專利名稱：生產(chǎn)修飾(多)肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)4務(wù)飾(多)肽的方法，所述方法包4舌以下
步驟在一種有才幾溶劑中，在一個或多個羧基上通過酯化或石克酯化， 和/或在N-端氨基酸的氨基上通過酰胺化或烷基化，對一種冠醚鍵 合(多)肽進行修飾。
背景技術(shù)：
在本i兌明書中，引用了許多文獻，包括專利申請和制造者手冊。 將這些文獻的公開全文結(jié)合于此以供參考，而不認(rèn)為其與本發(fā)明的 專利性有關(guān)。
在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，存在具有改良的藥理學(xué)特性的蛋白的需 要。為此目的，已將治療蛋白結(jié)合至各種聚合物從而，例如，降低 它們的免疫原性，提高對酶促降解的抗性或延長它們的半衰期。例 如，已表明聚乙二醇化一蛋白質(zhì)與聚乙二醇(PEG)的共價衍生作 用 一可提高許多治療相關(guān)蛋白的生物制藥特性與臨床特性。
歐洲專利申請EP 0 809 996描述了干擾素-a的一種聚乙二醇化 的衍生物。所描述的軛合物具有一個分支的PEG結(jié)構(gòu)。它是通過使 賴氨酸殘基的羰基(其依次攜帶與a-氨基和e-氨基連接的兩個PEG 分子)與干擾素-a的一個NH基或一個OH基軛合而獲得的。明確 地提及了賴氨酸以及絲氨酸作為蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點。Roberts等 (2002)提供了關(guān)于肽與蛋白質(zhì)聚乙二醇化的綜述。PEG與PEG衍生物在蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點是NH2以及較小范圍地是巰基。致力 于可逆的聚乙二醇化的部分提及了包4舌以PEG羧酸為中間產(chǎn)物的 西旨。然而，與蛋白質(zhì)的結(jié)合始終涉及氨基酸殘基的a-氨基和e-氨基。
本領(lǐng)域中已知的用聚合物書f生蛋白質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)常常產(chǎn)生永 久性4建合(permanent linkage )。例如，酰胺4匕與》克基^:通常為7lc久 性的。更進一步地，在一些情況下，復(fù)合衍生化(multiple derivatization,多重衍生化)會導(dǎo)致產(chǎn)生活性喪失。酰胺化的可逆 性只有當(dāng)氨基的保護基用于攜帶將與蛋白質(zhì)結(jié)合的分子時才可實 現(xiàn)(Tsubery等(2004 ))。
在藥物化學(xué)中，酯化作用已被用于獲得緩釋型藥物(例如緩釋 形式的可的*〉)并且親脂醇的酯化作用可用于實現(xiàn)增強的吸收(例 如，諸如匹氨西林和肽氨西林的盤尼西林酯)。在第一種情況下， 關(guān)鍵效果(key effect)是酯化藥物或前藥是無活性的?；钚孕问诫S 后通過酯的水解作用得到緩慢釋放。在第二種情況下，酯化作用的 相應(yīng)效果是去除羧酸鹽的電荷以及由酯的親脂醇部分產(chǎn)生的增強 的親脂性。然而，對可的^^和盤尼西林進行修飾所采用的方法不可
轉(zhuǎn)用于蛋白質(zhì)的修飾。
肽和蛋白質(zhì)的脂質(zhì)化被用于獲得改良的粘膜滲透(增強的吸收 與遞送)，從而提高生物藥效率并且在一些情況下產(chǎn)生增強的潛能 (Wang， J. et al"尸/za， L 19,609-14 (2002); Hartley, O. et al" PA^& 101， 16460-16465(2004))。然而，用標(biāo)準(zhǔn)方法進4亍的蛋白質(zhì)的 脂質(zhì)化通常是永久性的(不可逆的)且常常(當(dāng)產(chǎn)生酰胺4建或氨基 曱酸乙酯4建時)導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。此外脂質(zhì)通常難溶于水并且4艮難 使蛋白質(zhì)與脂質(zhì)以可再生和可控制方式功能化。
Yamada等(2002)描述了套索冠醚(或冠醚)用于細(xì)胞色素C 在甲醇中增溶的應(yīng)用。作者調(diào)研了冠醚的衍生對于細(xì)胞色素C增溶效率的影響。增溶的目的是提供溶解于有機溶劑中的細(xì)胞色素c， 值得注意的是作者旨在提供在有機溶劑中發(fā)揮作用的有效的生物
催化劑。Oshima等(2002)研究了作為生物聚合物的識別工具的 杯芳烴衍生物。他們調(diào)研了多種杯芳烴在富含賴氨酸蛋白的提取中 的選擇性。特定的杯芳烴用于細(xì)胞色素C的選擇性提取。描述了溶 解于氯仿中的細(xì)胞色素C表現(xiàn)出罕見的過氧化物酶活性。兩篇論文 都(i)探究了增溶劑的化學(xué)修飾對溶解效率的影響并且(ii)報道 了觀察到對于溶解蛋白的罕見的催化特性。Julian等(2001 )也描 述了通過冠醚而溶解于有機溶劑中的細(xì)胞色素C。使用ESI-MS提 供了表明4個18-冠-6分子與蛋白質(zhì)表面上暴露的賴氨酸側(cè)鏈強有 力地結(jié)合的數(shù)據(jù)。對于蛋白質(zhì)一旦被溶解就會發(fā)生衍生作用，在這 些出版物中既沒有進4亍設(shè)想也沒有給出建議。
Botti等(1996)描述了由較小的肽進行的肽的逐步合成，其中 冠醚用作保護基。作為成功實施他們的方法的必需要求，Botti等提 及了具有二,欠氮(secondary nitrogen )(例^口 Pro )或氮原子凈皮只又重 取代的(例如Fmoc-保護的氨基酸或肽)N-端殘基。此外，要保護 Asp和Glu的羧基功能。Botti等(1996 )的意圖是提供一種合成肽
相對的非共價保護基。
對于一種允許聚合物以可控制方式的安全結(jié)合(即，對蛋白質(zhì) 活性沒有不利影響)且另外產(chǎn)生一種在生物體內(nèi)完全可逆的4建合的 方法仍有未滿足的需求。由于現(xiàn)有技術(shù)中描述的方法的局限性，因 而本發(fā)明的根本技術(shù)問題是提供用于修飾蛋白質(zhì)藥理學(xué)特性的改 進的或可替代的手段與方法。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)4奮飾(多)肽的方法，所述方法包
括以下步驟在有機溶劑中，通過在一個或多個羧基上的酯化或硫 酯化，和/或通過在N-端氨基酸的氨基上的酰胺化或烷基化，對一 種冠醚結(jié)合(多)肽進^H資飾。
本文中用到的術(shù)語"(多)肽"描述的是包括由達到30個氨基 酸構(gòu)成的肽，以及由多于30個氨基酸構(gòu)成的多肽。其應(yīng)理解為包 括蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)片斷以及合成分子。其進一步包4舌抗體以及抗體 的片斷和書f生物。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"修飾(多)肽"涉及通過羧基的(硫)酯化 來衍生化和/或通過N-端氨基酸的氨基的酰胺化或烷基化來衍生 化。
術(shù)語"有^L溶劑"在本領(lǐng)域中是已知的并且涉及用于有機合成 中的非水溶劑。 一般而言，有機溶劑比水較為親脂或疏水。因而，
它們的log P的值通常大于零。該log P的值是以10為底的分配系 數(shù)P的對數(shù)，P又被定義為比值P呵A]正辛醇/[A]水，其中A是涉及的 化學(xué)品種類，在本例中為有機溶劑。根據(jù)本發(fā)明的有機溶劑包括曱 醇、乙醇、C3-C1()醇、乙腈、丁酮、1,1，1-三氟乙》克(TFE)、六氟 異丙醇(HFIP)、乙S交乙酯、四氯化-友、丁醇、二丁醚、二乙醚、 環(huán)己烷、氯4b亞曱(二氯曱烷)、己烷、乙酸丁酯、二異丙醚、苯、 二戊醚、氯仿、庚烷、四氯乙烯、曱苯、十六烷、二曱基曱酰胺(DMF)、 四氫吹喃(THF)以及二氧雜環(huán)乙烷。
術(shù)語"冠醚，，在本領(lǐng)域中所熟知的并且指明(大)環(huán)聚醚呈王冠 形構(gòu)象。通常采用的命名法是n-冠-m，其中n指明環(huán)中的原子總數(shù)而m指明聚醚環(huán)中的氧原子數(shù)。該術(shù)語包括其中一個或多個芳環(huán)縮 合為(大)環(huán)的多種衍生物，例如二苯并-18-冠-6。
由于(多)肽通常在有機溶劑中是可溶的，蛋白質(zhì)的衍生作用， 例如與諸如PEG或脂質(zhì)的生物相容性聚合物，目前〗又限于不要求有 才幾、溶劑的反應(yīng)類型。(多)肽與冠醚的配位作用(complexation)允 許在有才幾溶劑中制備所述(多)肽的溶液，實現(xiàn)了進行化學(xué)^f'務(wù)飾的 可能性，這種化學(xué)修飾在水溶液中不能實現(xiàn)(尤其是未受保護的 (多)肽)。這對于水溶性蛋白質(zhì)的化學(xué)#~飾和/或?qū)τ谟貌蝗苡谒?br> 的分子或諸如脂質(zhì)的足夠程度上的不溶于水的分子對(多)肽的修 飾具有特別相關(guān)性。出乎意料并有利地，所述冠醚的作用是在(多)
肽表面上與帶電荷的伯氨基(Lys和Arg側(cè)連，以及N-端氨基)發(fā) 生的。因而，通常不會發(fā)生蛋白質(zhì)的錯折疊(既不會因為配位作用 發(fā)生，也不會在向有機溶劑中轉(zhuǎn)移中發(fā)生)并且不會喪失生物活性。 例如，PSC-Rantes[N-曱酰-Trp57]， 一種抗畫HIV畫1蛋白，在與冠醚的 配合(以及隨后在有機溶劑中的溶解)中完全保持其抗病毒活性(參 見所附實施例)。伴隨產(chǎn)生地，(多)肽與一種或多種冠醚分子之間 形成的配合物(complex)是充分疏水的-帶電的氨基^皮冠醚所掩蔽 (mask)-從而賦予其在有機溶劑中的溶解性。氨基的掩蔽還用于 保護其避免發(fā)生副反應(yīng)(side reaction )。與冠醚的配位作用可在溫 和條件下進行并且因此可使用完全未被保護的(多)肽進行。與冠 醚的配位作用是可逆的并且能夠通過，例如改變pH或添加諸如氯 化鈉(NaCl)的單鹽，而進4于調(diào)整。
酯4建與石克酯4定具有明顯優(yōu)勢，它們在生物體內(nèi)是可逆的。開裂 (cleavage)是通過(i)非催化的水解作用和/或(ii )通過酯酶的 酶解(參見圖2這些開裂過程的示例，其發(fā)生在通過4艮據(jù)本發(fā)明的 "間接"方法(見下文)所獲得的一種修飾(多)肽上)。硫酯在生物 體中可經(jīng)第三種機制開裂，即，通過與內(nèi)源硫醇(例如谷胱甘肽)進行硫醇交換。所有類型的開裂的速度都取決于基質(zhì)的結(jié)構(gòu)。通過 適當(dāng)?shù)剡x擇通過酯4建或石克酯4建與(多)肽結(jié)合的部分，可達到特定
的(tailored)釋放速度。(多)肽羧基的酯化作用具有這樣的優(yōu)勢-而與上文回顧的現(xiàn)有4支術(shù)相對-氨基保持未改變，即，它們的電荷不 會因為衍生作用而被去除(suppress),從而避免了錯折疊和/或溶解 度的損失及隨其后的(多)肽的沉淀。然而，(多)肽羧基的酯化 作用須在包含過量的羥基(醇)的有機溶劑中進行。值得注意的是 (多)肽羧基的酯化或硫酯化是修飾所述(多)肽的合乎需要的途 徑，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)(多)肽的冠醚結(jié)合形式是用于進行 所述酯4匕作用的尤其合適的中間體(intermediate)-由于(多)肽 在與冠醚配^f立以及向有才幾溶劑中的轉(zhuǎn)移過程中維持或基本上維持 其天然結(jié)構(gòu)，因此酯化作用可能僅發(fā)生在表面暴露的羧基上。
通過使用本發(fā)明的方法，可獲得具有增強的藥理學(xué)和/或藥物動 力學(xué)特性的(多)肽。所述增強的特性包括增強的吸收或遞送，受 到保護以避免降解、持續(xù)長時間的活性和/或提高的潛能(進一步詳 述見下文)。同時，并如上所討-論的，(多)肽的^f務(wù)飾形式確^呆所述
保未修飾(多)肽最終釋放并發(fā)揮其生物學(xué)/治療學(xué)作用?？商娲兀?如通過本發(fā)明方法獲得的修飾形式的(多)肽能夠發(fā)揮所關(guān)注的(of interest)的治療學(xué)作用且不同于那些未修飾的(多)肽。更進一步 地，(多)肽的治療學(xué)相關(guān)形式可在部分水解、開裂和/或^克醇交換: 中形成，以至于某些》多飾作用仍存在于治療學(xué)相關(guān)形式中而其他的 則不存在于治療學(xué)相關(guān)形式中。
如果有機溶劑具有一個羥基部分(醇)，添加一種活化劑會形 成溫和的并可控的酯或石泉酯。溫和條件包括在室溫下的反應(yīng)。適合 的活4匕劑的列表可在T.W.Green and P.G.M. Wuts，尸ro/e"/wg Growp CVgam'c 5y涵e57'51, III Ed, 1999, John Wiley & Sons New York373-377中找到，并且其中包括硅烷或諸如三甲基氯硅烷(TMSiCl) 的甲硅烷基化劑、碳二亞胺(例如DIC、 DCU )、 l,l-羰二咪唑(CDI )、 2-乙氧基-1-(乙氧羰基)-1,2-二氫喹啉(EEDQ)、以及三烷基亞磷 酸酯(trialkyl phosphite )和二曱基曱酰胺的乙縮醛。術(shù)語"可控的" 涉及(由酯和/或硫酯的形成)起作用的行為或過程的可調(diào)節(jié)程度。 調(diào)節(jié)是通過使用過量的活化劑而實現(xiàn)的。在J. March, y^wmced O，m'c C/ 簡考，4th ed. Wiley & Sons 1992, pp. 392-400中提供了 對酯化反應(yīng)與機制的綜迷。
N-端氨基酸的氨基的選擇性修飾(其中堿性氨基酸的側(cè)鏈氨基
不被修飾)可通過使用合適的諸如吡啶乙酸鹽的有機緩沖液來進
行，所述有機緩沖液確定相當(dāng)于溫和酸性條件的pH，優(yōu)選地在大
約4至大約6的pH范圍內(nèi)。在這種條件下，側(cè)鏈氨基將保持基本
上被質(zhì)子化及被冠醚保護，而N-端氨基酸的氨基，由于側(cè)鏈氨基相
比石烕性較弱，因此不被質(zhì)子化或不完全被質(zhì)子化，從而不被冠醚保
護或不完全一皮冠醚〗呆護并且因而可用于反應(yīng)。優(yōu)選的與N-端氨基酸
的氨基結(jié)合的基團包括脂質(zhì)和生物相容性聚合物。下文限定的術(shù)語 "月旨質(zhì)"和"生物相容性聚合物"是作為這些基團的優(yōu)選實施例。優(yōu)選
地才是供了作為活化酯(例如脂肪酸活化酯)或醛的將^皮結(jié)合的所述 基團。活化酯與游離N-端氨基的反應(yīng)產(chǎn)生一種N-端酰胺化的(多) 肽；而在還原條件下(如NaCNBH3或NaBH4 )醛的反應(yīng)給出一種 具有N-端氨基酸的氨基被烷基化的(多)肽。

圖13提供了 N-端修 飾的示例性反應(yīng)順序。可替^C地，N-端氨基酸的氨基可以與一個氨 基酸或一個包括2、 3、 4、 5或多達大約IO個氨基酸的寡肽進行酰 胺化，其中所述氨基酸或構(gòu)成所述寡肽的多個氨基酸中的至少 一個 選自非天然氨基酸、D-氨基酸、氨基酸衍生物或它們的組合。術(shù)語 "非天然氨基酸"是指在通常不存在(non-occurrence)于蛋白質(zhì)中的 氨基酸。該術(shù)語包括p-丙氨酸、a-氨基丁酸、i氨基丁酸、a-氨基 異丁酸、正纈氨S吏、己氨酸、s-賴氨酸、鳥氨酸、高絲氨酸以及羥基脯氨酸。術(shù)語"D-氨基酸"可理解為包括天然氨基酸以及非天然氨 基酸二者的D型-對應(yīng)氨基酸(counterparts )。術(shù)語"氨基酸衍生物" 包括具有被保護側(cè)鏈的氨基酸和N-烷基化氨基酸。適合的保護基在 本領(lǐng)域中是^^知的。在這種實施方式中， 一種可重組地生產(chǎn)的(多) 肽可通過本發(fā)明的方法在其N-端進行》務(wù)飾乂人而獲得一種具有^f奮飾 的或增強的藥理學(xué)和/或藥物動力學(xué)特性的(多)肽。加入的氨基酸 或構(gòu)成所述寡肽的多個氨基酸的至少一個可以不是編碼該(多)肽 的基因或mRNA所編碼的氨基酸。
在本發(fā)明方法的一種優(yōu)選實施方式中，由酯鍵或硫酯鍵進行的 修飾選自與一種或多種以下物質(zhì)的酯鍵或硫酯鍵的形成的組中
(a)生物相容性聚合物；(b)脂質(zhì)；(c )包括一個羥基或巰基的連 4妻物分子(linker molecule); (d)所述(多)肽的側(cè)鏈羥基；(e) 寡核苷酸；(f)(前體)藥物；(g)標(biāo)^己物(marker); (h)標(biāo)簽
(label); (i)曱醇或苯曱醇分子；(j)具有同源轉(zhuǎn)運載體的小分子； 以及(a)至(j)的任意組合。
這種實施方式涉及一種將所述分子或基團與所述(多)肽結(jié)合 的方式，其要求將被結(jié)合至(多)肽(其經(jīng)所述結(jié)合而被修飾)的 分子或基團具有至少一個羥基(參見用于示例的圖la)。這種實施 方式也是作為一種與通過涉及所述連接物(linker)的"間接"方式而 進行的結(jié)合相對的可替代的或另外的"直接"(或"一步")修飾，所 述間-接方式在下文中作進一步描述。
術(shù)語"生物相容性聚合物"是指對人體或動物體的不產(chǎn)生不利 反應(yīng)的聚合物。生物相容性聚合物廣泛用于修復(fù)術(shù)(假體， prosthetic )、縫合術(shù)、持續(xù)和/或延時釋放的藥物組合物 (pharmaceutical composition )等用途。術(shù)語"聚合物，，狹義上可理解 為包括兩種聚合物，即，由多個結(jié)構(gòu)單元(building blocks )或由一 種或多于一種類型(在第二種情況中所述聚合物也指共聚物)形成的分子，其中在由多個結(jié)構(gòu)單元形成聚合物的過程中，不會另外形 成一種或多種分子(例如水分子)，也不會形成縮聚物，即，根據(jù) 本發(fā)明的聚合物，其中在由聚合物結(jié)構(gòu)單元形成聚合物的過程中， 除了形成聚合物之外還另外形成一種或多種分子(例如水分子)。 對于那些實施例(其中所述生物相容性聚合物用于本發(fā)明的"直接" 方法中)，應(yīng)理解的是生物相容性聚合物呈現(xiàn)至少一個游離羥基或 游離巰基。術(shù)語"脂質(zhì)"是本領(lǐng)域中公知的并且主要涉及可攜帶極性頭基 的親脂/疏水的分子，從而賦予脂質(zhì)分子兩親性。對于在(多)肽修 飾的直接方法中脂質(zhì)的使用，羥基的存在是先決條件。根據(jù)本發(fā)明 的脂質(zhì)包括諸如烴類(三十烷、角鯊烯、類胡蘿卜素)、醇類(蠟 醇、^L黃醇、月旦固醇、線性單羥基烴或多羥基烴，^尤選:l也具有2至大約30個碳原子)、醚、脂肪酸以及酯(例如單酰基甘油、雙酰基 甘油與三?；视?的簡單脂類。此外還包括諸如脂蛋白、磷脂以 及糖脂的復(fù)合脂類?！钒吨职ㄖT如^粦脂酸的甘油磷脂 (glycerophospholipids )、 5容jk石舞月旨i^、石舞月旨醜"^H由、'd舞月旨、^j6l 二磷脂酸、磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰 絲氨酸、磷脂酰肌醇以及磷酰酯。糖脂包括諸如單半乳糖甘油二酯 和雙半乳糖甘油二酯的甘油糖脂以及;ml代異鼠李糖甘油二酯。才艮據(jù) 本發(fā)明的術(shù)語"脂質(zhì)"還包括鞘磷脂、鞘糖脂與神經(jīng)酰胺。應(yīng)理解的是術(shù)語"連接分子"是指能將夠至少兩個分子實體連 接在一起的部分。為了進行連接，所述連接分子，除上述羥基或巰 基外，包括被保護或游離形式的其他的官能團(functionality),其 中由所述官能團進行化學(xué)反應(yīng)，優(yōu)選一種化學(xué)選擇性反應(yīng)。所述化 學(xué)選擇性反應(yīng)優(yōu)選地僅涉及在所述功能基團和第二分子(所述修飾 (多)肽或?qū)⒈恍揎椀?多)肽為第一分子)之間的反應(yīng)，其中第 一分子不參與所述化學(xué)選4奪性反應(yīng)。優(yōu)選的連"l妄物包括或者由以下物質(zhì)組成具有2至大約15個^灰原子的烴鏈、所述羥基或巰基以 及所述(第二)功能基團。在下文及圖5中給出了所述功能基團的 優(yōu)選結(jié)構(gòu)。所述(多)肽的側(cè)鏈羥基的酯化作用是指在所要》f飾的同一 (多)肽分子中的內(nèi)酯鍵的形成。羥基可由Ser、 Thr或Tyr的側(cè)鏈 提供。得到的酯(內(nèi)酯)是環(huán)狀或大環(huán)狀的。除了具有基本相同的結(jié)合特性的寡核糖核苷酸與寡脫氧核糖 核苷酸分子之外，根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語"寡核苷酸"還具有一個不同的 骨架，如代替磷酸-糖骨架的肽骨架。因此，術(shù)語"寡核苷酸"包括肽 核酸(PNA)以及寡核苷酸-PNA嵌合體。術(shù)語"PNA"代表"肽核酸"。簡言之，PNA是一種合成的DNA 類4以物，具有耳又^了 DNA或RNA的4唐-》粦臥臾骨架的酰胺骨架 (Nielsen et al. (1991) Science, 254， 1497-1500; Egholm et al. (1993), Nature, 365， 566-568 )。 PNA呈現(xiàn)多種有利特性。它們在酸性條件下 穩(wěn)、定并且耐核酸酶及蛋白酶(Demidov et al. (1994), Biochem. Pharmacol., 48, 1310-1313)。與相應(yīng)的DNA國DNA雙鏈的穩(wěn)、定性相 比，它們的靜電中性的骨架提高了與互補DNA的結(jié)合強度(Wittung et al. (1994), Nature, 368， 561-563; Ray and Norden (2000), Faseb J.， 14, 1041-1060)。因此，當(dāng)用作雜交4笨針時，PNA寡聚體可以比寡 核苷酸短。另一方面，4昔配會產(chǎn)生更強的不穩(wěn)、定效應(yīng)，因而^是高了正確配 對與錯配之間的識別。因為不需抵消(如帶負(fù)電荷的兩條DNA鏈 之間的)鏈間排斥力，由于PNA不帶電荷的本性，PNA還允許DNA 樣品在低鹽或無鹽條件下的雜交。結(jié)果，靶DNA在雜交條件下具 有專交少的二《及結(jié)構(gòu)并且更易于結(jié)合(more accessible to ):探針分子。根據(jù)本發(fā)明的PNA嵌合體為包括一個或多個PNA部分的分子。嵌 合體分子的剩余部分可包括一個或多個DNA部分。本發(fā)明的寡核苷酸的優(yōu)選長度為12至200個石成基，更加優(yōu)選 為20至100個石咸基。在本發(fā)明的寡核香酸為siRNA的那些實施例 中，優(yōu)選具有20至25個堿基，尤其是優(yōu)選21至23個堿基長度的 雙鏈作為3'端突出。出于RNAi目的最優(yōu)選的是由21-nt正義鏈與 21-nt反義鏈構(gòu)成的siRNA雙鏈，以具有19-核苷酸的雙鏈區(qū)域和在 每個3'端具有2-核苦酸的突出的方式配對。術(shù)語"(前體)藥物"應(yīng)理解為包括藥物和前體藥物。術(shù)語"藥物" 包括任何經(jīng)批準(zhǔn)用于人體或獸醫(yī)用途的活性劑(列表參見，例如， the Merck Index, 13th ed. Merck Publishing Group, Rahway， NJ, USA; 以及 Martindale， "The Complete Drug Reference" London: Pharmaceutical Press. Electronic version, Thomson Micromedex， Greenwood Village, Colorado, 34th ed.)。"前體藥物"是一種通常不具 有生物學(xué)和/或藥理學(xué)活性的化合物。然而，當(dāng)其^皮激活時，通常在 生物體中由酶促裂解或水解裂解而將前體藥物轉(zhuǎn)化為生物學(xué)和/或 藥理學(xué)化合物(藥物)，前體藥物的給藥將得到預(yù)期的醫(yī)療效果。 前體藥物通常是通過對生物學(xué)和/或藥理學(xué)4b合物進4亍化學(xué)纟務(wù)飾而 形成。伊J^口， 在Design of Prodrugs, ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985 中描述了用于選擇和制備適合的前體藥物衍生物的傳統(tǒng)方法。例如 當(dāng)活性藥物毒性太大而不能進行全身給藥時，當(dāng)活性藥物很難4皮消 化道吸收時，或者當(dāng)活性藥物到達其靶標(biāo)之前就被機體分解時，前 體藥物是4艮有用的?？梢酝ㄟ^體內(nèi)代謝，例如在穿過諸如細(xì)胞膜的 體內(nèi)屏障后，而發(fā)生前體藥物的激活。術(shù)語"標(biāo)記物"是指促進或者允許檢測修飾(多)肽的分子、片 斷或基團。標(biāo)記物包括蛋白質(zhì)分子，例如包括藍色、青色、綠色和黃色熒光蛋白(BFP、 CFP、 GFP和YFP)的熒光蛋白以及發(fā)光蛋 白。還包括本領(lǐng)域中7>知的報告子結(jié)構(gòu)。術(shù)語"標(biāo)簽(label，指示物)"是本領(lǐng)域中公知的并且包括具有 放射性、熒光性和/或發(fā)光性等的原子或功能性基團的分子、片斷或 基團。放射性核素包括"P、 35S、 3H、卯Y以及1311。熒光標(biāo)記物包 括芴、芘、包括熒光素的氧雜蒽、若丹明、香豆素、萘胺、吖啶、 苯丙噁唑、苯丙二噁唑、均二苯乙烯、聚對苯乙炔、聚噻吩、聚對 苯撐乙炔以及聚對苯撐。萘胺可在a位或p位具有氨基并且包括1-二甲氨基萘-5-磺酸鹽、l-萘胺基-8-萘磺酸鹽以及2-對-甲苯胺基 (toluidinyl)-6-萘磺酸鹽。香豆素包括3-苯基-7-異氰基香豆素；吖 啶包括9-異硫氰酸基吖啶和吖啶橙；以及苯丙噁唑包括氮-(對-(2-笨丙噁唑)苯基)馬來酰亞胺。應(yīng)理解的是復(fù)數(shù)形式的使用，諸如"芴類"，表明不僅包括芴本 身，并且還包括在本申請優(yōu)先4又日本領(lǐng)域中已知的芴的衍生物。才艮據(jù)本發(fā)明的特定熒光標(biāo)記包括以下商購的(例如可乂人 Synthegen公司獲得的)熒光染料Tamra-dT、 5-熒光素(FITC)、5- 羧基熒光素(FAM)、 6-羧基熒光素(FAM)、 3，6-羧基熒光素 (FAM )、 6-羧基熒光素-DMT ( FAM-X )、 5(6)-羧基熒光素(FAM )、6- 六氯熒光素(HEX)、 6-四氯熒光素(TET)、 JOE、 LightCycler Red 640、 LightCycler Red 705、 FAR-Fuchsia ( 5，- Amidite )、 FAR-Fuchsia(SE )、 FAR-Blue ( 5，畫Amidite )、 FAR國Blue ( SE )、 FAR畫Green One (SE )、 FAR-Green Two( SE )、 Oregon Green 488、 Oregon Green 500、 Oregon Green 514、 BODIPYFL隱X、 BODIPYFL、 BODIPY國TMR-X、 BODIPY R6G、 BODIPY 650/665、 BODIPY 564/570、 BODIPY 581/591、 BODIPY TR-X、 BODIPY 630/650、 BODIPY 493/503、羧 基若丹明6G、 MAX、 5(6)-羧基四甲基若丹明(TAMRA)、 6-羧基 四曱基若丹明(TAMRA)、 5(6)-羧基-X、若丹明(ROX )、 6-羧基0<:-若丹明(ROX)、 AMCA-X (香豆素)、Texas Red-X (德州紅-X)、 若丹明紅-X、 Marina Blue (馬里那藍)、Pacific Blue (太平洋藍)、 若丹明綠-X、 7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸、7-曱氧基香豆素-3-羧酸、 Cy3、 Cy3B、 Cy5、 Cy5.5、 DY國505、 DY-550、 DY-555、 DY-610、 DY-630、 DY畫633、 DY畫636、 DY-650、 DY-675、 DY-676、 DY畫681、 DY-700、 DY-701、 DY畫730、 DY-750、 DY-751、 DY-782、 Cy3.5以 及EDANS。術(shù)語"具有同源轉(zhuǎn)運載體的小分子"是指在體內(nèi)被特異性轉(zhuǎn)運 載體識別并轉(zhuǎn)運的分子。這樣的分子就^^它們的同源轉(zhuǎn)運載體一樣 是本領(lǐng)域中/>知的。優(yōu)選的分子包4舌維生素B12(參見Russell-Jones, G.J.， Adv. Drug. Deliv. Rev.， 2001, 46， 59-73 )以及維生素C。在本發(fā)明方法的另一種優(yōu)選實施方式中，所述羧基選自以下的 組(a) Glu的一個或多個側(cè)鏈羧基；(b) Asp的一個或多個側(cè)鏈 羧基；(c) C-端氨基酸的主鏈羧基；以及(d) (a)至(c)的任意 組合。在另一優(yōu)選實施方式中，所述方法包括所述連接物與選自由一 種或多種以下物質(zhì)組成的組中的分子發(fā)生反應(yīng)的更多步驟(a)生 物相容性聚合物；(b)脂質(zhì)；(c)連接物；(d)第二(多)肽；(e) 寡核苷酸；(f)(前體)藥物；(g)標(biāo)記物；(h)標(biāo)簽；(i)具有同 源轉(zhuǎn)運載體的小分子；以及(a)至(i)的任意組合。這種實施方式涉及生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的修飾(多)肽的分子模塊 化方法(其在本文中也稱為"間接"或"兩步"方法)。在這種實施方式 中，(多)肽在第一步中與具有羥基或巰基的連接物發(fā)生酯化，其 中所述連接物另外還具有一個第二功能基團，其在形成的每個酯4建 上引入一個"鉤狀部(hook)"。因此，在第一步后，產(chǎn)生了限定凝乙 量的酯鍵，并且選擇的基團可通過所述第二功能基團在第二步中經(jīng)平穩(wěn)的化學(xué)選擇性反應(yīng)而得以結(jié)合(參見用以舉例說明的圖lb)。 這樣，我們就能夠?qū)⒈贿B接至蛋白質(zhì)上的基團的功能發(fā)揮水平進 行調(diào)節(jié)。這種技術(shù)對于插入諸如聚合物的大基團或如脂質(zhì)的疏水基 團以獲得治療相關(guān)(多)肽的緩釋形式是理想的。調(diào)節(jié)化學(xué)選擇性 反應(yīng)(第二步)從而獲得各種情況下所需的取代水平。最后通過模
塊化策略(modular strategy ),可以4吏具有多種基團的感興趣的(多) 肽發(fā)揮功能從而進一步增強生物制藥特性。
在一種優(yōu)選實施方式中，所述連4妄物反應(yīng)的更多步驟是通過弱 石咸-羰基化學(xué)反應(yīng)而實現(xiàn)的。這種反應(yīng)可在非常溫和的、弱酸性條件 下進行。因此，(多)肽或抗體或它們的片斷或衍生物的結(jié)構(gòu)不受 干擾。優(yōu)選地，所述反應(yīng)包括一個親電基團(諸如醛或酮)與一個 親才亥基團(^者如肼或羥胺4汙生物，分別具有通式NH2NHR或 NH2OR)或一個1，2-能團進行反應(yīng)以產(chǎn)生作為反應(yīng)產(chǎn)物的醚環(huán)。優(yōu) 選的1，2-官能團是1，2-氨基-巰基、1,2-氨基-羥基、1,2-羥基-巰基、 1，2-二巰基以及1，2-二羥基。在與連接物結(jié)合的基團具有一個親電 基團的情況下，親核基團可以是所述連接物的第二功能基團，或者 反之亦然(參見圖5)。
在另一優(yōu)選實施方式中，炔烴與疊氮基團的銅催化偶合(通常 稱為點擊4b學(xué)，參見，例如V. Rostovtsev et al. 2002, Angew. Chem., 41, 2596)用于化學(xué)選擇性地將連接物與要結(jié)合的分子相連接。結(jié) 合是通過醚環(huán)的形成而發(fā)生的。
通過生物相容性聚合物的結(jié)合而對(多)肽進行的結(jié)構(gòu)性修飾， 結(jié)果使因此而獲得的修飾(多)肽表現(xiàn)一種或多種以下出人意料和 /或有利的功能特性(i)增強的吸收或遞送，(ii)保護避免被降解， (iii)延長的活性，以及(iv)提高的潛能。增強的吸收或轉(zhuǎn)移 (translocate )是因為，例如在通過細(xì)月包月莫或體內(nèi)屏障(如血腦屏障 或粘膜表層)時，生物相容性聚合物被優(yōu)先的吸收或者轉(zhuǎn)移，這樣，例如所述生物相容性聚合物的轉(zhuǎn)移就會先于并且促進(多)肽的吸 收或轉(zhuǎn)移。所述生物相容性聚合物可以是線性的(參見用以舉例說
明的圖7)，支鏈的或交聯(lián)的(見圖8和圖9)。增強的吸收可通過
實現(xiàn)。保護以避免被(例如，酶)降解是通過與(多)肽結(jié)合的生 物相容性聚合物的屏蔽作用而實現(xiàn)的。在這種情況下，優(yōu)選支鏈或 交聯(lián)的聚合物(見圖8和圖9)。圖8示出了局部保護，其優(yōu)選地是 通過由小于(多)肽的生物相容性聚合物分子對(多)肽進行衍生 而完成的，其中圖9舉例i兌明了完全保護，其優(yōu)選地是通過由大于 (多)肽的聚合物分子(例如分子量或總尺寸為兩倍大)而完成的。
同樣，所述屏蔽效應(yīng)必然會使(entail)活性延長，既然為了表 現(xiàn)生物活性，生物相容性聚合物需至少部分地;故降解或(多)肽凈皮 完全地釋放。根據(jù)本發(fā)明的表現(xiàn)出這種延長的活性的修飾(多)肽 是有用的，例如可作為所述(多)肽的緩釋配方。對脂質(zhì)化(多) 肽的提高的潛能已有過報道。由于沒有被特定理論束縛，設(shè)想這種 效應(yīng)是由于(多)肽的增強的親脂性，允許對細(xì)胞膜的附著以及與 同源受體間增強的或延長的相互作用。
在一種優(yōu)選實施方式中，所述連4妄物與一個或多個上述分子的 反應(yīng)是在水性介質(zhì)中進行的。換言之，本發(fā)明兩步法的第一步完成 以后，由一種或多種連接物修飾的(多)肽可被轉(zhuǎn)移至一種水性介 質(zhì)中，在那里將進4亍第二步，即，連接物的書亍生作用。術(shù)語"水性 介質(zhì)，，包括水、纟爰沖液以及通常在其中以水作為溶劑的溶液。可-, 代地，如果將要與所述連接物結(jié)合的基團或分子因為溶解度的原因 而要求含有機溶劑的情況下，衍生(多)肽與冠醚進行配位并且可 使用根據(jù)本發(fā)明的一種有機溶劑或水性介質(zhì)與有機溶劑的混合物。
在本發(fā)明方法的 一種優(yōu)選實施方式中，所述生物相容性聚合物 選自由以下物質(zhì)組成的組聚醚、多#唐、聚酯(包括多正酯類)、聚氰基丙烯酸酯、幾-克基丙烯酰胺(hydroxy alky lacrylamides )、表 面活性劑以及它們的混合物。
術(shù)語"表面活性劑"在本領(lǐng)域中是公知的。應(yīng)理解的是它包括能 夠形成膠團的分子。術(shù)語"表面活性劑"不僅包括聚合體性質(zhì)的分子 而且包括脂質(zhì)，例如在上文中已作進一步詳細(xì)介紹的磷脂和糖脂。
關(guān)于其理化特性，根據(jù)本發(fā)明的生物相容性聚合物可以是一種 水凝膠?？商娲鼗蛄硗獾?，所述生物相容性聚合物可以是一種表 面;舌'f生劑(surfactant)或表面;舌'f生的(tensioactive )。同才羊可替4戈;也 或另外地，所述一種或多種聚合物能夠形成脂質(zhì)體、聚合膠團、微 球體、微嚢和/或納米顆粒。通過使用本發(fā)明的方法， 一種冠醚結(jié)合 (多)肽可以與聚合物共價結(jié)合，該聚合物為脂質(zhì)體、膠團、微球 體、孩t嚢或納米顆4立的p參一組分或多種《且成分子之一。從而獲4尋一 種在其內(nèi)部包含共價結(jié)合(多)肽的脂質(zhì)體、膠團、微球體、微嚢
或納米顆粒。在脂質(zhì)體、膠團、孩t球體、微嚢或納米顆粒中捕獲(trap ) 的冠醚可通過(例如用氯化鈉的水溶液)洗脫而^皮去除。
優(yōu)選的多糖包括環(huán)糊精、淀粉、幾丁質(zhì)、殼多糖、黃素、葡聚 糖、纖維素、藻酸鹽、芽霉菌糖、果膠(pectine)、糖脂以及葡糖胺 聚糖(包括-石克酸軟骨素、石克酸皮膚素、石克酸角質(zhì)素、石克酸乙酰肝素、 肝素以及透明質(zhì)酸)。
在更多的優(yōu)選實施方式中，所述聚酯為聚合物或共聚物，其中 結(jié)構(gòu)單元(building block)(或者如果是共聚物的至少一個結(jié)構(gòu)單 元)為諸如乳酸或羥基乙酸的a-羥基酸。
在另 一優(yōu)選實施方式中，所述生物相容性聚合物是分支的和/ 或交聯(lián)的。分支的和/或交聯(lián)的聚合物特別適合上述的屏蔽效應(yīng)，即，(多) 肽的包裹。
優(yōu)選地，聚醚是聚乙二醇(PEG)或聚酯是聚乳酸/聚乙醇酸。 術(shù)語"PEG"是指本領(lǐng)域中公知的一類聚醚多元醇。大范圍分子量的 PEG可商購獲得。示例性分子量范圍在大約100至大約10000000, 包括分子量大約為，例如，200、 300、 400、 500、 800、 1000、 2000、 5000、 10000、 100000、 500000以及1000000的PEG。才艮才居本發(fā)明 的術(shù)語"聚乳酸/聚乙醇酸"包括聚乳酸、聚乙醇酸以及乳酸和羥基乙 酸的共聚物。
優(yōu)選地，所述第二 (多)肽是一種膜穿透(多)肽。在許多情 況下，細(xì)月包轉(zhuǎn)運可通過將蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(蛋白轉(zhuǎn)運i或(protein transducing domains ); PTD )結(jié)合入革巴蛋白中而實王見。這些通常4豆 于中等大小的多肽序列，因此常常稱為細(xì)胞穿透(多)肽(CPP) 或膜穿透(多)肽，不表現(xiàn)明顯的親脂性，而其是兩親性的且通常 在生理pH下攜帶許多正電荷。它們能夠單獨地或者與蛋白"運載物 (cargo)，，結(jié)合，有效地穿過細(xì)胞質(zhì)膜。盡管它們穿過膜的機制仍 待充分闡明，但PTD已日益被用作將蛋白轉(zhuǎn)運至細(xì)胞中的載體并表 現(xiàn)了其用于藥物遞送的潛能。因此，并且由于沒有特定理i侖的束縛， 設(shè)想由聚合物通過酯的形成而對蛋白質(zhì)進行的衍生作用，不僅可通 過消除負(fù)電荷并添加親脂性聚合物，而增強蛋白質(zhì)自身的親脂性， 而且還可貝武予蛋白質(zhì)與陽離子CPP相似的理化特性，,人而允許細(xì)月包穿透。
在一種優(yōu)選實施方式中，所述月莫穿透(多)肽選自以下組中 Penetratin (Antennopedia 43-58 )、 TAT、 TAT 46-60、 PTD-4、 SynBl 與SynB3 (Protegrin 1， (4元菌肽))、4爭運子(Transportan )、 MAP (模式兩親性肽)、Pep-1 、富含脯氨酸的肽(VXLPPP)n、 pVEC、 plSL、 聚4青氨酸、SN50、 MPG (參見Zorko, M和Langel, U. (2005)Advanced Drug Delivery Reviews; 57: 529-545 )。上述月莫穿透肽能夠 可以是天然形式(由L-殘基形成)，或由D-殘基形成。
在另一種優(yōu)選實施方式中第二 (多)肽是由胃腸(GI)轉(zhuǎn)運載 體識別并轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)或(多)肽。這種(多)肽以及體內(nèi)的其同 源轉(zhuǎn)運載體是本領(lǐng)域中/>知的。優(yōu)選的由胃腸轉(zhuǎn)運載體識別并轉(zhuǎn)運 的(多)肽是轉(zhuǎn)鐵蛋白(Xia， C.Q. et al. J. Pha腿col.Exp.Ther.， 2000, 295, 594-600 )以及外源凝集素(Lehr, C.M., J. Control.Rd., 2000, 65, 19-29 )。
在本發(fā)明方法的一種優(yōu)選實施方式中，其中第二(多)肽^皮輒 合至將通過直接和/或間接方式而被修飾的(多)肽，所述第二 (多) 肽被連接至(前體)藥物分子。
優(yōu)選地，所述(前體)藥物是一種抗癌(前體)藥物。
在另一種優(yōu)選實施方式中，所述抗癌(前體)藥物選自下組中 依托泊苷、苯酚氮芥(Phenol mustard )、苯丙氨酸氮芥(美法侖)、 抗葉酸素(包括甲氨喋呤)、氮芥、氯霉素、5-氟-2，-脫氧尿苷、喜 樹堿、5-氟尿嘧啶、5-氟尿苷、蒽環(huán)霉素衍生物、蒽環(huán)類抗生素(包 括柔紅霉素、阿霉素)、9-氨基喜樹堿、維拉帕米、奎寧、雙嘧達莫、 絲裂霉素、長春胺衍生物、紫杉醇、多西他賽、鉑試劑、嗎氯貝胺 氮芥、烯二炔、新制癌菌素、?？舅亍C-1065類似物、多卡霉 素(duocarmycin )類合乂物、氨基-CBI彩亍生物、奧瑞4也汀(auristatin )、 一甲基奧瑞他汀、多拉司他汀10、美登素、美登醇DM1、美登醇 DM4、格爾德霉素、加里剎霉素、治療性放射同位素(釔-90和碘 -131)、來自細(xì)菌的毒素(白喉毒素或假單胞菌外毒素)和來自植物 的外毒素(由蓖麻籽提取的蓖麻毒素或白樹毒素)。在(前體)藥物表現(xiàn)出高毒性和/或較弱的細(xì)胞內(nèi)遞送和/或較 弱的穿過諸如血腦屏障的體內(nèi)屏障遞送的情況下，特別優(yōu)選使用本 發(fā)明的方法。
優(yōu)選地，所述寡核香酸選自下組中反義寡核苦酸、siRNA以 及核酶。
正如本4貞i或中已知的，反義RNA序列與mRNA或者其中一部 分互補并可與所述mRNA選擇性地結(jié)合，所述序列能夠抑制由 mRNA編碼的蛋白質(zhì)的合成。才艮據(jù)本發(fā)明的核酶與mRNA或其一 部分互補并可與所述mRNA結(jié)合并將其裂解，因而抑制了由mRNA 編碼的蛋白質(zhì)的合成。優(yōu)選地，本發(fā)明的反義RNA與核酶優(yōu)選地 與mRNA的編碼區(qū)互補，例如與編碼區(qū)的5'部分互補。在具備所 述mRNA序列或編碼所述mRNA的基因序列的情況下，本領(lǐng)域中 技術(shù)人員能夠制備并利用上述反義RNA或核酶。siRNA是在RNAi 4支術(shù)中4吏用的小干護C認(rèn)A (參見，如Zamore Nat Struct Biol 2001, 8(9): 746-50或Tuschl T. CHEMBIOCHEM. 2001, 2:239-245 )。
優(yōu)選地，所述(多)肽是一種抗體或其中保留了所述抗體的結(jié) 合特異性的片斷或布于生物。圖3 (直"l妄方法)與圖4 (間4妄方法) 中提供了用于制備抗體的本發(fā)明方法的 一 個示例。
才艮據(jù)本發(fā)明的術(shù)語"抗體或片斷或其^f汙生物"包括單克隆抗體、 多克隆抗體、單鏈抗體、或它們的片斷以及此外的雙特異性抗體、 合成^t體以及i者如Fab、 F (ab2) ,, Fv或scFv片斷等的4元體片斷、 或這些中4壬4可一種的4匕學(xué)<奮飾的4汙生物?？梢岳缤ㄟ^在K6hler and Milstein, Nature 256 (1975)， 495,和Galfr6, Meth. Enzymol. 73 (1981)， 3中最#刀4笛述的#支術(shù)來制備單克隆4元體，該4支術(shù)包4^1,小鼠 骨髓瘤細(xì)胞與由具免疫力的哺乳動物中揭:耳又的脾細(xì)胞，通過本領(lǐng)i或 中發(fā)展形成的》務(wù)飾方法而融合。此外，上述肽的抗體或其片斷可通過4吏用，侈寸^口,在Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual": CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988中所述的方法而獲得。當(dāng)所述 抗體的衍生物通過噬菌體表面展示技術(shù)而獲得時，如在BIAcore中 所使用的表面等離子共振可用于提高與本發(fā)明的肽或多肽的抗原 決定基結(jié)合的嗟菌體#元體的歲文率(Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995)， 7-13)。嵌合抗體的制備，在例如WO89/09622中得到描述。 根據(jù)本發(fā)明所使用的抗體的另一來源是所謂的異種抗體。制備異種 抗體(如小鼠中的人抗體)的一般原則在，例如WO91/10741、 WO 94/02602、 WO 96/34096以及WO 96/33735中得到描述。才艮據(jù)本發(fā) 明所4吏用的抗體或其相應(yīng)的一個或多個免疫5求蛋白鏈可通過^f吏用 本領(lǐng)域中已知的傳統(tǒng)技術(shù)得到進一步修飾，例如，通過利用單獨地 或相互結(jié)合地，4吏用蛋白質(zhì)刪除、插入、取代、增加、和/或重組和 /或本領(lǐng)域中已知的任何其他的4多飾方法。用于將這種^f奮飾引入 DNA序列中(為免疫球蛋白鏈的氨基酸序列的基礎(chǔ))的方法對本 領(lǐng)域中技術(shù)人員是公知的；參見，如上述引文中的Sambrook(1998)。
術(shù)語"單克隆抗體"或"多克隆抗體"(參見上述引文中的Harlow and Lane， (1998))還涉及保留了或基本上保留了所述抗體的結(jié)合特 異性的所述抗體衍生物。所述抗體的其他優(yōu)選衍生物為包括，例如 小鼠或大鼠可變區(qū)與人恒定區(qū)的嵌合抗體。
術(shù)語"scFv片斷"(單鏈Fv片斷)是本領(lǐng)域中/>知的并且由于 其小尺寸以及有可能重組地制備這種片斷而得到優(yōu)選。
與根據(jù)本發(fā)明使用的抗體相關(guān)的術(shù)語"結(jié)合特異性"意指抗體 等不會或者基本上不會與具有與目標(biāo)抗原類似結(jié)構(gòu)的抗原發(fā)生交 叉反應(yīng)(crossreact)。研究中的一系列(panel)抗體等的交叉反應(yīng) 可，例如通過評定所述系列抗體等在常規(guī)條件下(參見，例如上述 引文中的Harlow and Lane， ( 1988))與所關(guān)注的抗原以及許多(在結(jié)構(gòu)上和/或功能上)或多或少密切相關(guān)的抗原之間的結(jié)合，而得到檢 測。只有那些與所關(guān)注抗體結(jié)合，而不與或基本上不與4壬<可其4也抗 原(其優(yōu)先與所關(guān)注蛋白由相同組織而表達)結(jié)合的抗體，被認(rèn)為 是對所關(guān)注的抗原具有特異性。
在本發(fā)明方法的一種特別優(yōu)選實施方式中，所述抗體或抗體結(jié) 根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語"人源化抗體"意指一種非人源抗體，其中在
可變區(qū)內(nèi)的至少一個互4卜決定區(qū)(CDR)， fe口CDR3并優(yōu)選所有的6 個CDR，都#1具有所需特異性的人源抗體的CDR所取代?？蛇x擇 地，抗體的一個或多個非人恒定區(qū)^皮人抗體的一個或多個恒定區(qū)所 取代。用于制備人源化抗體的方法在，如EP-A1 0 239 400以及WO 90/07861中得到了描述。
在本發(fā)明方法的一種伊乙選實施方式中，所述冠醚選自以下的 組18-冠國6、 12-冠-4、 15-冠-5、苯并畫18-冠畫6、 二苯并-18-冠-6、 12-冠-4、 15-冠-5、 (12-冠-4)-2-甲醇、18-冠-6四歡酸、(18-冠-6)畫2-曱醇、苯并-15-冠-5、 二苯并-15-冠-5、 4，-氨基-苯-15-冠-5、 4，-氨基 -苯并-18-冠-6以及諸如杯[4]芳烴、杯[6]芳烴、杯[8]芳烴，和杯[6] 芳烴-六乙酸六乙酯的杯芳烴。
更加優(yōu)選地，所述冠醚為18-冠-6。
本發(fā)明還涉及冠醚結(jié)合(多)肽作為#~飾(多)肽的合成中的 中間產(chǎn)物的用途，其中所述(多)肽在一個或多個羧基上通過酯化 或碌u酯化和/或在N-端氨基酸的氨基上通過酰胺化或烷基化得到i^ 飾。在本發(fā)明的用途的一種優(yōu)選實施方式中，所述修飾(多)肽通 過本發(fā)明的方法而獲得。
本發(fā)明還涉及一種可通過本發(fā)明方法而獲得的修飾(多)肽。
本發(fā)明還包括一種(多)肽，其由下述物質(zhì)所^"飾 一種或多 種生物相容性聚合物、脂質(zhì)、包括一個羥基的連接物、第二(多) 肽、寡核苷酸、(前體)藥物、標(biāo)記物、標(biāo)簽、曱醇或苯曱醇分子、 具有一個同源轉(zhuǎn)運載體的小分子或它們的任意組合，其中所述生物 相容性聚合物、脂質(zhì)、連接物、第二 (多)肽、寡核苷酸、(前體) 藥物、標(biāo)記物、標(biāo)簽或甲醇、苯甲醇分子或具有一個同源轉(zhuǎn)運載體 的小分子通過酯鍵或硫酯鍵連接于(多)肽羧基上，和/或其在N-端氨基酸的氨基上被酰胺化或烷基化。下文中提供了 (多)肽的實 例，其中羧基通過用曱醇或苯曱醇得到酯化。此外，可分別由4-(2-
羥乙基)-2-2-二曱基-l,3-二氧戊環(huán)進行酯化(見實施例1 (b))或由 石克代甘油進行硫酯化(見實施例2 )。
在本發(fā)明的(多)肽的一種優(yōu)選實施方式中，所述(多)肽羧 基選自以下的組(a) Glu的一個或多個側(cè)鏈羧基；(b ) Asp的一 個或多個側(cè)鏈羧基；(c ) C-端氨基酸的主鏈羧基；或(d) ( a)至(c ) 的l壬意纟且合。
在本發(fā)明的(多)肽的另一種優(yōu)選實施方式中，所述連4妻物攜 帶下列一種或多種(a)生物相容性聚合物；(b)脂質(zhì)；(c)連接 物；(d)第二(多)肽；(e)寡核苦酸；(f)(前體)藥物；(g)標(biāo) 記物；(h)標(biāo)簽；(i)具有一個同源轉(zhuǎn)運載體的小分子；或(a)至 (i)的任意組合。優(yōu)選地，所述生物相容性聚合物選自以下的組聚醚、多糖、 聚酯(包括多正酯類)、聚氰基丙烯酸酯、羥烷基丙烯酰胺 (hydroxyalkylacrylamides )、表面活'性劑以及它們的〉'昆合物。
優(yōu)選地，所述生物相容性聚合物是分支和/或交聯(lián)的。
優(yōu)選地，聚醚是PEG或聚酯是聚乳酉^/聚乙醇酸。
優(yōu)選地，所述第二 (多)肽是一種膜穿透(多)肽。
在本發(fā)明(多)肽的一種優(yōu)選實施方式中，所述第二 (多)肽 被連接至一種(前體)藥物分子。
優(yōu)選地，所述(前體)藥物是一種抗癌(前體)藥物。
優(yōu)選地，所述寡核苦酸選自以下的組反義寡核苷酸、siRNA 以及核酶。
在一種優(yōu)選實施方式中，所述(多)肽是一種抗體或保留了其 結(jié)合特異性的所述抗體的片斷或衍生物。
本發(fā)明還涉及一種抗體或保留了其結(jié)合特異性的所述抗體的 片斷或書f生物，其攜帶一個或多個通過酯4建或碌u酯4建與所述抗體或 其片斷或衍生物的一個或多個羧基連接的連接物，其中所述連接物 攜帶一個膜穿透(多)肽，該膜穿透多肽又?jǐn)y帶一個(前體)藥物 分子。才艮據(jù)本發(fā)明的這種結(jié)構(gòu)允許將藥物遞送至特定的細(xì)胞類型
現(xiàn)的，例如，通過該抗體或其片斷或衍生物，識別存在于通過治療 性調(diào)節(jié)(intervention)而4皮耙向的一種或多種細(xì)胞類型上的細(xì)胞表 面才示t己。酯鍵或硫酯鍵的裂解導(dǎo)致膜穿透(多)肽與(前體)藥物的軛
合物(conjugate)釋方文。膜穿透(多)肽又允i午進入細(xì)月包和存在于 細(xì)胞內(nèi)，活性化合物被(例如通過胞內(nèi)酶)從膜穿透(多)肽中開 裂，并且如果其為前體藥物，則使其具有活性。在圖6中示出了本 發(fā)明的這種實施方式。
本發(fā)明另外還包含一種藥物組合物，包4舌本發(fā)明的(多)肽和 /或抗體或其片斷或形f生物。
應(yīng)考慮個體患者的臨床病癥、藥物組合物的遞送位點、給藥方 法、鄉(xiāng)會藥時間安排、以及醫(yī)生已知的其他因素，以與良好醫(yī)療實踐 (good medical practice )才目一致的方式只t^亥藥凈勿纟且合凈勿進4亍酉己制和 纟合藥。因此，為此目的的該藥物組合物的"有#文量"由這些考慮因素 所決定。
技術(shù)人員了解的是，每個人使用的藥物組合物的有效量將尤其 耳又決于4匕合物(compound)的斗生質(zhì)(nature )。例長口，長口果戶斤述纟且合 物為一種(多)肽或蛋白，非腸胃給藥的每劑藥物組合物的總藥用 有效量為患者體重的大約1嗎蛋白質(zhì)/kg/天至10 mg蛋白質(zhì)/kg/天 的范圍內(nèi)，然而，如上所示，這應(yīng)服從于治療的決定。更加優(yōu)選地， 這種劑量為至少0.01 mg蛋白質(zhì)/kg/天，并且對于人最優(yōu)選的是大約 0.01和1 mg蛋白質(zhì)/kg/天。如果連續(xù)給藥，藥物組合物通常通過每 天1-4次注射或通過(例如使用微泵)進行持續(xù)的皮下注射，以大 約1 ng/kg/小時至大約50嗎/kg/小時劑量率進行給藥。也可采用靜 月永車lr液(intravenous bag solution )。用于^L察變4匕的治療以及用于發(fā) 生反應(yīng)的間隔的隨后治療的時間長度依賴于所需效果而不同。
本發(fā)明的藥物組合物可經(jīng)口服、直腸內(nèi)、腸胃夕卜、池內(nèi)、陰道 內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(如由粉劑、軟膏劑、滴劑或透皮貼劑)給藥、 含服、或作為口腔或鼻腔噴霧而給藥。"藥學(xué)上可接受的載體，，意指一種無毒固體、半固體或液體充填劑、稀釋劑、封裝材料或任意類
型的配制助劑(formulation auxiliary )。如本文所用的術(shù)語"腸胃外 的"涉及包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下以及關(guān)節(jié)內(nèi)注 射和，俞注的*合藥方式。
該藥物組合物也可通過持續(xù)釋放系統(tǒng)適當(dāng)給藥。持續(xù)釋放組合 物的適合實例包括成形物(shaped articles )形式的半滲透性聚合材 料，如，薄膜、或微嚢。持續(xù)釋放材料包括聚交酯(美國專利第 3,773,919號，EP 58,481 )、 L-谷氨酸和y-乙基-L谷氨酸的共聚物 (Sidman， U. et al., Biopolymers 22:547-556(1983))、聚(2-羧乙基異 丁烯臥更酯)(R. Langer et al.， J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277(1981) 和R. Langer, Chem. Tech. 12:98-105(1982))、乙烯醋酸乙烯酯(R. Langer et al.， Id.)或聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988 )。持續(xù)釋力文藥 物組合物還包括脂質(zhì)體捕獲的化合物。包4舌所述藥物組合物的脂質(zhì) 體其本身通過已知方法制備。DE 3,218,121; Epstein et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692(1985); Hwang et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)77:4030-4034(1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88，046; EP 143,949; EP 142,641; Japanese Pat. Appl. 83-118008; U.S. Pat. Nos. 4,485,045和4，544，545;以及EP 102,324。通常，脂質(zhì)體具有小的(大 約200-800埃)單層類型，其中脂質(zhì)成分多于約30 mol。/。的膽固醇， 所選擇的比例隨最佳治療進行調(diào)節(jié)。
對于腸胃外給藥，所述藥物組合物通常是通過將其以所需純 度，與一種藥學(xué)可接受載體(即， 一種對于接受者，以使用的劑量 或濃度，是無毒的并且可與組合物中的其他成分相容的載體)混合 在一個單位劑量的可注射形式(溶液、混懸液、或乳狀液)中來配制。
通常，該劑型通過將藥物組合物的組分與液態(tài)載體或細(xì)分的固 體載體或其二者均一并緊密地接觸來制備的。然后，如果需要，可將產(chǎn)品制成所需劑型的形狀。載體優(yōu)選地是一種腸胃外載體，更加 優(yōu)選地是一種與受體的血液等滲的溶液。這種載體介質(zhì)的實例包括 水、生理鹽水、林才各氏溶液、以及葡萄糖溶液。也可以使用諸如非 揮發(fā)油和油酸乙酯以及脂質(zhì)體的非水載體。該載體適當(dāng)?shù)匕倭?諸如增強等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)的添加劑。這種材^牛對于以該 劑量和濃度使用的受體是無毒的，且包括緩沖液，例如磷酸鹽、檸
檬酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸、以及其他有機酸或它們的鹽；抗氧化劑， 例如抗壞血酸；l氐分子量(少于大約IO個殘基)的(多)肽，如， 聚精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白； 親水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、 天門冬氨酸、或精氨酸；單糖、雙糖、以及其他包括纖維素或其衍 生物、葡萄糖、甘露糖或糊精的碳水化合物；諸如EDTA的螯合劑； 諸如甘露醇或山梨醇的糖醇；諸如鈉的平4軒離子；和/或諸如聚山梨 醇酯、聚羥體(poloxamer，聚羥亞烴)、或PEG的非離子型表面活 性劑。
用于治療性纟會藥的藥物組合物的組分必須是無菌的?？赏ㄟ^過 濾除菌膜(如，0.2孩史米的膜)進行過濾而輕易實現(xiàn)無菌。藥物組 合物的治療組分通常^皮置于一個具有無菌通口 (access port)的容 器(例如^爭脈輸液包或具有一個可由靜脈注射針穿透的塞子的小 瓶)中。
作為一種7jc溶'液或作為一種用于重新配制的凍干配方(制劑，
formulation)的藥物組合物的組分，通常儲存在單位劑量或多劑量 的容器內(nèi)(例如，密封的安瓿瓶或小瓶)。如一種凍干配方的實例， 在10 ml小瓶中裝入5ml無菌過濾的l°/。(w/v)的水溶液，并將得 到的混合物進4亍凍干。輸注溶液是通過〗吏用抑菌的注射用水重新配 制凍干復(fù)合物而制備的。本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的(多)肽用于制造一種用于治療疾病
的藥物組合物的應(yīng)用，其中(a)所述(多)肽是月夷島素而所述疾 病為糖尿??；(b)所述(多)肽是EPO而所述疾病是貧血癥或慢性 腎衰竭；(c)所述(多)肽是G-CSF而所迷疾病是嗜中性白細(xì)胞減 少癥；(d)所述(多)肽是一種天冬酰胺酶而所述疾病是癌癥；(e) 所述(多)肽是凝血第VII因子(FactorVII)而所述疾病是不可控 出血；(f)所述(多)肽是干擾素oc而所述疾病是慢性乙型或丙型
肝炎；(g)所述(多)肽是干擾素y而所述疾病是纖維變性、結(jié)核 病、腦膜炎或癌癥；(h)所述(多)肽是B2036而所述疾病是肢端 肥大癥；(i)所述(多)肽是一超氧化物歧化酶而所述疾病是腦損 傷；(j)所述(多)肽是白細(xì)胞介素-2而所述疾病是癌癥或要求免 疫刺;效(condition requiring immunostimulation )的習(xí)犬)兄；(k)戶斤述 (多)肽是水蛭素而所述疾病是肝素誘發(fā)的血小板減少癥或心絞 痛，并且其中所述(多)肽經(jīng)如上文所限定的<'務(wù)飾。這種實施方式 涉及具有已知生物學(xué)活性并且是已確定的治療相關(guān)性(多)肽的應(yīng) 用，該治療相關(guān)性(多)肽根據(jù)本發(fā)明被修飾從而改變、增強或改 善它們的藥理性質(zhì)。應(yīng)理解的是本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明進行修飾 的另外的治療相關(guān)(多)肽的應(yīng)用。在這種情況下，設(shè)想的醫(yī)學(xué)適 應(yīng)癥是能夠通過考慮中的(多)肽得到預(yù)防、改善或治愈的適應(yīng)癥。
人生長激素(hGH)拮抗劑B2036是本領(lǐng)域中公知的。B2036 是由hGH通過引入9個氨基酸置換而獲得的，其被賦予了拮抗特 性并增強了受體親和力(參見美國專利第5,849,535號)。為了治療 肢端肥大癥，可以設(shè)想任何其他的生長激素(GH )-受體拮抗劑(可 替代地或除GH-受體拮抗劑B2036之外的)。優(yōu)選的可用天門冬酰 胺酶進4亍治療的癌癥形式為、淋巴細(xì)月包白血病和大細(xì)月包'淋巴瘤。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的一種(多)肽的應(yīng)用，其中所述(多) 肽與一種抗癌(前體)藥物連^妾，以制造用于治療癌癥的藥物組合 物。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多肽(其為一種抗體、抗體的片斷或衍 生物)或本發(fā)明的抗體或其片斷或衍生物用于制造一種用于治療癌 癥的藥物組合物的應(yīng)用，其中所述(前體)藥物是一種抗癌(前體) 藥物且所述(多)肽或抗體或其片斷或衍生物特異地結(jié)合一種腫瘤 相關(guān)抗原。術(shù)語"腫瘤相關(guān)抗原"是本領(lǐng)域中公知的并指代被肺瘤細(xì)
胞優(yōu)先或?qū)嵸|(zhì)上唯一 (exclusively)表達的抗原。優(yōu)選的是所述腫 瘤相關(guān)纟元原在"中瘤細(xì)"包的表面上表達。
在所述應(yīng)用的一種優(yōu)選實施方式中，所述腫瘤相關(guān)抗原選自以 下的組CD30、 CD70、 CanAg、 CD22、 PSMA、 CD56、 Lewis7、 CD33、 CD20、 CD44v6、 CG56972、 CD52、 HER2/廳、HER2、 ErbB2、 VEGF、 VEGFR2、 EGFR、 TRAIL-R1以及PEM。
在本發(fā)明的應(yīng)用的另一種優(yōu)選實施方式中，所述特異結(jié)合所述 特定腫瘤相關(guān)抗原的(多)肽或抗體或抗體片斷或書于生物將用于特 定形式的癌癥。在那些情況下，其中所述(多)肽或抗體或抗體片 斷或書亍生物特異地結(jié)合CD30，才艮據(jù)這種優(yōu)選實施方式可治療何杰 金(氏)淋巴瘤或非何杰金(氏)淋巴瘤；同樣CD70是腎細(xì)胞癌 相關(guān)細(xì)胞所提供的一種抗原；CanAg是胃腸癌和非小細(xì)胞肺癌相關(guān) 細(xì)月包^是供的一種抗原；CD22, B細(xì)月包白血?。籔SMA,前列&泉癌； CD56,小細(xì)胞肺癌和神經(jīng)內(nèi)分泌多發(fā)性骨髓瘤；LewisY，非小細(xì)胞 肺癌、結(jié)腸癌和胃癌；CD33,急性骨髓性白血??；PEM,卵巢癌； CD44v6，頭頸癌和乳&袈癌；HER2，乳&泉癌；GC56972,黑素瘤； EGFR和VEGF，轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌；CD52， 'f曼性'淋巴細(xì)月包白血病以及 CD20，復(fù)發(fā)性/頑固性非何杰金(氏)淋巴瘤。圖
1:(多)肽羧基的直接(a)和間接或兩步(b)酯化作用。
圖
2:生物體內(nèi)酯4建形成的可逆性。
圖
3:抗體羧基的直接酯化作用。
圖
4:抗體的兩步^f奮飾。"PTD"代表蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域。
圖
5:才艮據(jù)本發(fā)明的(多)肽兩步《奮飾的第二步中涉及的示例 性官能團。
圖
6:示例性抗體-吸收強化因子(脂質(zhì)或蛋白-轉(zhuǎn)導(dǎo)域)-藥物 輒合物以及其在人體或動物體內(nèi)的^各徑。
圖7:表現(xiàn)增強的吸收/轉(zhuǎn)運特性的修飾(多)肽。
圖
8:修飾(多)肽，其具有n個(拷貝數(shù))通過可逆酯鍵連 接從而實現(xiàn)在分子表面上的保護作用的聚合物。分子的保護作用通 過聚合物以足夠數(shù)量的聚合物拷貝數(shù)的遮蔽而獲得的。
圖
9:修飾(多)肽，其由與(多)肽連接的交聯(lián)的生物相容 性聚合物分子產(chǎn)生的保護作用所保護，避免了酶促消化。該(多) 肽也表現(xiàn)增強的吸收。
圖
10:曱醇中的[N畫曱酰-Trp57]PSC畫Rantes的酯4匕的MS。
圖
11: PSC-Rantes與4-(2-羥乙基)-2-2-二曱基-l,3-二氧戊環(huán)的 酯4匕作用的HPLC (上部)和MS (下部)。圖12: M8石危代甘油酯化作用的HPLC和MS:峰1 (形成1 種酯)，峰2 (形成2種酯)。
圖13:(多)肽N-端修飾的示例性反應(yīng)順序。
圖14:與冠醚的絡(luò)合作用對于生物活性的影響。(a) [N-曱酰 Trp57 PSC-Rantes]對于HIV-1的融合抑制活性的生物測定(兩次重 復(fù))；(b)在與18-冠-6結(jié)合及在曱醇中溶解后的[N-曱酰-Trp57 PSC-Rantes]的生物測定(兩次重復(fù))。在甲醇蒸發(fā)且通過在HPLC 柱上過濾而進4亍脫鹽步驟之后，蛋白質(zhì)溶解在生理緩沖液中并4全測 HIV-1的融合抑制活性。
圖15: (a)用于通過半永久性羧基酯化策略，將Ac-EEED肽 轉(zhuǎn)運至細(xì)月包中，而i殳計的結(jié)構(gòu)。(b )用胰蛋白酶處理轉(zhuǎn)染了 a-SMA-EGFP結(jié)構(gòu)的大鼠胚月臺成纖維細(xì)胞(REF-52細(xì)胞) (C16ment et al.， J Cell Sci. 118, 1395-1404(2005))，蓋上蓋玻片,在 DMEM/2°/。FCS中力文置1天，并在沒有FCS的DMEM中(37°C， i咅 養(yǎng) 箱 中 ) 用 SMA- 肽 ( 5昭/ml)處 理45min。在DMEM中漂洗細(xì)胞，用ly。PFA固定，并制成標(biāo)本用 于共聚焦顯孩t鏡(LSM510, Carl Zeiss )觀察。a-SMA-EGFP轉(zhuǎn)染細(xì) 月包不進行處理(對照；左側(cè))，或用 SMA-肽 [Ac-E(OBzl)-E(OBzl)-E(OBzl)-D(OBzl)-K(Ac)-CONH2](右側(cè))處理 45分鐘。SMA-FP處理導(dǎo)致a-SMA正應(yīng)力纖維消失。
圖16:在有初》容劑中與冠醚之間的結(jié)合對生物活性的影響。 (a)趨化因子PSC-Rantes對于HIV-1融合抑制活性的生物測定； (b )PSC-Rantes在與18-冠-6結(jié)合以及在曱醇中〉容解6小時后的生
物測定。在甲醇蒸發(fā)及脫鹽步驟后，蛋白溶解在生理緩沖液中，并
才檢測其對HIV-1的融合抑制活性。圖17:序列FAPMSQQSTSCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKC SNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS的 一 個稱為 L2P7的趨化因子與一個短PEG ( HOCH2CH2(OCH2CH2)2OH )的酯 化作用結(jié)果。HPLC曲線(HPLC trace )(上面)和MS譜(下面)。
具體實施例方式
以下實施例舉例說明了本發(fā)明但不應(yīng)理解為進行限制。 實施例1
利用4斤疊PSC-Rantes的酯^>實聰，
(a)甲基-西旨的形成。
將[N-甲酰-Trp57 ]PSC-Rantes 0.5 mg， (MW=7921 )與2.5 mg 的18-冠-6在DCM/甲醇混合物中進行復(fù)合。然后蒸發(fā)溶劑而將殘 留物轉(zhuǎn)移(takenup)至0.2ml的甲醇中。4妾下來加入11 (xl的三甲 基氯硅烷并隨后在室溫下反應(yīng)lh。主峰的質(zhì)謙顯示了與4種酯的形 成(MW=7977) —致的主要產(chǎn)品，以及5種酯(MW=7991 )和6 種酉旨(MW=8006)的曲線(參見圖10)。
作為對照，將PSC-Rantes的甲酰-Trp衍生物樣品如上所述地與 18-冠-6進4亍配4立。然后將樣品如上所述、溶解在甲醇中并在室溫下 放置lh。甲醇3皮蒸發(fā)，而將蛋白質(zhì)通過HPLC進行脫鹽以去除18-冠-6。 3奪蛋白利用R5-tropic包月莫(tropic envelope)-依賴的細(xì)月包融 合測定法，對于HIV-1的融合抑制活性進4亍才企測(Hartley, O. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101， 16460-16465(2004))并發(fā)現(xiàn)其與標(biāo)準(zhǔn) 樣品一樣有效，從而證明了蛋白質(zhì)與冠醚的配位及溶解不會導(dǎo)致生 物活性的喪失(參見圖14和16)。(b) 4陽(2畫羥乙基)國2-2-二曱基-l,3-二氧戊環(huán)(MW 146.18)酉旨
的形成。
將0.5 mg的PSC-Rantes ( MW=7894 )與2.5 mg的18-冠-6在 DCM/曱醇混合劑中進行配位。然后蒸發(fā)溶劑而將殘留物轉(zhuǎn)至0.2ml 的4-(2-羥乙基)-2-2-二甲基-l,3-二氧戊環(huán)中。接下來力口入11 pi的三 甲基氯硅烷并隨后在室溫下反應(yīng)45分鐘。lh后，HPLC的主峰(圖 11,上部)顯示了大約50%的一種酯的形成。尤其是，二氧戊環(huán)的 環(huán)打開且產(chǎn)物的MS與一個丙酮分子的丟失相一致。這種效果大相無 是由于(酸性條件下)由三甲基氯硅烷產(chǎn)生的HC1引起的環(huán)狀結(jié)構(gòu) (具有痕量的水)發(fā)生的水解作用。相應(yīng)的MS質(zhì)譜在圖11的下 部示出。
實施例2
趨化因子M8酯化作用
硫代甘油(Mw 108.1 )酯已用由噬菌體表面展示技術(shù)獲得的稱 為M8的新的趨化因子(由Dr. Oliver Hartley捐贈)形成。將0.25mg 的趨化因子M8 (MW=7995.3 )如前述與18-冠-6配合。蒸發(fā)溶劑 并將殘留物轉(zhuǎn)至O.lml的無水碌i/f戈甘油中。然后加入5pl的三甲基 氯石圭烷并隨后在室溫下反應(yīng)30至60分鐘。相應(yīng)的HPLC凄t據(jù)和 MS"i普在圖12中示出。
實施例3
才寞式趨化因子L2P7的酯化作用
將0.2mg的Ms 7976.5的折疊趨化因子L2P7與18-冠-6配合， 溶解在0.1M的商購的PEG ( HOCH2CH2(OCH2CH2)2OH )中。然后，加入8 pl的三甲基氯硅烷并隨后在室溫下反應(yīng)30分鐘和90分鐘。 在t=90分鐘時的相應(yīng)HPLC凄t據(jù)和MS譜在圖17中示出。MALDI MS示出了相應(yīng)于與2個PEG分子力口合的Ms 8242.94的峰，以及相 應(yīng)于與3個PEG分子加合的8374.89的峰。
實施例4
酯化肽的細(xì)胞穿透特性
Ac-EEED是一種短肽，許多研究中已表明其使用顯微注射 (Chaponnier et al. JCB, 1995 )和融合至PTD中(Hinz et al. JCB， 2002)， /人而能夠阻斷a-平滑月幾-月幾動蛋白(a-SMA)的聚合，并因 此調(diào)節(jié)應(yīng)力纖維的形成，這在許多生理過程中都有所涉及，最顯著 的是在傷口愈合過程中的成肌纖維細(xì)胞的收縮行為。這個實施例涉 及4吏用結(jié)合一個C端賴氨酸殘基的合成肽的半永久性羧基酯化策 略肽的遞送，其中所述肽的羧基端被酰胺化并且s氨基被乙?；?作為柄(handle)與示蹤劑(熒光染料、生物素等，圖15 (a))相 連。檢測了四種結(jié)構(gòu)，其保護的酯部分的親脂性有所不同。具有被 苯曱基酯化的羧酸鹽的模板表現(xiàn)出向細(xì)胞中的穿透，通過對預(yù)期生 物活性的4全測來監(jiān)控所述細(xì)胞(圖15 (b))。
即使穿透程度(通過與標(biāo)準(zhǔn)物的生物活性之間的比較來測量) 是不完全的，這可由我們的模板在水中的難溶性和/或由每個分子中 的每個酯部分的非定量分解而容易地得到解釋。因此，例如在賴氨 酸側(cè)鏈上作為乙?；奶娲铮蛟贑"上，引入聚乙二醇(PEG) 鏈，將同時有利于分子的水相分配和酯基的溶劑化(solvatation)， 立刻解決了這兩個問題。
其他參考文獻Botti, P. et al"尸印A 5W. 2， 371-380(1996)。 Julian et al., /"A / Maw 5^ e"ram. 210, 613(2001)。 Oshima, T. et al.， Wowacrawo/ecw/e s. 3, 438-444(2002)。 Roberts, M. J. et al"扯.^wgDe/zv. Wev. 54, 459-476(2002)。 Tsubery et al" 乂CTz纖279, 38118-38124(2004)。 Yamada, T. et al" /麼g. C7z纖39， 3049-3056(2000)。
權(quán)利要求
1. 一種生產(chǎn)修飾(多)肽的方法，所述方法包括以下步驟在有 才幾溶劑中，通過在一個或多個羧基上進4亍酯化或石危酯化，和/ 或通過在N-端氨基酸的氨基上進4于酰胺化或烷基化，3于冠醚 結(jié)合(多)肽進行修飾。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述酯4建或石克酯鍵的修飾 是通過與以下物質(zhì)中的一種或多種形成一個或多個酯4建或石克 酯鍵來實現(xiàn)(a) 生物相容性聚合物；(b) 脂質(zhì)；(c) 包括一個羥基或巰基的連接物分子；(d) 所述(多)肽的側(cè)鏈羥基；(e) 寡核香酸；(f) (前體)藥物；(g) 標(biāo)記物；(h) 標(biāo)簽；(i) 曱醇或苯曱醇分子；(j)具有同源轉(zhuǎn)運載體的小分子； 以及(a)至(j)的任意組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述羧基選自以下組 成的組(a ) —個或多個Glu側(cè)鏈羧基；(b ) —個或多個Asp側(cè)鏈羧基；(c) C-端氨基酸的主鏈羧基；以及(d) (a)至(c)的任意組合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，所述方法包括所述連 才妄物與選自以下的組中的 一種或多種物質(zhì)的分子進4亍反應(yīng)的 更多步驟(a) 生物相容性聚合物；(b) 脂質(zhì)；(c) 連接物；(d) 第二 (多)肽；(e) 寡核香酸；(f) (前體)藥物；(g) 標(biāo)記物；(h) 標(biāo)簽；(i) 具有同源轉(zhuǎn)運載體的小分子； 以及(a)至(i)的任意組合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述反應(yīng)在水性介質(zhì)中實 現(xiàn)。
6. 才艮據(jù)權(quán)利要求2至5中任一項所述的方法，其中，所述生物相 容性聚合物選自以下的組聚醚、多糖、包括多正酯類的聚酯、 聚氰基丙烯酸烷基S旨、羥烷基丙烯酰胺、表面活性劑以及它們 的混合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項所述的方法，其中，所述生物相 容性聚合物是分支和/或交聯(lián)的。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中，所述聚醚是PEG或 所述聚酯是聚(乳酸/乙醇酸)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2至8中任一項所述的方法，其中，所述第二(多) 肽是一種膜穿透(多)肽或由胃-腸(GI)轉(zhuǎn)運載體識別并轉(zhuǎn) 運的(多)肽。
10. 根據(jù)權(quán)利要求2至9中任一項所述的方法，其中，所述第二(多) 肽與(前體)藥物分子連接。
11. 根據(jù)權(quán)利要求2至10中任一項所述的方法，其中，所述(前 體)藥物是一種抗癌(前體)藥物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求2至11中任一項所述的方法，其中，所述寡核 芬酸選自由反義寡核苦酸、siRNA和核酶組成的組。
13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述(多)肽 斷或書f生4勿。
14. 才艮據(jù)前述^又利要求中任一項所述的方法，其中，所述冠醚選自 以下的組18-冠-6、 12-冠-4、 15-冠-5、苯并-18-冠-6、 二苯并 -18畫冠-6、 12畫冠-4、 15-冠-5、 (12隱冠匿4)-2-甲醇、18國冠-6四羧 酸、(18-冠-6)-2-曱醇、苯并-15-冠-5、 二苯并-15-冠-5、 4，-氨 基-苯并-15-冠-5、 4，-氨基-苯并-18-冠-6以及諸如杯[4]芳烴、 杯[6]芳烴、杯[8]芳烴，和杯[6]芳烴-六乙酸六乙酯的杯芳烴。
15. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述冠醚是 18-冠-6。
16. —種冠醚結(jié)合(多)肽作為修飾(多)肽合成中的中間體的應(yīng) 用，其中，所述(多)肽通過在一個或多個羧基上的酯化或石克 酯化，和/或通過在N-端氨基酸的氨基上的酰胺化或烷基化得 到》務(wù)飾。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其中，所述修飾(多)肽是通 過權(quán)利要求2至15中任一項所述的方法而獲得的。
18. —種可通過4又利要求1至15中任一項所述的方法而獲得的》務(wù) 飾(多)肽。
19. 一種由一個或多個生物相容性聚合物、脂質(zhì)、包括一個羧基的 連接物、第二 (多)肽、寡核苷酸、(前體)藥物、標(biāo)記物、 標(biāo)簽、甲醇或苯曱醇分子、具有同源轉(zhuǎn)運載體的小分子或它們 的任意組合而^f奮飾的(多)肽，其中，所述生物相容性聚合物、 脂質(zhì)、連接物、第二 (多)肽、寡核苷酸、(前體)藥物、標(biāo) 記物、標(biāo)簽、曱醇或苯甲醇分子或具有同源轉(zhuǎn)運載體的小分子 通過酯鍵或硫酯鍵與(多)肽羧基連接，和/或所述多肽在所 述N-端氨基酸的氨基上被酰胺化或烷基化。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的(多)肽，其中，所述(多)肽羧基 選自以下的纟且(a) —個或多個Glu側(cè)鏈羧基；(b) —個或多個Asp側(cè)鏈羧基；(c) C-端氨基酸的主鏈羧基；或(d) (a)至(c)的任意組合。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的(多)肽，其中，所述連接物攜 帶以下物質(zhì)中的一種或多種(a) 生物相容性聚合物；(b) 脂質(zhì)；(c) 連接物；(d) 第二 (多)肽；(e) 寡核苷酸；(f) (前體)藥物；(g) 標(biāo)記物； (h )標(biāo)簽；(i)具有同源轉(zhuǎn)運載體的小分子； 或(a)至(i)的任意組合。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19至21中任一項所述的(多)肽，其中，所述 生物相容性聚合物選自以下的組聚醚、多糖、包括多正酯類 的聚酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、羥烷基丙烯酰胺、表面活性劑 以及它們的混合物。
23. 根據(jù)權(quán)利要求19至22中任一項所述的(多)肽，其中，所述 生物相容性聚合物是分支和/或交聯(lián)的。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的(多)肽，其中，所述聚醚是 PEG或所述聚酯是聚(乳酸/乙醇酸)。
25. 根據(jù)權(quán)利要求19至24中任一項所述的(多)肽，其中，所述 第二 (多)肽是一種膜穿透(多)肽或由胃-腸(GI)轉(zhuǎn)運載 體識別并轉(zhuǎn)運的(多)肽。
26. 根據(jù)權(quán)利要求19至25中任一項所述的(多)肽，其中，所述 第二(多)肽與(前體)藥物分子連接。
27. 才艮據(jù)權(quán)利要求19至26中任一項所述的(多)肽，其中，所述(前體)藥物是一種抗癌(前體)藥物。
28. 才艮據(jù)4又利要求19至27中任一項所述的(多)肽，其中，所述 寡核香酸選自由反義寡4亥苷酸、siRNA和4亥酶《且成的纟且。
29. 才艮據(jù)權(quán)利要求19至28中任一項所述的(多)肽，其中，所述(多)肽是一種抗體或者其中保留了所述抗體結(jié)合特異性的所 述才元體的片斷或書于生物。
30. —-片斷或衍生物，攜帶通過酯鍵或硫酯鍵與所述抗體或其片斷或 衍生物的一個或多個羧基連接的一種或多種連接物，其中，所 述連接物攜帶膜穿透(多)肽，所述膜穿透(多)肽又?jǐn)y帶(前 體)藥物分子。
31. —種藥物組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求18至29中任一項所述的(多)肽和/或4又利要求30所述的抗體或其片斷或書f生物。
32. 根據(jù)權(quán)利要求18至25中任一項所述的(多)肽用于制造治療 疾病的藥物組合物的應(yīng)用，其中(a) 所述(多)肽是胰島素，所述疾病是糖尿??；(b) 所述(多)肽是EPO，所述疾病是貧血癥或慢性腎衰竭；(c) 所述(多)肽是G-CSF,所述疾病是嗜中性白細(xì)胞 減少癥；(d) 所述(多)肽是天(門)冬酰胺酶，所述疾病是癌癥；(e) 所述(多)肽是凝血第VII因子，所述疾病是不可 控出血；(f) 所述(多)肽是干擾素a，所述疾病是慢性乙型或 丙型肝炎；(g) 所述(多)肽是干擾素y,所述疾病是纖維變性、 結(jié)才亥病、腦力莫炎或癌癥；(h) 所述(多)肽是B2036,所述疾病是月支端月巴大癥；(i) 所述(多)肽是超氧化物歧化酶，所述疾病是腦損傷；(j)所述(多)肽是白細(xì)胞介素-2，所述疾病是癌癥或 一種需要免疫刺激的狀況；(k)所述(多)肽是水蛭素，所述疾病是肝素誘導(dǎo)的血 小4反減少癥或心絞痛，以及其中，所述多肽如根據(jù)權(quán)利要求19至25中任一項中所 限定的進行+務(wù)飾。
33. 根據(jù)權(quán)利要求18、 26或27所述的(多)肽在用于制造治療癌 癥的藥物《且合物中的應(yīng)用。
34. 根據(jù)權(quán)利要求18或29所述的(多)肽或根據(jù)權(quán)利要求30所 述的抗體或其片斷或衍生物在用于制造治療癌癥的藥物組合 物中的應(yīng)用，其中，所述(前體)藥物是一種4元癌(前體)藥 物而所述(多)肽或抗體或其片斷或書f生物與腫瘤相關(guān)的抗原 特異性結(jié)合。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的應(yīng)用，其中，所述腫瘤相關(guān)的抗原選 自以下的組CD30、 CD70、 CanAg、 CD22、 PSMA、 CD56、LewisY、 CD33、 CD20、 CD44v6、 CG56972、 CD52、 HER2/neu、 HER2、 ErbB2、 VEGF、 VEGFR2、 EGFR、 TRAIL-R1以及 PEM。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)修飾(多)肽的方法，所述方法包括以下步驟在一種有機溶劑中，通過在一個或多個羧基上進行酯化或硫酯化，和/或通過在N-端氨基酸的氨基上進行酰胺化或烷基化，對一種冠醚結(jié)合(多)肽進行修飾。本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明方法獲得的(多)肽和抗體以及它們的醫(yī)療用途。
文檔編號C07K1/107GK101312986SQ200680043622
公開日2008年11月26日 申請日期2006年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月28日
發(fā)明者保羅·博蒂 申請人:日內(nèi)瓦大學(xué)