專利名稱：神經(jīng)節(jié)苷脂相關(guān)的重組抗體及其在腫瘤的診斷和治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是用基因工程獲得的新的重組抗體，具體地說(shuō)是從鼠單克隆抗體P3(MAb P3)和其抗獨(dú)特型(anti-idiotype)鼠單克隆抗體1E10(MAbai 1E10)獲得的嵌合和人源化抗體。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及與含有N-乙醇?；?N-glycolylated)唾液酸的神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的抗體，但是，其既不與乙酰化形式的神經(jīng)節(jié)苷脂也不與中性糖脂結(jié)合。含有N-乙醇?；僖核岬纳窠?jīng)節(jié)苷脂是在乳腺癌和黑素瘤中廣泛表達(dá)的抗原。另一方面，MAbai 1E10的抗腫瘤效果亦已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭斜蛔C明。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，其含有前面所述的在癌癥，尤其在乳腺癌和黑素瘤的診斷和治療中有用的重組抗體。
現(xiàn)有技術(shù)神經(jīng)節(jié)苷脂是含有唾液酸的糖鞘脂并且存在于脊椎動(dòng)物細(xì)胞的胞質(zhì)膜中(Stults等人(1989)糖鞘脂結(jié)構(gòu)、生物學(xué)來(lái)源和特性(Glycosphingolipidsstructure，biological source andproperties)，Methods Enzymology，179167-214)。在文獻(xiàn)中已見(jiàn)某些該種分子作為腫瘤相關(guān)或腫瘤標(biāo)記抗原的報(bào)道(Hakomori等人(1991)腫瘤相關(guān)碳水化合物類抗原的可能的功能(Possiblefunctions of tumor associated carbohydrate antigens)，Curr.Opin.Immunol.，3646-653)，由于這個(gè)原因，抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體的應(yīng)用已經(jīng)被認(rèn)為在癌的診斷和治療中是有用的(Hougton等人(1985)檢測(cè)GD3神經(jīng)節(jié)苷脂的鼠單克隆抗體IgG3抗體在惡性黑素瘤患者中的第I階段試驗(yàn)(Mouse monoclonal antibody IgG3antibody detecting GD3 gangliosideto phase I trial inpatients with malignant melanoma)，PNAS USA，821242-1246；Zhang等人(1997)應(yīng)用免疫組織化學(xué)篩選作為免疫攻擊目標(biāo)的碳水化合物類腫瘤抗原，I.聚焦在神經(jīng)節(jié)苷脂上(Selection ofcarbohydrate tumor antigens as targets for immune attackusing immunohistochemistry.I.Focus on gangliosides)，Int.J.Cancer，7342-49)。
在動(dòng)物中更經(jīng)常表達(dá)的唾液酸是N-乙酰化(NeuAc)和N-乙醇?；?NeuGc)(Corfield等人(1982)唾液酸的發(fā)生(Occurrence ofsialic acids)，Cell.Biol.Monogr.，105-50)。一般來(lái)說(shuō)，NeuGc在正常人和雞的組織中不表達(dá)，但在其它脊椎動(dòng)物中分布廣泛(Leeden和Yu，(1976)唾液酸化學(xué)和分析(Chemistry andanalysis of sialic acid).Biological Role of Sialic Acid.Rosemberg A和Shengtrund CL(Eds).Plenum Press，New York，1-48；Kawai等人(1991)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)人癌組織和禽淋巴瘤細(xì)胞系中表達(dá)的作為腫瘤相關(guān)的唾液酸的N-羥乙酰神經(jīng)氨酸進(jìn)行定量測(cè)定(Quantitative determination of N-glycolylneuraminic acid expression in human canceroustissues and avian lymphoma cell lines as a tumor associatedsialic acid by gas chromatography-mass spectrometry)，Cancer Research，511242-1246)。但是，有報(bào)道指出，抗-NeuGc抗體，可識(shí)別某些人的腫瘤和腫瘤細(xì)胞系(Higashi等人(1988)在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中作為N-羥乙酰神經(jīng)氨酸特異的腫瘤相關(guān)Hanganutziu-Deicher抗原的神經(jīng)節(jié)苷脂的檢測(cè)(Detection of gangliosides as N-glycolylneuraminic acidspecific tumor-associated Hanganutziu-Deicher antigen inhuman retinoblastoma cells)，Jpn.J.Cancer Res.，79952-956；Fukui等人(1989)在人的胃癌細(xì)胞系NUGC4中作為腫瘤相關(guān)Hanganutziu-Deicher抗原的糖蛋白的檢測(cè)(Detection ofglycoproteins as tumor-associated Hanganutziu-Deicherantigen in human gastric cancer cell line)，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1601149-1154)。在人的乳腺癌中已發(fā)現(xiàn)GM3(NeuGc)神經(jīng)節(jié)苷脂水平的提高(Marquina等人(1996)在人的乳腺癌中表達(dá)的神經(jīng)節(jié)苷脂(Gangliosides expressed inhuman breast cancer)，Cancer Research，1996；565165-5171)，這一結(jié)果使該分子作為癌癥治療的靶位的應(yīng)用受到注意。
用保藏號(hào)ECACC 94113026的細(xì)胞系生產(chǎn)單克隆抗體(Mab)P3(歐洲專利EP 0 657 471 B1)，它是有著IgM同種型的鼠單克隆抗體，它是在融合用含有GM3(NeuGc)和破傷風(fēng)類毒素的脂質(zhì)體接種過(guò)的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞和鼠骨髓瘤細(xì)胞系P3-X63-Ag8.653時(shí)獲得。該Mab P3與含有N-乙醇?；僖核岬纳窠?jīng)節(jié)苷脂起強(qiáng)烈反應(yīng)但既不與乙酰化形式的神經(jīng)節(jié)苷脂也不與中性糖脂起反應(yīng)。用從良性的和惡性的腫瘤中得到的細(xì)胞系和組織進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)研究證明，Mab P3識(shí)別乳腺癌(Vázquez等人(1995)，對(duì)N-羥乙酰神經(jīng)氨酸特導(dǎo)的鼠單克隆抗體的產(chǎn)生，其亦識(shí)別硫酸糖脂(Generation of a murine monoclonal antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides that alsorecognizes sulfated glycolipids)，Hybridoma，14551-556)和黑素瘤。
即使不用佐劑和載體蛋白，Mab P3誘導(dǎo)了BALB/c小鼠(同基因模型)的抗獨(dú)特型免疫反應(yīng)(Vázquez等人(1998)抗含有抗NeuGc的神經(jīng)節(jié)苷脂的單克隆抗體的同基因抗獨(dú)特型單克隆抗體(Syngeneic antiidiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody)；Hybridoma，17527-534)。免疫化學(xué)分析提示了負(fù)電基團(tuán)唾液酸(對(duì)于神經(jīng)節(jié)苷脂)和SO3-(對(duì)于硫苷脂)，在該抗體的識(shí)別特性中的作用(Moreno等人(1998)用抗含有N-羥乙酰神經(jīng)氨酸的神經(jīng)節(jié)苷脂的特異性抗體識(shí)別的表位的描述(Delineation of epitoperecognized by an antibody specific for N-glycolylneuraminican acid-containing gangliosides)，Glycobiology，8695-705)。
從用與KLH偶聯(lián)的Mab P3免疫接種過(guò)的BALB/c小鼠獲得IgG1亞型的抗獨(dú)特型Mab 1E10(Mabai 1E10)(美國(guó)專利6,063,379，以保藏號(hào)ECACC 97112901保藏的細(xì)胞系)。Mabai 1E10可特異性地識(shí)別Mab P3而且其不與其它抗神經(jīng)節(jié)苷脂IgM抗體結(jié)合。并且，Mabai 1E10阻止Mab P3與GM3(NeuGc)及與從乳腺導(dǎo)管癌(對(duì)于MabP3的結(jié)合為陽(yáng)性)得到的細(xì)胞系MDA-MB-435的特異性結(jié)合。在給同基因或同種異基因(alogenic)模型中的小鼠免疫接種時(shí)，Mabai 1E10誘導(dǎo)Ab3抗體的強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，即使在其攜帶的獨(dú)特表位與Ab1抗體攜帶的相類似時(shí)，該Ab3抗體沒(méi)有象Mab P3那樣顯示出同樣的特異性(Vázquez等人(1998)抗含有抗NeuGc的神經(jīng)節(jié)苷脂單克隆抗體的同基因抗獨(dú)特型單克隆抗體(Syngeneic anti-idiotypicmonoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containingganglioside monoclonal antibody)，Hybridoma，17527-534)。Mabai 1E10誘導(dǎo)了同基因的以及同種異基因的小鼠中的很強(qiáng)的抗腫瘤作用。當(dāng)BALB/c小鼠被接種的情況下，用重復(fù)劑量的Freund佐劑中的與KLH偶聯(lián)的Mabai 1E10可大大減少乳腺癌細(xì)胞系F3II的生長(zhǎng)。接種疫苗之后，也減少了自發(fā)的肺轉(zhuǎn)移的數(shù)量。在用黑素瘤細(xì)胞B16靜脈接種之后10~14天，靜脈給藥Mabai 1E10給接種了的C57BL/6小鼠，與用無(wú)關(guān)的IgG治療的小鼠相比較，導(dǎo)致了肺轉(zhuǎn)移的數(shù)量驚人地減少。該結(jié)果提示了一種以上抗腫瘤作用機(jī)制的啟動(dòng)。(Vázquez等人(2000)與含有N-乙醇酰的神經(jīng)節(jié)苷脂有關(guān)的抗獨(dú)特型單克隆抗體的抗腫瘤特性(Antitumor properties of ananti-idiotypic monoclonal antibody in relation to N-glycolyl-containing gangliosides)，Oncol.Rep.，7751-756，2000)。
在15年中雜交瘤技術(shù)已經(jīng)得到發(fā)展(Koehler和Milstein(1975)分泌預(yù)定的特異性抗體的融合細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)(Continuouscultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity)，Nature，256495-497)并且當(dāng)單克隆抗體在診斷和研究中仍然非常有用時(shí)，仍不能證明其對(duì)人治療的有效性。這主要因?yàn)槠湓谘褐卸虝旱陌胨テ谝约笆笮?yīng)子功能對(duì)人免疫系統(tǒng)和人抗鼠的抗體免疫反應(yīng)的失效(HAMA反應(yīng))。
另外，自從操縱免疫球蛋白基因，使獲得降低抗原性的修飾抗體和用于特定病理的治療或診斷而改進(jìn)其效應(yīng)子的功能成為可能以來(lái)，基因工程技術(shù)使MAb的潛在用途有了發(fā)展。降低免疫球蛋白免疫原性的方法有著一個(gè)根本的任務(wù)，就是縮小鼠抗體和人免疫球蛋白之間的差別，而不改變抗原識(shí)別的特異性(Morrison和Oi(1989)基因工程的抗體分子(Genetically engineered antibody molecules)，Adv Immunol.，4465-92)。
近來(lái)有幾種方法已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出以人源化小鼠或大鼠抗體，該方法減少異體蛋白注射到人體時(shí)對(duì)抗異體蛋白的異基因免疫反應(yīng)。最早的減少抗原性的方法之一是嵌合抗體，在該方法中是將鼠蛋白質(zhì)的可變區(qū)插入人分子的恒定區(qū)，它表現(xiàn)出相同的特異性但是與其的鼠類的相對(duì)應(yīng)部分相比降低了免疫原性，人的效應(yīng)子功能用嵌合抗體來(lái)保持，(Morrison等人(1984)嵌合人類抗體分子鼠抗原結(jié)合區(qū)與人的恒定區(qū)(Chimeric human antibody moleculesMouse antigen-binding domains with human constant region domains)，PNASUSA，816851-6855)。甚至在嵌合抗體具有與鼠類的相對(duì)應(yīng)部分相同特異性的時(shí)候，對(duì)嚙齒類動(dòng)物可變區(qū)的免疫反應(yīng)常?？杀挥^察到。
在進(jìn)一步降低嵌合抗體免疫原性的嘗試中，僅將來(lái)自嚙齒類動(dòng)物單克隆抗體的CDRs移植到人的構(gòu)架區(qū)，該雜交可變區(qū)與人的恒定區(qū)一起表達(dá)(Jones等人(1986)用鼠類的互補(bǔ)決定區(qū)替換人的抗體中的互補(bǔ)決定區(qū)(Replacing the complementary-determiningregions in a human antibody with those from a mouse)，Nature 321522-524；Verhoeyen等人(1988)重構(gòu)人的抗體移植抗溶菌酶的活性(Reshaping human antibodiesgraftingan antilysozyme activity)，Science 239，1534-1536)。但是，該方法存在若干不足所得抗體常常有著降低了的親和力并且大量的構(gòu)架殘基必須被回復(fù)突變?yōu)閷?duì)應(yīng)的鼠類的殘基以恢復(fù)結(jié)合能力(Rietchmann等人(1988)用于治療的重構(gòu)人類抗體(Reshapinghuman antibodies for therapy)，Nature，332323-327；Queen等人(1989)結(jié)合白細(xì)胞介素2受體的人源抗體(A humanizedantibody that binds to the interleukin 2 receptor)，PNASUSA，8610029-10033；Tempest等人(1991)重構(gòu)人類單克隆抗體以阻止人的體內(nèi)呼吸道合胞病毒感染(Reshaping a humanmonoclonal antibody to inhibit human respiratory syncytialvirus infection in vivo)，Biotechnology，9266-272)。此外，耐久的免疫原性在移植CDR的抗體中常常被觀察到。
Mateo和其同事(美國(guó)專利號(hào)US 5 712 120)敘述了一種降低鼠抗體免疫原性的方法。根據(jù)該方法，修飾限于可變區(qū)，特別是嵌合抗體的鼠FRs。此外，替換只在FRs具有兩性序列的那些區(qū)域進(jìn)行，因此它們是被T細(xì)胞識(shí)別的潛在表位。該方法包括幾個(gè)氨基酸殘基被最同源的人類相應(yīng)序列審慎地替換，被替換的氨基酸殘基位于潛在免疫原性表位中，主要對(duì)規(guī)范的結(jié)構(gòu)起作用的氨基酸以及與CDRs緊密相鄰的或Vernier區(qū)中的殘基必須保留。
所得抗體保留其抗原結(jié)合特異性并且與它的鼠的或嵌合的前體相比免疫原性更小(Mateo等人(2000)從基因工程抗體去除T細(xì)胞表位生產(chǎn)被修飾了的降低了免疫原性的免疫球蛋白(Removal of Tcell epitopes from genetically engineered antibodiesProduction of modified immunoglobulins with reducedimmunogenicity)，Hybridoma 19463-71)，該特性提高了其治療效用。采用該新方法，僅有幾種突變需要完成，當(dāng)然，就只要進(jìn)行較少的基因操作。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及由基因工程技術(shù)獲得的重組抗體。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及從鼠單克隆抗體P3得到的嵌合抗體，它是用保藏號(hào)ECACC94113026的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)。MAB P3識(shí)別在乳腺癌細(xì)胞和黑素瘤中表達(dá)的抗原。MAB P3的特征在于重鏈和輕鏈高度可變區(qū)(CDRs)的下述序列重鏈CDR1RYSVHCDR2MIWGGGSTDYNSALKSCDR3SGVREGRAQAWFAYCADENA LIGERACDR1KASQDVSTAVACDR2SASYRYTCDR3QQHYSTPWT優(yōu)選的重鏈和輕鏈的FRs序列如下重鏈FR1QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSFR2WVRQPPGKGLEWLGFR3RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARFR4WGQGTLV輕鏈FR1DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCFR2WYQQKPGQSPKLLIYFR3GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCFR4FGGGTKL在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合抗體，含有人的IgG1重鏈的恒定區(qū)和人Ck輕鏈的恒定區(qū)。在另一方面，本發(fā)明涉及由用保藏號(hào)ECACC 94113026的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的Mab P3得到的人源化抗體，其特征在于含有人IgG1重鏈的恒定區(qū)和人輕鏈Ck的恒定區(qū)并且其輕鏈的FRs區(qū)含有任一下面的點(diǎn)突變輕鏈位置8用Pro替換His位置9用Ser替換Lys位置10用Ser替換Phe位置11用Leu替換Met位置13用Ala替換Thr在另一方面，本發(fā)明涉及由用保藏號(hào)ECACC 97112901的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的鼠單克隆抗體1E10得到的嵌合抗體，并且它是能識(shí)別Mab P3的抗獨(dú)特型抗體。MAbai 1E10的特征在于重鏈和輕鏈高度可變區(qū)(CDRs)的下述序列重鏈CDR1SYDINCDR2WIFPGDGSTKYNEKFKGCDR3EDYYDNSYYFDY輕鏈CDR1RASQDISNYLNCDR2YTSRLHSGCDR3QQGNTLPWT優(yōu)選的重鏈和輕鏈的FRs序列如下重鏈FR1QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTFR2WVRQRPEQGLEWIGFR3KATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCARFR4WGQGTTLTV輕鏈FR1DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCFR2WYQQKPDGTVKLLIYFR3VPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCFR4FGGGTKLFSK
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合抗體，含有人IgG1重鏈的恒定區(qū)和人Ck輕鏈的恒定區(qū)。在另一方面，本發(fā)明涉及由用保藏號(hào)ECACC 97112901的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的Mab 1E10得到的人源化抗體，其特征在于它含有人IgG1重鏈的恒定區(qū)和人Ck輕鏈的恒定區(qū)并且重鏈和輕鏈FRs區(qū)含有任一下面的點(diǎn)突變輕鏈位置7用Ser替換Thr位置8用Pro替換Thr位置15用Val替換Leu重鏈位置5用Val替換Gln位置40用Ala替換Arg位置42用Gly替換Glu位置87(根據(jù)Kabat編號(hào)為83)用Arg替換Thr在另一方面，本發(fā)明涉及表達(dá)所述嵌合和人源化抗體的細(xì)胞系；另外本發(fā)明涉及含有所述抗體的藥物組合物。
優(yōu)選的是，涉及含有所述的抗體和適當(dāng)?shù)馁x形劑的用于治療乳腺、肺、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、黑素瘤、肉瘤和神經(jīng)外胚層的腫瘤、以及它們的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的藥物組合物。
在本發(fā)明的另一表述中，含有所述的抗體的藥物組合物，可以用于對(duì)乳腺、肺、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、黑素瘤、肉瘤和神經(jīng)外胚層的腫瘤、以及它們的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)進(jìn)行的體內(nèi)定位和診斷。
用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))進(jìn)行Mab P3和Mabai 1E10可變區(qū)的cDNA的合成和基因擴(kuò)增。
從大約106的P3(鼠IgM MAb，可識(shí)別GM3 N-乙醇酰化神經(jīng)節(jié)苷脂)或1E10(抗P3的抗獨(dú)特型抗體)雜交瘤細(xì)胞中提取胞質(zhì)RNA。使用TRIZOL試劑(GIBCO BRL，Grand Island，NY)，根據(jù)生產(chǎn)者的說(shuō)明書(shū)來(lái)提取RNA。
混合5μg RNA、25皮摩爾Vh(與VHP3的鼠IgM的恒定區(qū)互補(bǔ)，并且具有VH 1E10的鼠IgG1恒定區(qū))或Vk(與兩種抗體的鼠κ恒定區(qū)互補(bǔ))、2.5mM各種dNTP、pH值7.5的Tris-Hcl 50mM、75mMKCl、10mM DTT、8mM MgCl2，并且在每50μl反應(yīng)混合物中加入15單位RNA酶抑制劑以進(jìn)行cDNA的合成反應(yīng)。在70℃加熱10分鐘，緩慢冷卻至37℃。然后，加入100單位MLV逆轉(zhuǎn)錄酶并且在42℃下連續(xù)培育一小時(shí)。
用PCR擴(kuò)增可變區(qū)VK和VH的cDNAs。簡(jiǎn)言之，將5μl VH或VK的cDNA與25皮摩爾的特異性引物、2.5mM各種dNTP、5μl 10倍Taq DNA聚合酶的緩沖液和1單位該酶的組成物混合。試樣須經(jīng)在94℃下30秒、50℃下30秒、72℃下1分鐘的25次熱循環(huán)，最后在72℃下培育5分鐘。
擴(kuò)增的cDNA的克隆和序列測(cè)定將VH和VK(各為P3和1E10的)的PCR產(chǎn)物克隆到TA載體中(TA克隆試劑盒.Promega，USA)。對(duì)所得克隆產(chǎn)物用T7 DNA聚合酶以雙脫氧的方法測(cè)序(T7測(cè)序試劑盒.Pharmacia，Sweden)。
嵌合基因的構(gòu)建用酶消化的方法從TA載體上將VH VK基因切下，并且將其克隆到各自的表達(dá)載體中(Coloma等人(1992)用于表達(dá)使用以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生產(chǎn)的可變區(qū)的抗體分子的新型載體(Novel vectors forthe expression of antibody molecules using variable regionsgenerated by polymerase chain reaction)，J.Immunol.Meth.，15289-104)。
用EcoRV和Nhel以酶消化的方法從TA載體中將VH基因切下，并且克隆到包含人的IgG1可變區(qū)和組氨醇抗性基因的表達(dá)載體(PAH4604)中。結(jié)果產(chǎn)生的構(gòu)建體是P3VH-PAH4604和1E10VH-PAH4604。用EcoRV和SaII以酶消化的方法從TA載體中將VK基因切下，并且克隆到表達(dá)載體(PAG 4622)中。該載體包括霉酚酸抗性基因和人的κ恒定區(qū)。結(jié)果產(chǎn)生的構(gòu)建體是P3VK-PAG4622和1E10VK-PAG4622。
從Mab P3和Mabid 1E10獲得的嵌合抗體的表達(dá)將NS-0細(xì)胞用10μg P3VK-PAG4622或1E10VK-PAG4622電穿孔，將表達(dá)人的κ輕鏈的克隆用10μg P3VH-PAH4604或1E10VH-PAH4604轉(zhuǎn)染。
用Pvul酶通過(guò)消化把DNA直線化，用乙醇沉淀并溶解在50μlPBS中。用離心法得到大約107的細(xì)胞，將其與電穿孔杯中消化過(guò)的DNA一起在0.5ml PBS中重新懸浮。置于冰上10分鐘后，給細(xì)胞一個(gè)200Volts 960μF的脈沖電流，并且在冰上再放置10分鐘。將細(xì)胞與加入10％胎牛血清的D′MEM F12一起分置到96孔板中。二或四天后，加入選擇培養(yǎng)基(分別含有霉酚酸0,45μg/ml或組氨醇10mM的D′MEM F12)。14天后，轉(zhuǎn)染的克隆可以在肉眼下看到。
用ELISA測(cè)定含有轉(zhuǎn)染克隆的孔中培養(yǎng)基中存在的人類抗體。用羊抗人κ輕鏈(對(duì)于生產(chǎn)人的κ鏈的克隆)或抗人IgG(γ鏈特異的)(對(duì)于生產(chǎn)完全抗體的克隆)抗體覆蓋微量滴定板孔。用PBST(含0.05％Tween20的磷酸鹽緩沖溶液)洗滌后，在37℃把稀釋的含有轉(zhuǎn)染產(chǎn)物的培養(yǎng)基加入到每一微量滴定板孔中一小時(shí)?？子肞BS-T洗滌，并加入與辣根過(guò)氧化物酶共軛(peroxidase of spicyradish-conjugated)的羊抗人κ輕鏈或與堿性磷酸酶共軛的羊抗人IgG(γ鏈特異的)，之后在37℃培育一小時(shí)?？子肞BS-T洗滌過(guò)之后，分別加入含有鄰苯二胺或?qū)ο趸搅姿猁}(p-nitrophenylphosphate)的底物緩沖液。半小時(shí)后，分別測(cè)定在492或405nm下的吸收。
通過(guò)人源化T細(xì)胞表位構(gòu)建人源化抗體P3hu和1E10hu。T細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)。
用AMPHI算法分析P3和1E10可變區(qū)的序列(Margalit等人(1987)從一級(jí)序列預(yù)測(cè)免疫決定輔助T細(xì)胞抗原位點(diǎn)(Predictionof immunodominant helper T cell antigenic sites from theprimary sequence)，J.Immunol.，1382213-2229)。檢出有著7或11個(gè)氨基酸殘基的與T免疫原性有關(guān)的兩親性(amphipatic)螺旋片段。程序SOHHA還預(yù)測(cè)了疏水的螺旋片段。(Elliot等人(1987).An hypothesis on the binding of an amphipatic，alpha helical sequence in li to the desotope of class IIantigen，J.Immunol.，1382949-2952)。兩種算法都預(yù)測(cè)抗體P3和1E10可變區(qū)中序列的何種片段能夠在MHC II類分子環(huán)境中呈遞給輔助T細(xì)胞。
與人免疫球蛋白的同源性分析將鼠可變區(qū)的氨基酸序列與GeneBank和EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)(從因特網(wǎng)中可獲得)中包含的免疫球蛋白序列比較。對(duì)于每個(gè)抗體，確定了最同源的人類可變區(qū)序列。序列同源性檢測(cè)使用的軟件是PC-TWOHIBIO PROSIS 06-00(Hitachi)。
免疫原性減小的分析本方法的目的是用最小的變化來(lái)減少免疫原性，破壞或人源化潛在的有免疫原性的T表位。方法包括位于兩親性螺旋片段的幾個(gè)氨基酸殘基的審慎的替換。對(duì)規(guī)范的結(jié)構(gòu)起主要作用的氨基酸以及與CDRs緊密相鄰的或Vernier區(qū)中的殘基必須保留。
根據(jù)本方法，將鼠可變區(qū)序列與最同源的人類序列比較，并且將在每一個(gè)位置上的鼠MAb和最同源的人類序列之間不同的氨基酸殘基確定下來(lái)，僅考慮FRs中的殘基(Kabat(1991)，Sequences ofproteins of immunological interest，第五版，NationalInstitute of Health)，把前面確定的殘基用在最同源的人類序列中存在的那些殘基替換。替換過(guò)程由定向誘變技術(shù)來(lái)完成。
涉及結(jié)合部位的三維結(jié)構(gòu)的殘基不被突變；它可能影響抗原識(shí)別。關(guān)于替換在三級(jí)結(jié)構(gòu)中的影響的附加信息能夠從抗原結(jié)合部位的分子模擬來(lái)獲得。
兩親性螺旋片段中脯氨酸殘基的存在和特定的鼠的殘基并不出現(xiàn)在人類最同源序列的相同位置但在其它的人免疫球蛋白中頻繁出現(xiàn)的事實(shí)，是必須牢記的。出于這個(gè)原因，替換到構(gòu)架中的鼠的氨基酸集合不是唯一的。用不同數(shù)量替換以獲得不同形式的修飾抗體是可能的。該突變是通過(guò)重疊PCR來(lái)進(jìn)行。
克隆和表達(dá)人源化抗體P3hu和1E10hu。
按照所敘述的關(guān)于嵌合抗體的方法，與P3hu和1E10hu對(duì)應(yīng)的遺傳構(gòu)建體被克隆到表達(dá)載體中。結(jié)果產(chǎn)生的構(gòu)建體是P3VKhu-PAG4622或1E10Vkhu-PAG4622和P3VHhu-PAH4604和1E10VHhu-PAH4604。按照關(guān)于嵌合抗體的前述方案將它們轉(zhuǎn)染到NS-0細(xì)胞中。
重組抗體的純化。
使用蛋白質(zhì)A(Pharmacia，Upssala，Sweden)用親和層析提純重組抗體。
生物活性。
用ELISA測(cè)定的與抗原的特異性結(jié)合情況檢測(cè)了重組抗體的生物活性。
對(duì)于重組MAb P3，用甲醇中的GM3(NeuGc)神經(jīng)節(jié)苷脂覆蓋微量滴定板。干燥一小時(shí)后，用Tris-HCl緩沖液中的1％牛血清白蛋白(BSA)阻斷非特異性結(jié)合，并在37℃培育一小時(shí)。用PBS洗滌孔并且與純化的重組Mab P3一起在37℃培育一小時(shí)。用tris-HCl洗滌孔并且加入與堿性磷酸酶共軛的羊抗人類抗體，之后在37℃培育一小時(shí)。最后，洗滌孔，加入含有對(duì)硝基苯磷酸的底物緩沖液。半小時(shí)后分別測(cè)定在405或492nm下的吸收。
對(duì)于重組Mabai 1E10，除用Mab P3覆蓋孔和用PBS-0.05％Tween 20進(jìn)行洗滌之外，其它ELISA實(shí)驗(yàn)條件相似。
實(shí)施例在下面實(shí)施例中使用的全部酶，以及試劑和材料均從商業(yè)來(lái)源獲得，除非特別指明。
實(shí)施例1.嵌合MAb P3的獲得。
如前所述，cDNA的合成是通過(guò)使用逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)來(lái)獲得的，它是用從生產(chǎn)Mab P3的雜交瘤獲得的RNA開(kāi)始的。在該反應(yīng)中所用的特異性引物的序列如下所示對(duì)于VH5′AGGTCTAGAA(CT)CTCCACACACAGG(AG)(AG)CCAGTGGATAGAC3′對(duì)于VK5′GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG3′用Taq聚合酶和特異性的引物通過(guò)PCR將cDNA VHP3和cDNAVKP3擴(kuò)增。引物中包含的限制位點(diǎn)，對(duì)于VH是ECORV/NHEI，對(duì)于VK是ECORV/SALI。所用引物的序列如下對(duì)于VH引物1(信號(hào)肽)5′GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT3′引物2(CH1)5′GGGGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGT3′對(duì)于VK引物1(信號(hào)肽)5′GGGGATATCCACCATGGAG(TA)CACA(GT)(TA)CTCAGGTCTTT(GA)T3′引物2(Ck)5′AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC3′將PCR產(chǎn)物克隆到TA載體中(TA cloning kit，Invitrogen)。對(duì)十二個(gè)獨(dú)立克隆使用T7 DNA Pol(Pharmacia)以雙脫氧的方法測(cè)序。用同源檢索分析，確定了VHP3和VKP3的最同源序列組。根據(jù)Kabat分類，VHP3和VKP3序列(

圖1和圖2)分別與IB和V組有很高的同源性。
對(duì)于VHP3用限制酶ECORV和NHEI而對(duì)于VKP3用限制酶ECORV和SALI消化后，它們被克隆到事先用相同的酶消化過(guò)的表達(dá)載體中，對(duì)于VH和VK分別為PAH4604和PAG4622。該表達(dá)載體由SherieMorrison(UCLA，California，USA)提供，它適合于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的免疫球蛋白的表達(dá)。載體PAH 4604已經(jīng)包含了人IgG1的恒定區(qū)和人的PAG 4622(Coloma等人(1992)用于表達(dá)使用以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生產(chǎn)的可變區(qū)的抗體分子的新型載體(Novel vectors forthe expression of antibody molecules using variable regionsgenerated by polymerase chain reaction)，J.Immunol.Meth.，15289-104)。結(jié)果產(chǎn)生的構(gòu)建體是P3VH-PAH4604和P3VK-PAG4622。
將NS-0細(xì)胞用10μg P3VK-PAG4622轉(zhuǎn)染，將表達(dá)輕鏈的克隆用10μg P3VH-PAH4604轉(zhuǎn)染，在這兩種情況下，在轉(zhuǎn)染前，都用PvuI把DNA直線化，用乙醇沉淀并溶解在50μl PBS中。
用離心法得到大約107的細(xì)胞，將其與電穿孔杯中消化過(guò)的DNA一起在0.5ml PBS中重新懸浮。置于冰上10分鐘后，給細(xì)胞一個(gè)200Volts 960μF的脈沖電流，并且在冰上再放置10分鐘。將細(xì)胞與加10％胎牛血清的D′MEM F12一起分置到96孔板中。二或四天后，加入選擇培養(yǎng)基(分別含有霉酚酸0,45μg/ml或組氨醇10mM的D′MEM F12)。14天后，轉(zhuǎn)染的克隆可以在肉眼下看到。
用ELISA測(cè)定含有轉(zhuǎn)染克隆的孔中培養(yǎng)基中存在的人類抗體。用羊抗人κ輕鏈(對(duì)于生產(chǎn)人κ鏈的克隆)或抗人IgG(γ鏈特異的)(對(duì)于生產(chǎn)完全抗體的克隆)抗體覆蓋微量滴定板孔。用PBST(含0.05％Tween20的磷酸鹽緩沖溶液)洗滌后，在37℃把稀釋的含有轉(zhuǎn)染產(chǎn)物的培養(yǎng)基加入到每一微量滴定板孔中一小時(shí)?？子肞BS-T洗滌，并加入辣根過(guò)氧化物酶共軛的羊抗人κ輕鏈或與堿性磷酸酶共軛的羊抗人IgG(γ鏈特異的)，之后在室溫培育一小時(shí)?？子肞BS-T洗滌過(guò)之后，分別加入含有鄰苯二胺或?qū)ο趸搅姿猁}的底物緩沖液。半小時(shí)后，分別測(cè)定在492或405nm下的吸收。
實(shí)施例2.不同形式的人源化抗體P3的獲得。
將鼠VHP3和VKP3序列(圖1和圖2)與人的序列比較。圖3和圖4顯示了最同源的人序列。在鼠P3可變區(qū)序列中檢測(cè)兩親性螺旋片段或潛在的T細(xì)胞表位，根據(jù)所用方法制定氨基酸替換的審慎的策略，以破壞或人源化鼠序列中的潛在T細(xì)胞表位。
對(duì)于VHP3的分析得到了(圖3)2個(gè)兩親性片段，第一個(gè)片段包括CDR1、FR2和CDR2的某些殘基，第二個(gè)片段包括FR3的末端和CDR3。在CDR或涉及結(jié)合部位的三維結(jié)構(gòu)的殘基中發(fā)現(xiàn)了與最同源人序列和鼠的序列的主要差別。由于這個(gè)原因，決定不替換任何鼠的VHP3的氨基酸。
關(guān)于VKP3的分析也得到了2個(gè)兩親性片段(圖4)，第一個(gè)片段包括FR1，第二個(gè)片段包括CDR2和FR3的某些殘基。決定用最同源人序列中相同位置的殘基替換在位置8、9、10、11和13的殘基。分別用Pro、Ser、Ser、Leu和Ala替換氨基酸His、Lys、Phe、Met和Thr。替換使用引物1和2和3和4通過(guò)重疊PCR進(jìn)行(Kammann等人(1989)用DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)快速插入誘變(Rapidinsertional mutagenesis of DNA polymerase chain reaction(PCR))，Nucleic Acids Res.，175404)，所用引物的序列如下引物15′ATGACCCAGTCTCCTTCTTCTCTTTCCGCGTCAGTAGGAGAC3′引物25′AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC3′引物35′GTCTCCTACTGACGCGGAAAGAGAAGAAGGAGACTGGGTCAT3′引物45′GGGGATATCCACCATGGAG(TA)CACA(GT)(TA)CTCAGGTCTTT(GA)T3′以序列測(cè)定檢驗(yàn)點(diǎn)突變。結(jié)果產(chǎn)生的構(gòu)建體是P3Vkhu，并將其克隆到PAG 4622表達(dá)載體上。結(jié)果產(chǎn)生的構(gòu)建體是P3VKhu-PAG4622。為表達(dá)人源化抗體P3，將NS-0細(xì)胞用P3VH-PAH4604和P3VKhu-PAG4622轉(zhuǎn)染。
按照前述用于嵌合抗體的電穿孔和檢測(cè)方法，轉(zhuǎn)染P3hu抗體。
實(shí)施例3嵌合MAb P3的生物活性。
用ELISA測(cè)定與抗原的特異性結(jié)合情況來(lái)檢測(cè)嵌合MAb P3的生物活性。
對(duì)于重組MAb P3，用甲醇中的GM3(NeuGc)神經(jīng)節(jié)苷脂覆蓋微量滴定板。在37℃干燥一小時(shí)后，用Tris-HCl緩沖液中的1％牛血清白蛋白(BSA)阻斷非特異性結(jié)合，并在37℃培育一小時(shí)。用PBS洗滌孔并且與純化的重組Mab P3一起在37℃培育一小時(shí)。用tris-HCl洗滌孔并且加入與堿性磷酸酶共軛的羊抗人類抗體，之后在37℃培育一小時(shí)。最后，用tris-HCl洗滌孔，加入含有對(duì)硝基苯磷酸的底物緩沖液。半小時(shí)后測(cè)定在405nm下的吸收。
嵌合Mab T1被作為陰性對(duì)照來(lái)應(yīng)用。
圖5顯示了嵌合MAb P3與抗原的特異性結(jié)合的情況。
實(shí)施例4.嵌合MAb 1E10的獲得。
如前所述，cDNA的合成是通過(guò)使用逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)來(lái)獲得的，它是用從生產(chǎn)Mab 1E10的雜交瘤獲得的RNA開(kāi)始的。在該反應(yīng)中所用的特異性引物的序列如下所示對(duì)于VH5′GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT3′對(duì)于VK5′GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGGA3′用Taq聚合酶和特異性的引物通過(guò)PCR將cDNA VH1E10和cDNAVK1E10擴(kuò)增。
對(duì)于VH引物1(信號(hào)肽)5′GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT3′引物2(CH1)5′GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT3′對(duì)于VK
引物1(信號(hào)肽)5′GGGGTTAACCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)GCTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GG(GA)3′引物2(Ck)5′AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC3′將PCR產(chǎn)物克隆到TA載體中(TA cloning kit，Invitrogen)。對(duì)十二個(gè)獨(dú)立克隆使用T7 DNA Pol(Pharmacia)以雙脫氧的方法測(cè)序(圖7和圖8)。通過(guò)同源檢索分析，確定了VH1E10和VK1E10的最同源序列組。根據(jù)Kabat分類，VH1E10和VK1E10序列分別與混雜的組和V組有很高的同源性。
對(duì)于VH1E10用限制酶ECORV和NHEI而對(duì)于VK1E10用限制酶HincII和SALI消化后，它們被克隆到事先用相同的酶消化過(guò)的表達(dá)載體中，對(duì)于VH和VK分別為PAH4604和PAG4622。該表達(dá)載體由Sherie Morrison(UCLA，California，USA)提供，它適合于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的免疫球蛋白的表達(dá)。載體PAH 4604已經(jīng)包括了人IgG1的恒定區(qū)和人的PAG 4622(Coloma等人(1992)用于表達(dá)使用以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生產(chǎn)的可變區(qū)的抗體分子的新型載體(Novelvectors for the expression of antibody molecules usingvariable regions generated by polymerase chain reaction)，J.Immunol.Meth.，15289-104)。結(jié)果產(chǎn)生的構(gòu)建體是1E10VH-PAH4604和1E10VK-PAG4622。
將NS-0細(xì)胞用10μg 1E10VK-PAG4622轉(zhuǎn)染，將表達(dá)輕鏈的克隆用10μg 1E10VH-PAH4604轉(zhuǎn)染，在這兩種情況中，在轉(zhuǎn)染前，都用PvuI把DNA直線化，用乙醇沉淀并溶解在50μl PBS中。
用離心法得到大約107的細(xì)胞，將其與電穿孔杯中消化過(guò)的DNA一起在0.5ml PBS中重新懸浮。置于冰上10分鐘后，給細(xì)胞一個(gè)200Volts 960μF的脈沖電流，并且在冰上再放置10分鐘。將細(xì)胞與加入10％胎牛血清的D′MEM F12一起分置到96孔板中。二或四天后，加入選擇培養(yǎng)基(分別含有霉酚酸0,45μg/ml或組氨醇10mM的D′MEM F12)。14天后，轉(zhuǎn)染的克隆可以在肉眼下看到。
用ELISA測(cè)定含有轉(zhuǎn)染克隆的孔中培養(yǎng)基中存在的人類抗體。用羊抗人κ輕鏈(對(duì)于生產(chǎn)人κ鏈的克隆)或抗人IgG(γ鏈特異的)(對(duì)于生產(chǎn)完全抗體的克隆)抗體覆蓋微量滴定板孔。用PBST(含0.05％Tween20的磷酸鹽緩沖溶液)洗滌后，在37℃把稀釋的含有轉(zhuǎn)染產(chǎn)物的培養(yǎng)基加入到每一微量滴定板孔中一小時(shí)。孔用PBS-T洗滌，并加入與辣根過(guò)氧化物酶共軛的羊抗人κ輕鏈或與堿性磷酸酶共軛的羊抗人IgG(γ鏈特異的)，之后在室溫培育一小時(shí)。孔用PBS-T洗滌過(guò)之后，分別加入含有鄰苯二胺或?qū)ο趸搅姿猁}的底物緩沖液。半小時(shí)后，分別測(cè)定在492或405nm下的吸收。
實(shí)施例5.不同形式的人源化抗體1E10的獲得。
將鼠VH 1E10和VK 1E10序列(圖6和圖7)與人的序列比較。圖8和圖9顯示了最同源人序列。在鼠1E10可變區(qū)序列中檢測(cè)兩親性螺旋片段或潛在的T細(xì)胞表位，根據(jù)所用方法制定氨基酸替換的審慎的策略，以破壞或人源化鼠序列中的潛在T細(xì)胞表位。
對(duì)于VH1E10的分析得到了(圖8)3個(gè)兩親性片段，第一個(gè)片段包括FR1，第二個(gè)片段包括FR2，第三個(gè)片段包括FR3。決定用最同源人序列中相同位置的殘基替換在位置5、40、42和87(根據(jù)Kabat的編號(hào)為83)的殘基。氨基酸Gln、Arg、Glu分別被Val、Ala、Gly和Arg替換。
替換使用一系列不同的引物通過(guò)重疊PCR進(jìn)行(Kammann等人(1989)用DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)快速插入誘變(Rapidinsertional mutagenesis of DNA polymerase chain reaction(PCR))，Nucleic Acids Res.，175404)。
用于在重鏈位置5突變的引物是1和2和3和4，其序列如下引物15′CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCT3′引物25′GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT3′引物35′AGCTCCAGACTGCACCAGCTGAACCTG3′
引物45′GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT3′用測(cè)序檢查位置5的點(diǎn)突變后，位置40和42的突變被引入。
用于重鏈位置40和42突變的引物引物15′TGGGTGAGGCAGGCGCCTGGGCAGGGACTTGAG3′引物25′GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT3′引物35′CTCAAGTCCCTGCCCAGGCGCCTGCCTCACCCA3′引物45′GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT3′用測(cè)序檢查位置40和42的點(diǎn)突變后，位置87(根據(jù)Kabat的編號(hào)為83)的突變被引入。
用于重鏈位置87(根據(jù)Kabat的編號(hào)為83)突變的引物引物15′CTCAGCAGGCTGCGGTCTGAGGACTCT3′引物25′GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT3′引物35′AGAGTCCTCAGACCGCAGCCTGCTGAG3′引物45′GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT3′因?yàn)闅埢婕敖Y(jié)合部位的三維結(jié)構(gòu)，因此不進(jìn)行其他替換。
用測(cè)序核實(shí)點(diǎn)突變。結(jié)果產(chǎn)生的構(gòu)建體是1E10VHhu，并將它克隆到PAH4604表達(dá)載體中。結(jié)果產(chǎn)生的構(gòu)建體是1E10VH-PAH4604。
關(guān)于VK1E10的分析也得到了3個(gè)兩親片段(圖9)，第一個(gè)片段包括FR1，第二個(gè)片段包括CDR1，第三個(gè)片段包括FR3。決定用最同源人序列中相同位置的殘基替換在位置7、8和15的殘基。分別用Ser、Pro和Val替換氨基酸Thr、Thr和Leu。替換使用引物1和2和3和4通過(guò)重疊PCR進(jìn)行(Kammann等人(1989)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)快速插入誘變DNA(Rapid insertional mutagenesis ofDNA by polymerase chain reaction(PCR))，Nucleic AcidsRes.，175404)，所用引物的序列如下用于輕鏈位置7、8和15突變的引物引物15′CAGATGACACAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTC3′引物25′AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC3′引物35′GACTCTGTCTCCCACAGAGGCAGACAGGGAGGAAGGAGACTGTGTCATCTG3′引物45′GGGGTTAACCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)GCTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GG(GA)3′用測(cè)序核實(shí)點(diǎn)突變。結(jié)果產(chǎn)生的構(gòu)建體是1E10Vkhu，并將其克隆到PAG 4622表達(dá)載體中。結(jié)果產(chǎn)生的構(gòu)建體是1E10VKhu-PAG4622。
為表達(dá)人源化抗體1E10，將NS-0細(xì)胞用1E10VHhu-PAH4604和1E10VKhu-PAG4622轉(zhuǎn)染。
按照前述用于嵌合抗體的電穿孔和檢測(cè)方法，轉(zhuǎn)染1E10hu抗體。
實(shí)施例6嵌合MAb 1E10的生物活性。
用ELISA測(cè)定與抗原的特異性結(jié)合情況來(lái)檢測(cè)嵌合MAb 1E10的生物活性。
對(duì)于重組MAb 1E10，用Mab P3覆蓋微量滴定板。用PBST(含0.05％吐溫20的磷酸緩沖鹽溶液)洗滌后，用PBST中的1％牛血清白蛋白(BSA)阻斷非特異性結(jié)合，在37℃培育一小時(shí)。洗滌孔并且與純化的重組Mab 1E10一起在37℃培育一小時(shí)。用PBST洗滌孔并且加入與堿性磷酸酶共軛的羊抗人抗體，之后在37℃培育一小時(shí)。最后，用PBST洗滌孔，加入含有對(duì)硝基苯磷酸的底物緩沖液。半小時(shí)后測(cè)定在405nm下的吸收。
嵌合Mab C5被作為陰性對(duì)照來(lái)應(yīng)用。
圖10顯示了嵌合MAb 1E10與Mab P3的特異性結(jié)合的情況。
附圖簡(jiǎn)述圖1VHP3 DNA和推出的氨基酸序列。序列根據(jù)Kabat的編號(hào)排列(Kabat等人(1991)，Sequences of proteins ofimmunological interest，第五版，National Institute ofHealth)，出現(xiàn)的CDR用虛線標(biāo)明。
圖2VKP3 DNA和推出的氨基酸序列。序列根據(jù)Kabat的編號(hào)排列(Kabat和其同事(1991)，Sequences of proteins ofimmunological interest，第五版，National Institute ofHealth)，出現(xiàn)的CDR用虛線標(biāo)明。
圖3VHP3與最同源的人的序列比對(duì)。兩親性片段加下劃線并且CDR為黑體字。
圖4VKP3與最同源的人的序列比對(duì)。兩親性片段加下劃線并且CDR為黑體字。
圖5嵌合Mab P3與GM3(NeuGc)的特異性結(jié)合。用ELISA測(cè)定了Mab P3和Mab T1(陰性對(duì)照)的不同濃度。將微量滴定板用甲醇中的GM3(NeuGc)和GM3(NeuAc)(陰性對(duì)照)神經(jīng)節(jié)苷脂覆蓋，并測(cè)定特異性結(jié)合情況。
圖6VH1E10 DNA和推出的氨基酸序列。序列根據(jù)Kabat的編號(hào)排列(Kabat和其同事(1991)，Sequences of proteins ofimmunological interest，第五版，National Institute ofHealth)，出現(xiàn)的CDR用虛線標(biāo)明。
圖7VK1E10 DNA和推出的氨基酸序列。序列根據(jù)Kabat的編號(hào)排列(Kabat等人(1991)，Sequences of proteins ofimmunological interest，第五版，National Institute ofHealth)，出現(xiàn)的CDR用虛線標(biāo)明。
圖8VH1E10與最同源的人的序列比對(duì)。兩親性片段加下劃線并且CDR為黑體字。
圖9VK1E10與最同源的人的序列比對(duì)。兩親性片段加下劃線并且CDR為黑體字。
圖10嵌合Mab 1E10與鼠類Mab P3的特異性結(jié)合。用ELISA測(cè)定了Mab 1E10和MAb C5(陰性對(duì)照)的不同濃度。將微量滴定板用Mab P3和Mab A3(陰性對(duì)照)覆蓋，并測(cè)定其特異性結(jié)合情況。
權(quán)利要求
1.一種嵌合單克隆抗體，它從可識(shí)別鼠類MAb P3的鼠類抗獨(dú)特型單克隆抗體1E10得到，所述單克隆抗體1E10由保藏號(hào)為ECACC97112901的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)，其中其重鏈和輕鏈的高度可變區(qū)包括下述序列重鏈CDR1SYDINCDR2WIFPGDGSTKYNEKFKGCDR3EDYYDNSYYFDY輕鏈CDR1RASQDISNYLNCDR2YTSRLHSGCDR3QQGNTLPWT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其中其重鏈和輕鏈的構(gòu)架區(qū)(FRs)包括下述序列重鏈FR1QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTFR2WVRQRPEQGLEWIGFR3KATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCARFR4WGQGTTLTV輕鏈FR1DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCFR2WYQQKPDGTVKLLIYFR3VPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCFR4FGGGTKLESK。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其中為了其人源化和保持對(duì)抗原的結(jié)合能力，其至少包括下面替代中的一種輕鏈位置7用Ser替換Thr位置8用Pro替換Thr位置15用Val替換Leu重鏈位置5用Val替換Gln位置40用Ala替換Arg位置42用Gly替換Glu位置87(根據(jù)Kabat的編號(hào)為83)用Arg替換Thr。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其中重鏈恒定區(qū)包括γ-1鏈的氨基酸序列，輕鏈恒定區(qū)包括κ鏈的氨基酸序列，γ-1鏈和κ鏈都源自人的免疫球蛋白。
5.一種細(xì)胞系，它可用于生產(chǎn)權(quán)利要求1-4的任意一種單克隆抗體。
6.一種藥物組合物，它用于惡性乳腺腫瘤和黑素瘤以及它們的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的治療，該藥物組合物包括權(quán)利要求1-4的任意一種單克隆抗體。
7.一種藥物組合物，它用于惡性乳腺腫瘤和黑素瘤以及它們的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的“體內(nèi)”定位和鑒定，該藥物組合物包括權(quán)利要求1-4的任意一種單克隆抗體。
8.權(quán)利要求1-4的任意一種單克隆抗體在制備用于惡性乳腺腫瘤和黑素瘤以及其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的治療的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用DNA重組技術(shù)方法獲得的修飾抗體，它是用在布達(dá)佩斯條約下保藏號(hào)ECACC 94113026保藏的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的鼠單克隆抗體P3(MAb P3)和保藏號(hào)ECACC 97112901保藏的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的其抗獨(dú)特型鼠單克隆抗體1E10(MAbai 1E10)來(lái)生產(chǎn)的，獲得單克隆抗體的目的是，保持原始抗體的與抗原特異性結(jié)合的生物功能，然而又具有減少的免疫原性。本發(fā)明的嵌合抗體含有鼠免疫球蛋白的可變區(qū)和人免疫球蛋白的恒定區(qū)；除含有人免疫球蛋白的恒定區(qū)之外，并且將其人源化，其在鼠類構(gòu)架區(qū)(FRs)，尤其在那些處于T細(xì)胞抗原位點(diǎn)中的區(qū)域被修飾，因此，若干FRs的位置也是人的。該抗體可以在不同類型的腫瘤的診斷和治療中應(yīng)用。本發(fā)明還涉及用于治療和診斷目的的抗體的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101054417SQ20071010210
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2002年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月6日
發(fā)明者德 阿考斯塔 德?tīng)?里奧 C·M·馬特, 瓦拉達(dá)里斯 J·羅姆巴德羅, L·T·羅克納瓦羅, 勒奎那 A·洛佩茲 申請(qǐng)人:分子免疫中心