專利名稱：高純度藥用甜葉菊糖苷的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種提純方法，具體地說是一種甜葉菊糖苷的提純方法。
背景技術(shù)：
目的意義工業(yè)生產(chǎn)中甜味劑主要有三大類第一類是為化工合成產(chǎn)品糖精、甜蜜素、阿斯巴甜等；第二類是化學(xué)改性的天然植物性糖，如木糖醇、甘露糖醇；第三類是天然植物性糖。天然植物性糖又包括有能量代謝(蔗糖、麥芽糖、果糖、葡萄糖等)，無能量代謝(甘草糖苷、甜葉菊糖苷等)。
隨著人類生活水平的不斷提高，人們更加傾向于使用安全性較高的天然產(chǎn)物甘草糖苷和甜葉菊糖苷，因此在未來的生活中甘草糖苷和甜葉菊糖苷有較廣闊的應(yīng)用前景。
甜葉菊糖苷具有如下的特點1、甜葉菊糖苷甜度高，與糖苷濃度有關(guān)，大約為蔗糖的250～450倍，甜味接近于蔗糖，可代替糖精和部分蔗糖；甜葉菊糖苷主要有8種成分組成，其中Stevioside和Rebaudioside成分達(dá)到90％以上，而且Rebaudioside甜味最接近于蔗糖。
2、低熱量，其熱量大約為蔗糖的1/300，穩(wěn)定性好，其在人體內(nèi)不參與代謝。
3、無毒性的特點，大量的動物實驗證明了甜葉菊糖苷無毒性，1970年開始，日本將從甜葉菊中葉片中提取甜葉菊糖苷作為了甜味劑在食品、保健品、藥品等行業(yè)廣泛應(yīng)用。
4、還有報道甜葉菊糖苷對糖尿病、小兒齲齒、肥胖癥、高血壓、心臟病有一定防治功能和輔助療效。
2004年8月，JECFA在第63次會議上認(rèn)可了甜葉菊提取物使用的試行案。該試行案允許甜葉菊糖苷作為甜味劑使用，認(rèn)為成人每天的安全攝取甜葉菊糖苷量為2mg/kg。該試行案的實施意味著甜葉菊糖苷的應(yīng)用將從部分地區(qū)走向世界。但是JECFA認(rèn)為作為甜味劑的甜葉菊糖苷純度必須在95％以上；目前在中國生產(chǎn)的甜葉菊糖苷純度只有80％，還沒有達(dá)到該試行案的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可以將甜葉菊糖苷的純度達(dá)到95％以上，使甜葉菊糖苷的濃度可以達(dá)到藥用標(biāo)準(zhǔn)的高純度甜葉菊糖苷的制備方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的1、Al2O3柱層析法純化(1)Al2O3的前處理稱取一定重量的Al2O3，經(jīng)5％的HCL浸泡12h后，用蒸餾水洗至中性，濕法裝柱，徑高比為1∶10；(2)上樣稱取80℃下烘至恒重的純度為80％甜葉菊糖苷粗干粉，粗干粉高度為Al2O3高度的1/5；(3)洗脫和定性檢測用第一次柱層析的第一次流動相即丙酮∶石油醚＝1∶1進(jìn)行洗脫，自然洗脫流速或液面高差為1m，對洗脫液進(jìn)行硫酸顯色定性檢測，至無紅色為止；改用用第一次柱層析的第二次流動相即100％乙醇進(jìn)行洗脫，同時用自動部分收集器進(jìn)行收集；對洗脫液進(jìn)行硫酸顯色定性檢測，至無粉紅色為止；2.濃縮收集第一次柱層析的第二次流動相洗脫液，進(jìn)行濃縮；3.硅膠柱層析法純化
(1)裝柱稱取一定重量的硅膠，用水浸泡后濕法裝柱，徑高比為1∶10；(2)上樣將第2步的濃縮液體上樣，上樣量為硅膠柱高度的1/10；(3)洗脫用第二次柱層析的流動相即20％乙醇進(jìn)行洗脫，自然洗脫流速或液面高差為1m，對洗脫液進(jìn)行硫酸顯色定性檢測，從粉紅色出現(xiàn)到無粉紅色為止，收集該段洗脫液得到本發(fā)明的產(chǎn)品。
本發(fā)明的產(chǎn)品可以通過這樣的方法來定性、定量檢測(1)甜葉菊糖苷的定性檢測法----硅膠薄層層析用0.1mol/L的硼酸溶液調(diào)漿制硅膠板，展開體系(正丁醇∶乙酸∶乙醚∶水＝9∶6∶3∶1)；顯色劑50％的硫酸。本方法能夠?qū)⑻鹑~菊糖苷中的兩種主要單體成分(St和RA)、麥芽糖、葡萄糖區(qū)分開。
(2)甜葉菊糖苷的定量檢測有5種方法參考。
A.分光光度計可見光法。郝再彬申請的專利快速測定甜葉菊糖苷含量的方法和專用試劑，專利申請?zhí)?00510010277.3；專利公開號CN1731144A；2006年2月8日公示，見發(fā)明專利公報2006，22(06)311；B.流動注射化學(xué)發(fā)光法。楊丹，郝再彬(2005)，化學(xué)工程師0423～25；C.鐵氰化鉀-魯米諾流動注射化學(xué)發(fā)光法。郝再彬申請的專利(正在申請中)；D.高壓液相色譜紫外檢測法。坂牧成惠等(2004)。食品衛(wèi)生志(日文)。45(2)81～86；E.毛細(xì)管電泳紫外檢測法等方法。邵寒娟，胡涌剛(2001)。植物學(xué)通報，18(1)113～117。
高純度藥用甜葉菊糖苷的定義高純度的含量為95％-98％；同時達(dá)到JECFA認(rèn)可的甜葉菊提取物使用的試行案中純度必須在95％以上的要求。[注2004年8月世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧組織(WHO/FAO)所屬的食品添加劑專家委員會(JECFA)在第63次會議上認(rèn)可了甜葉菊提取物使用的試行案，純度必須在95％以上的要求]。
藥用符合中華人民共和國藥典的要求。
本發(fā)明所基于的原理為吸附層析就是利用吸附劑這種吸附能力可受溶媒影響而發(fā)生改變的性質(zhì)，在樣品中的物質(zhì)被吸附劑吸附后，用適當(dāng)?shù)南疵撘簺_洗，改變吸附劑的吸附能力，使被吸附的物質(zhì)解吸，隨洗脫液向前移動。經(jīng)過反復(fù)的吸附—解吸—再吸附—再解吸的過程，物質(zhì)即可沿洗脫液的前進(jìn)方向移動，其移動速度取決于當(dāng)時條件下吸附劑對該物質(zhì)的吸附能力。若吸附劑對物質(zhì)的吸附能力強(qiáng)，該物質(zhì)向前移動的速度慢；反之，若吸附能力弱，其移動速度快。由于吸附劑對樣品中個組分的吸附能力不同，所以在洗脫過程中個組分便會由于移動速度不同而逐漸的分離開來，這就是吸附層析的基本原理。
經(jīng)本發(fā)明的方法可使甜葉菊糖苷的含量由80％提高到95％--98％，起到精細(xì)加工的目的，為我國生產(chǎn)的高純度甜葉菊糖苷走向國際市場奠定了基礎(chǔ)。這對于改變我國是甜葉菊糖苷生產(chǎn)大國，而不是生產(chǎn)強(qiáng)國的局面；對于中國的甜葉菊糖苷工業(yè)生產(chǎn)的未來，具有一定的理論意義和實際應(yīng)用價值。
第一次層析以Al2O3為固定相，用第一次層析流動相洗脫，可去除葡萄糖、麥芽糖、蛋白質(zhì)、色素等大分子的雜質(zhì)，收集部分洗脫液后進(jìn)行濃縮進(jìn)行第二次層析。第二次層析以硅膠為固定相，用第二次層析流動相洗脫，可去除其他等雜質(zhì)，收集部分洗脫液后進(jìn)行濃縮進(jìn)行經(jīng)檢測甜葉菊糖苷含量可達(dá)到95％--98％。
本發(fā)明的制備高純度甜葉菊糖苷的方法，可使甜葉菊糖苷的含量達(dá)到98％，達(dá)到了JECFA的要求，具有一定的理論意義和較高的實際應(yīng)用價值。
四

圖1是甜葉菊糖苷的結(jié)構(gòu)式，其中R是H時為St、R是葡萄糖時為RA；
圖2是幾種糖的顯色反應(yīng)，其中1.St；2.RA；3.麥芽糖；4.葡萄糖；圖3幾種糖的薄層層析圖，其中1.St；2.RA；3.葡萄糖；4.麥芽糖。
五具體實施例方式
下面對本發(fā)明做更詳細(xì)的描述1.材料甜葉菊糖苷粗粉。
2.儀器設(shè)備BT124S萬分之一電子天平；玻璃層析柱(直徑5.0cm×長80.0cm)；玻璃試管；SBSZ100數(shù)控計滴自動部分收集器；UV-1600紫外可見分光光度計。
3.試劑(1)柱層析用的試劑第一次柱層析Al2O3、第一次流動相(丙酮∶石油醚＝1∶1)，第二次流動相(100％乙醇)；第二次柱層析硅膠(100μm)、流動相(20％乙醇)。
(2)定性檢測用的試劑甜葉菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(300倍蔗糖甜度的st和450倍蔗糖甜度的RA)、葡萄糖、麥芽糖，正丁醇、乙酸、乙醚、水、50％的硫酸。
4.Al2O3柱層析法純化甜葉菊糖苷(1)Al2O3的前處理稱取一定重量的Al2O3，經(jīng)5％的HCL浸泡12h后，用蒸餾水洗至中性，濕法裝柱，徑高比為1∶10。
(2)上樣稱取80□下烘至恒重的純度為80％甜葉菊糖苷樣品(粗干粉)，粗干粉高度為Al2O3高度的1/5。
(3)洗脫和定性檢測用第一次柱層析的第一次流動相(丙酮∶石油醚＝1∶1)進(jìn)行洗脫，自然洗脫流速或液面高差為1m，對洗脫液進(jìn)行硫酸顯色定性檢測(圖2)，至無紅色為止。改用用第一次柱層析的第二次流動相(100％乙醇)進(jìn)行洗脫，同時用自動部分收集器進(jìn)行收集。對洗脫液進(jìn)行硫酸顯色定性檢測(圖2)，至無粉紅色為止。
5.濃縮收集第一次柱層析的第二次流動相(100％乙醇)洗脫液，進(jìn)行濃縮。
6.硅膠柱層析法純化甜葉菊糖苷(1)裝柱稱取一定重量的硅膠，用水浸泡后濕法裝柱，徑高比為1∶10。
(2)上樣將第5步的濃縮液體上樣，上樣量為硅膠柱高度的1/10。
(3)洗脫用第二次柱層析的流動相(20％乙醇)進(jìn)行洗脫，自然洗脫流速或液面高差為1m，對洗脫液進(jìn)行硫酸顯色定性檢測(圖2)，從粉紅色出現(xiàn)到無粉紅色為止。收集該段洗脫液。
7.定性、定量檢測(1)硅膠薄層層析法定性檢測甜葉菊糖苷用0.1mol/L的硼酸溶液調(diào)漿制硅膠板，展開體系(正丁醇∶乙酸∶乙醚∶水＝9∶6∶3∶1)；顯色劑50％的硫酸。本方法能夠?qū)⑻鹑~菊糖苷中的兩種主要單體成分(St和RA)、麥芽糖、葡萄糖區(qū)分開(圖3)。
(2)分光光度法定量檢測甜葉菊糖苷(參見郝再彬申請的專利快速測定甜葉菊糖苷含量的方法和專用試劑，專利申請?zhí)?00510010277.3；專利公開號CN1731144A；2006年2月8日公示，見發(fā)明專利公報2006，22(06)311)
權(quán)利要求
一種高純度藥用甜葉菊糖苷的制備方法，其特征是1.1 Al2O3柱層析法純化1.1.1 Al2O3的前處理稱取一定重量的Al2O3，經(jīng)5％的HCL浸泡12h后，用蒸餾水洗至中性，濕法裝柱，徑高比為1∶10；1.1.2上樣稱取80℃下烘至恒重的純度為80％甜葉菊糖苷粗干粉，粗干粉高度為Al2O3高度的1/5；1.1.3洗脫和定性檢測用第一次柱層析的第一次流動相即丙酮∶石油醚＝1∶1進(jìn)行洗脫，自然洗脫流速或液面高差為1m，對洗脫液進(jìn)行硫酸顯色定性檢測，至無紅色為止；改用用第一次柱層析的第二次流動相即100％乙醇進(jìn)行洗脫，同時用自動部分收集器進(jìn)行收集；對洗脫液進(jìn)行硫酸顯色定性檢測，至無粉紅色為止；1.2濃縮收集第一次柱層析的第二次流動相洗脫液，進(jìn)行濃縮；1.3.硅膠柱層析法純化1.3.1裝柱稱取一定重量的硅膠，用水浸泡后濕法裝柱，徑高比為1∶10；1.3.2上樣將第2步的濃縮液體上樣，上樣量為硅膠柱高度的1/10；1.3.3洗脫用第二次柱層析的流動相即20％乙醇進(jìn)行洗脫，自然洗脫流速或液面高差為1m，對洗脫液進(jìn)行硫酸顯色定性檢測，從粉紅色出現(xiàn)到無粉紅色為止，收集該段洗脫液得到本發(fā)明的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種高純度藥用甜葉菊糖苷的制備方法，它包括Al
文檔編號C07H1/00GK1876669SQ200610010278
公開日2006年12月13日 申請日期2006年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月12日
發(fā)明者郝再彬, 原益山, 蒼晶, 楊丹, 王貴民, 一井真比古 申請人:哈爾濱綠葉科技開發(fā)有限責(zé)任公司