專利名稱：：魁蚶中的多肽蛋白類活性物質(zhì)及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明公開(kāi)了一禾中魁酣(Jrco/"/ZateReeve，Scop/zarca6rawg/ztom7)中多肽蛋白類活性物質(zhì)的用途及其提取方法。
背景技術(shù)：
：《中國(guó)海洋藥物》雜志2003年第2期37頁(yè)，介紹了牡蠣蛋白的分離方法。新鮮牡蠣軟體，4"C下以2倍量生理鹽水勻槳，3000r/min離心15min，取上清液，分別加入(NH4)2S04，使溶液的(NH4)2S04的飽和度分別達(dá)到50%、75%和100。/。，4。C下靜置12h。再以3000r/min離心15min，取沉淀，少量水溶解后，倒入透析袋脫鹽。每2h換水一次。直至15%CaCl2檢測(cè)溶液中無(wú)S042—存在，最后得到蛋白。牡蠣提取物的營(yíng)養(yǎng)分析顯示，牡蠣中含有豐富的糖源、蛋白質(zhì)及必需氨基酸，特別是?；撬岷扛?，還含有多種必須的微量元素和多種維生素?！侗静菥V目》等均記載了牡蠣的治療功效，牡蠣入藥在我國(guó)已有千年的歷史。除此之外，發(fā)明人在檢索過(guò)程中并未發(fā)現(xiàn)關(guān)于魁蚶多肽蛋白類活性物質(zhì)的藥用報(bào)道及其提取方法的報(bào)道。上述文獻(xiàn)報(bào)道的方法中使用(NH4)2S04沉淀步驟來(lái)提取蛋白，得到的只是粗總蛋白，其中含有多糖等多種大分子雜質(zhì)，是多種成分的混合物。所得提取物不能直接用于純度要求高的用途中。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種來(lái)源于魁蚶中的多肽蛋白類活性物質(zhì)及其制備方法和醫(yī)藥用途，通過(guò)本發(fā)明的制備方法提取得到的魁蚶的多肽蛋白類活性物質(zhì)純度大大提高，可以直接用于純度要求高的用途中。本發(fā)明是通過(guò)如下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。將魁蚶內(nèi)容物清洗后，加入蒸餾水，勻漿，離心去渣，取上清；對(duì)上清進(jìn)行離子交換柱層析，收集各洗脫峰，分別脫鹽，再分別經(jīng)凝膠柱層析分離，合并分子量為3—150kDa的各峰，經(jīng)濃縮干燥后得到純度較高的魁蚶多肽蛋白類活性物質(zhì)。將該多肽蛋白類活性物質(zhì)，配以適當(dāng)?shù)妮o料，制成一定劑型的藥物，可用于抑制腫瘤。用本發(fā)明的多肽蛋白類活性物質(zhì)制成抗腫瘤藥物，藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其抑瘤率達(dá)到79.60%，同時(shí)由于是天然生物提取物質(zhì)，其具有低毒的特點(diǎn)。本發(fā)明中魁蚶多肽蛋白類活性物質(zhì)的提取方法直接將魁蚶內(nèi)容物進(jìn)行離子交換柱層析，脫鹽后，再進(jìn)行凝膠柱層析分離。操作條件溫和，質(zhì)量可控，活性物質(zhì)的提取率高，可達(dá)到將多肽蛋白提取物在分離提取的同時(shí)得到純化的效果，且能最大限度地保持提取物的活性，更好地適用于醫(yī)藥用途。最佳實(shí)施方式實(shí)施例l下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。取魁蚶，去殼，取其內(nèi)容物，用4'C常水清洗3次后，再用4"C的蒸餾水清洗兩遍；按內(nèi)容物與水為1:3的重量比例加入蒸餾水，以5000r/min勻漿3min，在離心機(jī)上去渣，離心10min后取上清；對(duì)上清液進(jìn)行離子交換^i/i析，洗脫條件為CM陽(yáng)離子交換介質(zhì)，采用磷酸緩沖液以0.4-1.5M鹽濃度梯度洗脫，紫外檢測(cè)器280nm檢測(cè)。通過(guò)該步驟，已經(jīng)將提取物按照對(duì)離子交換介質(zhì)吸附能力的不同分離純化。分別收集四個(gè)洗脫峰后，透析脫鹽。脫鹽后再經(jīng)凝膠柱層析分離，洗脫條件為SephadexG-75凝膠柱層析介質(zhì)，利用磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，紫外檢測(cè)器280rnn檢測(cè)。進(jìn)一歩將相同吸附力的提取物按照不同分子量進(jìn)行分離，將得到的分子量在3-150kDa的四個(gè)洗脫峰合并，這四個(gè)洗脫峰的分子量約為5-7kDa，12陽(yáng)13kDa，18-21kDa，96-150kDa，得到魁蚶的多肽蛋白類活性物質(zhì)，它的組成及純度有了很大的提高。實(shí)施例2取上述魁蚶的多肽蛋白類活性物質(zhì)進(jìn)行荷瘤小鼠的體內(nèi)腫瘤實(shí)驗(yàn)，取雄性昆明種小鼠，體重1921g,隨機(jī)分組，每組10只.每只小鼠左腋下接種0.2mlS賜腹水癌的瘤液。次日開(kāi)始以生理鹽水為陰性對(duì)照，5-氟尿嘧啶為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行腹腔注射，注射8天后稱重，解剖皮下瘤塊，稱重。實(shí)體瘤的療效以瘤重抑制百分率表示，計(jì)算公式如下:瘤重抑制率。/。=(l-T/C)X100%T:治療組平均瘤重C:陰性對(duì)照組平均瘤重藥物對(duì)小鼠S,腫瘤的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提取的活性蛋白的抑瘤率高達(dá)79.60%，且其毒性低于陽(yáng)性對(duì)照5-氟尿嘧啶組(樣品組小鼠實(shí)驗(yàn)前后體重下降明顯低于5-氟尿嘧啶組，說(shuō)明其毒性較低)；同時(shí)，該制劑對(duì)體外腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)也有較高的抑制率。因此，本發(fā)明的提取物具有高效低毒，制作過(guò)程無(wú)污染等特點(diǎn)，有望為臨床提供一種安全、有效、質(zhì)量可控的新型抗腫瘤藥物。權(quán)利要求1、一種魁蚶(ArcainflateReeve；Scapharcabroughtonii)中的多肽蛋白類活性物質(zhì)，它是通過(guò)下述方法制備的將魁蚶內(nèi)容物清洗后，加入蒸餾水，勻漿，離心去渣，取上清；對(duì)上清進(jìn)行陽(yáng)離子交換柱層析；分別收集各峰后，脫鹽；經(jīng)凝膠柱層析分離，合并分子量為3-150kDa的各峰，經(jīng)濃縮干燥后得到多肽蛋白類活性物質(zhì)。2、權(quán)利要求1的魁蚶中的多肽蛋白類活性物質(zhì)的制備方法，該方法包括將魁蚶內(nèi)容物清洗后，加入蒸餾水，勻漿，離心去渣，取上清；對(duì)上清液進(jìn)行陽(yáng)離子交換柱層析；分別收集各峰后，脫鹽；經(jīng)凝膠柱層析分離，合并分子量為3—150kDa的各峰，經(jīng)濃縮干燥后得到多肽蛋白類活性物質(zhì)。3、按照權(quán)利要求2所述的魁蚶中多肽蛋白類活性物質(zhì)的提取方法，其特征是魁蚶的內(nèi)容物，先用4。C常水清洗3次后，再用fC的蒸餾水清洗兩遍。4、按照權(quán)利要求2所述的魁蚶中多肽蛋白類活性物質(zhì)的提取方法，其特征是陽(yáng)離子交換柱層析采用CM陽(yáng)離子交換介質(zhì)，磷酸緩沖液以0.4-1.5M鹽濃度梯度洗脫；凝膠柱層析采用SephadexG-75凝膠柱層析介質(zhì)，利用磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫。5、含有權(quán)利要求1的魁蚶中的多肽蛋白類活性物質(zhì)的藥物組合6、權(quán)利要求1的魁蚶中的多肽蛋白類活性物質(zhì)在制備用于抑制腫瘤的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種魁蚶(ArcainflateReeve；Scapharcabroughtonii)中多肽蛋白類活性物質(zhì)及其制備方法和用途。所述制備方法包括直接將魁蚶勻漿后得到的上清液進(jìn)行離子交換柱層析，脫鹽后，再進(jìn)行凝膠柱層析分離，合并分子量為3-150kDa的各峰，濃縮干燥后，得到多肽蛋白類活性物質(zhì)。上述活性物質(zhì)對(duì)腫瘤具有79.60％的抑制率，可制成抗腫瘤藥物，且純度高，低毒低。文檔編號(hào)C07K14/435GK101104000SQ200610036488公開(kāi)日2008年1月16日申請(qǐng)日期2006年7月14日優(yōu)先權(quán)日2006年7月14日發(fā)明者嚴(yán)春艷,于榮敏,王亦軍申請(qǐng)人:于榮敏;嚴(yán)春艷;王亦軍