專利名稱：：新型亞胺杯芳烴衍生物和氨基杯芳烴衍生物，其制備方法，由該方法制備的自組裝單層...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新型亞胺杯芳烴書f生物，其制備方法，以及由該方法制備的自組裝單層，使用該自組裝單層固定J氐聚DNA的方法，以及由該方法制備的低聚DNA芯片。本發(fā)明更具體涉及一種能夠?qū)⒑羞B續(xù)鳥嘌呤堿基的低聚DNA通過(guò)分子識(shí)別固定至^皮璃基底或金基底上單層中的固體基底表面的亞胺杯芳烴化合物以及通過(guò)使用自組裝單層制備低聚DNA單層(即低聚DNA芯片)的方法。此外，本發(fā)明涉及新型氨基杯芳烴々于生物，其制備方法，以及由該方法制備的自組裝單層，通過(guò)所述自組裝單層中低聚DNA的不可逆的，自動(dòng)分子識(shí)別固定4氐聚DNA的方法，以及由該方法制備的低聚DNA芯片。本發(fā)明更具體涉及一種能夠?qū)⒑羞B續(xù)鳥嘌呤堿基的低聚DNA通過(guò)多堿基的不可逆/自動(dòng)分子識(shí)別固定至固體基底表面的氨基杯芳烴化合物，一種在如玻璃或金基底等固體基底上將其制備為單層生物芯片基底的#支術(shù)以及一種將<氐聚DNA以高密度作為單層固定在由所述制備技術(shù)制備的生物芯片基底上從而制備低聚DNA芯片的方法。
背景技術(shù)：
：在國(guó)家人類基因組研究所和賽雷拉基因公司在人類基因組計(jì)劃下竟?fàn)幮蕴剿骱脱芯咳祟惢蚪M后，人類基因信息圖于2000年完成，從而促進(jìn)了使用DNA功能研究，變異DNA研究，以及其中的信息進(jìn)行診斷性低聚DNA芯片的開發(fā)。該用于探索單核苷多態(tài)性(SNP)的低聚DNA可特別被預(yù)期用于診斷有缺陷DNA引起的遺傳疾病，或處于早期階-敬的癌癥等。此外，纟笨索和^f究用于生產(chǎn)低聚DNA芯片(其中一系列的低聚DNA被固定在基底上)的技術(shù)已成為世界范圍的趨勢(shì)，該低聚DNA芯片提供了基于病毒類型的準(zhǔn)確病毒感染途徑的信息，對(duì)于有害或無(wú)害等的分析以及基于一組致癌病毒的分型7十癌癥等的發(fā)生的預(yù)測(cè)。事實(shí)上，可用于測(cè)定人乳頭瘤病毒(HPV)類型的低聚DNA芯片已經(jīng)在韓國(guó)被韓國(guó)食品藥品管理局(KFDA)世界上首次審定為用于預(yù)測(cè)宮頸癌發(fā)生可能性的診斷和予貞防醫(yī)學(xué)生物芯片。此外，該i貪斷宮頸癌的^氐聚DNA芯片已被KFDA審定，并已才更入^吏用。低聚DNA芯片包含了固定在基底上的15-50mer短DNAs(低聚:DNAs)。因此，盡管用于分析:DNA變體的c-:DNA芯片通常采用簡(jiǎn)單的物理p及附法，該J氐聚DNA芯片仍然采用幾十年前開發(fā)的方法，例如基于通過(guò)醛和胺之間化學(xué)鍵的亞胺鍵合法的固定方法；或基于在醛和胺功能基團(tuán)之間的化學(xué)鍵合后進(jìn)行還原反應(yīng)提高鍵合的胺鍵合法的固定方法。這是由于目前還未能成功開發(fā)出在再現(xiàn)性和1"更利性上優(yōu)于醛-芯片的生物芯片基底。然而，在醛-芯片基底中，通過(guò)合成技術(shù)連接至低聚DNA末端的胺功能基團(tuán)被通過(guò)亞胺鍵連接化學(xué)鍵合至該醛-芯片；因此，在固定DNA數(shù)量和可與c-DNA在實(shí)際雜交反應(yīng)中組合的固定低聚DNA的數(shù)量的理論最大密度之間存在著巨大的差別。此外，由于受固定條件的重大影響，固定〗氐聚DNA的密度經(jīng)常變化，因此難以成功開發(fā)具有再現(xiàn)性的芯片。—種采用鏈酶親和素-生物素的鍵合方法的技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用，且所迷的技術(shù)是一種制備低聚DNA的方法，其通過(guò)將鏈酶親和素-生物素通過(guò)物理吸附，化合鍵合等方法固定在固體基底上，然后Y吏該4連酶親和素-生物素分子識(shí)別連^妻了該生物素的^f氐聚DNA的生物素功能基團(tuán)(Science,1993;Vol.262，pp1706-1708)。然而，該采用化學(xué)鍵合法或鏈酶親和素-生物素鍵合法的技術(shù)在性能上仍落后于醛-芯片基底。同時(shí)，在蛋白芯片中，抗體的活性位點(diǎn)存在于固定在表面上的蛋白的一個(gè)位置上，因此如果僅有能結(jié)合抗原的所述位置被定位時(shí)則應(yīng)當(dāng)能獲得結(jié)果。然而，在低聚DNA芯片中，至少多數(shù)低聚DNAs中的部分石威基必須與在雜交反應(yīng)中4矣近的c-DNAs相4建合，且該鍵合石咸基的數(shù)量應(yīng)當(dāng)通過(guò)使該cDNAs盡量接近該低聚DNAs固定的基底得到最大化。為此，2003年的歐洲協(xié)會(huì)建議在固定低聚DNAs之間^呆留一些空間以允"i午c-DNAs自由進(jìn)入，現(xiàn)在獲得該種空間的技術(shù)已成為本領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究對(duì)象。以分子水平固定在表面上的低聚DNAs易于自發(fā)組裝在一起，因此要將該技術(shù)應(yīng)用于化學(xué)鍵合低聚DNA芯片相對(duì)比較困難。相應(yīng)的，可將20-25-mer便足夠的4氐聚DNA的〗氐聚DNA延長(zhǎng)至50-mer,/人而侵^妄近的c-DNA無(wú)需下落至底部，且提高了雜交反應(yīng)中鍵合的石威基數(shù)量以重現(xiàn)診斷的結(jié)果。然而，要^f吏該結(jié)果清晰可讀至少需要幾個(gè)小時(shí)到超過(guò)一天，因此該技術(shù)并不比關(guān)于禽流感等分析的傳統(tǒng)診斷技術(shù)更加出色。
發(fā)明內(nèi)容才支術(shù)問(wèn)題在如化學(xué)鍵合法和鏈酶親和素-生物素法等固定低聚DNAs的傳統(tǒng)方法中發(fā)現(xiàn)了如下問(wèn)題1.固定密度的均一性化學(xué)4建合法是最為廣泛使用的方法，且已知在低聚DNAs被固定時(shí)，在醛功能基團(tuán)(-CHO)和胺功能基團(tuán)(-NH)之間發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，從而化學(xué)固定了低聚DNAs;在該反應(yīng)中脫掉了一個(gè)H20以使低聚DNA以亞胺鍵(-C二N-)的形式得到固定。然而，由于該反應(yīng)發(fā)生于水;容'液中，該固定密度并不均一，即，不可復(fù)制。此外，該低聚DNA的密度很難維持均一性，因?yàn)樵谒芤褐腥菀装l(fā)生亞胺鍵恢復(fù)為原始的功能基團(tuán)的逆反應(yīng)。另外，為減少該種逆反應(yīng)，可采用如NaBH4等還原劑對(duì)亞胺4建進(jìn)行還原反應(yīng)，但該種還原反應(yīng)會(huì)影響低聚DNAs的鍵合，從而難以始終保持固定低聚DNAs的長(zhǎng)度。由于每次生產(chǎn)結(jié)果的不一致性，新型低聚DNA芯片的開發(fā)將是一個(gè)長(zhǎng)期過(guò)程，這被看作是低聚DNA芯片生產(chǎn)中的巨大障礙。與此同時(shí)，該固定低聚DNA可通過(guò)4建合與所述低聚DNA密度成比例連接了熒光物質(zhì)(例如，Cy-3)的c-:DNAs，然后檢測(cè)c-DNAs的存在及其濃度以進(jìn)行i貪斷。因此，如果無(wú)法持續(xù)維持4氐聚DNA的密度，則該^氐聚DNA無(wú)法作為商業(yè)產(chǎn)品進(jìn)行生產(chǎn)，鑒于同樣原因，許多投入了資金的公司仍未能獲得他們預(yù)期的結(jié)果。[14]2.在j氐聚DNAs之間獲4尋空間供c-DNAs進(jìn)入的必要性(不可能發(fā)生超高速雜交反應(yīng))病原體的模板基因通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的c-DNAs必須最終被連接至4氐聚DNA芯片。然而，如圖7所示，如果固定DNAs之間的距離過(guò)短，貝'Jc-DNAs無(wú)法輕易到達(dá)低聚DNAs的下部。目前許多低聚DNA芯片需要數(shù)小時(shí)到超過(guò)一天的雜交反應(yīng)，這主要是由于缺乏允許c-DNAs輕易接近固定低聚DNAs底部能與之鍵合的堿基的空間。因此一種在低聚DNAs間獲得適當(dāng)水平的空間的4支術(shù)成為一種需要，^旦人們并未對(duì)此得到有效的解決方案。為解決這一問(wèn)題，有必要開發(fā)通過(guò)連續(xù)堿基的表面鍵合以獲得適當(dāng)水平的空間使c-DNAs能輕易接近DNA芯片的技術(shù)。3.功能基團(tuán)的連接該通過(guò)化學(xué)鍵或鏈酶親和素-生物素4建合固定低聚DNA的技術(shù)僅在將生物素或胺功能基團(tuán)連接至低聚DNA時(shí)才可能存在。然而，在低聚DNA合成后再連接該種功能基團(tuán)的成本是少量功能基團(tuán)已被連接的低聚DNA傳統(tǒng)合成方法的三到十倍。此外，即使僅固定了幾十個(gè)低聚DNAs來(lái)生產(chǎn)供銷售的低聚DNA芯片，仍需要4全測(cè)成百上千的樣本，且其所需的成本(不計(jì)生產(chǎn)終產(chǎn)品的成本)^更需要數(shù)百或數(shù)百萬(wàn)美元，這成為開發(fā)〗氐聚DNA芯片的另一障礙。為減少該種問(wèn)題，有必要開發(fā)一種通過(guò)不連接功能基團(tuán)的低聚DNAs生產(chǎn)低聚DNA芯片的技術(shù)。4.與三種石咸基A,C和G連4妻的胺功能基團(tuán)與醛-芯片基底的功能基團(tuán)之間的化學(xué)鍵合該醛-芯片基底可生產(chǎn)低聚DNA芯片，其中該低聚DNAs通過(guò)表面的醛功能基團(tuán)和連接了胺功能基團(tuán)的低聚DNAs的反應(yīng)進(jìn)行固定。然而，該胺功能基團(tuán)已連接至所述的與該低聚DNA連接的眾多堿基中占四分之三的三種堿基，且當(dāng)與低聚DNA末端連接的胺功能基團(tuán)與醛反應(yīng)時(shí)在中部的低聚DNAs比已固定堿基時(shí)要快得多，因此可用于與接近的，熒光連接的c-DNA進(jìn)行多氫鍵合的堿基數(shù)量不足。醛還可以通過(guò)氫鍵與另外接近的c-DNA的堿基鍵合，從而將其去除，在低聚DNAs被固定后應(yīng)進(jìn)行化學(xué)處理，已知已生成DNA芯片的復(fù)制變得更為困難。5.—種診斷SNP的技術(shù)低聚DNA芯片在各種技術(shù)中最有利于分析DNAs以對(duì)存在于多種病毒(如禽流感，豬瘟疫，癌癥擴(kuò)散病毒等)中的各類DNA進(jìn)行分型。然而，該種病毒大部分為/人原始病毒類型變異生成的新形式，同樣的，在多凄t情況下在病毒許多病毒組僅在一或兩個(gè)堿基序列上表現(xiàn)出區(qū)別。相應(yīng)的，開發(fā)低聚DNA芯片中最重要的部分在于制備一種能夠在開關(guān)水平鑒別單個(gè)石威基的變化(即，能診斷SNP)的低聚DNA芯片。許多研究者同意采用當(dāng)前最常用的醛-芯片基底生產(chǎn)的低聚DNA芯片在固定低聚DNAs之間沒(méi)有鑒別該單堿基變體所必需的足夠空間，并且因此無(wú)法生產(chǎn)用于鑒別單堿基變體的診斷性低聚DNA芯片。6.生產(chǎn)低價(jià)芯片的技術(shù)如果通過(guò)連接如胺，生物素等功能基團(tuán)固定低聚:DNA，則該低聚DNA的成本可上升超過(guò)十倍，且該芯片必須覆蓋高濃度的DNAs以阻止表面堿基4A合。于是生產(chǎn)該種低聚DNA芯片的成本將變得極高。技術(shù)方案[23]本發(fā)明的目的在于4是供能夠分子識(shí)別具有連續(xù)鳥噤呤基團(tuán)的低聚DNA的亞胺杯衍生物，及其制備方法，從而解決上述傳統(tǒng)低聚DNA固定方法的問(wèn)題，如固定密度的均一性問(wèn)題，在低聚DNAs之間荻得足夠空間的問(wèn)題，功能基團(tuán)的連接問(wèn)題等。本發(fā)明的另一目的在于提供一種低聚DNA單層，其中各類低聚DNAs通過(guò)所述亞胺杯芳烴書f生物與^皮璃基底(一種胺^皮片)或金基底(金薄層或金)的結(jié)合可未經(jīng)任何處理:故密集填充并<呆留適當(dāng)水平的空間；也就是提供一種能夠制作低聚DNA芯片的亞胺杯芳烴^"生物單層。本發(fā)明更為具體的目標(biāo)為提供一種低聚DNAs單層，其中具有至少七個(gè)連續(xù)鳥。票呤的低聚DNAs未經(jīng)任何處理:故密集填充并保留了適當(dāng)水平的空間，也就是提供一種能夠制作低聚DNA芯片的亞胺杯芳烴書于生物單層。在另一方面本發(fā)明的目的在于提供一種低聚DNA芯片，其能夠同時(shí)解決不能進(jìn)行超高速雜交反應(yīng)、不能確保i貪斷SNP的技術(shù)、與三個(gè)堿基A,C和G連接的胺功能基團(tuán)與醛-芯片基底的功能基團(tuán)之間的化學(xué)鍵合，在芯片上難以均一密度固定低聚DNAs等所有傳統(tǒng)低聚DNA芯片的問(wèn)題。也就是說(shuō)，本發(fā)明的目的在于提供能夠不可逆分子識(shí)別連續(xù)鳥噪呤基團(tuán)的氨基杯芳烴衍生物，一種以其自組裝形式制備的低聚DNA芯片的基底的生產(chǎn)方法，以及一種通過(guò)在芯片基底表面的自發(fā)分子識(shí)別不可逆固定低聚DNAs生產(chǎn)的葉氐聚DNA芯片。本發(fā)明的另一目的在于4是供一種^氐聚DNAs單層，其中通過(guò)將上述化合物作為單層與具有胺功能基團(tuán)的玻璃基底(胺玻片)等固體基底，或與金基底(金薄層或金)相連接，各類低聚DNAs可未經(jīng)處理以最大密度固定并保留適當(dāng)水平的空間，也就是說(shuō)，提供一種以氨基杯芳烴衍生物生產(chǎn)的能制作低聚DNA芯片的芯片基底。本發(fā)明的另一目的在于提供一種低聚DNA單層，其中該連續(xù)鳥嘌P令石咸基凈皮成線性固定在該表面上，乂人而^吏該4氐聚DNAs未經(jīng)處理以最大密度固定并保留適當(dāng)水平的空間，也就是說(shuō)4是供一種用于生產(chǎn)4氐聚DNA芯片的技術(shù)。圖1為在玻璃基底(胺玻片)上本發(fā)明的亞胺杯芳烴4汙生物自組裝單層的制備過(guò)程的示意圖。圖2為在金基底上本發(fā)明的亞胺杯芳烴書f生物自組裝單層的制備過(guò)程的示意圖。圖3為本發(fā)明具有連續(xù)鳥。票呤堿基的低聚DNA的固定方法示意圖。圖4和5顯示了僅具有連續(xù)鳥。票P令石咸基的^氐聚DNA的選擇性固定方法，并顯示了用帶熒光的c-DNA分析固定低聚DNA密度的結(jié)果。4氐聚DNA時(shí)需要至少7個(gè)連續(xù)鳥。票p令功能基團(tuán)。[35]圖7顯示了為-瞼證在向本發(fā)明的亞胺杯芳烴書于生物自組裝單層固定低聚DNA時(shí)該鳥。票呤堿基通過(guò)分子識(shí)別被選才奪性識(shí)別，使用具有類似結(jié)構(gòu)的咪唑功能基團(tuán)進(jìn)行竟?fàn)幮苑磻?yīng)的結(jié)果。圖8為在玻璃基底上本發(fā)明的氨基杯芳烴衍生物自組裝單層的制備過(guò)程的示意圖。圖9為在金基底上本發(fā)明的氨基杯芳烴衍生物自組裝單層的制備過(guò)程的示意圖。圖10和1為本發(fā)明具有連續(xù)鳥嘌呤堿基的低聚DNA通過(guò)自動(dòng)分子識(shí)別進(jìn)行固定的方法示意圖以及最大密度固定的實(shí)際試驗(yàn)結(jié)杲。圖12為檢測(cè)進(jìn)行最大密度固定的最佳連續(xù)鳥嘌呤堿基數(shù)的試驗(yàn)結(jié)果。圖13為c-DNA可以由固定4氐聚DNA時(shí)通過(guò)確保連續(xù)石咸基之間的適當(dāng)空間而得到的固定低聚DNA之間的空間而接近芯片底部的示意圖。圖14和15為顯示通過(guò)高速雜交SNP鑒別可能達(dá)到開關(guān)水平的實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果。圖16為顯示鳥嘌呤堿基與其它堿基固定相比可進(jìn)行選擇性高速固定的實(shí)際竟?fàn)幮苑磻?yīng)結(jié)果。本發(fā)明的新型亞胺杯芳烴衍生物具有下列式1或2的結(jié)構(gòu)。所述的亞胺杯芳烴彩f生物是具有至少7個(gè)連續(xù)鳥噤。令堿基的^f氐聚DNA的固定方法中所采用的自組裝單層的關(guān)鍵化合物。[式1][46]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(其中Rl5R2,R3和R4獨(dú)立選自組合-H,-CH3，-C2H5，-C3H7-OCH3,-CI,-(:6115和-COOR,并且在所述-COOR中，R代表-CH或一，5)。[式2][49][50](其中R!，R2，R3和R4獨(dú)立選自組合-H,-CH3，-C2H5，-C3H7，-OCH3，-CI,《6115和-(2001^，并且在所述-COOR中，R代表-CH3或-C2H5;此外，所述的YbY2,Y3和Y4獨(dú)立選自組合-H,-(CH2)n-CH=0,-(CH2)n-SH,-(CH2CH20)m—CH2CH2-CH=0,-(CH2CH20)m-CH2CH2-SH，-(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z和-CO-(CH2)m—廣C6H4-(CH2)c-Z(其中n=2-15,m=1-10，c=0-10,Z=-SH，-CHO,-COOH或一NH2))。本發(fā)明還提供制備所述式1和2的亞胺杯芳烴衍生化合物的方法。具有下列式3的該5,11,17,23-四氨基杯[4]芳烴化合物可通過(guò)在參照下列引用的參考文獻(xiàn)1中所述的方法將杯[4]芳烴轉(zhuǎn)化為5,11,17，23-四硝基杯[4]芳烴后經(jīng)還原反應(yīng)合成得到[引用的參考文獻(xiàn)1:JournalofOrganicChemistry,1990,Vol55,pp5639-5643;JournalofOrganicChemistry,1979，Vol44，pp1233-1238;]。[式3][55]本發(fā)明所述式1的亞胺杯芳烴衍生化合物可通過(guò)以所述式3的5,11，17，23-四氨基杯[4]芳烴化合物作為起始原料，將式3的胺功能基團(tuán)與具有下列式4的芳香醛反應(yīng)合成得到(參見(jiàn)下文實(shí)施例中的反應(yīng)2)。[式4][58]CHOR(其中R選自組合-H,-CH3,-C2H5,-C3H7,-OCH3,-CI,-C6H5和-COOR',并且在所述-COOR'中，R'代表-CH3或-C2Hs)。此外，本發(fā)明式2的該亞胺杯芳烴衍生化合物可通過(guò)式1化合物與醛化合物的反應(yīng)合成得到，其中一種卣素被連接至末端基團(tuán)，從而在該末端基團(tuán)中醛或硫醇被連接至式1的第一和第三-OH基團(tuán)位置(參見(jiàn)下列實(shí)施例的反應(yīng)3-5)。[62]所述的卣化醛選自以下組合X-(CH2)n-CH=0,X-(CH2)n-SH,X-(CH2CH20)m-CH2CH2-CH=0,X-(CH2CH20)m-CH2CH2-SH,X-(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z以及X-CO-(CH2)m-廣C6H4-(CH2)c-Z,其中n=2-15，m=l-10,c=0-10,X=-C1,-Br，-I或-08020^4(^13,Z=-SH,-CHO,-COOH或-麗2。此外，本發(fā)明提供了一種向金基底連接一種帶有硫醇基團(tuán)的亞胺杯芳烴衍生物制備得到的自組裝單層固體基底。此外，本發(fā)明提供了一種通過(guò)亞胺鍵將亞胺杯芳烴衍生物連接至如玻璃，硅晶片或晶體等固體基底制備得到的自組裝單層固體基底，以及一種通過(guò)如酯，醚和酰胺鍵等化學(xué)4建將亞胺杯芳烴衍生物連接至如玻璃，硅晶片或晶體等固體基底制備得到的自組裝單層固體基底。此外，本發(fā)明提供了一種低聚DNA單層(即，一種低聚DNA芯片)，及其制備方法，其中各類低聚DNA通過(guò)將所述式2的亞胺杯芳烴衍生化合物與連接了胺功能基團(tuán)的金基底或玻璃基底相連4妄^皮高密度固定。圖1圖示了在i皮璃基底上本發(fā)明的亞胺杯芳烴書于生物自組裝單層的制備過(guò)程。在連接了胺功能基團(tuán)的玻璃基底上制備亞胺杯芳烴衍生物自組裝單層的具體方法如下首先，該連4妄了所述胺功能基團(tuán)的玻璃基底(玻璃玻片)可參照下述引用的參考文獻(xiàn)2[引用的參考文獻(xiàn)2:Langmuir，1997,Vol13,pp4305-4308;Lang籠ir，1996,Vol12,pp5338畫5342]通過(guò)在具有充足硅烷醇(-Si-OH)功能基團(tuán)的玻璃基底上的化學(xué)反應(yīng)得到的帶有胺末端基團(tuán)的玻璃基底(胺玻片或胺芯片)的形式進(jìn)行制備。從而制備得到連接了胺功能基團(tuán)的玻璃基底并將式2化合物以0.1-5mM的濃度添加入氯仿和THF混合溶液(CHCl3:THF=9:1)。1-5小時(shí)后，以氯仿，丙酮和乙醇的順序洗滌并干》喿，然后完成如圖1所示的亞胺杯芳烴自組裝單層。所述單層的形成可通過(guò)紅外線外部反射光i普確認(rèn)。市場(chǎng)上的各類玻片均可用作所述的玻璃基底。對(duì)于4建合中所用的亞胺4走，該4建可在水中長(zhǎng)期存i文時(shí)斷裂。然而，由于低聚:DNA等活物質(zhì)在制備時(shí)通常溶于pH介于7-8的緩沖溶液中，經(jīng)確i人在用其立即形成亞胺4建時(shí)不存在問(wèn)題。單層的制備過(guò)程。在金基底上制備亞胺杯芳烴衍生物自組裝單層的具體方法如下將連接了石克醇的式2的化合物以0.1-5mM的濃度溶解于如氯仿(CHC1;0等有才;L溶劑中制備溶液。金基底被放入所制備的溶液并放置l-5小時(shí)后，將其耳又出并以氯仿，丙酮和水的順序洗滌，并干燥，然后完成如圖2所述的亞胺杯芳烴書于生物自組裝單層。所述的金基底可以是任何類型的金薄膜；然而，一般而言，優(yōu)選在玻璃，熔融硅，硅晶片，塑料基底等在真空鍍以2-10nm的鉻(Cr)或鈦(Ti)等物質(zhì)后以50-200nm的厚度真空鍍金的基底。一般而言，所制備的金基底在即將使用前^皮置于食人魚溶液(強(qiáng)硫酸:30%過(guò)氧化氫=3:)中約1分鐘，然后以純凈水洗滌并吹氮?dú)飧稍锖筮M(jìn)行使用。所述單層的形成可通過(guò)紅外線外部反射光譜確認(rèn)。[73]此外，本發(fā)明l是供了一種通過(guò)固定4氐聚DNA而制備低聚DNA芯片的方法以及由該方法制備得到的低聚DNA芯片，其中通過(guò)多分子識(shí)別將連續(xù)鳥嘌P令石咸基固定到所述固體基底。更具體地，本發(fā)明^是供了一種通過(guò)所述亞胺杯芳烴衍生物的四個(gè)氮原子分子識(shí)別連續(xù)鳥嘌呤功能基團(tuán)的多分子識(shí)別固定低IRDNA的方法。本發(fā)明的低聚DNA固定方法形成了所有采用低聚DNA的分析方法的基礎(chǔ)，這是目前為止全世界未見(jiàn)類似研究報(bào)導(dǎo)的新型方法。圖3為本發(fā)明具有連續(xù)鳥嘌呤基團(tuán)的低聚DNA的固定方法示意圖。該具有用于固定的連續(xù)鳥。票呤基團(tuán)的低聚DNA為5'-GGGGGGGGGAAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.1)。^!奪與其結(jié)合的帶熒光的c-DNA為5'-Cy3-GTGCAGCTGTGGGTTGATT-3'(SEQIDNO.2),其具有與固定低聚DNA互補(bǔ)的DNA序列。此時(shí)，該l氐聚DNA的固定密度可通過(guò)將熒光物質(zhì)Cy-3(Telechem，美國(guó))連接至該末端基團(tuán)從而僅在該連接位點(diǎn)顯示熒光得到測(cè)定。在將低聚DNA以54(ig/ml(6.75pmol/ml)的濃度溶解于含有15%丙三醇的溶液500mMKC1中后，該4氐聚DNA可通過(guò)涂4隻于用購(gòu)自ProteogenCo.(Korea)的4敖陣列制備的直徑約為150um的亞胺杯芳烴單層上得到固定。約1-4小時(shí)后，以含有0.1%SDS(十二》克基石黃酸鈉)的2XSSC(IXSSC=碎寧4蒙酸鈉15mM+NaCl150mM)'溶液洗滌，以0.1XSSC溶液洗滌3分鐘并干燥制備。經(jīng)確定該制備低聚DNA單側(cè)在至少6個(gè)月的測(cè)量中未顯示出4壬<可變4匕。[78]圖4和5為顯示了在本發(fā)明的低聚DNA單層熒光分析該寸氐f:DNA密度的示意圖。該具有用于固定至圖3中制備的J氐聚DNA單層的連續(xù)鳥嘌口令基團(tuán)的4氐聚DNA為5'-GGGGGGGGGAAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.])。將與其結(jié)合的帶熒光的c-DNA為5'畫Cy3-GTGCAGCTGTGGGTTGATT-3'(SEQIDNO.2),其具有與固定低聚DNA互補(bǔ)的DNA序列。此外，該低聚DNA的固定密度可通過(guò)將焚光物質(zhì)Cy-3(Telechem，美國(guó))連一妾至該末端基團(tuán)從而僅在該連接位點(diǎn)顯示熒光得到測(cè)定。該單層以含0.17nmol/ml的與固定^f氐聚DNA熒光連4妻的c-DNA的60(al4xSSC+0.002%SDS+50。/。丙三醇混合溶液進(jìn)^f亍涂布，然后在50。C下將DNA雜交30分鐘。隨后先以含0.1%SDS的4xSSC溶液在室溫下洗滌，再以4xSSC溶液洗滌，并干燥。所得產(chǎn)品可用掃描儀(GSIlite,美國(guó))進(jìn)行確認(rèn)。對(duì)于用于固定的低聚DNAs,可采用分別具有如下DNA序列的低聚DNA:具有9個(gè)連續(xù)A,T,C，G堿基序列、一種連接了生物素(類似鳥嘌呤的功能基團(tuán))的低聚DNA以及一種無(wú)連續(xù)堿基序列的4氐聚DNA。相應(yīng)的，經(jīng)試一險(xiǎn)確i^f又連續(xù)鳥嘌呤石咸基^皮選沖奪性固定。該用于固定比4交的DNA序列如下所示9T5'-TTTTTTTTTTAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.3)9A5'-AAAAAAAAATAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.4)9C5'-CCCCCCCCCCAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.5)生物素5'畫生物素-TATATAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.6)no5'-AATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.7)該通過(guò)雜交與之結(jié)合的c-DNA可經(jīng)合成具有互補(bǔ);成基序列。5'-Cy3畫GTGCAGCTGTGGGTTGATT-3'(SEQIDNO.2)同時(shí)可以通過(guò)將熒光物質(zhì)(Cy3)與熒光掃描儀的連接相對(duì)分析所連接的c-DNA的密度，即，連接了c-DNA的固定低聚DNA的密度。才艮據(jù)實(shí)際試-驗(yàn)結(jié)果，在上述條件中以相同方式涂^隻和固定各低聚DNA后，該c-DNA以能固定在表面的低聚DNA最大量的三倍進(jìn)行涂覆，從而使充分熒光連接的c-DNA與所有固定低聚DNA在此結(jié)合。然后，進(jìn)行洗滌和干燥并以熒光掃描儀進(jìn)行分析。實(shí)際^式-驗(yàn)結(jié)果為以6X6顯示結(jié)果的圖5的中圖，該結(jié)果以數(shù)值進(jìn)行熒光分析得到且該分析顯示于圖5右側(cè)的柱狀圖中。實(shí)際試-驗(yàn)結(jié)果顯示具有9個(gè)連續(xù)鳥。票呤基團(tuán)的低聚DNA9G所呈現(xiàn)的熒光約比連接了不同連續(xù)堿基，或連接了生物素，或未連接連續(xù)堿基的低聚DNA高10-40倍。所述結(jié)果顯示僅當(dāng)固定低聚DNA時(shí)存在連續(xù)鳥嘌呤石成基時(shí)，該低聚DNA才能以可分析的水平固定在亞胺杯芳烴的表面上。圖6顯示了向本發(fā)明的亞胺杯芳烴書f生物自組裝單層固定低聚DNA時(shí)必需有至少7個(gè)連續(xù)鳥嘌呤功能基團(tuán)。該低聚DNA固定在圖3所示的條件下進(jìn)行，且該c-DNA可根據(jù)上述條件使用同樣用于圖4的帶熒光低聚DNA進(jìn)行雜交。1G5'-GAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.8)4G5'-GGGGAATCAACCCACAGCTGCA畫3'(SEQIDNO.9)7G5'-GGGGGGGAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.10)9G5'-GGGGGGGGGAAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.1)12G5'畫GGGGGGGGGGGGGAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.11)15G5'-GGGGGGGGGGGGGGGGAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.12)[104]c-DNA5'-Cy3畫GTGCAGCTGTGGGTTGATT-3'(SEQIDNO.2)(Cy-3;熒光物質(zhì))在上述相同條件下;余覆，洗滌并干燥低聚DNA。才艮據(jù)實(shí)際試-驗(yàn)結(jié)果，在上述條4牛中以相同方式〉余^隻和固定各^f氐聚DNA后，該c-DNA以能固定在表面的低聚DNA最大量的三倍進(jìn)行涂覆，從而使與所有固定低聚DNA熒光連接的c-DNA在此結(jié)合。然后對(duì)其進(jìn)行洗滌和干燥以通過(guò)熒光掃描儀進(jìn)行分析。實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果為以6X6顯示結(jié)果的圖6的中圖，該結(jié)果以數(shù)值進(jìn)行熒光分析得到且該分析顯示于圖6右側(cè)的柱狀圖中。當(dāng)連續(xù)鳥。票呤堿基序列約為1或4時(shí)，其結(jié)果為幾乎沒(méi)有表面固定。此外，當(dāng)其具有7個(gè)連續(xù)鳥嘌呤(7G)時(shí)顯示強(qiáng)烈熒光，并在具有9個(gè)連續(xù)鳥。票p令(9G)時(shí)顯示出最強(qiáng)的熒光。同時(shí)，當(dāng)<氐聚DNA具有長(zhǎng)于9個(gè)連續(xù)鳥噤呤石咸基的12個(gè)(12G)和15個(gè)(15G)連續(xù)鳥嘌呤堿基時(shí)，該熒光靈敏度開始下降。該結(jié)果顯示9個(gè)鳥嘌呤堿基是足以通過(guò)分子識(shí)別進(jìn)行固定的水平，且理-論上當(dāng)^吏用更長(zhǎng)的鳥嘌呤石成基時(shí)，固定具有12G的低聚DNA比固定具有9G的低聚DNA需要多出約1/3的空間，因而該熒光靈敏度下降至約1/3的水平。具有15G的低聚DNA需要多于9G約額外2/3的空間，因此理論上被固定的數(shù)量下降至約3/5的水平(即60%),實(shí)際上熒光靈壽丈度與9G相比下降了約55%。綜合所述結(jié)果，可以理解固定所需的連續(xù)鳥。票P令數(shù)量至少為7個(gè)。所述連續(xù)鳥嘌呤的^:量?jī)?yōu)選為7-15個(gè)，更優(yōu)選為9-12個(gè)，最有選9個(gè)。[109]圖7裝單層固定低聚DNA時(shí)該鳥嘌呤堿基通過(guò)分子識(shí)別被選4奪性識(shí)別，使用具有類似結(jié)構(gòu)的咪唑功能基團(tuán)進(jìn)行竟?fàn)幮苑磻?yīng)的結(jié)果。圖7顯示了連續(xù)鳥噤p令石咸基通過(guò)分子識(shí)別進(jìn)行固定的結(jié)果，該結(jié)果通過(guò)一項(xiàng)在固定中包含一種能夠進(jìn)行與鳥噪呤堿基類似的分子識(shí)別的咪唑的研究獲得。由于咪唑在亞胺杯芳烴中具有比鳥。票呤堿基相對(duì)弱的分子識(shí)別，因此可在高于待固定低聚DNA的濃度下進(jìn)行分子識(shí)別的竟?fàn)幮苑磻?yīng)。在與圖3相同的固定條件下進(jìn)行固定并采用圖4所用的相同方法中的c-DNA進(jìn)行熒光靈壽丈度的測(cè)量。圖7的左圖顯示了實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果，右圖顯示了依賴于熒光靈每丈果顯示該下降起始于約20mM的水平，且在30mM的水平下降至一半，而在100mM和以上時(shí)低聚DNA幾乎不進(jìn)行固定。該結(jié)果顯示低聚DNA通過(guò)亞胺杯芳烴衍生物中的9個(gè)連續(xù)鳥。票呤堿基的多分子識(shí)別進(jìn)行固定。識(shí)別進(jìn)行9個(gè)連續(xù)鳥噤呤石咸基的不可逆固定。通過(guò)熒光分析表示的固定低聚DNA數(shù)量特別顯示了高于傳統(tǒng)已知方法的5-30倍的固定密度。同樣地，本發(fā)明:提供了一種能在單層表面固定連續(xù)鳥嘌呤石成基時(shí)獲得具有其長(zhǎng)度(2.5-3.5nm)的空間的新型低聚DNA固定方法，從而在以診斷或研究等目的分析具有特定堿基序列的基因時(shí)通過(guò)纟是供至少具有^:百個(gè)石成基序列的c-DNA下降至低聚DNA底部并與固定低聚DNA強(qiáng)烈鍵合所需的足夠的空間(2.5-3.5nm)，將c-DNA雜交所需的時(shí)間由原先的至少12小時(shí)顯著下降至1-2小曰寸以內(nèi)。作為本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的新型氨;&杯芳烴衍生物具有以下式5-8的結(jié)構(gòu)。所述氨基杯芳烴衍生物是具有固定連續(xù)鳥嘌呤基團(tuán)的^f氐聚DNA的固定方法中所用的自組裝單層的關(guān)^t化合物。[式5](其中R1;R2,R3,R4，R5，R6，R7，R8，R、R'2,R'3,R'4，R'5，R'6，R'7，R's獨(dú)立選自組合-H,-CH3，-C2H5,-C3H7,-OCH3,曙Cl,-C6H5,-OH.-OCH2CH3，-Br，-CF3,-OCH2C6H5,-OC6H5，-OC6H4CH3,-OC6H4C(CH3)3，-OC6H4CF3,-OC6H4Cl,-OCOCH3，-NHCOCH3，-CONHCH3,-CN,COOH和-COOR,且在所述-COOR中，R代表—CH3或一C2Hs)。OHOHOHHO[119][式6][120]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>(其中Ri，R_2，R3,R4,R5，R7，R，R'i,R'2，R'3，R'4，R'5，R'6，R'7，R'8獨(dú)立選自組合誦H，-CH3,-C2H5,-C3H7，-OCH3，-Cl，-C6H5,-OH,-OCH2CH3，-Br，-CF3,-OCH2C6H5,-OC6H5,-OC6H4CH3，-OC6H4C(CH3)3，-OC6H4CF3，-OC6H4Cl，-OCOCH3,-NHCOCH3，-CONHCH3，-CN，COOH和-COOR，且在所述-COOR中，R代表-CH;或-C2H5。此夕卜，所述的Y!,Y2,Y3和Y4獨(dú)立選自組合-H,-(CH2)n-CH=0，-(CH2)n-SH，-(CH2CH20)m-CH2CH2-CH=0，-(CH2CH20)m-CH2CH2-SH，-(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z，和-CO-(CH2)m-l-C6Hr(CH2)c-Z(其中n=2-15,m=1-10,c=0-10，Z=-SH，畫CHO,-COOH，-NH2，且"QH4-和C6H5#1定義為苯-基基團(tuán)))。[式7][124](其中Ri,R2,R3,R4，R5，R6,R7,R8,R'i，R'2,R'3，R'4,R's,RV"R'7，R'8獨(dú)立選自組合-H，-CH3，-C2H5，-C3H7,-OCH3,-Cl，-C6H5，-OH，-OCH2CH3，-Br，-CF3，-OCH2C6H5,-OC6H5,-OC6H4CH3,-OC6H4C(CH3)3，-OC6H4CF3，-OC6H4Cl,-OCOCH3,-NHCOCH3,-CONHCH3，-CN，COOH和-COOR，且在所述-COOR中，R代表—CH3或—C2H5)。[式8][126][127](其中R,，R2,R3,R4,R5，R6，R7,R8，R'i,R'2，R'3,R、，R's,R、,R'7,R'8獨(dú)立選自組合-H,-CH3，-C2H5,-C3H7,-OCH3,-Cl，-C6H5,-OH,-OCH2CH3，-Br，-CF3,-OCH2C6H5,-OC6H5,-OC6H4CH3，-OC6H4C(CH3)3，-OC6H4CF3,-OC6H4Cl,-OCOCH3，-NHCOCH3,-CONHCH3,匪CN,COOH和-COOR,且在所述-COOR中，R代表-CHb或-QH5。然而,排除R,R2，R3，R4，R5，R6,R7，R8，R'i,R'2，R'3,R'4，R's,R'6,R'7,R'8同時(shí)為-H的情況。此外，所述的Yl5Y2，Ys和丫4獨(dú)立選自組合-H，-(CH2)n-CH=0，-(CH2)n-SH,-(CH2CH20)m-CH2CH2-CH=0,-(CH2CH20)m-CH2CH2-SH，-(CH2)m-C6H4-(CH2)C-Z,和-CO-(CH2)m-l-C6H4-(CH2)c-Z(其中11=2-15,m=1-10，c=0-10，Z=-SH，-CHO,-COOH,-NH2,且-C6H4和-(:6115^皮定義為苯基基團(tuán)))。本發(fā)明提供制備所述式5-8的氨基杯芳烴衍生化合物的方法。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>[131]所述式9的四氨基杯[4]芳烴可通過(guò)參照所引用的參考文獻(xiàn)1的方法將杯[4]芳烴轉(zhuǎn)化為四硝基杯[4]芳烴后進(jìn)行還原反應(yīng)合成得到。本發(fā)明所述式5和7的氨基杯、芳烴衫于生〗匕合物可通過(guò)將用已知方法合成的式9的四氨基杯[4]芳烴化合物作為起始原料，將式9的胺功能基團(tuán)與下文實(shí)施例13中的芐基氯或芐基溴衍生物反應(yīng)合成得到。備選地，在式9的功能基團(tuán)與芳香醛參照下文實(shí)施例16的方法反應(yīng)后4吏用還原劑進(jìn)行還原反應(yīng)，即是與節(jié)基氯或千基溴書t生物反應(yīng)合成式5和7的氨基杯芳烴衍生物。本發(fā)明式6和8的氨基杯芳烴衍生化合物(其中醛或硫醇通過(guò)下列-O.H,即，醇功能基團(tuán)中的第一和第三醇功能基團(tuán)與烷基基團(tuán)末端相連4妄)可通過(guò)將式5和7的4b合物與具有醛等功能基團(tuán)的化合物(其中卣素參照下列實(shí)施例17-19被連接至末端基團(tuán))反應(yīng)得到。此外，本發(fā)明提供了一種用于制備能通過(guò)將所述式6或8的氨基杯芳烴書f生物連接至帶有胺等各種功能基團(tuán)的金基底或如玻璃等固體基底以高密度固定各種類型的低聚DNA的低聚DNA單層的4氐聚DNA芯片的制備方法。此外，本發(fā)明4是供了一種通過(guò)亞胺和酰胺4t連4妻氨基杯芳烴衍生物(其中醛功能基團(tuán)被連接至所述式6或8的氨基杯芳烴衍生物的末端基團(tuán))和選自玻璃，硅晶片和晶體的帶有胺功能基團(tuán)的固體基底制備得到的自組裝單層固體基底。此外，本發(fā)明才是供了一種通過(guò)選自酯，醚或酰胺4建的化學(xué)鍵連接氨基杯芳烴衍生物(其中醛功能基團(tuán)被連接至所述式6或8的氨基杯芳烴衍生物的末端基團(tuán))和選自玻璃，硅晶片和晶體的帶有胺功能基團(tuán)的固體基底制備得到的自組裝單層固體基底。此外，本發(fā)明提供了一種通過(guò)不可逆分子識(shí)別將未經(jīng)處理的具有連續(xù)堿基的低聚DNA固定至所述低聚DNA芯片基底制備一種低聚DNA單層，即一種低聚DNA芯片的方法。圖8顯示了在如玻璃，硅晶片，熔融石圭等固體基底上制備本發(fā)明的氨基杯芳烴衍生物自組裝單層的過(guò)程。在連接了胺功能基團(tuán)的玻璃基底上制備氨基杯芳烴衍生物自組裝單層的具體方法如下連接了之前使用的胺功能基團(tuán)的玻璃基底(玻璃玻片)可參照下述引用的參考文獻(xiàn)2通過(guò)在具有充足硅烷醇(-Si-OH)功能基團(tuán)的玻璃基底表面上的化學(xué)反應(yīng)得到的帶有胺末端基團(tuán)的玻璃基底(胺玻片或胺芯片)的形式進(jìn)行制備。將如此制備的連接有胺功能基團(tuán)的玻璃基底加入氯仿和THF的混合溶液，其中式6或8的化合物以0.1-5mM的濃度溶于其中(CHCL3:THF=9:1)。1-5小時(shí)后，以氯仿，丙酮和乙醇的順序洗滌，并干燥，然后完成如圖8所示的氨基杯芳烴衍生物自組裝單層，即A型BMTDNA芯片基底。所述單層的形成可通過(guò)紅外線外部反射光i普確i^。市場(chǎng)上的各類^:片或玻璃均可用作所述的玻璃基底。對(duì)于鍵合中所用的亞胺鍵，該鍵可在水中長(zhǎng)期存放時(shí)斷裂。然而，由于4氐聚DNA等活物質(zhì)在制備時(shí)通常溶于pH介于7-8的緩沖溶液中，經(jīng)研究結(jié)果確認(rèn)在用其立即形成亞胺^fe時(shí)不存在問(wèn)題。3口果^。圖8所示一夸該制備A型BMTDNA芯片基底力文入含有如BH:3-TH:F或1-5%NaBH4等還原劑的有才幾溶劑中1-10分鐘，該亞胺凈皮還原成更強(qiáng)的胺，因此可為長(zhǎng)期〗呆存或在不同pH范圍內(nèi)制備DNA芯片提供出色的穩(wěn)定性。圖9顯示了在金基底上本發(fā)明的氨基杯芳烴衍生物自組裝單層的制備過(guò)程。在金基底上制備氨基杯芳烴衍生物自組裝單層的具體方法如下將連接了碌L醇的式6或8的化合物以0.1-5mM的濃度溶解于如氯仿(CHCl3)等有機(jī)溶劑中制備溶液。金基底被放入所制備的溶液并力文置1-5小時(shí)后，^1夸其耳又出并以氯〗方，丙酮和水的順序洗滌，并干燥，然后完成如圖9所述的氨基杯芳烴書f生物自組裝單層。所述的金基底可以是任何類型的金薄膜；然而，一般而言，優(yōu)選在玻璃，溶融硅，硅晶片，塑料基底等在真空4度以2-10nm的鉻(Cr)或鈦(Ti)等物質(zhì)后以50-200nm的厚度真空鍍金的基底。優(yōu)選將所制備的金基底在即將使用前置于食人魚溶液(強(qiáng)硫酸:30°/。過(guò)氧化氫=3:1)中約l分鐘，然后以純凈水洗滌并吹氮?dú)飧稍铩Ｋ鰡螌拥男纬煽赏ㄟ^(guò)紅外線外部反射光譜確認(rèn)。[148]此外，本發(fā)明^是供了一種通過(guò)多分子識(shí)別連^妾連續(xù)鳥。票口令堿基和所述固體基底固定低聚DNA以制備低聚DNA芯片的方法，以及由該方法制備得到的低聚:DNA芯片。本發(fā)明更具體提供了一種通過(guò)所述氨基杯芳烴衍生物的四個(gè)氮原子分子識(shí)別連續(xù)鳥嘌呤功能基團(tuán)的多分子識(shí)別固定低聚DNA的方法。技術(shù)提供了基礎(chǔ)技術(shù)，這是一種迄今為止全世界未見(jiàn)類似研究結(jié)果的新型方法。圖lO和ll為通過(guò)自動(dòng)分子識(shí)別制備高密度低聚DNA芯片的4支術(shù)示意圖，以及組成單層的氨基杯芳烴纟汙生物凄t量的理i侖計(jì)算示意圖。它是將實(shí)際低聚DNA濃度與通過(guò)理論計(jì)算得到的可固定在氨基杯芳烴書f生物單層上最大4氐聚DNA濃度比較而得的實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果。固定低聚DNA的理-淪最大量可通過(guò)下文方程計(jì)算。通過(guò)X射線測(cè)定法得到的氨基杯芳烴的直徑為2.1-2.2nm。當(dāng)其在表面上作為單層進(jìn)行自組裝時(shí)所需分子的數(shù)量與通過(guò)連接三個(gè)氨基杯芳烴書f生物中心的直線構(gòu)成的兩個(gè)三角形的面積相同。因此，一個(gè)杯芳烴A'f生物在表面上占據(jù)的面積可通過(guò)以下方程獲得[方程]2.1譲x2.1nmxsin60。=3.82xl(T14cm2[156]因此，每lcm2中存在的氨基杯芳烴衍生物的數(shù)量為1/3.82x10-14cm2=2.62x10n=43.5pmol/cm2。由于6-7結(jié)合氨基杯、芳烴衍生物的面積可用于固定一個(gè)低聚DNA,可固定的最大低聚DNA密度為43.5/(6-7)pmol/cm2=6.2-7.25pmol/cm2。參照實(shí)》也例24的方法，將用于固定的低聚DNA5'-GGGGGGGGGAAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.16)與帶熒光的c-DNA5'畫cy3-GTGCAGCTGTGGGTTGATT國(guó)3'(SEQIDNO.19)雜交并以最大密度連接至低聚DNA芯片后，根據(jù)實(shí)施例13的方法在洗滌和干燥后通過(guò)熒光掃描儀(GSI，美國(guó))測(cè)得的熒光靈敏度的測(cè)量結(jié)果顯示于圖11的雜交結(jié)果2)中。作為使用熒光掃描儀在干燥相同的用于在不同;農(nóng)度下雜交的c-DNA5'-cy3畫GTGCAGCTGTGGGTTGATT-3'(SEQIDNO.19)后測(cè)量類似熒光靈每文度的結(jié)果，在以3.8pmol/cm濃度涂^隻并干燥后可獲得類似水平的熒光靈牽丈度，該水平是理論計(jì)算值的一半。該結(jié)果顯示于圖11的1)中干燥熒光低聚DNA的結(jié)果中。該結(jié)果顯示參照本發(fā)明開發(fā)的BMT低聚DNA芯片基底可通過(guò)固定接近理論最大值的低聚DNA制備低聚DNA芯片，并可在雜交30分鐘后獲得約最大熒光的50%，且這是世界上首個(gè)同時(shí)支持超高速雜交和實(shí)現(xiàn)高密度固定技術(shù)的低聚DNA芯片制備技術(shù)。圖12為參照實(shí)施例22通過(guò)鳥噪p令^咸基連續(xù)連4妄的具有相同石咸基序列的低聚DNA以5倍的濃度固定低聚DNA(6.75nmol/mL，lnL),參照實(shí)施例22進(jìn)4亍雜交，洗滌并干燥以發(fā)現(xiàn)最佳連續(xù)石咸基數(shù)量后，使用熒光掃描儀(GSI，美國(guó))分析的結(jié)果。在圖12的試驗(yàn)中采用了表4所示的石咸基序列，在雜交中采用了表4所示的熒光c-DNA。實(shí)際i式-驗(yàn)結(jié)果為以6X6顯示結(jié)果的圖12的中圖所示的掃描數(shù)據(jù)，該結(jié)果以數(shù)值進(jìn)行熒光分析得到且該分析顯示于圖12底部的柱狀圖中。當(dāng)連續(xù)鳥噤呤堿基序列約為1或4時(shí)，其結(jié)果為幾乎沒(méi)有表面固定。然而，當(dāng)其具有7個(gè)連續(xù)鳥。票呤(7G)時(shí)顯示強(qiáng)烈熒光，并在具有9個(gè)連續(xù)鳥嘌呤(9G)時(shí)顯示兩倍于7個(gè)連續(xù)鳥嘌呤(7G)的熒光水平。當(dāng)使用具有長(zhǎng)于9個(gè)連續(xù)鳥噤呤石咸基的12個(gè)(12G)和15個(gè)(15G)連續(xù)鳥。票呤堿基的低聚DNA時(shí)，據(jù)顯示熒光靈壽文度下降至9個(gè)連續(xù)鳥噤p令石咸基時(shí)的1/2,1/3的水平。這顯示9個(gè)連續(xù)鳥嘌呤堿基是足以通過(guò)分子識(shí)別固定低聚DNA的水平且在使用更長(zhǎng)的鳥嘌呤堿基時(shí)，理論上12G的低聚DNA需要大于9G的空間，因此焚光靈壽文度下降至1/2的水平。15G的4氐聚DNA與9G相比需要約2/3的額外空間，因此被固定的低聚DNA下降至約30%的水平，而熒光靈壽文度纟皮下降至9G的約1/3的水平。綜合這些結(jié)果，可以看到固定所需的最佳連續(xù)鳥嘌呤的數(shù)量為9。如果連續(xù)鳥嘌p令的lt量小于9G，則可能無(wú)法達(dá)到通過(guò)分子識(shí)別不可逆固定^氐聚DNA的充分水平。此外，從這些結(jié)果還可以看到連接鳥。票呤堿基的數(shù)量大于9G時(shí)，待固定的面積(即固定所需的面積)將大于9G,這從而導(dǎo)致了實(shí)際固定的低聚DNAs數(shù)量的下降。圖13為c-DNA可以通過(guò)固定低聚DNA時(shí)通過(guò)連續(xù)石成基而荻得的適當(dāng)?shù)目臻g而確保的固定低聚DNA之間的空間接近芯片底部且維持了超高速接近所需的足夠空間水平的示意圖。與此同時(shí)，它還顯示了6-7氨基杯芳烴4汙生物實(shí)際固定時(shí)的表面面積可用于固定低聚DNA。在圖14和15中，表5所示的石咸基序列參照實(shí)施例23分別固定了不同的A,C,G，T型4氐聚DNA。然后，在參照實(shí)施例23的為斥企測(cè)帶熒光的DNA(Cy3-DNA)而與c-DNA進(jìn)4亍的雜交只于能與之結(jié)合的互補(bǔ)c-DNA進(jìn)4亍雜交后，如實(shí)施例23所述，該帶焚光的表5的低聚DNA被用于實(shí)施例23所述的熒光連接中。此后可進(jìn)行洗滌和干燥以通過(guò)熒光掃描4義(GSI，美國(guó))進(jìn)行熒光靈敏度分析。圖14和15顯示了這是一種甚至能夠在如30分鐘左右的短雜交時(shí)間中進(jìn)行可在開-關(guān)水平辨別和分析熒光靈壽丈度，同時(shí)在開-關(guān)水平辨別SNP的超高速雜交的低聚DNA芯片。此外，該結(jié)果顯示作為本發(fā)明目標(biāo)的低聚DNA芯片的制備技術(shù)是一種支持超高速雜交并以高復(fù)制簡(jiǎn)便分析單核苷多態(tài)性(SNP)的新型技術(shù)。圖16為顯示單獨(dú)鳥。票呤石威基與其它石成基固定相比進(jìn)行選"^性高速固定的實(shí)際竟?fàn)幮苑磻?yīng)結(jié)果。使用以如實(shí)施例25相同濃度連接了9G的低聚DNA(9G-1),其不與帶焚光的表6的低聚DNA結(jié)合，通過(guò)以低聚DNA(9G-1)1,2,4倍的濃度涂覆混合4類含有與帶熒光低聚DNA(Cy-3-DNA)互補(bǔ)的堿基序列且連接9A,9G,9T,9C的低聚:DNA混合物以圖16所示的順序固定DNA。同時(shí)，如果9A,9C，9T，9G以相同濃度混合的低聚DNA的固定快于低聚DNA(9G-1),則可通過(guò)與參照實(shí)施例25進(jìn)行的雜交過(guò)程中的帶熒光低聚DNA結(jié)合顯示熒光，而如果該連接9G的低聚DNA(9G-1)固定更快，則顯而易見(jiàn)不會(huì)顯示熒光。才艮據(jù)圖16的實(shí)際實(shí)馬全結(jié)果可以確定在固定9G的位點(diǎn)上，在固定時(shí)熒光靈敏度隨低聚DNA濃度的上升而上升，乂人而當(dāng)9G-1:9G=1:1時(shí)，可顯示約為50%的焚光靈敏度，而在1:4時(shí)，可顯示約80%的熒光靈敏度。對(duì)于9T，9C可以確定該熒光靈每丈度上升極少，甚至在9A時(shí)Y叉顯示了4倍于16G的量的輕微熒光靈敏度水平。因此，可以看到當(dāng)實(shí)際固定時(shí)使用了連接9G的低聚DNA時(shí)，將用于雜交的石成基(即，將用于與c-DNA結(jié)合的堿基)部分不參與固定，也就是說(shuō)，僅9G選擇性結(jié)合的位點(diǎn)可制備能通過(guò)以最大密度與本發(fā)明的氨基杯芳烴衍生物單層結(jié)合進(jìn)行復(fù)制的低聚DNA?？偠灾摻Y(jié)果顯示可通過(guò)以根凈居本發(fā)明開發(fā)的氨基杯芳烴衍生物自組裝單層多分子識(shí)別連續(xù)鳥噤呤堿基在單層表面上不可逆固定4氐聚DNA從而制備^氐聚DNA芯片，且這是一種能通過(guò)40始終支持固定以使熒光分析顯示的固定低聚DNA的量4妾近理i侖最大密度的可復(fù)制的低聚DNA芯片制備的基礎(chǔ)技術(shù)。此外，在本發(fā)明中，連續(xù)鳥。票P令石成基^皮固定在單層表面的并呈圖13所示的固定的低聚DNA確保具有與所述堿基相同長(zhǎng)度的穩(wěn)固空間。該空間可在以診斷或研究目的分析具有特殊^咸基序列的DNAs時(shí)使至少具有幾十到上百個(gè)堿基序列的c-DNA能輕松地以超高速自由到達(dá)芯片基底表面，從而可以在如10分鐘-1小時(shí)的極短時(shí)間通過(guò)使最大數(shù)量的石咸基互補(bǔ)結(jié)合進(jìn)行超高速雜交。此外，本發(fā)明提出了一種制備低聚DNA單層的技術(shù)并結(jié)合了在固定DNAs之間充分獲得空間從而即使小單核苷多態(tài)性也能簡(jiǎn)單診斷的技術(shù)，即，一種用于制備^氐聚DNA芯片的基礎(chǔ)才支術(shù)。日J(rèn)明并非〗義限于此。具體實(shí)施例方式實(shí)施例15,11,17，23-四氨基杯[4]芳烴的制備[反應(yīng)式1〗同K/描述。然而本發(fā)[171]淺黃色固體產(chǎn)物5,11，17，23-四氨基杯[4]芳烴(TACA)可以5,11,17，23-四硝基杯[4]芳烴(TNCA)作為起始原料參照下述參考文獻(xiàn)3[引用的參考文獻(xiàn)3:VanWagenigen，A.M.A.;Snip,E.;VerboomW.;.Reinhoudt，D.N.;Boerrigter,H.;LiebigsAnn/Recueil1997.pp2235-2245]所述的合成方法以75%的產(chǎn)率合成得到。所述反應(yīng)表示為反應(yīng)式1。實(shí)施例25，11，17，23-四爺基亞胺-杯[4]芳烴的制備[反應(yīng)式2]岡[177]將500mg的TACA(1.03mmol)和200mg的無(wú)水MgS04放入干燥圓底燒并瓦中，同時(shí)添加150ml的乙腈和0.84ml的苯曱醛(8.24mmol),然后在室溫和氮?dú)饨绘紫禄旌蟽尚r(shí)。反應(yīng)后，過(guò)濾去除固體產(chǎn)物，然后對(duì)溶液減壓并去除殘留溶劑。然后在完全溶解于5ml的CH2Cl2后，添加30ml正己烷使5，11,17,23-四千基亞胺-杯[4]芳烴(TBICA)結(jié)晶為淺粉色固體。減壓過(guò)濾并減壓去除殘留溶劑獲得TBICA(822mg,產(chǎn)率95.7%)。所述反應(yīng)表示為反應(yīng)式2。iHNMR(300MHz，CDC13):10.15(s，4H，OH),8.34(s,4H,N=CH)，7.82隱7.78(m，8H，Ar)，7.40-7.38(m,12H,Ar),7.01(s,8H，Ar),4.3l(d，4H,ArCH2Ar，J=13Hz)，3.63(d,4H,ArCH2Ar，J=13Hz)13CNMR(300MHz,CDC13):159.26,146.28，136.40,131.32,tl28.86，121.90,32.47岡實(shí)施例35,11,17,23-四卡基亞胺烷氧基-杯[4]芳烴的制備[反應(yīng)式3]岡<formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula>[185]將500mg的TBICA(0.6薩al),無(wú)水K2CO3(830mg,6mmol)和碟化鈉(810mg，5.4mmol)放入干燥圓底燒瓶中，添加150ml的乙腈，然后在氮?dú)饨粨Q下混合。IO分鐘后，添加6-溴正己醛(644mg，3.6mmo1),然后將反應(yīng)容器中的反應(yīng)溫度上升至80°C。然后將混合物攪拌24小時(shí)。反應(yīng)后，減壓去除乙腈，并使用150mlCH2Cl2溶解反應(yīng)產(chǎn)物。由于反應(yīng)過(guò)程中得到的KBr,KI，K2C03等物質(zhì)不溶解，它們可通過(guò)減壓過(guò)濾去除。將濾過(guò)溶液減壓去除溶劑并完全溶解于5ml的乙酸乙酯中。然后如果添加40ml的正己烷，5，11，17,23-四節(jié)基亞胺烷氧基-杯[4]芳烴(TBICOCA)可作為黃色固體被萃取。使用CHCl3/正己烷使TBICOCA結(jié)晶獲得淺黃色固體產(chǎn)物(570mg,產(chǎn)率90%)。所述反應(yīng)表示為反應(yīng)式3。NMR(300MHz,CDC13):9.81(t,2H，CHO),8.46(s,2H,N=CH)，8.24(s，2H,N=CH),7.86-7.82(m,4H,Ar),7.73-7.70(m，4H,Ar)，7.43-7.3l(m，12H,Ar),7.07(s,4H,Ar),6.83(s,4H，Ar),4.33(d,4H,ArCH2Ar，J=13Hz)，4.04(t,4H,OCH2),3.46(d,4H，ArCH2Ar,J=13Hz)，2.57(t，4H，CH2CHO),2.10(t,4H,OCH2CH2),1.88-1.70(m，8H，CH2CH2)13CNMR(300MHz,CDC13):202.07,197.11,159.61，158.90,148.21,147.19，145.93，143.10,H36.07,130.59-129.57,128.83-128.08,122.10,121.54，43.84，31.73，25.57[188][189]實(shí)施例4[190]5，11,17,23-四爺基亞胺-溴丁氧基-杯[4]芳烴的制備[191][反應(yīng)式4]網(wǎng)TBICATBBCA[193]將TBICA(500mg，0.6mmo1)，無(wú)水K2CO3(830mg，6mmo1)和碘化鈉(1.08g,7.2mmol)放入干燥圓底燒瓶中，添加150ml的乙腈，然后在室溫下混合10分鐘。向反應(yīng)容器添加1，4-二溴丁烷(1.3g,0.72ml，6mmol)并將反應(yīng)容器中的溫度上升至80°C。然后將混合物反應(yīng)24小時(shí)。在反應(yīng)容器冷卻至室溫后，減壓去除溶劑，并將殘留產(chǎn)物溶解在150ml的CH2C12中。由于反應(yīng)過(guò)禾呈中得到的KBr,KI,K2CO:;等物質(zhì)不溶解，它們可通過(guò)減壓過(guò)濾去除，并將濾過(guò)溶液減壓去除溶劑。以乙酸乙酯/正己烷萃取后，減壓過(guò)濾獲得黃色固體產(chǎn)物5，11，17,23-四節(jié)基亞胺-溴丁氧基-杯[4]芳烴(TBBCA)。使用CHCl3/正己烷使固體重結(jié)晶以獲得淺黃色TBBCA(480mg，產(chǎn)率72%)。所述反應(yīng)表示為反應(yīng)式4。[194]'HNMR(300MHz,CDC13):8.47(s,2H,N=CH),S.24(s,2H,N=CH)，7.98(s,2H，ArOH)，7.86-7.83(dd,4H,ArH)，7.73-7.70(dd,4H，ArH),7.41-7.3l(m,12H,ArH)，7.08(s,4H,Ar),6.83(s,4H,Ar),4.33(d，4H，ArCHAr,J=13Hz),4.06(t，4H,OCH),3.49(s,4H,ArCHAr，J=13Hz),3.45(t，4H,CHBr),2.37-2.29(m,OCH2CH2)2.24陽(yáng)2.18(m,CH2CH2Br)[196]實(shí)施例5[197]5,11,17，23-四芐基亞胺巰基丁氧基杯[4]芳烴的制備[198][反應(yīng)式5][199]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>)和石危代乙酸鐘(l14.21mg，immol)放入干燥圓底燒瓶中，并溶解在60ml丙酮中，在室溫和氮?dú)饨粨Q下聲波反應(yīng)90分鐘。反應(yīng)后，減壓去除溶劑，并溶解于30ml的CH2Cl2中。然后減壓過(guò)濾不溶解的沉淀物，以水洗滌濾過(guò)溶液兩次，分離有機(jī)層并以MgS04千燥。將有機(jī)層減壓過(guò)濾得到固體然后將濾過(guò)溶液減壓干燥并使用乙酸乙酯/正己烷重結(jié)晶，并減壓過(guò)濾獲得淺黃色固體晶體。將所得的固體晶體放入圓底燒瓶，并溶解于CH2Cl2:曱醇-5:l的混合溶液中，在室溫和氮?dú)饨粨Q下聲波反應(yīng)。1分鐘后，加入1.0MKOH(lml，lmmol),聲波反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)后，減壓去除-容劑，然后、溶解于5ml的CH2C12中并以0.1MHC1溶液洗滌一次。分離有4幾層并以MgS04干燥后，減壓過(guò)濾，減壓去除濾過(guò)溶液的溶劑以獲得淡黃色5，11,17,23-四爺基亞胺巰基丁氧基杯[4]芳烴(TBIMBCA)。以乙酸乙酯/正己烷重結(jié)晶所得的TBIMBCA以獲得白色固體晶體TBIMBCA(450mg，產(chǎn)率73%)。所述反應(yīng)表示為反應(yīng)式5。[201]，HNMR(300MHz,CDC13):8.48(s,2H,N=CH),8.17(s,2H,N=CH),7.84(m,4H,ArOH),7.68(m,4H,ArOR),7.38(m,6H,ArH)，7.28(m,6H,ArOR),7.10(s,4H,ArH),6.8l(s，4H，ArH)，4.34(d，4H,ArCHA2r),4.04(t,4H,ArOCH2)，3.47(d，4H,ArCH2Ar，J=13Hz)，3.03(t,4H,SHCH2),2.38(m,4H,ArOCH2CH2),2.1l(m,4H,CH2CH2)[202〗[203]實(shí)施例6[204]亞胺杯芳烴衍生物單層的制備[205]將實(shí)施例3中合成得到的TBICOCA溶解于如CHC13等有機(jī)溶劑中制備濃度為0.1-5mM的溶液。如圖1所示，將連接了胺功能基團(tuán)的玻片(胺芯片)放入制備得到的溶液中1-24小時(shí)，然后取出并以氯仿，丙酮和水洗滌，然后干燥，以制備本發(fā)明的亞胺杯芳烴單層。其它的亞胺杯芳烴衍生物單層參照相同的方法制備。[206][207]實(shí)施例7[208]金基底上亞胺杯芳烴衍生物單層的制備[209]將實(shí)施例5中合成得到的TBIMBCA溶解于如CHCl3等有牙幾溶劑中制備濃度為0.1-5mM的;容液。如圖2所示，將金基底i支入制備得到的溶液中1-24小時(shí)，然后耳又出并以氯仿，丙酮和水洗滌，然后干燥，以制備本發(fā)明的亞胺杯芳烴單層。其它的亞胺杯芳烴衍生物單層參照相同的方法制備。所述金基底可以各種形式4吏用，但一4殳而言，優(yōu)選在玻璃，熔融硅，硅晶片，塑料基底等在真空鍍以5-20nm的4各(Cr)或鈦(Ti)等物質(zhì)后以100-300nm的厚度真空鍍金的基底。將所制備的金基底在即將使用前置于食人魚溶液(強(qiáng)硫酸:30%過(guò)氧化氬=3:1的混合溶液)中約IO秒鐘-I分鐘，然后以水洗滌并在氮?dú)饨粨Q下干燥，并立即^f吏用所述單層的形成可通過(guò)紅外線外部反射光語(yǔ)(FTIR-ERS)分析。岡[211]實(shí)施例8[212]通過(guò)多分子識(shí)別固定低聚DNA的方法P13]在圖3所示的^氐聚DNA固定中采用了Genetics(英國(guó))的微陣列設(shè)備和ProteogenCo.(韓國(guó))的微陣列設(shè)備。將具有9個(gè)連續(xù)鳥噤呤石咸基的4氐聚DNA以6.75pmol/ml溶于BMT點(diǎn)才羊溶液中以制備固定溶液。^吏用陣列插針如圖1所示以所述固定溶液涂覆亞胺杯芳烴4汙生物單層^皮璃基底(玻片)并用與實(shí)施例所述6所述相同的方法以l-5nL的量將低聚DNA固定在直徑為150-lSOjim的點(diǎn)中。1_4小時(shí)后，以500ml的BMTWa-A-1溶液洗滌玻片一分鐘，并以BMTWa-A-2溶液洗滌兩次，然后干燥。為封閉其它的低聚DNA固定位點(diǎn)，將洗滌后的^皮片力文入250ml的BMT封閉溶液并處理30分鐘。然后以500ml的BMTWa-A-l;容液洗滌^皮片3分鐘，并以BMTWa-A-2;容'液洗滌兩次。然后將水去除以進(jìn)4亍干燥。[214][215]實(shí);^例9[216]通過(guò)多分子識(shí)別僅不可逆固定具有9個(gè)連續(xù)鳥。票呤堿基的^氐聚DNA的方法[217]在圖4所示的低聚DNA固定中采用了Genetics(英國(guó))的樣i陣列i殳備。為確定如下文表1的6種不同的固定功能基團(tuán)9A,9G,9C，9T，no，生物素等的固定效率，將各寸氐聚DNA以6.75pmol/ml溶于BMT點(diǎn)樣溶液中以制備固定溶液。使用陣列插針如圖1所示以所述固定〉容液涂覆亞胺杯芳烴書于生物單層玻璃基底(J皮片)并用與實(shí)》4例所述6所述相同的方法以l-5nL的量將^氐聚DNA固定在直徑為150-180pm的點(diǎn)中。l畫4小時(shí)后，以500ml的BMTWa-A-l溶液洗滌3皮片一分鐘，并以BMTWa-A-2〉容液洗滌兩次，然后干火喿。為封閉其它的《氐聚DNA固定位點(diǎn)，將洗滌后的J皮片放入250ml的BMT封閉〉容液并處理30分鐘。然后500ml的BMTWa-A-l溶液洗滌玻片3分鐘，并以BMTWa-A-2溶液洗滌兩次。然后去除水分以進(jìn)行干燥，并制備得到圖4所示的低聚DNA芯片。然后，穩(wěn)定連4妄一種直4圣為0.8cm的小室以進(jìn)4于雜交。[218]表1<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>[220]為了與下列帶熒光的標(biāo)的DNA進(jìn)4亍雜交，可在1.5ml管中配制2(il帶2pmol/(il熒光的標(biāo)的DNA與58|ilBMThyb-mixA的混合〉容液。將混合;容液在100。C水中力。熱3分鐘，并放在冰上3分鐘以進(jìn)行冷卻，將60^1的混合溶液放入連接了雜交室的玻片。然后，在恒溫恒濕的烘箱中將玻片在50。C下雜交30分鐘。在30。C的恒溫器中以BMTWa-B-1(4xSSC,0.1%SDS)溶液洗滌經(jīng)雜交的玻片2分鐘，并以BMTWa-B-2(4xSSC)纟容液在室溫下洗滌2次。干燥后，以孩1陣列掃描儀(GSILumonics,美國(guó))定量分析熒光靈敏度。實(shí)際結(jié)果顯示在圖5中。所述結(jié)果顯示具有9個(gè)鳥嘌呤的低聚:DNA以高密度固定，而其它石咸基不影響固定。[221][222]實(shí)施例10[223]在通過(guò)多分子識(shí)別不可逆固定具有1-5個(gè)連續(xù)鳥噪。令石威基的Y氐聚DNA時(shí)的歲丈率比凈交方法[224]在圖6顯示的^f氐聚DNA固定中采用了Genetics(英國(guó))的微陣列設(shè)備。為確定如下文表2的6種不同的固定功能基團(tuán)1G,4G，7G，9G，12G，15G等的固定效率，將各4氐聚DNA以6.75pmol/ml溶于BMT點(diǎn)樣溶液中以制備固定溶液。使用陣列插針如圖1所示以所述固定溶液涂覆亞胺杯芳烴4汙生物單層玻璃基底(玻片)并用與實(shí)施例所述6所述相同的方法以l-5nL的量將低聚DNA固定在直徑為150-180pm的點(diǎn)中。1-4小時(shí)后，以500ml的BMTWa-A-l溶液洗滌玻片一分鐘，并以BMTWa-A-2溶液洗滌兩次，然后干燥。為封閉其它的低聚DNA固定位點(diǎn)，將洗滌后的玻片放入250ml的BMT封閉溶液并處理30分鐘。然后以500ml的BMTWa-A-l溶液洗滌玻片3分鐘，并以BMTWa-A-2溶液洗滌兩次。干燥后制備得到圖4所示的低聚DNA芯片。然后，穩(wěn)定連接一種直徑為0.8cm的小室以進(jìn)行雜交。[225]表2<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>[226][227]為了與實(shí)施例9中所用相同的帶熒光DNA進(jìn)4亍雜交，可在1.5ml管中配制2^1帶2pmol/jxl熒光的標(biāo)的DNA與58^ilBMThyb-mixA的混合溶液。將混合;容液在100。C水中加熱3分4中，并i丈在冰上3分鐘以進(jìn)行冷卻，將60fil的混合溶液放入連4妄了雜交室的玻片。然后，在恒溫恒濕的烘箱中將玻片在50。C下雜交30分鐘。在30。C的恒溫器中以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)溶液洗滌經(jīng)雜交的玻片2分鐘，并以BMTWa-B-2(4xSSC)溶液在室溫下洗滌2次。干燥后，以微陣列掃描儀(GSILumonics,美國(guó))定量分析焚光靈敏度。實(shí)際結(jié)果如圖6所示。所述結(jié)果顯示為進(jìn)行固定至少需要7個(gè)連續(xù)鳥。票呤堿基。此外，它們顯示9個(gè)連續(xù)鳥嘌p令^咸基顯示出最高的固定密度。[228][229]實(shí)施例11[230]通過(guò)與咪唑的竟?fàn)幮苑磻?yīng)驗(yàn)證低聚DNA的多分子識(shí)別固定["1]在圖7顯示的4氐聚DNA固定中采用了Genetics(英國(guó))的4斂陣列設(shè)備。將堿基序列為5'-GGGGGGGGGAAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.l)的低聚DNA以6.75pmol/ml溶于BMT點(diǎn)樣溶液中以制備固定溶液。使用陣列插針如圖1所示以所述固定溶液涂覆亞胺杯芳烴書f生物單層玻璃基底(玻片)并用與實(shí)施例所述6所述相同的方法以l-5nL的量將低聚DNA固定在直徑為150-180nm的點(diǎn)中。以圖7所示濃度組成的不同濃度咪唑涂覆該固定〉容液。3小時(shí)后，以500ml的BMTWa-A-1溶液洗滌3皮片1分鐘，以BMTWa-A-2溶液洗滌兩次并千燥。為封閉其它的^f氐聚DNA固定位點(diǎn)，將洗滌后的玻片放入250ml的BMT封閉溶液并處理30分鐘。然后以500ml的BMTWa-A-l溶液洗滌玻片3分4中，并以BMTWa-A-2溶液洗滌兩次。去除水分并干燥后制備得到圖4所示的低聚DNA芯片。然后，穩(wěn)定連接一種直徑為0.8cm的小室以進(jìn)4于雜交。[232][233]為了與實(shí)施例9中所用相同的帶熒光DNA進(jìn)行雜交，可在1.5ml管中配制2fil帶2pmol/|il熒光的標(biāo)的DNA與58(^1BMThyb-mixA的混合;容液。將混合溶液在100°C水中力。熱3分鐘，并方文在冰上3分鐘以進(jìn)行冷卻，將60fil的混合溶液放入連接了雜交室的玻片。然后，在恒溫恒濕的烘箱中將玻片在5(TC下雜交30分鐘。在30。C的恒溫器中以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)溶液洗滌經(jīng)雜交的玻片2分鐘，并以BMTWa-B-2(4xSSC)溶液在室溫下洗滌2次。干燥后，以微陣列掃描儀(GSILumonics,美國(guó))分析熒光靈敏度。實(shí)際結(jié)果如圖7所示。所述結(jié)果顯示咪唑通過(guò)多分子識(shí)別抑制了連續(xù)鳥嘌P令固定，且在包含了至少lOOmM的。米唑時(shí)幾乎不進(jìn)^i氐聚DNA的固定。也就是i兌，它們顯示了咪唑通過(guò)分子識(shí)別進(jìn)^亍竟?fàn)?，具?個(gè)連續(xù)鳥嘌呤堿基的低聚DNA的固定率有所下降。[234][235]在實(shí)施例8-11中用于固定，清洗等用途的溶液組成如下[236]BMT點(diǎn)樣〉容液(4xSSC,15%丙三醇，1xPBS)[237]BMTWa-A-l(2xSSC,0.1%SDS)[238]BMTWa-A-2(0.1xSSC)[239]BMT去于閉;容液(5%牛奶酪蛋白溶液)[240]BMThyb-mixA(4xSSC,0.1%SDS，50%丙三醇，1xPBS)[241]BMTWa-B-1(4xSSC,0.1%SDS)[242]BMTWa-B-2(4xSSC)[244]實(shí)施例12[245]5，11，17，23-四氨基杯[4]芳烴的合成[246][反應(yīng)式6][247][248]淺黃色固體產(chǎn)4勿5，11,17,23-四氨基^T、[4]芳經(jīng)(TACA)可以5，11,17,23-四硝基杯[4]芳烴(TNCA)作為起始原料參照下述參考文獻(xiàn)3所述的合成方法以75。/o的產(chǎn)率合成4f到。[249][250]實(shí)施例13[251]5,11,17，23-四(2,4-二曱基)二節(jié)氨基杯[4]芳烴的合成[252][反應(yīng)式7][253]TACA2,4-DMTDBACA[254]將磁棒，TACA(l.Og,2.05mmol)和石與化鈉(3.0g,20.5mmo1)放入干燥的圓底燒〗fe中，將混合物減壓干燥。干燥后加入50ml的無(wú)水乙腈，然后將其在加熱器中氮?dú)饨粨Q下混合。5分鐘后，將2，4-二曱基芐基溴(16.2g，82mmol)》文入反應(yīng)容器，然后升溫并攪拌。然后添加吡啶(6.62ml，82mmo1),使混合物反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)后，使反應(yīng)容器冷卻至室溫，將溶劑減壓去除。然后，在溶解于150ml的CH2Cl2后，以水洗滌有機(jī)層兩次。將干燥后的有機(jī)層減壓過(guò)濾，并減壓去除濾過(guò)溶液。然后以CH2Cl2/MeOH重結(jié)晶以獲得2.1g的淺灰色固體產(chǎn)物5,11,17,23-四(2，4-二甲基)二爺氨基杯、[4]芳經(jīng)(2,4-DMTDBACA)(產(chǎn)率80%)。[255]'HNMR(300MHz，CDC13);10.14(s，4H，ArOH)，7.287.12(m，24H,ArH),6.03(s,8H,ArH),4.24(s,16H,ArNCH2)，4.1l(d,4H,ArCH2Ar，13Hz)，3.10(d,4H，ArCH2Ar,13Hz),2.43(s,12H,ArCH3),2.28(s,12H，ArCH3)網(wǎng)[257]實(shí)施例14[258]5,11，17,23-四(2，4-二甲基)苯曱亞胺-杯[4]芳烴的合成[259][反應(yīng)式8][260]TACA2,4-DMICA[261]將TACA(lOOmg，0.2mmol)和磁條放入干燥的圓底燒瓶。向反應(yīng)容器添加15ml的乙腈并混合。添加2，4-二甲基苯甲醛(322mg,2.4mmol)后，在氮?dú)饨粨Q和室溫下混合2小時(shí)。反應(yīng)后，將混合物減壓過(guò)濾，并減壓去除溶劑。然后將反應(yīng)物溶解于適當(dāng)量的CH2C12中，然后添加15ml的正己烷以獲得淺棕色固體產(chǎn)物。將該產(chǎn)物再次溶解于3mlCH2Cl2中，并添加15ml的正己烷以獲得155mg的亮淺棕色固體產(chǎn)4勿5,11,17,23-四(2，4-二曱基)苯曱亞胺-杯、[4]芳烴(2，4-DMICA)(產(chǎn)率81%)。[262]'HNMR(300MHz，CDC13);10.19(s,4H，ArOH)，8.54(s，8HN=CH)，7.79(d,4H,ArH),7.02(s，4H，ArH),7.01(d,4H,ArH),6.96(s,8H，ArH)，4.30(d，4H，ArCH2Ar，13Hz)，3.6l(s，4H，ArCH2Ar，13Hz),2.43(s，12H，ArCH3)，2.30(s，12H，ArCH3)網(wǎng)[264]實(shí)施例15[265]5,11,17,23-四(2，4-二甲基)節(jié)氨基杯[4]芳烴的合成[266][反應(yīng)式9][267]2,4-DMCA2,4-TDMBACA[268]將2,4-DMICA(100mg，O.lmmol)和磁條放入干燥的圓底燒并瓦，并減壓干燥。然后添加20ml的無(wú)水THF并在氮?dú)饨粨Q下混合。IO分鐘后，添加溶液1.0MBH3/THF溶液(0.8ml，0.8mmo1),然后使混合物在室溫下反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)后，減壓去除溶劑，并將殘留在燒瓶中的產(chǎn)物溶解在CH2C12中。再以0.1MHC1溶液洗滌兩次后，以蒸餾水洗滌兩次。將有機(jī)層分離并干燥，減壓過(guò)濾并減壓去除濾過(guò)溶液。然后以CH2Cl2/己烷重結(jié)晶以獲得72mg的淺黃色固體產(chǎn)物5，11,17,23-四(2，4-二曱基)千氨基杯[4]芳烴(2,4-TDMBACA)(產(chǎn)率75%)。[269〗NMR(300MHz,CDC13);9.86(s，4H，ArOH)，7.33-7.18(m，12H,ArH),6.21(s，8H,ArH),4.21-4.09(m，16H,ArCH2Ar,ArNHCH2),3.58(s,4H,NH)，3.22(d,4H,ArCH2Ar),2.43(s,12H,ArCH3),2.28(s，12H,ArCH3)[270][271]實(shí)施例16[272]5,11,17,23-四(2,4-二曱基四千基)芐氨基杯[4]芳烴的合成[273][反應(yīng)式10][274]2,4-TDMBACATB(2,4-DMTB)ACA[275;H夸f茲才奉和2,4-TDMBACA(500mg,0.5mmol)以及》與4匕鈉(8Omg，0.5mmol)^:入干燥的圓底燒并瓦中，并減壓干燥。干燥后力口入50ml的無(wú)水乙腈，然后將其在加熱器中氮?dú)饨粨Q下混合。5分鐘后，向反應(yīng)容器添加千基溴(l.lml,10mmol)并交換混合。向反應(yīng)容器加入吡啶(0.8ml，lOmmol)，并反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)后，使反應(yīng)容器冷卻至室溫，然后減壓去除溶劑。然后將其溶解于60ml的CH2Cl2中并以水洗、滌，然后干燥有才幾層并減壓過(guò)濾。然后減壓去除濾過(guò)卩容液，并以CH2Cl2/MeOH重結(jié)晶以獲4尋521mg的淺灰色固體產(chǎn)物5，11，17，23-四(2，4-二甲基四芳基)爺氨基-杯[4]芳烴(TB(2,4誦DMTB)ACA)(產(chǎn)率79%)。[276]!HNMR(300MHz,CDC13)10.01(s,4H,ArOH),7.35-7.10(m,34H,ArH)，6.20-6.06(br,8H，ArH),4.31-4.01(m,16H,ArCH2Ar,ArNHCH2),3.14(d,4H,ArCH2Ar)，2.45(s,12H,ArCH3),2.27(s,12H,ArCH3)[277][278]實(shí)施例17[279]5，11，17，23-四(2,4-二甲基)二千氨基杯[4]-芳烴-1,3-己醛的合成[280][反應(yīng)式11][281][282]依次將》茲才奉和2,4-DMTDBACA(500mg,0.35mmol)，K2C03(487mg,3.5mmol)，石與化鈉(473mg,3.15mmol)方欠入干燥的圓底燒瓶中，然后在氮?dú)饨粨Q下向反應(yīng)容器添加130ml的無(wú)水乙腈，并在加熱器中混合。添加6-溴己醛(376mg，2.1mmol)后，交換混合16小時(shí)。反應(yīng)后，將反應(yīng)物冷卻至室溫，并減壓去除溶劑。將反應(yīng)物溶解于130ml的CH2Cl2后，將其減壓過(guò)濾并減壓去除濾過(guò)溶液。然后用MeOH/CH2Cl2重結(jié)晶以荻得432mg的淺黃色固體產(chǎn)物5,11,17,23-四(2，4-二曱基)二芐氨基杯[4]-芳烴-1,3-己醛(2,4-DMTDBACAHA)(產(chǎn)率76%)。[283]'HNMR(300MHz,CDC13);9.78(s,2H,CHO),7.317.04(m12H,ArH),6.11-6.02(br，8H,ArH)，4.41-4.13(m,20H,ArNCH2,ArCH2Ar),3.89(t,4H,OCH2)，3.05(d,4H,ArCH2Ar,13Hz),2.57-2.49(t,4H,CHOCH2)，2.45-2.39(m,12H，ArCH3),2.31-2.25(m,12H,ArCH3),2.12-1.98(t，OCH2CH2)，1.78-1.62(m,8H,CH2CH2)[284][285]實(shí)施例18[286]5,11,17,23-四(2,4-二曱基四芐基)芐氨基溴-丁氧基杯[4]芳烴的合成[287][反應(yīng)式12][288]2,4-TDMBACATB(2,4-DMTB)ABCA[289]將2，4-TDMBACA(500mg,0.5mmol)和無(wú)水K2C03(619mg，5.Ommol)以及石與4匕鈉(674mg,4.5mmo1)》欠入干燥圓底燒弁瓦。向反應(yīng)容器加入160ml的無(wú)水乙腈并在室溫下混合15分鐘。向反應(yīng)容器加入1，4-二溴丁烷(1.03g，0.6ml，5.0mmol)并交換混合20小時(shí)。反應(yīng)容器冷卻至室溫后，將溶劑減壓去除。然后將其溶于CH2Cl2中并減壓過(guò)濾。減壓去除濾過(guò)溶液，在EA/己;t克中重結(jié)晶。然后減壓過(guò)濾以獲得610mg的淡棕色固體產(chǎn)物，5,11,17，23-四(2，4-二甲基四千基)芐氨基溴丁氧基杯[4]芳烴(TB(2,4-DMTB)ABCA)(產(chǎn)率77%)。[290]'HNMR(300MHz,CDC13);7.81(s,2H,ArOH),7.297.04(m，34H，ArH)，6.06-6.02(d,8H,ArH)，4.38-4.11(m，20H,ArNCH2，ArCH2Ar),3.89(t，4H,OCH2)，3.04(d,4H,ArCH2Ar,13Hz),2.46-2.43(m,12H，ArCH3),2.41-2.40(m,12H，ArCH3)2.31-2.27(t，4HBrCH2)，2.16-2.06(m，8H，CH2CH2)[291][292]實(shí)施例19[293]5，11，l入23-四(2，4-二甲基四節(jié)基)爺氨基巰基-丁氧基杯[4]芳烴的合成[294][反應(yīng)式13][295]TB(2,4-DMTB)ABCATB(2,4-DMTB)AMBCA[296]將TB(2，4畫DMTB)ABCA(500mg，0.31mmol)和石危代乙酸鐘(212mg,1.86mmol)放入干燥圓底燒瓶中。然后在其中溶解60ml的無(wú)水丙酮并在室溫和氮?dú)饨?奐下聲波反應(yīng)90分4中。反應(yīng)后，減壓去除溶劑，并以30ml的CH2Cl2溶解。減壓過(guò)濾后，將濾過(guò)溶液以水洗滌兩次并分離和干燥有4幾層。將有才幾層減壓過(guò)濾并將濾過(guò)〉容液減壓干燥后得到的固體用乙酸乙酯/正己烷重結(jié)晶，并減壓過(guò)濾獲得淺黃色固體晶體。將所得的固體晶體放入圓底燒瓶并溶解于CH2C12:曱醇=5:1的混合溶液中，在室溫和氮?dú)饨粨Q下聲波反應(yīng)。1分鐘后，加入1.0MKOH(1.5ml,1.5mmo1),聲波反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)后，減壓去除溶劑，溶解于CH2Cl2并以0.1MHC1溶液洗滌.有機(jī)層分離后，卩夸其干纟喿并減壓過(guò)濾。減壓去除濾過(guò)溶液的〉容劑。以CH2C12/MeOH重結(jié)晶后，可獲得320mg的淺黃色5,11，17，23-四(2,4-曱氧基)芐氨基巰基丁氧基杯[4]芳烴(TB(2,4-DMTB)AMBCA)(產(chǎn)率73%)。[297]'HNMR(300MHz,CDC13);7.84(s，2H,ArOH),7.297.01(m,34H,ArH)，6.25-6.19(br,8H，ArH),4.36-4.1l(m,20H，ArNCH2,ArCH2Ar),3.90(t,4H,OCH2),3.05(d,4H,ArCH2Ar,13Hz),2.30(t,4H，SHCH2),2.45-2.39(m,12H,ArCH3),2.31-2.25(m,12H,ArCH3)2.05-2.02(m,CH2CH2)[298][299]實(shí)施例20[300]圖8所示的氨基杯芳烴衍生物單層的制備[301]將實(shí)施例17中合成得到的2，4-DMTDBACAHA溶解于如CHCl3等有機(jī)溶劑中制備濃度為0.1-5mM:的溶液。如圖8所示，將連接了胺功能基團(tuán)的玻片(胺芯片)放入制備得到的溶液1-24小時(shí)并取出，分別以氯仿，丙酮和水洗滌并干燥。然后制備得到圖8的氨基杯芳烴衍生物單層(A型BMT^氐聚DNA芯片)。在將上述A型放入含BH3-THF或NaBH4的MeOH還原劑中1-10分鐘后，用水(去離子水)洗滌三次，在氮?dú)夥諊星г镆灾苽鋵?shí)施例8的氨基杯芳烴衍生物單層(B型BMT低聚DNA芯片)。[302][303]實(shí)施例21[304]圖9所示的金基底上氨基杯芳烴衍生物單層的制備[305]將實(shí)施例19中合成得到的TB(2,4-DMTB)AMBCA溶解于如CHCl3等有機(jī)溶劑中制備濃度為0.1-5mM的〉容液。如圖9所示，將金基底》史入制備得到的溶液中l(wèi)-24小時(shí)并耳又出，分別以氯仿，丙酮和水洗滌并干燥。然后制備得到圖9所示的氨基杯芳烴衍生物單層。其它的氨基杯芳烴衍生物單層參照相同的方法制備。所述金基底可以各種形式使用，但一般而言，優(yōu)選在玻璃，熔融硅，石圭晶片，塑^+基底等在真空4度以2-10nm的4各(Cr)或4太(Ti)等物質(zhì)后以50-200nm的厚度真空鍍金的基底。將所制備的金基底在即將使用前置于食人魚溶液(強(qiáng)硫酸:30%過(guò)氧化氬=3:1的混合溶液)中約10秒鐘-l分鐘，然后以水洗滌并在氮?dú)饨粨Q下干燥，并立即使用。所述單層的形成可通過(guò)紅外線外部反射光譜(FTIR-ERS)分析。[306][307]實(shí)施例22-25所用的溶液，低聚DNA,帶熒光的低聚DNA,以及c-DNA石威基序歹'J[308]表3實(shí)施例22-25所用的〉容-液BMT點(diǎn)樣溶液14XSSC，15%丙三醇，1XPBSBMT點(diǎn)樣溶液2600mMNH4Cl,15%丙三醇，1XPBSBMT點(diǎn)樣溶液3500mMKCl，15%丙三醇，1XPBSBMTWa-A-l2XSSC,0.1%SDSBMTWa-A-20.1XsscBMT封閉溶液5%牛奶酪蛋白溶液BMThyb-mixA4XSSC，0.002%SDS,15%丙三醇，1XPBSBMTWa-B-14XSSC，0.1%SDSBMTWa-B-24XSSC[309][310]表4最佳堿基數(shù)序列備注5-GAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.13)探針4G5-GGGGAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEqIDNO.14)7G5-GGGGGGGAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.15)9G5-GGGGGGGGGAAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQ[DNO.16)12G5-GGGGGGGGGGOGAAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.17)5-GGGGGGGGGGGGGGGAAATCAACCCACAGCTGCA鄰EQIDNO.18)Cy3-DMA5'-ey3-GTGCAGCTGTGGGTTGATT-3'(SEQIDNO.19)標(biāo)的67即][312沐5用于試-驗(yàn)的SNP序列備注SNP-A5'-GGGGGGGGGTTTACATAGCAT^TCGAGGTGGG-3'(SEQIDNO.24)探針SNP-T5-GGGGGGGGGTTTACATAGCAT工TCGAGGTGGG-3'(SEQIDNO.25)SNP-G5-GGGGGGGGGTTTACATAGCAT￡TCGAGGTGGG-3'(SEQIDNO.26)SNP-C5-GGGGGGGGGTTTACATAGCAT￡TCGAGGTGGG-3'(SEQIDNO.27)CN-A5-AATCAACCCACAGCTGAAAAAACCCACCTCGAAATGCTATGTGGAC-3'(SEQIDNO.28)檢查熒光的標(biāo)的CN-T5-AATCAACCCACAGCTGAAAAAACCCACCTCGAIATGCTATGTGGAC-3'(SEQIDNO.29)CN-G5'-AATCAACCCACAGCTGAAAAAACCCACCTCGAGATGCTATGTGGAC-3'(卿IDNO.30)C:N-C5'-AATCAACCCACAGCTGAAAAAACCCACCTCGA￡ATGCTATGTGGAC-3'(SEQIDNO.31)Cy3掘A5'-cy3-GTGCAGCTGTGGGTTGATT-3'(SEQIDNO.19)標(biāo)的[313][314]表6用于竟?fàn)幮苑磻?yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>[35][316]表7用于最大密度試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>用于竟?fàn)幮苑磻?yīng)的溶液的組成(ul)<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>[319][320]實(shí)施例22[321]測(cè)定通過(guò)多分子識(shí)別不可逆固定在圖12的氨基杯芳烴衍生物單層的最佳鳥。票呤堿基數(shù)量[322]-低聚DNA通過(guò)多分子識(shí)別在氨基杯芳烴衍生物單層上的固定[323]用于測(cè)定通過(guò)多分子識(shí)別在氨基杯芳烴衍生物單層上固定的鳥噤p令數(shù)量的樣品溶液及濃度組成等如表3所示。首先，將10ul分別具有下文表4的1G,4G,7G,9G，12G,15G等連續(xù)鳥嘌p令石威基的各低聚DNA(100pmol/ul)和148ulBMT點(diǎn)樣溶液3的混合溶液使用樣l陣列(GenetixQarray2)以l-5nL的量將溶液涂覆在用以固定低聚DNA的氨基杯芳烴衍生物單層上從而以150-180um的直徑于室溫下將其在固定室中分別固定1小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)。固定后，為取出殘留低聚DNA,以BMTWa-A-l(2xSSC，0.1%SDS)在室溫下洗滌氨基杯芳烴書f生物單層1分鐘，然后以BMTWa-A-2(O.lxSSC)洗滌，并以BMT封閉溶液(5%牛奶酪蛋白溶液)在室溫下封閉30分鐘。以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)在室溫下洗滌處理后的氨基杯芳烴衍生物單層3分鐘，然后以BMTWa-A-2(O.IXSSC)的洗并瓦洗滌并干燥。-與帶有焚光的DNA(Cy3-DNA)進(jìn)行雜交為了與帶有熒光的Cy3-DNA進(jìn)4亍雜交，將雜交室連4妻至固定了低聚DNA并干燥后的氨基杯芳烴衍生物單層。然后，將2ul表4指定的Cy3-DNA(5nmol/ml)與58ul的BMThyb-mixA(4xSSC,0.002%SDS，50%丙三醇，lxPBS)混合并在100。C的水中力口熱3分鐘。將其在冰上放置3分鐘，以微量移液管涂覆60ul，然后在50。C的恒溫恒濕培養(yǎng)器中雜交30分鐘。雜交后，為清潔氨基杯芳烴衍生物單層，以BMTWa-B匿l(4xSSC,0.1%SDS)在30。C下洗滌2分鐘。然后，在室溫下兩次以BMTWa-B-2(4xSSC)洗滌2分鐘并使用熒光掃描儀(GSILumonics,美國(guó))分析焚光靈敏度。實(shí)際結(jié)果顯示于圖12。所述結(jié)果顯示當(dāng)4氐聚DNA通過(guò)多分子識(shí)別被固定在氨基杯芳烴衍生物單層上時(shí)至少要求7個(gè)鳥噪。令石成基，且在使用9個(gè)鳥嘌呤石咸基時(shí)以最大密度固定。實(shí)施例23通過(guò)圖14和圖15的最佳空間布局確定單核苷多態(tài)性(SNP;SingleNucleotidePolymorphism)鑒另'J的i式馬全-在氨基杯芳烴書f生物單層上確定SNP[331]在用于固定低聚DNA的氨基杯芳烴衍生物單層上確定SNP的試驗(yàn)可通過(guò)先使用孩i陣歹'J(GenetixQarray2)將9.lul的<又相同位點(diǎn)的一個(gè)堿基;f皮此不同的表6的低聚DNAs(100pmol/ul)與35.9ul的:BMT點(diǎn)樣溶液1的混合溶液以150-180um的厚度和l-5nl的量進(jìn)^亍:余布，然后在室溫下于固定室中固定3小時(shí)。固定后，為耳又出殘留寸氐聚DNA,以BMTWa-A-l(2xSSC,0.1%SDS)在室溫下洗滌氨基杯芳烴書f生物單層1分鐘，然后以BMTWa-A-2(O.lxSSC)洗滌，并以:BMT封閉;容液(5%牛奶酪蛋白溶液)在室溫下封閉30分鐘。以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)在室溫下洗滌處理后的氨基杯芳烴衍生物單層3分鐘，然后以BMTWa-A-2(O.IXSSC)的洗瓶洗滌并干燥。-與C-DNA雜交以一企測(cè)帶有熒光的DNA(Cy3-DNA)為進(jìn)行雜交，在雜交室連接至單層后，將2ul表6中指定的各C-DNA(5nmol/ul)與28ul的BMThyb-mixA(4xSSC,0.002%SDS,50%丙三酉孚，lx:PBS)-混合并在100。C7K中力口熱。在,水上》丈置3分鐘并冷卻，然后使用孩i量移液管涂^隻30ul，在55。C恒溫培養(yǎng)器中雜交30分鐘。雜交后，為清潔氨基杯芳烴衍生物單層，以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)在30。C下洗滌2分鐘，然后兩次以BMTWa-B-2(4xSSC)在室溫下洗滌2分鐘。然后干燥并制備得到能夠與帶熒光DNA(Cy3-DNA)雜交的低聚DNA單層。-C-DNA與帶有熒光的Cy3-DNA的雜交[337]為進(jìn)行帶熒光的Cy3-DNA與以C-DNA完成雜交的單層的雜交，首先，連4妄雜交室，然后將2ul表6的Cy3-DNA(5nmol/ml)與28ul的BMThyb國(guó)mixA(4xSSC，0.002%SDS，50%丙三醇，lxPBS)混合并在IO(TC水中加熱3分鐘。在冰上》t置3分鐘并干燥后，4吏用孩t量移液管涂覆30ul，然后在45。C下于恒濕培養(yǎng)器中雜交30分鐘。雜交后，為清潔氨基杯芳烴書f生物單層，以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)在30。C下洗滌2分鐘，然后兩次以BMTWa-B-2(4xSSC)在室溫下洗滌2分鐘并干燥。然后使用焚光掃描儀(GSILumonics,美國(guó))通過(guò)焚光靈4丈度確i人SNP鑒別。該結(jié)果顯示于圖14和15。該結(jié)果顯示在具有不同石咸基的4氐聚dna#:固定的4立點(diǎn)上其^也DNAs未在雜交中結(jié)合。因此，該結(jié)果顯示如本發(fā)明所述的^支術(shù)可通過(guò)在被固定的低聚DNA之間設(shè)置適當(dāng)?shù)目臻g，從而通過(guò)該低聚DNAs之間的最佳空間布局來(lái)實(shí)現(xiàn)快速精確的SNP鑒別。實(shí)施例24圖10和11的高密度固定試^瞼[341]-低聚DNA固定在氨基杯芳烴書f生物單層上固定^f氐聚DNA的方法可通過(guò)使用微陣列(GenetixQarray2)在用于固定低聚DNA的氨基杯芳烴衍生物單層上以l-5nl的量涂覆9.1ul表7的低聚DNA(100pmol/ul)和35.9ul的MBT點(diǎn)樣溶液1的混合溶液，然后在室溫下將其固定在固定室3小時(shí)。固定后，為取出殘留低聚DNA,以BMTWa-A-l(2xSSC,0.1%SDS)在室溫下洗滌氨基杯芳烴4汙生物單層1分鐘，然后以BMTWa-A-2(O.lxSSC)洗滌，并以BMT去于閉溶'液(5%牛奶酪蛋白溶液)在室溫下封閉30分鐘。以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)在室溫下洗滌處理后的氨基杯芳烴衍生物單層3分鐘，然后以BMTWa-A-2(O.IXSSC)的洗瓶洗滌并干燥。-與帶有熒光的Cy3-DNA進(jìn)行雜交為與帶熒光的Cy3-DNA進(jìn)行雜交，首先，連接雜交室，然后將2ul表7的Cy3-DNA(5nmol/ml)與28ul的BMThyb-mixA(4xSSC，0.002%SDS，50%丙三醇，lxPBS)〉、昆合后在100。C7jc中加熱并放置于冰上冷卻。然后，使用孩i量移液管涂覆30ul，并在50。C培養(yǎng)器中雜交30分鐘。雜交后，為清潔氨基杯芳烴衍生物單層，以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)在30。C下洗滌2分鐘，然后兩次以BMTWa-B-2(4xSSC)在室溫下洗滌2分鐘并干燥。然后使用熒光掃描儀將熒光靈敏度與理論熒光靈敏度進(jìn)行比較和分析。-在芯片基底上干燥一定量的帶熒光c-DNA,并將其與理論最大值進(jìn)行比較和分析通過(guò)孩爻陣歹'J(GenetixQarray2)將表7的帶熒光c-DNA以l-5nl，1/2的理論最大值(0.675fmol/nl)涂覆至氨基杯芳烴亞生物并干燥后，使用熒光掃描儀進(jìn)行分析。理論熒光靈敏度和試驗(yàn)熒光靈壽文度比較的結(jié)果顯示于圖10和11中，使用理論最大值一半水平的帶熒光Cy3-DNA的結(jié)果看來(lái)與通過(guò)雜交固定的^f氐聚DNA所示的結(jié)果相同。因此，該結(jié)果顯示接近理論最大值的低聚DNA得到固定。實(shí)施例25[351]通過(guò)與圖16的9A,9T，9G,9C-DNA的竟?fàn)幮苑磻?yīng)對(duì)^又9個(gè)鳥噤呤堿基的不可逆固定的確認(rèn)試驗(yàn)用于竟?fàn)幮苑磻?yīng)的低聚DNA可采用表7所示的成分進(jìn)行制備。jt匕時(shí)，用于竟?fàn)?性反應(yīng)的不同DNAs凈皮列入表8且以0#，1倍，2倍和4倍的濃度進(jìn)行制備。可通過(guò)使用微量移液管將lu〗的分別通過(guò)表7所示方法制備的各低聚DNA混合溶液分別點(diǎn)在厚度2mm的氨基杯芳烴書t生物單層上并在室溫下于固定室中固定1小時(shí)使低聚DNA得到固定。固定后，為取出殘留低聚DNA,以BMTWa-A-l(2xSSC,0.1%SDS)在室溫下洗滌氨基杯芳烴衍生物單層1分鐘，然后以BMTWa-A-2(O.lxSSC)洗滌，并以BMT封閉溶液(5%牛奶酪蛋白溶液)在室溫下封閉30分鐘。以BMTWa-B畫1(4xSSC,0.1%SDS)在室溫下洗滌處理后的氨基杯芳烴々t生物單層3分鐘，然后以BMTWa-A-2(O.IXSSC)的洗并瓦洗滌并干燥。-與帶有熒光的Cy3-DNA進(jìn)4亍雜交[355]為與帶熒光的Cy3-DNA進(jìn)行雜交，首先，連接雜交室，(4xSSC,0.002%SDS,50%丙三醇，lxPBS)混合后使用微量移液管涂覆600ul，然后在50。C培養(yǎng)器中雜交30分鐘。雜交后，為清潔氨基杯芳烴衍生物單層，以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)在30。C下洗滌2分鐘，然后兩次以BMTWa-B-2(4xSSC)在室溫下洗滌2分鐘并千燥。然后使用熒光掃描儀(GSI)確認(rèn)熒光靈敏度。所述結(jié)果顯示于圖16中。該結(jié)果顯示4又9個(gè)鳥嘌p令通過(guò)多分子識(shí)別一皮不可逆固定而其它堿基不論是否連續(xù)均不會(huì)對(duì)固定產(chǎn)生較大影響。該結(jié)果作為實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果顯示了能獲得可復(fù)制雜交結(jié)果的低聚DNA芯片的制備才支術(shù)，其中用于雜交的;烕基不參與固定且僅連續(xù)特定石成基序列參與固定，從而始終維持雜交必需的堿基數(shù)量。工業(yè)適用性本發(fā)明解決了通過(guò)高i"介^f氐聚DNA與連接了傳統(tǒng)化學(xué)結(jié)合法中常用的胺功能基團(tuán)的醛玻片(醛芯片基底)之間的化學(xué)反應(yīng)而在醛芯片基底上固定低聚DNA以制備低聚DNA芯片時(shí)產(chǎn)生的許多問(wèn)題，從而使任何人均能輕易地制備低聚DNA芯片。使用連接了高價(jià)功能基團(tuán)的低聚DNA制備低聚DNA芯片時(shí)在固定步驟中很難荻得再現(xiàn)性，因此研發(fā)的周期很長(zhǎng)，且這一點(diǎn)阻止了"i午多生物產(chǎn)品乂人研發(fā)4爭(zhēng)向商業(yè)^:。it匕夕卜，通過(guò)測(cè)i式成百上千種低聚DNA堿基序列選擇可帶來(lái)最佳雜交結(jié)果的低聚DNA時(shí)，由于研發(fā)經(jīng)費(fèi)的負(fù)擔(dān)曾放棄了許多開發(fā)中的產(chǎn)品。如圖3所示，由于本發(fā)明中的連續(xù)鳥嘌呤石成基通過(guò)多分子識(shí)別固定在亞胺杯芳烴衍生物單層(BMT亞胺芯片)上，在相同條件下固定的低聚DNA的密度始終一致，從而顯示了極高的再現(xiàn)性。此外，在圖3中，通過(guò)將連續(xù)鳥。票呤石咸基固定在基底表面所形成的空間，應(yīng)當(dāng)與基底表面結(jié)合的c-DNA可通過(guò)自由進(jìn)入而與被固定的低聚DNA之間進(jìn)行雜交。相應(yīng)的，它對(duì)于密集固定了低聚DNA的傳統(tǒng)j氐聚DNA芯片的優(yōu)勢(shì)在干可G行雜交，從而支持快速診斷。通過(guò)分子識(shí)別固定的低聚DNA通過(guò)多分子識(shí)別在::容'液中^皮固定至BMT亞胺芯片，因此可^f吏用^氐聚DNA制備高密度固定低聚DNA芯片，即使該低聚DNA的密度為常規(guī)^K平的1/3-1/10。此外，在本發(fā)明中約需要2-4小時(shí)固定低聚DNA,然后進(jìn)行洗滌和干燥。因此，它可使低聚DNA芯片的制備變得簡(jiǎn)便和快速。特別地，在圖4和6中，低聚:DNA被通過(guò)9個(gè)連續(xù)鳥噪p令石咸基的多分子識(shí)別不可逆固定在亞胺杯芳烴書f生物自組裝單層上，且雜交的熒光分析結(jié)果顯示固定低聚DNA的固定密度為傳統(tǒng)方法的5至304咅。因此，本發(fā)明可比通過(guò)傳統(tǒng)低聚DNA固定制備低聚DNA芯片的技術(shù)以更快的速度制備低聚DNA芯片，且可以通過(guò)高再現(xiàn)水平降j氐;開發(fā)成本。此外，它是一種可以傳統(tǒng)制備方法1/3-1/5的成本制備產(chǎn)品的劃時(shí)^C的新型4支術(shù)。相應(yīng)地，隨后它可應(yīng)用于各種基于本發(fā)明的DNA芯片制備中。此外，作為本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明是一種能夠解決現(xiàn)有的DNA芯片制備技術(shù)中所呈現(xiàn)的各種問(wèn)題(例如，根據(jù)傳統(tǒng)技術(shù)無(wú)法進(jìn)ff高速雜交；無(wú)法確Y呆-〖t斷單沖亥苷多態(tài)性(SNP)的4支術(shù)；由于難以維」持如A,C，G等三個(gè)石咸基中的胺功能基團(tuán)與醛芯片基底的醛功能基團(tuán)之間進(jìn)行的化學(xué)鍵合所顯示的雜交結(jié)果，難以獲得DNA芯片的再現(xiàn)性；難以形成^氐聚DNA均一固定在制備芯片上的均勻密度固定)的新型技術(shù)。[365]本發(fā)明提供了一種能夠不可逆分子識(shí)別連續(xù)鳥噪呤基團(tuán)的氨基杯芳烴衍生物，以其自組裝單層形式制備的低聚DNA芯片基底的技術(shù)，通過(guò)在芯片基底表面的自發(fā)分子識(shí)別不可逆固定低聚DNA制備的低聚DNA芯片及其制備技術(shù)。如所述實(shí)施例和附圖所示，該固定4支術(shù)可自動(dòng)地適當(dāng)?shù)卦谑袒g維持與連續(xù)石威基4皮不可逆固定在底部時(shí)該堿基被排列所占據(jù)的空間相當(dāng)?shù)目臻g。該空間為足以使c-DNA在雜交過(guò)程中自由進(jìn)入芯片基底底部的空間，因此可高速進(jìn)行雜交。與此同時(shí)，雜交時(shí)該用于結(jié)合石威基的堿基數(shù)量可始終維持在最大值；因此，這是一種可通過(guò)高度特異性的雜交在開-關(guān)水平上確認(rèn)單獨(dú)》威基區(qū)別的新型技術(shù)。此外，本發(fā)明提供了一種具有最大密度水平同時(shí)維持適當(dāng)空間水平的固定低聚DNA單層，其中各類低聚DNA不經(jīng)任何處理被連接至固體基底(例如具有胺功能基團(tuán)的玻璃基底(胺玻片)或是金基底(金薄膜或金))得到固定，也即是，亞胺衍生物提供了用于固定低聚DNA的作為單層生產(chǎn)的芯片基底(即，生產(chǎn)低聚DNA可再現(xiàn)的產(chǎn)品的〗氐聚DNA芯片所必需的基礎(chǔ)才支術(shù)。此外，才艮據(jù)本發(fā)明，低聚DNA可通過(guò)一種新型#支術(shù)(即，多分子識(shí)別)在水溶液中無(wú)空余空間的狀態(tài)下固定。最大量的4氐聚DNAs因此得到固定，即，本發(fā)明是一種可使低聚DNAs自發(fā)組裝從而在可進(jìn)行高速雜交同時(shí)以最大密度固定低聚DNAs的新型技術(shù)。因此，本發(fā)明提供了一種具有最高靈敏度水平從而可通過(guò)在低濃度下識(shí)別c-DNA進(jìn)行診斷的低聚DNA芯片的生產(chǎn)技術(shù)。同時(shí)，由于低聚DNA始終以最大密度固定，它提供了將低聚DNA芯片制備為產(chǎn)品所必需的具有再現(xiàn)性的低聚DNA芯片的生產(chǎn)技術(shù)。常規(guī)使用的芯片基底可通過(guò)帶有高價(jià)反應(yīng)器的低聚DNA生產(chǎn)，且難以在固定低聚DNA的階段獲得生產(chǎn)率。因此，該研發(fā)的周期4艮長(zhǎng)，此外，這成為該研發(fā)無(wú)法進(jìn)行至生產(chǎn)階l爻的原因。通過(guò)采用能4吏生產(chǎn)更便捷的本發(fā)明的識(shí)別分子技術(shù)，并通過(guò)驗(yàn)證成百上千的低聚DNA堿基序列，可選4奪能帶來(lái)最大雜交結(jié)果的低聚DNA以降低低聚DNA芯片開發(fā)中的研發(fā)負(fù)擔(dān)。此外，本發(fā)明4是供了一種通過(guò)獲取生產(chǎn)率可以快速即時(shí)推出最佳低聚DNA芯片的新型技術(shù)。如果采用本發(fā)明提供的生產(chǎn)芯片的基礎(chǔ)技術(shù)，可進(jìn)行各種基因芯片的快速生產(chǎn)和商品4匕。此夕卜，本發(fā)明可以通過(guò)使用僅為表面固定低聚DNAs量的3至5倍的^氐聚DNAs，通過(guò)分子識(shí)別固定4氐聚DNAs乂人而生產(chǎn)高密度低聚DNA芯片。因此，本發(fā)明使僅用傳統(tǒng)低聚DNA芯片生產(chǎn)1/10-1/100的成本生產(chǎn)低聚DNAs成為可能，從而節(jié)省了大量的生產(chǎn)成本。理吸附的傳統(tǒng)低聚DNA固定方法，它是一種通過(guò)分子識(shí)別定義(即，多分子識(shí)別)使用連續(xù)鳥嘌呤石成基在固體基底上不可逆固定低聚DNA的新型方法。權(quán)利要求1.一種具有以下式1的亞胺杯芳烴衍生物[式1](其中R1，R2，R3和R4獨(dú)立選自組合-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，-OCH3，-Cl，-C6H5和-COOR，并且在所述-COOR中，R代表-CH3或-C2H5)。3.一種具有以下式2的亞胺杯、芳烴書f生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>[式2](其中R,,R2,R3和R4獨(dú)立選自組合-H,-CH3,-C2H5，-C3H7,-OCH3，-Cl，-0515和-€:0011,其中R代表-CH3或-C2H5，并且所述的Y,,Y2，Y3和Y4獨(dú)立選自組合-H,-(CH2)n-CH=0,-(CH2)n-SH,-(CH2CH20)m—CH2CH2-CH=0,-(CH2CH20)m-CH2CH2-SH，-(092)111畫(36114國(guó)(0^2)(;-2和隱0:0-((^只2)01.1-061^4-(CH2)C-Z(其中n=2-15,m=1-10,c=0-10,Z=-SH，-CHO，-COOH或-NH2))。一種由下列式3的5,11,17,23-四氨基杯[4]芳烴和下列式4的芳香醛反應(yīng)制備如權(quán)利要求1所述的亞胺杯芳烴衍生物的方法<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(其中R選自組合-H,-CH3,-C2H5，-C3H7,-OCH3，-Cl，-C6H5和畫COOR',其中R'代表一CH3或—C2H5)。4.一種通過(guò)如權(quán)利要求1所述的亞胺杯芳烴衍生物與雙功能化合物反應(yīng)制備如權(quán)利要求2所述的亞胺杯芳烴衍生物的方法，其中所述的雙功能化合物選自組合X-(CH2)n-CH二O,X-(CH2)n-SH,X-(CH2CH20)m-CH2CH2-CH=0,X-(CH2CH20)m-CH2CH2-SH,X-(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z以及X畫CO-(CH2)^-C6H4-(CH2)C-Z,其中n=2-15，m=l-10,c=0-10，X=-C1，-Br,-I或-OS02C6H4CH3,Z=-SH,-CHO,-COOH或-腿2。5.—種通過(guò)連接亞胺杯芳烴衍生物制備的自組裝單層固體基底，其中一種碌』事基團(tuán)^皮連接至金基底。6.—種通過(guò)亞胺鍵連接亞胺杯芳烴衍生物與選自玻璃、硅晶片和晶體的固體基底而制備得到的自組裝單層固體基底。7.—種通過(guò)選自酯，醚和酰胺《定的化學(xué)4建連接亞胺杯芳烴衍生物與選自玻璃，硅晶片和晶體的固體基底而制備得到的自組裝單層固體基底。8.—種通過(guò)固定低聚DNA制備得到的低聚DNA芯片，其中至少7個(gè)連續(xù)鳥。票呤堿基通過(guò)多分子識(shí)別被連接至如權(quán)利要求5-7任意一項(xiàng)所述的自組裝單層固體基底。9.一種通過(guò)固定低聚DNA制備低聚DNA芯片的方法，其中至少7個(gè)連續(xù)鳥嘌呤堿基通過(guò)多分子識(shí)別被連接至如權(quán)利要求5-74壬意一項(xiàng)所述的自組裝單層固體基底。10.如權(quán)利要求5-7任意一項(xiàng)所述的通過(guò)下列式3的5,11,17,23-四氨基杯[4]芳烴的亞胺衍生物制備的自組裝單層固體基底，其中氮^皮連4妻在杯、芳烴的5,11,17,234立上[式3]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>11.一種通過(guò)固定低聚DNA制備得到的低聚DNA芯片，其中至少7個(gè)連續(xù)鳥嘌呤-咸基通過(guò)多分子識(shí)別^皮連4妻至如—又利要求10所述的自組裝單層固體基底。12.—種通過(guò)固定低聚DNA制備低聚DNA芯片的方法，其中至少7個(gè)連續(xù)鳥噤呤堿基通過(guò)多分子識(shí)別—皮連接至如權(quán)利要求10所述的自組裝單層固體基底。13.—種具有以下式5的氨基杯芳烴布于生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(中Ri,R2，R3,1^4,R5,R^，R7,Rs,R，i,R'2，R'3，R'4，R，5,R，6，R'7，R'8獨(dú)立選自組合畫H,-CH3,-C2H5,-C3H7,-OCH3,-Cl，-C6H5，-OH，-OCH2CH3,-Br,-CF3，-OCH2C6H5,-OC6H5,-OC6H4CH3,-OC6H4C(CH3)3,-OC6H4CF3，-OC6H4Cl,-OCOCH3，-NHCOCH3,-CONHCH3,-CN,COOH和-COOR，其中Rft表一CH3或-C2H5)。14.一種具有以下式6的氨基杯芳烴書f生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>[式6]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(其中R1,R2,R3,R4,R5,R6，R7，R8,R'1，R'2，R'3,R'4，R's,R'6，R'7,R'8獨(dú)立選自組合畫H，-CH3，-C2H5,-C3H7,-OCH3,-CI,-C6H5，-OH,-OCH2CH3,-Br,-CF3,-OCH2C6H5,-OC6H5,-OC6H4CH3,-OG6H4C(GH;03,-OG6H4GF3,-OG6H4Gl,-OCOCH3,-NHCOCH3,-CONHCH3,-CN,COOH，和-COOR,其中R^f義表一CH3或-C2H5，且所述Yt,Y2，Y3和丫4獨(dú)立選自組合-H,-(CH2)n-CH=0,-(CH2)n-SH,-(CH2CH20)m-CH2CH2-CH=0,-(CH2CH2。)m-CH2CH2-SH，-(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z，和-CO-(CH2)m-l-C6H4-(CH2)C-Z(其中n=2-15，m=1,10，c=0-10，Z=-SH,畫CHO,-COOH,-NH2,且-C6l"Lr和C6H5被定義為苯基基團(tuán)))。15.—種具有以下式7的氨基杯芳烴纟汙生物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>[式7](其中R,,R2,R3,R4，R5,R6,R7,R8,R、R'2,R'3，R'4，R's,R'6,R'7，R'8獨(dú)立選自組合-H,-CH3,-C2H5，-C3H7，-OCH3，-Cl，-C6H5,-OH,-OCH2CH3,-Br,-CF3，-OCH2C6H5,-OC6H5,-OC6H4CH3，-OG6H4C(GH3)3,-OG6H4CF3,-OG6H4Gl,-OCOCH3，-NHCOCH3,-CONHCH3，-CN，COOH和-COOR，其中R代表-CH3或—C2H5)。16.—種具有以下式8的氨基杯芳烴右f生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>[式8]、+2Y3Y4(其中R,，R2,R3，R4,R5,R6,R7，R8，R'i,R'2,R'3，R'4，R's,RV"R'7,R'8獨(dú)立選自組合-H，-CH3,-C2H5,-C3H7，-OCH3,-Cl，-C6H5,-OH,-OCH2CH3,-Br,-CF3,-OCH2C6H5,-OC6H5,-OC6H4CH3,-OC6H4C(CH3)3,-OC6H4CF3，-OC6H4Cl,-OCOCH3，-NHCOCH3，-CONHCH3，-CN,COOH,和-COOR,其中R4戈表—CH3或—C2H5,寸旦R!,R2,R3，R4,R5,R6,R7,R8,R'i,R'2,R'3,R'4,R's,R'6，R'7,R'8不同時(shí)為-H,且所述Y，，Y2,Y3和Y4獨(dú)立選自組合-H,-(CH2)n-CH=0,-(CH2)n-SH,-(CH2CH20)m-CH2CH2-CH=0,-(CH2CH20)m-CH2CH2-SH,-(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z,和-CO-(CH2)m--C6H4-(CH2)C-Z(其中n=2-15，m=1-10,c=0-10，Z=-SH,-CHO，-COOH,-NH2，且—06]^4-和C6H5^皮定義為苯基基團(tuán)))。17.—種通過(guò)連接氨基杯芳烴衍生物而制^^的自組裝單層固體基底，其中如權(quán)利要求14或16所述的氨基杯芳烴衍生物中的石克醇基團(tuán)被連接至金基底。18.—種通過(guò)將如權(quán)利要求14或16所述的氨基杯芳烴書f生物中的末端基團(tuán)連接一種醛功能基團(tuán)的氨基杯芳烴衍生物與選自玻璃，硅晶片和晶體的通過(guò)亞胺鍵和胺鍵連接了胺功能基團(tuán)的固體基底相連接而制備得到的自組裝單層固體基底。19.一種通過(guò)將如權(quán)利要求14或16所述的氨基杯芳烴衍生物中的末端基團(tuán)連4妄一種醛功能基團(tuán)的氨基杯芳烴衍生物與選自玻璃，硅晶片和晶體的通過(guò)選自酯，醚和酰胺4定的化學(xué)鍵連接了胺功能基團(tuán)的固體基底相連接而制備得到的自組裝單層固體基底。20.—種通過(guò)固定低聚DNA制備得到的低聚DNA芯片，其中至少7個(gè)連續(xù)鳥嘌呤堿基通過(guò)多分子識(shí)別被連接至如權(quán)利要求17-19任意一項(xiàng)所述的自組裝單層固體基底。21.—種通過(guò)固定低聚DNA制備低聚DNA芯片的方法，其中至少7個(gè)連續(xù)鳥嘌p令^成基通過(guò)多分子識(shí)別^皮連4妻至如—又利要求17-19任意一項(xiàng)所述的自組裝單層固體基底。22.如權(quán)利要求17-19任意一項(xiàng)所述的通過(guò)下列式9的5,11,17,23-23.—種通過(guò)固定低聚DNA制備得到的低聚DNA芯片，其中至少7個(gè)連續(xù)鳥嘌p令;成基通過(guò)多分子識(shí)別一皮連4妾至如纟又利要求22所述的自組裝單層固體基底。24.—種通過(guò)固定低聚DNA制備低聚DNA芯片的方法，其中至少7個(gè)連續(xù)鳥嘌呤石咸基通過(guò)多分子識(shí)別纟皮連接至如權(quán)利要求22所述的自組裝單層固體基底。四氨基杯[4]芳烴的胺衍生物制備的自組中氮被連接在杯芳烴的5,11,17,23-位上:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>[式9]全文摘要本發(fā)明涉及新型亞胺杯芳烴衍生物，其制備方法，以及由該方法制備的自組裝單層，使用該自組裝單層固定低聚DNA的方法，以及由該方法制備的低聚DNA芯片。此外，本發(fā)明涉及新型氨基杯芳烴衍生物，其制備方法，以及由該方法制備的自組裝單層，通過(guò)液相中所述自組裝單層上的分子識(shí)別自動(dòng)固定低聚DNA的低聚DNA固定方法，以及由該方法制備的低聚DNA芯片。文檔編號(hào)C07C251/24GK101309896SQ200680038071公開日2008年11月19日申請(qǐng)日期2006年5月11日優(yōu)先權(quán)日2005年10月13日發(fā)明者宋錦秀,金亨燮,金正勛,金泰善申請(qǐng)人:博美利克斯技術(shù)公司