專利名稱：：一種紅景天苷的分離制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及天然藥物的分離，具體地說是一種通過工業(yè)色譜技術(shù)從傳統(tǒng)中藥紅景天中分離紅景天苷的制備方法。
背景技術(shù)：
：紅景天為景天科紅景天屬(RhodiolaL.)多年生草本或亞灌木植物，常具肉質(zhì)，匍匐的根狀莖，全世界有90多種，中國有70多種。民間多用以治療咳血、咯血、肺熱咳嗽、跌打損傷、燒燙傷。近年通過研究發(fā)現(xiàn)了許多新的藥理作用，紅景天具有抗缺氧、抗衰老、抗疲勞、抗不良刺激、對機(jī)體雙向調(diào)節(jié)、抗病毒及抗腫瘤、以及降血脂等生物醫(yī)學(xué)作用(VAKurk,PharmChemJ，1986,20(10):1237;尹桂山等.營養(yǎng)學(xué)報，1992，14(1):98;謝印芝等.中華航空醫(yī)學(xué)雜志,1994,5(2):98;葉子聰?shù)?中國藥理學(xué)報，1993，14(5):424;姜義等.中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志,1995,15(3):214;明海泉.藥學(xué)通報，1986,(6):373;明海泉等.紅景天研究進(jìn)展.中草藥,1988,19(5):37;于慶海等.沈陽藥學(xué)院學(xué)報，1986,6(4):235;尹旭輝等.解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,1996,14(6):405;孫非等.中草藥，1993,24(10):532;王薇等.白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,1997,23(1):20;王秀清等.紅景天素抗腫瘤作用的實驗研究.吉林中醫(yī)藥,1992,(3):40;錢錦康.高原醫(yī)學(xué)雜志,1988,107(2):9;趙生友等.癌變-畸變.突變,1997,19(6):370)。近年來國內(nèi)外競相研制、開發(fā)紅景天藥品和食品。紅景天苷，英文名salidroside,化學(xué)名"對羥苯乙基-P-D-吡喃葡萄糖苷(p-hydioxyp-henethyl-P-D-glucoside)",系統(tǒng)命名為卜(4-羥基)苯乙基-卩-0-吡喃葡萄糖苷。文獻(xiàn)報道紅景天甙為紅景天的主要成分(李建新等.中草藥，1998,29(10):659-676;陳紀(jì)軍等.云南植物研究.1999,21(4):525-530;EAKrasnov,etal.Khimprir.Soedin1979，(16):860;駱傳環(huán)等.王曙等.藥學(xué)學(xué)報,1992,27(2):117-120;EAKrasnov,etal.Khimprir.Soedin1984,(20):106;EAKrasnov,etal.Khimprir.Soedin1980，(16):756;彭江南等.中國中藥志,1994,19(11):676-702;馬忠武等.植物學(xué)報,1995,37(7):574;周凌云等.天然產(chǎn)物研究與開發(fā).2004,16(5):410-414;VAKurkinetal.KhimPrir.Soedin1982,(18):559;TTPangarova,etal.KhimPrir.Soedin1975,(11):334)。紅景天苷是紅景天中主要活性成分，具有增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶、改善心腦血管系統(tǒng)、抗疲勞、耐缺氧、抗衰老、增強(qiáng)免疫、抗病毒和保護(hù)臟器的作用，是一種很有開發(fā)前景的環(huán)境適應(yīng)元藥物(曲智威.中國實用中西醫(yī)雜志，2005，18(7):1063-1065)。文獻(xiàn)有關(guān)紅景天苷的提取分離制備的報道，基本上都是采取傳統(tǒng)的溶劑萃取、乙酸鉛沉淀、硅膠層析、活性炭吸附等方法(王威等.中草藥，1999，30(11):824-826;咸漠等.吉林大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報，1998，3:107-108;盧希賢等.中草藥，1980，4，147-148;丁朝武.分析測試學(xué)報，1997，16(1):38-41)，這些方法存在產(chǎn)品純度低、重現(xiàn)性差、耗時長、有機(jī)殘留嚴(yán)重、無法大規(guī)模生產(chǎn)等缺點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)品純度高、重現(xiàn)性好、周期短，可以大規(guī)模生產(chǎn)的紅景天苷分離制備方法。以滿足紅景天苷化合物標(biāo)準(zhǔn)品制備和大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的需要。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為1.一種紅景天苷的分離制備方法，其特征在于該方法包括的以下步驟1)提取稱取紅景天原藥材，粉碎，加入其重量8-12倍的水煎煮提取2-3次，每次1-3小時，得到提取液，將提取液濃縮至相對密度為1.10-1.15的浸膏，得到紅景天提取組分；2)醇沉將浸膏中加入乙醇使乙醇體積濃度達(dá)到50-70%，0-4。C冷藏靜置12-24小時，過濾，濾渣棄去，取濾液濃縮至相對密度1.05-1.10，回收乙醇；再加入乙醇使乙醇體積濃度達(dá)到75-80%，0-4'C冷藏靜置12-24小時過濾，濾渣棄去，取濾液濃縮揮發(fā)除去乙醇，樣品溶液經(jīng)過10000-25000轉(zhuǎn)/分鐘的高速離心機(jī)離心，得到紅景天醇沉組分；3)過膜將離心液經(jīng)過截留分子量3000-6000Da中空纖維膜分離儀分離，操作壓力為O.lMPa，截留液棄去，收集透過液；將透過液濃縮至0.2-0.8克/毫升，過0.2-0.4微米濾膜，即為紅景天膜分離組分；4)工業(yè)色譜分離以粒徑5-40微米的C18硅膠鍵合固定相為色譜填料，以甲醇和水為流動相，梯度洗脫，甲醇的體積濃度從0-100%變化，最好為從0-60%變化，收集目標(biāo)組分，冷凍干燥即為紅景天苷。將樣品進(jìn)行高效液相分析確定產(chǎn)品純度。所述色譜柱效為5000-15000塔板/米；色譜柱長為200毫米一600毫米，色譜柱內(nèi)徑為20毫米一300毫米。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1.樣品純度高，由于本發(fā)明采用了最先進(jìn)的工業(yè)色譜分離制備技術(shù)，色譜填料為高分離能力的ODS(硅膠C18健合固定相)分離材料，利用工業(yè)色譜的高分離能力，可以保證產(chǎn)品的純度達(dá)到98%以上。2.重現(xiàn)性好。本發(fā)明利用工業(yè)色譜系統(tǒng)和ODS穩(wěn)定的性能，可以保證紅景天苷分離制備的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。3.周期短。本發(fā)明從原藥材的粉碎提取到制備得到紅景天苷產(chǎn)品，只需要7天的時間。4.有機(jī)殘留低。由于本發(fā)明摒棄了傳統(tǒng)工藝中溶劑萃取、硅膠柱層析等工藝，采用了有機(jī)溶劑使用量較少的工業(yè)色譜方法，而且最終產(chǎn)品采用冷凍干燥處理，所以最終產(chǎn)品的有機(jī)溶劑殘留特別小。5.能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明所采用工藝非常容易實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，自動化，適于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。圖1為本發(fā)明實施例1工業(yè)色譜制備紅景天苷的制備色譜圖；圖2為本發(fā)明實施例1紅景天苷的高效液相分析色譜圖。具體實施方式實施例l將紅景天原藥材粉碎，定量稱取l千克，置于50升提取罐中，加入IO升水煎煮2小時，過濾，濾液保存?zhèn)溆茫瑸V渣中再加入10升水煎煮2小時，過濾，濾液與第一次合并，濾渣棄去。將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到240毫升至相對密度為1.12的浸膏。在浸膏中加入412毫升95%乙醇，充分?jǐn)嚢瑁?。C冷藏靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至160毫升，相對密度1.05，在濃縮液中加入854毫升95%乙醇，充分?jǐn)嚢瑁?。C冷藏靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至無醇味，濃縮液經(jīng)過高速離心機(jī)(20000轉(zhuǎn)/分鐘)離心，得到紅景天醇沉組分250毫升。將紅景天醇沉組分加入到截留分子量6000Da中空纖維膜分離儀的進(jìn)料罐中，調(diào)整操作壓力為O.lMPa，收集透過液，截留液棄去，透過液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至密度為0.5克/毫升，過0.22微米濾膜，得到紅景天膜分離組分30工業(yè)色譜系統(tǒng)依次由高壓二元梯度泵、高壓進(jìn)樣閥、色譜柱、紫外檢測器、色譜工作站組成。色譜柱柱長400毫米，內(nèi)徑80毫米，色譜填料為10-20微米的C18鍵合固定相，柱效為15000塔板/米，設(shè)定紫外檢測波長為280nm，設(shè)定洗脫梯度(見表l)，初始流動相(5%甲醇水)平衡色譜柱20分鐘，取紅景天膜分離樣品10ml，進(jìn)樣，按設(shè)定梯度洗脫，收集32分30秒至36分鐘組分。洗脫結(jié)束，再次平衡柱子，進(jìn)樣，收集洗脫組分。共進(jìn)樣三次(見圖1)，將三次收集得到的洗脫組分，合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10毫升，再通過冷凍干燥得到紅景天苷產(chǎn)品2.2克，將樣品進(jìn)行高效液相分析確定產(chǎn)品純度大于98%(見圖2)，取20毫克樣品進(jìn)行核磁分析，對結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。核磁數(shù)據(jù)1H畫R(C5D5N)S7.17(2H，d,J=8.0Hz,H隱4,8),7.09(2H,d，J=8.0Hz,H-5，7),4.86(1H,d,J=8.4Hz,Glc-H-l)，4.50(2H,br.d,J=11.5Hz,glc-H-6),4.01(2H,t,J=8.0Hz，H-l),2.99(2H,t,J=7.3Hz,H-2);13CNMR5C-l71.4，C-236.0，C-3129.9，C隱4130.7，C-5116.2，C隱6157.1，C-7116.2，C-8130.7，Glc-C畫l103.9,Glc-C-275.1，Glc-C-378.8，Glc-C-470.9，Glc-C-577.8，Glc-C-662.5。紅景天苷的結(jié)構(gòu)式為:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2將紅景天原藥材粉碎，定量稱取0.5千克，置于20升提取罐中，加入6升水煎煮1小時，過濾，濾液保存?zhèn)溆?，濾渣中再加入5升水煎煮3小時，過濾，濾液與第一次合并，濾渣棄去。將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到140毫升至相對密度為1.10的浸膏。在浸膏中加入240毫升95%乙醇，充分?jǐn)嚢瑁?"C冷藏靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至40毫升，相對密度1.07，在濃縮液中加入428毫升95%乙醇，充分?jǐn)嚢?，Or冷藏靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至無醇味，濃縮液經(jīng)過高速離心機(jī)(20000轉(zhuǎn)/分鐘)離心，得到紅景天醇沉組分140毫升。將紅景天醇沉組分加入到截留分子量3000Da中空纖維膜分離儀的進(jìn)料罐中，調(diào)整操作壓力為O.lMPa，收集透過液，截留液棄去，透過液旋轉(zhuǎn)蒸!濃縮至密度為0.4克/毫升，過0.22微米濾膜，得到紅景天膜分離組分18工業(yè)色譜柱柱長300毫米，內(nèi)徑80毫米，色譜填料為10-20微米的C18鍵合固定相，柱效為15000塔板/米，設(shè)定紫外檢測波長為280nm，設(shè)定洗脫梯度，初始流動相平衡色譜柱20分鐘，取紅景天膜分離樣品9ml，進(jìn)樣，按設(shè)定梯度洗脫，收集目標(biāo)組分。洗脫結(jié)束，再次平衡柱子，進(jìn)樣，收集洗脫組分。共進(jìn)樣兩次，將兩次收集得到的洗脫組分，合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至6毫升，再通過冷凍干燥得到紅景天苷產(chǎn)品1.2克。實施例3將紅景天原藥材粉碎，定量稱取5千克，置于250升提取罐中，加入60升水煎煮2小時，過濾，濾液保存?zhèn)溆?，濾渣中再加入60升水煎煮2小時，過濾，濾液與第一次合并，濾渣棄去。將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到1.2升至相對密度為1.13的浸膏。在浸膏中加入2.1升95%乙醇，充分?jǐn)嚢瑁?TC冷藏靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至0.7升，相對密度1.08，在濃縮液中加入3.8升95%乙醇，充分?jǐn)嚢瑁?。C冷藏靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至無醇味，濃縮液經(jīng)過高速離心機(jī)(20000轉(zhuǎn)/分鐘)離心，得到紅景天醇沉組分1.5升。將紅景天醇沉組分加入到截留分子量6000Da中空纖維膜分離儀的進(jìn)料罐中，調(diào)整操作壓力為O.lMPa，收集透過液，截留液棄去，透過液旋轉(zhuǎn)蒸^濃縮至密度為0.5克/毫升，過0.22微米濾膜，得到紅景天膜分離組分160工業(yè)色譜柱柱長600毫米，內(nèi)徑100毫米，色譜填料為20-40微米的C18鍵合固定相，柱效為6000塔板/米，設(shè)定紫外檢測波長為280nm，設(shè)定洗脫梯度，初始流動相平衡色譜柱20分鐘，流速400毫升/分鐘，取紅景天膜分離樣品30ml，進(jìn)樣，按設(shè)定梯度洗脫，收集目標(biāo)組分。洗脫結(jié)束，再次平衡柱子，進(jìn)樣，收集洗脫組分。共進(jìn)樣6次，將6次收集得到的洗脫組分，合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至100毫升，再通過冷凍干燥得到紅景天苷產(chǎn)品13克。實施例4將紅景天原藥材粉碎，定量稱取10千克，置于250升提取罐中，加入100升水煎煮2小時，過濾，濾液保存?zhèn)溆茫瑸V渣中再加入100升水煎煮2小時，過濾，濾液與第一次合并，濾渣棄去。將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到2.2升至相對密度為1.15的浸膏。在浸膏中加入3.8升95%乙醇，充分?jǐn)嚢瑁?'C冷藏靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至1.5升，相對密度1.09，在濃縮液中加入8升95%乙醇，充分?jǐn)嚢瑁?t:冷藏靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至無醇味，濃縮液經(jīng)過高速離心機(jī)(20000轉(zhuǎn)/分鐘)離心，得到紅景天醇沉組分2.8升。將紅景天醇沉組分加入到截留分子量3000Da中空纖維膜分離儀的進(jìn)料罐中，調(diào)整操作壓力為O.lMPa，收集透過液，截留液棄去，透過液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至密度為0.55克/毫升，過0.22微米濾膜，得到紅景天膜分離組分300毫升。工業(yè)色譜柱柱長500毫米，內(nèi)徑200毫米，色譜填料為20-40微米的C18鍵合固定相，柱效為5000塔板/米，設(shè)定紫外檢測波長為280nm，設(shè)定洗脫梯度，初始流動相平衡色譜柱20分鐘，流速800毫升/分鐘，取紅景天膜分離樣品60ml，進(jìn)樣，按設(shè)定梯度洗脫，收集目標(biāo)組分。洗脫結(jié)束，再次平衡柱子，進(jìn)樣，收集洗脫組分。共進(jìn)樣五次，將五次收集得到的洗脫組分，合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至180毫升，再通過冷凍干燥得到紅景天苷產(chǎn)品25克。權(quán)利要求1.一種紅景天苷的分離制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)提取稱取紅景天原藥材，加入其重量8-12倍的水煎煮提取2-3次，每次1-3小時，得到提取液，將提取液濃縮至相對密度為1.10-1.15的浸膏；2)醇沉將浸膏中加入乙醇使乙醇體積濃度達(dá)到50-70％，0-4℃冷藏靜置12-24小時，過濾，取濾液濃縮至相對密度1.05-1.10；再加入乙醇使乙醇體積濃度達(dá)到75-80％，0-4℃冷藏靜置12-24小時過濾，取濾液濃縮揮發(fā)除去乙醇，樣品溶液經(jīng)過10000-25000轉(zhuǎn)/分鐘的高速離心機(jī)離心；3)過膜將離心液經(jīng)過截留分子量3000-6000Da中空纖維膜分離儀分離，收集透過液；將透過液濃縮至0.2-0.8克/毫升，過0.2-0.4微米濾膜；4)工業(yè)色譜分離以粒徑5-40微米的C18硅膠鍵合固定相為色譜填料，以甲醇和水為流動相，梯度洗脫，甲醇的體積濃度從0-100％變化，收集目標(biāo)組分，冷凍干燥即為紅景天苷。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述紅景天苷的分離制備方法，其特征在于所述色譜柱效為5000-15000塔板/米。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述紅景天苷的分離制備方法，其特征在于所述色譜柱長為200毫米一600毫米，色譜柱內(nèi)徑為20毫米一300毫米。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述紅景天苷的分離制備方法，其特征在于所述梯度洗脫時，甲醇的體積濃度從0-60%變化，收集目標(biāo)組分。全文摘要本發(fā)明涉及天然藥物的分離，具體地說是一種紅景天苷的分離制備方法，將紅景天植物粉碎后，用10倍量水煎煮得到提取液，再濃縮得到浸膏(相對密度1.10-1.15)，加入乙醇醇沉兩次，然后通過6000Da分子量膜分離儀分離，經(jīng)高效工業(yè)色譜柱分離，甲醇水梯度洗脫，收集洗脫液濃縮冷凍干燥即得紅景天苷，本發(fā)明產(chǎn)品純度高、制備量大，工藝穩(wěn)定可靠。本發(fā)明特別適用于自中藥紅景天中分離制備大量的高純度的紅景天苷化合物。文檔編號C07H15/00GK101289478SQ200710011039公開日2008年10月22日申請日期2007年4月20日優(yōu)先權(quán)日2007年4月20日發(fā)明者豐加濤,青徐,梁鑫淼申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所