶有染色體中質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)，當(dāng)共聯(lián)體隨后在30℃生長于存在抗生素的情況下時(shí)，從其進(jìn)行的復(fù)制對(duì)細(xì)胞是有害的。因此，在30℃時(shí)，第二個(gè)重組事件(消除)的發(fā)生導(dǎo)致了質(zhì)粒的再生。然后可以在42℃測定單克隆的抗生素抗性，使得抗生素敏感的克隆不再具有整合入染色體的質(zhì)粒。為了對(duì)由第二次重組所產(chǎn)生質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行治愈，可將這些細(xì)胞生長于42℃而不加入抗生素。
在另一種方法中，TS質(zhì)粒可用來表達(dá)wtL，和實(shí)施例3非常相似，然而，所述細(xì)菌最初只能在容許性的溫度下生長。將wtL克隆至細(xì)菌啟動(dòng)子，例如T7的控制之下，在這種情況下，可以在30℃進(jìn)行表達(dá)。在通過電穿孔導(dǎo)入rM和rS RNA之后，由wtL編碼的前衣殼能夠包裝和復(fù)制兩種RNA。然后可以通過在42℃進(jìn)行生長且不加入抗生素而處理(cure)細(xì)胞的質(zhì)粒。所得的無質(zhì)粒細(xì)胞可以繼續(xù)復(fù)制RNA并可被用作不攜帶有與質(zhì)粒相關(guān)的調(diào)節(jié)內(nèi)容的細(xì)菌疫苗載體，例如導(dǎo)入抗生素抗性。
雖然在此已經(jīng)詳細(xì)地，并可參照其特定的實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但在不偏離本發(fā)明的內(nèi)涵和外延的情況下進(jìn)行的各種改變和修飾對(duì)本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員而言依然是顯而易見的。
權(quán)利要求
1.用于包裝，產(chǎn)生和/或遞送基因或RNA的細(xì)菌菌株，包含a)含有至少一種選擇性表型突變的基因組DNA；b)編碼產(chǎn)生核殼所必需基因的核酸序列；c)包含具有RNA包裝和RNA聚合酶活性的蛋白的一種或多種核殼；以及d)包含在所述一種或多種核殼內(nèi)部的dsRNA序列，所述dsRNA序列至少編碼i)彌補(bǔ)所述至少一種選擇性表型突變的基因產(chǎn)物，以及ii)可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA。
2.權(quán)利要求1的細(xì)菌菌株，其中編碼產(chǎn)生核殼所必需基因的所述核酸序列存在于所述一種或多種核殼之內(nèi)。
3.權(quán)利要求1的細(xì)菌細(xì)胞，其中編碼產(chǎn)生核殼所必需基因的所述核酸序列存在于所述基因組DNA之內(nèi)。
4.權(quán)利要求1的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)一步含有質(zhì)粒，且其中編碼產(chǎn)生核殼所必需基因的所述核酸序列是所述質(zhì)粒的一部分。
5.權(quán)利要求1的菌株，其中編碼產(chǎn)生核殼所必需基因的所述核酸序列含有RNA噬菌體的片段-L或其功能性突變體。
6.權(quán)利要求1的細(xì)菌菌株，其中在所述一種或多種核殼內(nèi)部所包含的dsRNA序列含有RNA的片段-S或RNA噬菌體或病毒的片段-M或二者的至少一部分。
7.權(quán)利要求6的細(xì)菌菌株，其中片段-S的所述部分是片段-S pac序列。
8.權(quán)利要求6的細(xì)菌菌株，其中片段-S的所述部分是片段-S RNA依賴的聚合酶識(shí)別序列。
9.權(quán)利要求6的細(xì)菌菌株，其中片段-M的所述部分是片段-M pac序列。
10.權(quán)利要求6的細(xì)菌菌株，其中片段-M的所述部分是片段-MRNA依賴的聚合酶識(shí)別序列。
11.權(quán)利要求1的細(xì)菌菌株，其中所述選擇性表型突變是營養(yǎng)缺陷型突變。
12.權(quán)利要求11的細(xì)菌菌株，其中所述營養(yǎng)缺陷型突變選自aroA，aroC，leuD，asd和murI。
13.權(quán)利要求1的細(xì)菌菌株，其中所述選擇性表型突變是細(xì)胞壁合成突變。
14.權(quán)利要求13的細(xì)菌菌株，其中所述細(xì)胞壁合成突變選自asd和murI。
15.權(quán)利要求1的細(xì)菌菌株，其中所述選擇性表型突變是阻止在溫度高于32℃條件下生長的突變。
16.權(quán)利要求15的細(xì)菌菌株，其中阻止在溫度高于32℃條件下生長的所述選擇性表型突變是htrB。
17.權(quán)利要求1的細(xì)菌菌株，其中具有RNA包裝和RNA聚合酶活性的所述蛋白以及編碼產(chǎn)生噬菌體或病毒核殼所必需基因的所述核酸序列得自選自Phi-6，Phi-7，Phi-8，Phi-9，Phi-10，Phi-11，Phi-12和Phi-13的噬菌體。
18.權(quán)利要求1的細(xì)菌菌株，其中所述細(xì)菌菌株得自于選自彎曲桿菌屬(Campylobacter)，奈瑟菌屬(Neisseria)，嗜血桿菌屬(Haemophilus)，產(chǎn)氣單胞菌屬(Aeromonas)，弗朗西斯菌屬(Francisella)，耶爾森氏菌屬(Yersinia)，克雷伯桿菌屬(Klebsiella)，博代氏桿菌屬(Bordetella)，軍團(tuán)桿菌屬(Legionella)，棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，衣原體(Chlamydia)，布魯氏菌屬(Brucella)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，螺桿菌屬(Helicobacter)，檸檬酸細(xì)菌屬(Citrobacter)，弧菌屬(Vibrio)，埃希氏菌屬(Escherichia)，志賀菌屬(Shigella)，沙門氏菌屬(Salmonella)，李斯特菌屬(Listeria)和分支桿菌屬(Mycobacterium)的細(xì)菌種。
19.權(quán)利要求1的細(xì)菌菌株，其中所述目的RNA編碼選自病毒抗原，細(xì)菌抗原，寄生蟲抗原，腫瘤抗原，移植物抗原，自身免疫抗原，佐劑和細(xì)胞因子的蛋白。
20.重組雙鏈RNA核殼(rdsRN)，其含有a)具有RNA包裝和RNA聚合酶活性的蛋白，以及b)dsRNA序列，其至少編碼i)基因產(chǎn)物，以及ii)可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA。
21.權(quán)利要求20的rdsRN，進(jìn)一步包含編碼產(chǎn)生核殼所必需基因的核酸序列。
22.權(quán)利要求21的rdsRN，其中所述核酸序列含有RNA噬菌體的片段-L或其功能性突變體。
23.權(quán)利要求20的rdsRN，其中所述dsRNA序列含有RNA噬菌體的片段-S或RNA噬菌體的片段-M或者二者的至少一部分。
24.權(quán)利要求23的rdsRN，其中片段-S的所述部分是片段-S pac序列，基因8，或野生型片段-S。
25.權(quán)利要求23的rdsRN，其中片段-S的所述部分是片段-S RNA依賴的聚合酶識(shí)別序列。
26.權(quán)利要求23的rdsRN，其中片段-M的所述部分是片段-M pac序列。
27.權(quán)利要求23的rdsRN，其中片段-M的所述部分是片段-M RNA依賴的聚合酶識(shí)別序列。
28.權(quán)利要求20的rdsRN，其中所述基因產(chǎn)物彌補(bǔ)宿主細(xì)胞中的可選擇表型突變。
29.權(quán)利要求28的rdsRN，其中所述表型突變選自aroA，aroC和leuD。
30.權(quán)利要求20的rdsRN，其中所述目的基因編碼細(xì)胞壁合成突變。
31.權(quán)利要求30的rdsRN，其中所述細(xì)胞壁合成突變選自asd和murI。
32.權(quán)利要求20的rdsRN，其中所述目的基因編碼阻止在溫度高于32℃條件下生長的突變。
33.權(quán)利要求32的rdsRN，其中所述目的基因是htrB。
34.權(quán)利要求20的rdsRN，其中具有RNA包裝和RNA聚合酶活性的所述蛋白得自選自Phi-6，Phi-8和Phi-13的噬菌體。
35.權(quán)利要求20的rdsRN，其中所述目的RNA編碼選自病毒抗原，細(xì)菌抗原，寄生蟲抗原，腫瘤抗原，移植抗原，自身免疫抗原，佐劑和細(xì)胞因子的蛋白。
36.權(quán)利要求20的rdsRN，其中一種或多種所述dsRNA序列是氟化的。
37.疫苗制劑，含有，細(xì)菌細(xì)胞，其含有a)含有至少一種選擇性表型突變的基因組DNA；b)編碼產(chǎn)生核殼所必需基因的核酸序列；c)包含具有RNA包裝和RNA聚合酶活性的蛋白的一種或多種核殼；以及d)在所述核殼內(nèi)部含有的dsRNA序列，所述RNA序列至少編碼i)基因產(chǎn)物，以及ii)可操作連接于真核翻譯起始序列的編碼免疫原的RNA。
38.權(quán)利要求37的疫苗制劑，其中一種或多種所述dsRNA序列是氟化的。
39.疫苗制劑，含有，重組雙鏈RNA核殼(rdsRNs)，其含有a)具有RNA包裝和RNA聚合酶活性的蛋白；b)dsRNA序列，其至少編碼i)彌補(bǔ)至少一種選擇性表型突變的基因產(chǎn)物，以及ii)可操作連接于真核翻譯起始序列的編碼免疫原的RNA；以及iii)編碼產(chǎn)生噬菌體或病毒核殼所必需基因的核酸序列。
40.構(gòu)建用作細(xì)菌包裝菌株的重組細(xì)菌的方法，包括以下步驟向細(xì)菌的基因組DNA中導(dǎo)入至少一種選擇性表型突變；對(duì)所述細(xì)菌進(jìn)行遺傳工程化從而使之含有編碼功能性雙鏈RNA噬菌體核殼蛋白的DNA；以及向所述細(xì)菌中插入mRNA片段，所述mRNA片段編碼i編碼彌補(bǔ)所述至少一種選擇性表型突變的功能性產(chǎn)物的至少一種基因；以及ii功能性雙鏈RNA噬菌體核殼蛋白。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述mRNA片段進(jìn)一步編碼目的基因。
42.突變細(xì)菌，其內(nèi)部含有表達(dá)dsRP前衣殼的一種或多種DNA序列以及能夠選擇和維持rdsRN的突變，所述rdsRN表達(dá)彌補(bǔ)所述突變的功能基因。
43.權(quán)利要求14的細(xì)菌菌株，其中所述細(xì)胞壁合成突變是asd。
44.權(quán)利要求17的細(xì)菌菌株，其中具有RNA包裝和RNA聚合酶活性的所述蛋白以及編碼產(chǎn)生噬菌體或病毒核殼所必需基因的所述核酸序列得自噬菌體Phi-8并包括噬菌體Phi-8的基因8。
45.權(quán)利要求18的細(xì)菌菌株，其中所述細(xì)菌菌株得自志賀菌屬。
46.權(quán)利要求19的細(xì)菌菌株，其中所述蛋白是細(xì)菌抗原。
47.權(quán)利要求46的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌抗原是結(jié)核抗原。
48.權(quán)利要求31的rdsRN，其中所述細(xì)胞壁合成突變是asd。
49.權(quán)利要求34的rdsRN，其中具有RNA包裝和RNA聚合酶活性的所述蛋白得自噬菌體Phi-8并包括噬菌體Phi-8的基因8。
50.權(quán)利要求35的rdsRN，其中所述蛋白是細(xì)菌抗原。
51.權(quán)利要求50的rdsRN，其中所述細(xì)菌抗原是結(jié)核抗原。
52.權(quán)利要求1的細(xì)菌菌株，其中所述目的RNA編碼凋亡增強(qiáng)蛋白。
53.權(quán)利要求52的細(xì)菌菌株，其中所述凋亡增強(qiáng)蛋白選自caspase8，死亡受體-5，F(xiàn)as和Fas細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域/CD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域融合蛋白。
54.權(quán)利要求1的細(xì)菌菌株，其中所述目的RNA編碼耐受誘導(dǎo)蛋白。
55.權(quán)利要求54的細(xì)菌菌株，其中所述耐受誘導(dǎo)蛋白是caspase 9。
56.權(quán)利要求20的重組雙鏈RNA核殼，其中所述目的RNA編碼凋亡增強(qiáng)蛋白。
57.權(quán)利要求20的重組雙鏈RNA核殼，其中所述目的RNA編碼耐受誘導(dǎo)蛋白。
58.權(quán)利要求1的細(xì)菌菌株，其中所述dsRNA含有核酸酶抗性RNA。
59.權(quán)利要求58的細(xì)菌菌株，其中所述核酸酶抗性RNA是氟化的RNA。
60.權(quán)利要求20的重組雙鏈RNA核殼，其中所述dsRNA含有核酸酶抗性RNA。
61.權(quán)利要求60的重組雙鏈RNA核殼，其中所述核酸酶抗性RNA是氟化的RNA。
62.用于包裝，導(dǎo)入和產(chǎn)生rdsRN的細(xì)菌菌株，含有a)含有至少一種選擇性表型突變的基因組DNA；b)編碼產(chǎn)生前衣殼所必需基因的核酸序列；以及c)包含具有RNA包裝和RNA聚合酶活性的蛋白的一種或多種前衣殼。
63.用于導(dǎo)入rdsRN的氟化RNA序列，其至少編碼i)彌補(bǔ)至少一種選擇性表型突變的基因產(chǎn)物；以及ii)可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA。
64.氟化RNA序列，其至少編碼i)彌補(bǔ)至少一種選擇性表型突變的基因產(chǎn)物；ii)用于穩(wěn)定產(chǎn)生核殼的基因-8(SEQ ID NO7)；以及iii)可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA。
65.氟化RNA序列，其至少編碼i)產(chǎn)生核殼所必需的基因；ii)彌補(bǔ)至少一種選擇性表型突變的基因產(chǎn)物；iii)可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA。
66.氟化RNA序列，其至少編碼i)產(chǎn)生核殼所必需的基因；ii)彌補(bǔ)所述至少一種選擇性表型突變的基因產(chǎn)物；iii)用于穩(wěn)定產(chǎn)生核殼的基因-8(SEQ ID NO7)；以及iv)可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA。
67.電穿孔介質(zhì)，其含有i)用于包裝、導(dǎo)入和產(chǎn)生rdsRN的細(xì)菌菌株，其含有a)含有至少一種選擇性表型突變的基因組DNA；b)編碼產(chǎn)生前衣殼所必需基因的核酸序列；以及c)包含具有RNA包裝和RNA聚合酶活性蛋白的一種或多種前衣殼；以及ii)氟化的RNA序列，其至少編碼a)彌補(bǔ)所述至少一種選擇性表型突變的基因產(chǎn)物，b)可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA。
68.電穿孔介質(zhì)，其含有i)用于包裝、導(dǎo)入和產(chǎn)生rdsRN的細(xì)菌菌株，其含有a)含有至少一種選擇性表型突變的基因組DNA；b)編碼產(chǎn)生前衣殼所必需基因的核酸序列；以及c)包含具有RNA包裝和RNA聚合酶活性的蛋白的一種或多種前衣殼；以及ii)氟化的RNA序列，其至少編碼a)彌補(bǔ)所述至少一種選擇性表型突變的基因產(chǎn)物，b)用于穩(wěn)定產(chǎn)生核殼的基因-8(SEQ ID NO7)；以及c)可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA。
69.電穿孔介質(zhì)，其含有i)用于包裝、導(dǎo)入和產(chǎn)生rdsRN的細(xì)菌菌株，其含有a)含有至少一種選擇性表型突變的基因組DNA；b)編碼產(chǎn)生前衣殼所必需基因的核酸序列；以及c)包含具有RNA包裝和RNA聚合酶活性的蛋白的一種或多種前衣殼；以及ii)氟化的RNA序列，其至少編碼a)產(chǎn)生核殼所必需的基因；b)彌補(bǔ)所述至少一種選擇性表型突變的基因產(chǎn)物；c)用于穩(wěn)定產(chǎn)生核殼的基因-8(SEQ ID NO7)；以及d)可操作連接于真核翻譯起始序列的目的RNA。
70.權(quán)利要求1的細(xì)菌菌株，其中所述至少一種選擇性表型突變是不可回復(fù)的選擇性表型突變。
71.權(quán)利要求28的rdsRN，其中所述選擇性表型突變是不可回復(fù)的選擇性表型突變。
72.權(quán)利要求37的疫苗制劑，其中所述至少一種選擇性表型突變是不可回復(fù)的選擇性表型突變。
73.權(quán)利要求39的疫苗制劑，其中所述至少一種選擇性表型突變是不可回復(fù)的選擇性表型突變。
74.權(quán)利要求40的方法，其中所述至少一種選擇性表型突變是不可回復(fù)的選擇性表型突變。
75.權(quán)利要求62的細(xì)菌菌株，其中所述至少一種選擇性表型突變是不可回復(fù)的選擇性表型突變。
76.權(quán)利要求63的氟化RNA序列，其中所述至少一種選擇性表型突變是不可回復(fù)的選擇性表型突變。
77.權(quán)利要求63的氟化RNA序列，其中所述至少一種選擇性表型突變是不可回復(fù)的選擇性表型突變。
78.權(quán)利要求64的氟化RNA序列，其中所述至少一種選擇性表型突變是不可回復(fù)的選擇性表型突變。
79.權(quán)利要求65的氟化RNA序列，其中所述至少一種選擇性表型突變是不可回復(fù)的選擇性表型突變。
80.權(quán)利要求66的氟化RNA序列，其中所述至少一種選擇性表型突變是不可回復(fù)的選擇性表型突變。
81.權(quán)利要求67的電穿孔介質(zhì)，其中所述至少一種選擇性表型突變是不可回復(fù)的選擇性表型突變。
82.權(quán)利要求68的電穿孔介質(zhì)，其中所述至少一種選擇性表型突變是不可回復(fù)的選擇性表型突變
83.權(quán)利要求69的電穿孔介質(zhì)，其中所述至少一種選擇性表型突變是不可回復(fù)的選擇性表型突變。
全文摘要
本發(fā)明公開了適用于產(chǎn)生重組雙鏈RNA核殼(rdsRNs)的細(xì)菌包裝菌株。所述包裝菌株可用于制備在真核細(xì)胞或組織中編碼疫苗抗原，生物活性蛋白，免疫調(diào)節(jié)蛋白，反義RNA，以及催化RNA的RNA。本發(fā)明還公開了將重組ssRNA導(dǎo)入所述菌株并進(jìn)行包裝從而以從頭合成的方式形成rdsRNs。
文檔編號(hào)C07H21/02GK101068919SQ200580041153
公開日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2005年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月30日
發(fā)明者大衛(wèi)·邁克爾·霍恩, 約翰·富爾克松, 杰拉爾德·C·薩多夫, 大衛(wèi)·奧尼亞貝, 米謝勒·斯通 申請(qǐng)人:Aeras全球Tb疫苗基金會(huì)