一種利用難溶或不溶蛋白、多肽抗原制備納米微粒疫苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及疫苗制備領(lǐng)域，具體涉及一種利用難溶或不溶蛋白、多肽抗原制備納 米微粒疫苗的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為一種對(duì)動(dòng)物群體疫病的有效控制手段，動(dòng)物疫苗技術(shù)優(yōu)化和新型動(dòng)物疫苗技 術(shù)開發(fā)得到世界各國(guó)相關(guān)研宄機(jī)構(gòu)的重視。據(jù)統(tǒng)計(jì)，到2013年底，我國(guó)通過獸藥GMP認(rèn)證 的動(dòng)物疫苗生產(chǎn)企業(yè)有88家，是2000年前疫苗生產(chǎn)企業(yè)數(shù)量的4倍。動(dòng)物疫苗市場(chǎng)的巨 大需求是動(dòng)物疫苗行業(yè)發(fā)展源動(dòng)力。長(zhǎng)期以來，我國(guó)用于動(dòng)物傳染病預(yù)防的疫苗大多是傳 統(tǒng)疫苗，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展、不同病原致病機(jī)理的深入研宄及世界各國(guó)對(duì)動(dòng)物性食 品安全性的要求不斷提高，傳統(tǒng)疫苗制備技術(shù)已經(jīng)不能滿足疫苗企業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展需求。
[0003] 對(duì)于某些原核細(xì)胞或真核細(xì)胞過量表達(dá)的重組蛋白，或者人工合成的用于疫苗制 備的多肽片段，經(jīng)過純化或多次沉淀和干燥，蛋白或多肽抗原常常難溶于性質(zhì)溫和的緩沖 液中，蛋白、多肽抗原在未達(dá)到疫苗配制所需濃度時(shí)便大量析出，這一情況使疫苗制備工藝 一方面使復(fù)雜化，限制了疫苗劑型，也增加了疫苗生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用難溶或不溶蛋白、多肽抗原制備納米微粒疫苗的 方法。
[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種利用難溶或不溶蛋白、多肽抗原制備納米微粒疫苗的方法，其依次包括如下 步驟：
[0007] a.取溶解于生理鹽水或PBS緩沖液的抗原液，在相對(duì)離心力為7000-10000xg的條 件下離心處理15min，收集沉淀物；
[0008] b.將經(jīng)過a步驟得到的沉淀物用100?150倍體積（W : V)的生理鹽水或PBS 重懸（100-150倍體積（W:V)是指沉淀物的質(zhì)量（g)與生理鹽水或PBS的體積（ml)比為 100-150)，接著攪拌使沉淀物均勻分散；然后在相對(duì)離心力為7000-10000 Xg的條件下離心 處理15min，收集沉淀物；將收集到的沉淀物用生理鹽水或PBS重復(fù)洗滌3次；
[0009] c.將經(jīng)過b步驟得到的沉淀物在相對(duì)離心力為7000-10000xg的條件下離心處理 15min，收集沉淀物；
[0010] d.接著將C步驟得到的沉淀物重懸于100?150倍體積（W : V)的生理鹽水或 PBS中；接著，進(jìn)行冰浴超聲處理使沉淀物均勻分散，得到沉淀物懸液；
[0011] e.將d步驟獲得的沉淀物懸液加入無(wú)菌的低溫超高壓均質(zhì)機(jī)/低溫納米級(jí)微生 物破碎機(jī)的上樣容器中，在2?8°C、600?800bar的壓力下進(jìn)行均質(zhì)，收集第一穿出液；接 著，將第一穿出液在2?8°C、1000?1200bar的壓力下進(jìn)行制粒，重復(fù)兩次，得到，收集第 二穿出液；
[0012] f.將e步驟收集到的第二穿出液（即疫苗抗原）用生理鹽水或PBS調(diào)整濃度到 ^ 300 μ g/mL ;
[0013] g.向經(jīng)過f步驟處理得到的第二穿出液（即疫苗抗原）中加入佐劑，制得疫苗。f 步驟處理得到的第二穿出液（即疫苗抗原）與佐劑進(jìn)行乳化，制得疫苗。在實(shí)踐中，可以根 據(jù)疫苗制備劑型和佐劑使用說明對(duì)乳化方法進(jìn)行調(diào)整。
[0014] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為在g步驟中：在加入佐劑進(jìn)行疫苗配制之前，根據(jù)《中國(guó) 獸藥典》附錄方法對(duì)收集到的第二穿出液（即疫苗抗原）進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、內(nèi)毒素含量檢驗(yàn)和 純度檢驗(yàn)，然后將檢驗(yàn)合格的第二穿出液中加入佐劑進(jìn)行疫苗配制。
[0015] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為還包括步驟h :將g步驟制得的疫苗按照《中國(guó)獸藥典》附 錄方法進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。
[0016] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述e步驟中的制粒工藝制得的微粒的平均粒徑為 20_200nm 〇
[0017] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述a步驟中的抗原液通過如下方法獲得：將培養(yǎng)基中 的工程菌進(jìn)行酶解或機(jī)械裂解，離心，分別收集上清液和沉淀；將收集到的沉淀物重懸于 100?150倍體積（W : V)的的TNE-U緩沖液中，在超聲破碎儀中在200w的功率下冰浴超 聲10-20min，使沉淀物均勻分散；接著加入體積為培養(yǎng)基體積1/100的TNE-U緩沖液，然 后在溫度為4°C的層析柜中振蕩30min ;接著離心收集沉淀，所述離心處理的相對(duì)離心力為 7000xg、時(shí)間為15min ;接著將收集到的沉淀重懸于體積為培養(yǎng)基體積1/100的TNE-T緩沖 液中，超聲破碎儀中在200w的功率下冰浴超聲10-20min，使沉淀物均勻分散；接著加入體 積為培養(yǎng)基體積1/100的TNE-T緩沖液，然后在溫度為4°C的層析柜中振蕩30min，得到抗 原液；
[0018] 所述TNE-U緩沖液由如下方法制成：將Tris-Base、NaCl、Urea和蒸餾水混合，然 后經(jīng)過0. 45 μπτ濾器過濾除菌處理，即得；其中Tris-Base的摩爾濃度為0. 5mol/L、NaCl的 摩爾濃度為〇. 25mol/L、Urea的摩爾濃度為2-4mol/L，所述TNE-U緩沖液的pH值為7. 4 ;
[0019] 所述TNE-T緩沖液由如下方法制成：取脫氧膽酸和Triton XlOO的一種，然后 與Tris-Base、NaCl和蒸餾水混合，然后經(jīng)過0.45μπι濾器過濾除菌處理，即得；其中 Tris-Base的摩爾濃度為0· 5mol/L、NaCl的摩爾濃度為0· 25mol/L、TritonXlOO的體積百 分?jǐn)?shù)為〇. 1-1 %、脫氧膽酸的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5-10%，所述TNE-T緩沖液的pH值為7. 4。
[0020] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述蛋白抗原為在生理溶液中溶解度較低的純化蛋白或 重組表達(dá)后為包涵體形式的蛋白；所述多肽抗原為人工合成、提純后在生理溶液中難溶多 肽或重組表達(dá)后不溶解的多肽物。
[0021] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為：
[0022] 所述TNE-U緩沖液中Tris-Base的摩爾濃度為0. 5mol/L、NaCl的摩爾濃度為 0· 25mol/L、Urea 的摩爾濃度為 2mol/L，pH 值為 7. 4 ;
[0023] 所述TNE-T緩沖液中Tris-Base的摩爾濃度為0. 5mol/L、NaCl的摩爾濃度為 0· 25mol/L、Triton XlOO的體積百分?jǐn)?shù)為0· 1-1 %、脫氧膽酸的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5-10%，pH值 為 7. 4。
[0024] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述a步驟中的相對(duì)離心力為lOOOOxg，離心時(shí)間為 15min〇
[0025] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述b步驟具體為：將經(jīng)過a步驟得到的沉淀物重懸于 100?150倍（W : V)沉淀物體積的生理鹽水或PBS中，然后在7000r/min的轉(zhuǎn)速下攪拌 15min使沉淀物均勾分散；在相對(duì)離心力為IOOOOxg的條件下離心處理15min，收集沉淀物； 將收集到的沉淀物用生理鹽水或PBS重復(fù)洗滌3次。
[0026] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述d步驟具體為：接著將c步驟得到的沉淀物重懸于 100?150倍（W : V)沉淀體積的生理鹽水或PBS中；接著，進(jìn)行冰浴超聲處理使沉淀物均 勻分散，得到沉淀物懸液；其中，所述冰浴超聲處理的功率為200w、時(shí)間為10-20min。
[0027] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述e步驟具體為：將d步驟獲得的沉淀物懸液加入無(wú)菌 的低溫超高壓均質(zhì)機(jī)/低溫納米級(jí)微生物破碎機(jī)的上樣容器中，在2?8°C、800bar的壓力 下進(jìn)行均質(zhì)，收集第一穿出液；接著，將第一穿出液在2?8°C、IlOObar的壓力下進(jìn)行制粒， 重復(fù)兩次，得到，收集第二穿出液（即為疫苗抗原）。
[0028] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述超聲破碎儀中在200w的功率下冰浴超聲lOmin。
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：經(jīng)過本發(fā)明的純化處理、均質(zhì)和制粒處理等 工藝，獲得一種純凈度高、均質(zhì)、穩(wěn)定的蛋白微?？乖桓匾氖?，經(jīng)此工藝制備的納米抗 原可選擇制備油包水型（W/0)、水包油包水型（W/0/W)和水包油型（Ο/W)疫苗，擴(kuò)大了疫苗 佐劑可選擇范圍。應(yīng)用該工藝制備的納米級(jí)微?？乖蟠蠛?jiǎn)化了此類疫苗生產(chǎn)工藝，縮短 了疫苗生產(chǎn)時(shí)間，顯著減低疫苗生產(chǎn)成本。微?；目乖欣谕淌杉?xì)胞的吞噬及抗原 呈遞細(xì)胞的活化和將抗原呈遞到T細(xì)胞等，蛋白或多肽抗原性的有效釋放，同時(shí)大大降低 了疫苗的抗原使用量。
[0030] 下面結(jié)合附圖及【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0031] 下面結(jié)合附圖進(jìn)一步闡明本發(fā)明的實(shí)施例。
[0032] 圖1為實(shí)施例2中的SDS-PAGE方法測(cè)試蛋白純度的電泳圖；
[0033] 圖2為實(shí)施例2中顯微鏡下的抗原顆粒圖；
[0034] 圖3為實(shí)施例2中顯微鏡下的抗原粒徑分布圖；
[0035] 其中，圖1中，M、蛋白Marker的泳道；1、為菌體裂解物的泳道；2、TNE-U洗滌后的 沉淀的泳道；3、TNE-T洗滌后的沉淀（最終產(chǎn)物）的泳道；
[0036] 圖2中，黑色三角指示的是單個(gè)的顆粒，白色三角指示的是聚集的顆粒。
【具體實(shí)施方式】 [0037] 實(shí)施例1
[0038] 一種利用難溶或不溶蛋白、多肽抗原制備納米微粒疫苗的方法，依次包括如下步 驟：
[0039] a.取溶解于生理鹽水或PBS緩沖液的抗原液，在相對(duì)離心力為7000xg的條件下離 心處理15min，收集沉淀物；
[0040] b.將經(jīng)過a步驟得到的沉淀物用100?150倍體積（W : V)的生理鹽水或PBS重 懸，接著攪拌使沉淀物均勻分散；然后在相對(duì)離心力為7000Xg的條件下離心處理15min，收 集沉淀物；將收集到的沉淀物用生理鹽水或PBS重復(fù)洗滌3次；
[0041] c.將經(jīng)過b步驟得到的沉淀物在相對(duì)離心力為7000xg的條件下離心處理15min， 收集沉淀物；
[0042] d.接著將c步驟得到的沉淀物重懸于100倍體積（W : V)的生理鹽水或PBS中； 接著，進(jìn)行冰浴超聲處理使沉淀物均勻分散，得到沉淀物懸液；
[0043] e.將d步驟獲得的沉淀物懸液加入無(wú)菌的低溫超高壓均質(zhì)機(jī)/低溫納米級(jí)微生物 破碎機(jī)的上樣容器中，在5°C、800bar的壓力下進(jìn)行均質(zhì)，收集第一穿出液；接著，將第一穿 出液在5°C、1100bar的壓力下進(jìn)行制粒，重復(fù)兩次，得到，收集第二穿出液；
[0044] f.將e步驟收集到的第二穿出液（即疫苗抗原）用生理鹽水或PBS調(diào)整濃度到 ^ 300 μ g/mL ;
[0045] g.向經(jīng)過f步驟處理得到的第二穿出液（即疫苗抗原）中加入佐劑，制得疫苗。f 步驟處理得到的第二穿出液（即疫苗抗原）與佐劑進(jìn)行乳化，制得疫苗；
[0046] 所述a步驟中的抗原液通過如下方法驟獲得：將培養(yǎng)基中的PCV2Cap_pET21 / Rosetta種子菌進(jìn)行機(jī)械破碎，離心，分別收集上清液和沉淀。