專利名稱：同位素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同位素氮15標(biāo)記-L-半胱氨酸和L-胱氨酸的制備方法，具體涉及利用有機合成的方法，制備15N標(biāo)記L-半胱氨酸和L-胱氨酸。
背景技術(shù)：
氮-15(簡稱15N，下同)是氮元素的穩(wěn)定同位素，可以用作示蹤劑，廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域，尤其對生命科學(xué)研究有極為重要的意義。特別是在蛋白質(zhì)的人工合成方面，氮-15氨基酸起著獨特的示蹤作用，其應(yīng)用越來越廣泛，市場前景良好。
此類產(chǎn)品產(chǎn)量小，對純度和豐度要求高。目前主要是通過化學(xué)合成法或生物發(fā)酵法生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法設(shè)備要求簡單，生產(chǎn)的氨基酸是DL型氨基酸(消旋體)，豐度高，但不具有光學(xué)活性，需要再經(jīng)化學(xué)或酶法拆分得到L型氨基酸。D型氨基酸大多被廢棄，導(dǎo)致氮-15原料利用率降低，增加了生產(chǎn)成本。生物發(fā)酵法具有反應(yīng)步驟少，產(chǎn)品光學(xué)純度高的優(yōu)點。但需要較大的設(shè)備投入，對菌種的要求高，后提取步驟較多。
L-半胱氨酸和L-胱氨酸均為含硫氨基酸，是構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要成分，屬非必需氨基酸，其化學(xué)合成法生產(chǎn)十分困難。目前國內(nèi)外報導(dǎo)的方法均為生物化學(xué)法。主要以動物毛發(fā)經(jīng)水解、分離、精制后得到，是當(dāng)前L-半胱氨酸、L-胱氨酸常用的生成方法。但目前尚未看到由化學(xué)合成法制備同位素15N標(biāo)記L-半胱氨酸的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種同位素15N標(biāo)記L-半胱氨酸的制備方法。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)同位素15N標(biāo)記L-半胱氨酸的制備方法，其特征在于，該方法包括以下工藝步驟(1)鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽的制備將含有15N標(biāo)記無機氮源與堿性溶液作用，經(jīng)鄰苯二甲酸溶液充分吸收氨氣后，蒸除溶劑，加熱后得到鄰苯二甲酰亞胺固體，將該固體與KOH的甲醇溶液作用得到鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽；無機氮源、鄰苯二甲酸、KOH的用量比為1∶1～5∶1～3；(2)鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯鈉鹽的制備將鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽與新鮮制備的溴代丙二酸二乙酯作用，經(jīng)加熱、冷卻、研磨、洗滌后得到鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯；再將該前體加熱溶解于適量無水甲苯，加入稍過量的金屬鈉，攪拌反應(yīng)1～7小時，冷卻過濾后得到黃色產(chǎn)物，為15N標(biāo)記的鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯鈉鹽，簡稱鈉鹽，下同；(3)縮合反應(yīng)將鈉鹽和芐基氯甲硫醚、無水甲苯共熱并回流5～25小時后，過濾沉淀，蒸除濾液中的甲苯，并經(jīng)無水乙醇重結(jié)晶后得到15N標(biāo)記的N-芐基氯甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯，簡稱縮合產(chǎn)物，下同；(4)水解反應(yīng)將縮合產(chǎn)物懸浮于乙醇與水的1∶1混合物中，于攪拌下加入5mol/L NaOH，并保持溫度在55～60℃反應(yīng)1～12小時，再加入足量HCl徹底水解；母液調(diào)pH值至中性后，析出的沉淀經(jīng)乙醇洗滌、過濾、重結(jié)晶后，得到晶體狀15N標(biāo)記的D，L-芐基半胱氨酸；(5)拆分過程采用氨基?；阜ú鸱值姆椒?，將上述D，L-芐基半胱氨酸經(jīng)乙酰化、氨基?；覆鸱郑蛛x后得到15N標(biāo)記的L-芐基半胱氨酸；未反應(yīng)的D-型乙?；S基半胱氨酸可經(jīng)消旋后繼續(xù)用于拆分；(6)解保護反應(yīng)L-芐基半胱氨酸于-70～-33.5℃低溫下，溶解于適量液氨中，緩慢加入小塊金屬鈉至體系維持藍色3～5min不褪；反應(yīng)完成后蒸發(fā)除去液氨，殘余物緩慢加水溶解，調(diào)pH值至中性、空氣流氧化，過濾、干燥后，得到15N標(biāo)記的L-胱氨酸，經(jīng)還原后可得到15N標(biāo)記的L-半胱氨酸。
所述的步驟(1)中15N標(biāo)記無機氮源選自(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl或NH4HCO3中的一種或幾種。
所述的步驟(3)中芐基氯甲硫醚的制備方法包括以下工藝步驟將芐硫醇與稍過量的三聚甲醛混合后，冰浴下冷卻，并用干燥HCl氣飽和，加入足責(zé)備量無水CaCl2，再于室溫下保持10～30小時后過濾，濾液經(jīng)洗滌、干燥，減壓下蒸餾，收集102℃、2mmHg的餾分，得到芐基氯甲硫醚。
所述的步驟(4)、(5)、(6)中可得到15N標(biāo)記半胱氨酸的相關(guān)衍生產(chǎn)品，該衍生產(chǎn)品包括L-、D-以及D，L-型的芐基半胱氨酸、乙酰化芐基半胱氨酸、半胱氨酸、胱氨酸。
本發(fā)明提供了一套15N標(biāo)記L-半胱氨酸和L-胱氨酸的制備方法。在現(xiàn)有的有機合成α-氨基酸技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合15N原料昂貴的特點，選擇適宜的合成前體，優(yōu)化合成路線和工藝，使之具有良好的經(jīng)濟性。該方法適用于合成15N標(biāo)記的L-、D-、D，L-型半胱氨酸、胱氨酸。本方法過程較為簡單，15N原料利用率高，得到的L-半胱氨酸及其衍生產(chǎn)品純度在99％以上，豐度在98％以上。
具體實施例方式
實施例1一種同位素15N標(biāo)記L-胱氨酸的制備方法，該方法包括以下工藝步驟(1)鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽的制備將60ml濃度為4mol/L的NaOH溶液緩慢滴加到放置有5.45g(0.10mol)15NH4Cl的燒瓶中，產(chǎn)生的氨氣鼓泡通入含18.27g(0.11mol)的鄰苯二甲酸懸浮液中，經(jīng)鄰苯二甲酸溶液充分吸收氨氣后，蒸除水分，升溫300℃后得到鄰苯二甲酰亞胺固體。將制得的固體與溶有70.14g(0.125mol)KOH的甲醇溶液作用，得到17.7g鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽，收率95％。
(2)鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯鈉鹽的制備將17.7g(0.095mol)鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽與新鮮制備的25.1g(0.105mol)溴代丙二酸二乙酯作用，經(jīng)油浴加熱、冷卻、研磨、洗滌后得到鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯。再將該前體加熱溶解于適量甲苯，加入2.4g(0.104mol)的金屬鈉，攪拌反應(yīng)1～7小時，冷卻過濾后得到24.95g(0.076mol)黃色產(chǎn)物，為15N標(biāo)記的鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯鈉鹽(簡稱鈉鹽，下同)，收率80％。
(3)縮合反應(yīng)將24.95g(0.076mol)鈉鹽和14.7g(0.085mol)芐基氯甲硫醚、200ml無水甲苯共熱并回流6小時后，將沉淀過濾、洗滌，并經(jīng)無水乙醇重結(jié)晶后，得到20.51g(0.046mol)15N標(biāo)記的N-芐基甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(簡稱縮合產(chǎn)物，下同)，收率61％。
(4)水解反應(yīng)取20.51g(0.046mol)15N標(biāo)記的縮合產(chǎn)物懸浮于100ml乙醇與水的1∶1混合物中，于攪拌下加入50ml濃度為5mol/L NaOH溶液，并保持溫度在55～60℃反應(yīng)6小時，再加入過量濃HCl徹底水解。母液用氨水調(diào)至中性后，析出的沉淀經(jīng)乙醇洗滌、過濾、重結(jié)晶后，得到5.41g(0.0255mol)晶體狀15N標(biāo)記的D，L-芐基半胱氨酸，收率55％，熔點212～215℃。
(5)拆分將上述得到的5.41g(0.0255mol)D，L-芐基半胱氨酸在NaOH溶液中與過量乙酸酐反應(yīng)，得到的乙酰化產(chǎn)物溶解于50ml NaOH溶液中，調(diào)節(jié)pH值至8，加入0.5g氨基?；福鸱滞瓿珊?，經(jīng)分離得到2.16g15N標(biāo)記的L-芐基半胱氨酸，熔點211～214℃，[α]20D＝+19.4°(c＝1mol/L NaOH)。單程收率80％。未反應(yīng)的D-型乙?；S基半胱氨酸可經(jīng)消旋后繼續(xù)用于拆分。
(6)解保護2.16g(0.010mol)15N標(biāo)記的L-芐基半胱氨酸于低溫下(-70～-33.5℃)，溶解于50ml液氨中，緩慢加入小塊金屬鈉至體系，維持藍色3～5min不褪；反應(yīng)完成后蒸發(fā)除去液氨，殘余物緩慢加水溶解，調(diào)pH值至中性、空氣流氧化，過濾、干燥后，得到0.95g(0.0039mol)15N標(biāo)記的L-胱氨酸，收率78％。
實施例2一種同位素15N標(biāo)記L-半胱氨酸的制備方法，其中步驟(1)～(6)與實施例1相同，該方法還包括以下工藝步驟(7)還原反應(yīng)將0.95g(0.0039mol)15N標(biāo)記L-胱氨酸(0.01mol)溶解于20ml濃度為2mol/L的HCl溶液中，加入0.5g(0.042mol)金屬錫粉，55℃下攪拌反應(yīng)5小時，室溫放置過夜，通入H2S氣體至終點后，過濾，濾液減壓濃縮后經(jīng)多次結(jié)晶，真空干燥后得到0.87g L-半胱氨酸鹽酸鹽(0.0035mol)，收率90％，熔點173～175℃。
權(quán)利要求
1.同位素15N標(biāo)記L-半胱氨酸的制備方法，其特征在于，該方法包括以下工藝步驟(1)鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽的制備將含有15N標(biāo)記無機氮源與堿性溶液作用，經(jīng)鄰苯二甲酸溶液充分吸收氨氣后，蒸除溶劑，加熱后得到鄰苯二甲酰亞胺固體，將該固體與KOH的甲醇溶液作用得到鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽；無機氮源、鄰苯二甲酸、KOH的用量比為1∶1～5∶1～3；(2)鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯鈉鹽的制備將鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽與新鮮制備的溴代丙二酸二乙酯作用，經(jīng)加熱、冷卻、研磨、洗滌后得到鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯；再將該前體加熱溶解于適量無水甲苯，加入稍過量的金屬鈉，攪拌反應(yīng)1～7小時，冷卻過濾后得到黃色產(chǎn)物，為15N標(biāo)記的鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯鈉鹽，簡稱鈉鹽，下同；(3)縮合反應(yīng)將鈉鹽和芐基氯甲硫醚、無水甲苯共熱并回流5～25小時后，過濾沉淀，蒸除濾液中的甲苯，并經(jīng)無水乙醇重結(jié)晶后得到15N標(biāo)記的N-芐基氯甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯，簡稱縮合產(chǎn)物，下同；(4)水解反應(yīng)將縮合產(chǎn)物懸浮于乙醇與水的1∶1混合物中，于攪拌下加入5mol/L NaOH，并保持溫度在55～60℃反應(yīng)1～12小時，再加入足量HCl徹底水解；母液調(diào)pH值至中性后，析出的沉淀經(jīng)乙醇洗滌、過濾、重結(jié)晶后，得到晶體狀15N標(biāo)記的D，L-芐基半胱氨酸；(5)拆分過程采用氨基?；阜ú鸱值姆椒?，將上述D，L-芐基半胱氨酸經(jīng)乙?；?、氨基?；覆鸱郑蛛x后得到15N標(biāo)記的L-芐基半胱氨酸；未反應(yīng)的D-型乙酰化芐基半胱氨酸可經(jīng)消旋后繼續(xù)用于拆分；(6)解保護反應(yīng)L-芐基半胱氨酸于-70～-33.5℃低溫下，溶解于適量液氨中，緩慢加入小塊金屬鈉至體系維持藍色3～5min不褪；反應(yīng)完成后蒸發(fā)除去液氨，殘余物緩慢加水溶解，調(diào)pH值至中性、空氣流氧化，過濾、干燥后，得到15N標(biāo)記的L-胱氨酸，經(jīng)還原后可得到15N標(biāo)記的L-半胱氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同位素15N標(biāo)記L-半胱氨酸的制備方法，其特征在于，所述的步驟(1)中15N標(biāo)記無機氮源選自(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl或NH4HCO3中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同位素15N標(biāo)記L-半胱氨酸的制備方法，其特征在于，所述的步驟(3)中芐基氯甲硫醚的制備方法包括以下工藝步驟將芐硫醇與稍過量的三聚甲醛混合后，冰浴下冷卻，并用干燥HCl氣飽和，加入足責(zé)備量無水CaCl2，再于室溫下保持10～30小時后過濾，濾液經(jīng)洗滌、干燥，減壓下蒸餾，收集102℃、2mmHg的餾分，得到芐基氯甲硫醚。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同位素15N標(biāo)記L-半胱氨酸的制備方法，其特征在于，所述的步驟(4)、(5)、(6)中可得到15N標(biāo)記半胱氨酸的相關(guān)衍生產(chǎn)品，該衍生產(chǎn)品包括L-、D-以及D，L-型的芐基半胱氨酸、乙酰化芐基半胱氨酸、半胱氨酸、胱氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及同位素
文檔編號C07C323/58GK101041630SQ200610024939
公開日2007年9月26日 申請日期2006年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月22日
發(fā)明者湯財?shù)? 羅勇, 王博, 強歌, 李美華 申請人:上?；ぱ芯吭?br>