專利名稱：用于治療腫瘤病的抗體結(jié)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及免疫結(jié)合物領(lǐng)域，更具體地說(shuō)是涉及免疫結(jié)合物在治療癌癥中的用途。本發(fā)明也涉及用單克隆抗體(MoAbs)和細(xì)胞毒素部分的結(jié)合物來(lái)治療黑素瘤，這些細(xì)胞毒素部分是例如gelonin、核糖體抑制蛋白質(zhì)、其它從植物中派出來(lái)的細(xì)胞毒素部分或是細(xì)胞毒素的或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的生物應(yīng)答修飾因子。
由于在治療腫瘤的足夠反應(yīng)要視腫瘤內(nèi)藥物濃度的釋放和保持而定，故癌癥治療的精確定向必然是相當(dāng)關(guān)鍵的。定位療法是采用單克隆抗體作為特定治療劑載體的一些研究者的目標(biāo)。
癌癥是西方社會(huì)中死亡率和發(fā)病率的一個(gè)主導(dǎo)原因。有許多類型的癌癥，并各具特征。但是，癌癥至少有一個(gè)共同特征，即細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)過(guò)程中存有缺陷。
黑素瘤，最致使的皮膚癌，是侵襲男女的高轉(zhuǎn)移性的疾病，在診斷后的五年中幾乎所有病人都難免一死。外科手術(shù)切除去局部惡性腫瘤僅在發(fā)病初期還未擴(kuò)散時(shí)才有效。一旦疾病擴(kuò)散后，外科手術(shù)必須附以其它一般方法作為補(bǔ)充以根除病變的細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞。大多數(shù)通常使用的補(bǔ)充療法諸如放射療法或化療，它們非局限于對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用，雖然相對(duì)而言對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的殺滅作用較大，但常常會(huì)在一定程度上損傷正常細(xì)胞。
許多腫瘤表達(dá)一些正常細(xì)胞表達(dá)極微弱或根本不表達(dá)的抗原或抗原決定簇。一些腫瘤細(xì)胞表達(dá)胚胎類型細(xì)胞所表達(dá)的抗原，而這種抗原不被成熟動(dòng)物的正常細(xì)胞所表達(dá)。這些異常表達(dá)的抗原被稱為腫瘤相關(guān)抗原。這些抗原的專一性在于盡管特定的抗原可能被多于一種腫瘤所表達(dá)，但它通常是被表達(dá)該抗原的特定腫瘤的所有或大多數(shù)細(xì)胞所表達(dá)。一個(gè)腫瘤細(xì)胞可以表達(dá)一種或多種腫瘤相關(guān)抗原。這些腫瘤相關(guān)抗原可在細(xì)胞的表面上表達(dá)(細(xì)胞表面抗原)也可以由腫瘤細(xì)胞分泌出來(lái)(分泌抗原)，或仍保留在細(xì)胞內(nèi)(細(xì)胞內(nèi)抗原)。
這些腫瘤相關(guān)抗原已被用來(lái)檢測(cè)、診斷并定位腫瘤。在某些情況下腫瘤細(xì)胞上腫瘤相關(guān)抗原的存在就允許了對(duì)腫瘤細(xì)胞有特異性的特殊藥物及其它治療手段的定向應(yīng)用。
抗體通常是由動(dòng)物免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生的對(duì)外界抗原或抗原決定簇應(yīng)答的蛋白質(zhì)?？贵w定向地連接在特定的抗原上。例如，對(duì)其它黑素瘤抗原的抗體在全身和腹膜內(nèi)使用后被用來(lái)測(cè)定人體中特定的腫瘤位置。
隨著針對(duì)腫瘤細(xì)胞上抗原的特異單克隆抗體的發(fā)展，一種減少對(duì)正常細(xì)胞損害的靶向化療法已成為可能，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞上的抗原不會(huì)在正常細(xì)胞上出現(xiàn)。與特定抗原或抗原決定簇定向的單克隆抗體可以大量地制備。
為了讓抗體用來(lái)定位和治療惡性腫瘤，可給它進(jìn)行標(biāo)記。這類放射性同位素標(biāo)記的單克隆抗體可附于腫瘤細(xì)胞表面抗原上，通過(guò)體外閃爍照像已成功地使病人體內(nèi)腫瘤成象(Deland，Semin Nucl Med.19(3)158-65(Review)(1989);Juhl，Hepalogastroenterology 36(1)27-32(Review)(1989))。結(jié)合藥物的抗體可用作一個(gè)釋放系統(tǒng)，藥物通過(guò)它可以抗體所定向的特定腫瘤細(xì)胞為目標(biāo)，這是因?yàn)槿硎褂昧私Y(jié)合藥物的抗體后，抗體有到達(dá)腫瘤區(qū)域的獨(dú)特能力。抗體也可與毒素相結(jié)合，從而作一個(gè)釋放系統(tǒng)使毒素定向地運(yùn)行到特定腫瘤細(xì)胞。
通常用于抗體結(jié)合物的細(xì)胞毒素劑大體分為三類物質(zhì)毒素、放射核素和化療劑。與這三類中每類結(jié)合的抗體可作為具一定效力的治療劑但也存在一些特有的問(wèn)題(Frankel，el al.Ann，Rev.Med.37125-142(1986)，Reimann et al.，J.Clin.Invest.82(1)129-138(1988).).含有植物毒素的免疫結(jié)合物與其它類型的抗體結(jié)合物相比有一個(gè)獨(dú)特的長(zhǎng)處，因?yàn)?.抗腫瘤活性所需的免疫毒素的劑量一般要比抗體-藥物結(jié)合物所需的低得多。
2.毒素與抗體的結(jié)合不影響抗體的親和力。Gelonin是一種糖蛋白(分子量約為29-30，000Kd)，從Gelonium multiforum種子中純化而得。Gelonin屬于強(qiáng)核糖體失活植物毒素類。該類核糖體一失活植物毒素的其它組員是相思豆毒素、蓖麻蛋白和modeccin的鏈。與相思豆毒素和蓖麻蛋白一樣，Gelonin通過(guò)損傷哺乳動(dòng)物核糖體的60s亞單位來(lái)抑制蛋白質(zhì)合成。雖然相思豆毒素的A鏈(RTA)已廣泛用于免疫毒素，但gelonin對(duì)化學(xué)和物理處理比RTA穩(wěn)定[Barbieri et al.，Comcer Swrv.1489-520(1982)]。此外，gelonin本身不與細(xì)胞結(jié)合，因而是無(wú)毒的(除了高濃度外)且在實(shí)驗(yàn)室操作中是安全的。核糖體的失活是不可逆的，不涉及輔助因子并有揭示酶促作用的效能。
許多工作者建議或報(bào)告了將細(xì)胞毒素劑與抗體結(jié)合組成“免疫毒素”。單克隆抗體與細(xì)菌毒或諸如蓖麻蛋白或相思豆毒素的植物毒素的醇活性部分(A醇)b結(jié)合組成的免疫毒素有特殊的興趣。(Nevelle et al.，Immunol.Rev.，6275-92(1982);Ross et al.，European J.Biochem.104(1980);Vitteta et al.，Immunol.Rev.62158-183(1982);Ross et al.，Cancer Res.42(1982)457-464;Trowbridge and Domingo，Nature(Cond.)294171-173(1981)).以蛋白質(zhì)重量為基礎(chǔ)，Gelonin和蓖麻蛋白是抑制蛋白質(zhì)合成活性最大的毒素。Gelonin在抑制蛋白質(zhì)合成中比蓖麻蛋白A鏈的活性大10-1000倍。像蓖麻蛋白和相思豆毒素的肽鏈包含兩條鏈，毒性單位A鏈及用來(lái)與細(xì)胞結(jié)合的B鏈。與蓖麻蛋白和相思豆毒素不同，gelonin只由一條鏈組成，由于它缺少用來(lái)與細(xì)胞結(jié)合的B鏈，極它本身對(duì)于完整的細(xì)胞是相對(duì)無(wú)毒的(Stirpe et al.，J.Biol Chem 2556947-6953(1980))。哺乳綱細(xì)胞明顯缺少與gelonin分子結(jié)合和/或使gelonin分子內(nèi)在化的能力。gelonin與腫瘤靶向的單克隆抗體的配對(duì)物既提供了將gelonin連接至細(xì)胞上的特定方法又提供使gelonin-抗體復(fù)合物內(nèi)在化的途徑。這種單克隆抗體諸如定向于特定的腫瘤細(xì)胞例如黑素瘤細(xì)胞抗原的單抗ZME。采用毒素gelonin比之采用諸如蓖麻蛋白A鏈毒素的優(yōu)點(diǎn)之一是與蓖麻蛋白A鏈相比減少了對(duì)正常組織的毒性。gelonin與定向于抗-腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體配對(duì)物，它們?cè)谀[瘤治療中是一種有活性。選擇性的免疫毒性劑。
以前的研究已闡述了許多含有g(shù)elonin的抗體一毒素結(jié)合物(Lambert et al.，J.Biol Chem.26012035-12038(1985);Thorpe et al.，Eur.J.Biochem 116447-454(1981);Singh et al.，J.Biol.Chem.2643089-95(1989);Scott et al.，J.Natl.Cancer Inst.791163-72(1987);Tedder et al.，J.Immunol.137(4)1387-91(1986)).最近Ozawa，et al(Int.J.Cancer 43152-157)已構(gòu)思了一種由抗體B467組成的gelonin免疫毒素，該抗體B467與接受表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的細(xì)胞受體相結(jié)合。該B467-gelonin結(jié)合物對(duì)EGF受體表達(dá)的細(xì)胞毒素很高但對(duì)缺乏受體的細(xì)胞的無(wú)毒的。Sviam et al(Cancer Research 473169-3173(1987)制成了抗黑素瘤抗體9.2.2.7與gelonin結(jié)合物，并與相思豆素和蓖麻蛋白A鏈的9.2.2.7結(jié)合物比較其體內(nèi)的體外殺細(xì)胞活性。這些研究證明gelonin結(jié)合物體外對(duì)抗原陽(yáng)性細(xì)胞確有選擇性的細(xì)胞毒性效果。體內(nèi)試驗(yàn)證明直至總的抗體劑量為2mg/小鼠時(shí)gelonin結(jié)合物還是無(wú)毒的;多次靜脈注射gelonin免疫毒素足以延遲皮下人體腫瘤異體移植物在裸鼠中的生長(zhǎng)。與以相思豆毒素和蓖麻蛋白的結(jié)合物相比較，gelonin結(jié)合物有相似的效力，在體內(nèi)治療中選擇性更好且對(duì)腫瘤定位更準(zhǔn)確。
由于連有藥物、毒素或放射性元素標(biāo)記的抗體只與表達(dá)特定抗原的腫瘤細(xì)胞結(jié)合，故只有腫瘤細(xì)胞被殺死。相反的，采用放射療法，來(lái)自放射性同位素標(biāo)記化合物的射線不只局限于接受射線的腫瘤細(xì)胞。例如，抗體的新陳代謝或酶促降解可釋放放射性標(biāo)記物，使它們能到達(dá)諸如腎或骨髓的其它組織中，對(duì)這些器官造成不可接受的放射損傷。放射性同位素標(biāo)記的抗體有這類問(wèn)題，就限制了其在治療劑中的使用或使其在治療劑的中的使用復(fù)雜化。
本發(fā)明提供了一種抗體(這里稱為ZME-018)的免疫結(jié)合物，該抗體可以識(shí)別在黑素瘤細(xì)胞上的GP240抗原。Wilson et al.，討論的一種抗體(22528S)可識(shí)別這個(gè)黑素瘤膜抗原(Wilson et al.，Int.J.Cancer 28293(1981))。該抗原在這里定義為GP240。與GP240結(jié)合的抗體225.28s在這里進(jìn)一步定義為ZME-018。在一個(gè)具體實(shí)例中，抗體與選自由gelonin、蓖麻蛋白A鏈和相思豆素A鏈所組成組的一種毒素相連接。在另一個(gè)具體實(shí)例中，ZME抗體可與諸如阿霉素的殺細(xì)胞藥或諸如淋巴因子或細(xì)胞激動(dòng)素的生物應(yīng)答修飾劑相連接。在另一個(gè)實(shí)例中抗體可用諸如放射性同位素化學(xué)發(fā)光劑、熒光劑或酶標(biāo)記物的可檢測(cè)標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。通過(guò)給需要這類治療的個(gè)體使用這些殺細(xì)胞免疫結(jié)合物來(lái)治療腫瘤和預(yù)防帶有腫瘤相關(guān)GP240的腫瘤復(fù)發(fā)。應(yīng)用該技術(shù)領(lǐng)域人員熟知的技術(shù)可檢測(cè)的標(biāo)記ZME免疫結(jié)合物可用來(lái)診斷和定位腫瘤。這些標(biāo)記的免疫結(jié)合物也可通過(guò)該技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法用來(lái)測(cè)定生物樣品內(nèi)存在的GP240并給體內(nèi)的腫瘤位置定位。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種細(xì)胞毒性組合物，它將特異性結(jié)合并殺死腫瘤細(xì)胞提供一種特異性地與表達(dá)上述的GP240抗原的腫瘤細(xì)胞結(jié)合并殺死它的細(xì)胞毒性組合物也是特別作為本發(fā)明的一個(gè)目的。在Hybritech，Inc中用鹽分餾和DEAE色譜層析來(lái)制備抗體ZME-018并通過(guò)SDS PAGE(Wilson et al.，Int.J.Cancer 28 293-300(1981))來(lái)判斷是否均質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是關(guān)于通過(guò)使細(xì)胞與殺細(xì)胞有效量的免疫毒素相接觸而殺死人體黑素瘤細(xì)胞或表達(dá)ZME(GP240)抗原的其它腫瘤細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于提供這樣的組合物，使之對(duì)腫瘤細(xì)胞有毒性但對(duì)正常器官的損傷最小。


圖1表明ZME-gelonin連接和純化的流程。
圖2表明用S-300凝膠滲透色譜層析對(duì)ZME-gelonin的純化。
圖3表明從S-300色譜層析出來(lái)的高分子量的物質(zhì)在Cibachron一點(diǎn)瓊脂糖凝交柱上用線性鹽梯度洗脫(0-300mM NaCl)流出簡(jiǎn)圖。顯示出兩個(gè)蛋白質(zhì)峰一個(gè)徹底流出峰(餾份14-20)和一個(gè)用高鹽洗脫出的鄰接峰(餾份44-75)。
圖4表明gelonin和ZME gelonin結(jié)合物的電泳類型。
圖5表明ZME(空心圈)和ZME gelonin(滿圈)的比較的ELISA分析數(shù)據(jù)。
圖6表明ZME-gelonin和游離gelonin對(duì)對(duì)數(shù)期AAB-527細(xì)胞在72小時(shí)暴露后的毒性。
圖7表明ZME-gelonin和游離gelonin對(duì)對(duì)數(shù)期AAB-527細(xì)胞的毒性。
圖8表明ZME-gelonin對(duì)抗原陽(yáng)性靶黑素瘤細(xì)胞(AAB-527)和抗原陰性T-24細(xì)胞在培養(yǎng)基中的毒性。
圖9表明游離抗體對(duì)ZME-gelonin細(xì)胞毒性的影響。
圖10表明IFN-α、IFN-γ和TFN對(duì)ZME-gelonin細(xì)胞毒性的作用。涂覆的圈表明對(duì)只有ZME-gelonin的劑量反應(yīng)?？招牡姆綁K表明對(duì)ZME-gelonin加上IFN-γ的劑量反應(yīng)。空心的三角形表明在適當(dāng)量TNF-α的存在下ZME-gelonin的劑量反應(yīng)。帶有空白點(diǎn)的涂滿的圈表明在適當(dāng)量IFN-α存在下，ZME-gelonin劑量反應(yīng)曲線。
圖11表明ZME-gelonin對(duì)抗原阻性(A-375，涂覆的圈)及抗原陰性(CEM，空立方塊)細(xì)胞在人體腫瘤起源細(xì)胞分析中的作用。
圖12表明ZME-gelonin對(duì)從4個(gè)病人的新鮮活組織中得到的不同型起源細(xì)胞存活的細(xì)胞毒性作用。
圖13表明ZME抗體和ZME-gelonin結(jié)合物在帶有人體黑素瘤異體移值物的裸鼠中的組織分布。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”表示一種總體均勻的抗體組合物。它并不限定抗體的來(lái)源或制備抗體的方法。
黑素瘤細(xì)胞在其細(xì)胞表面上表達(dá)出240KD(GP240)抗原。已生產(chǎn)出這個(gè)抗原的抗體?？贵wZME-018(Hybritech Inc生產(chǎn))是一種能識(shí)別存在于大多數(shù)人體黑素瘤細(xì)胞表面上240Kd糖蛋白的鼠的單克隆抗體IgG2a?？梢陨a(chǎn)出能識(shí)別這個(gè)240KD抗原的表位的IgG1、IgG2a和IgG2b同位素的單克隆抗體。用于本發(fā)明目的的ZME抗原的240Kd表位被稱為表位。因此，能識(shí)別該ZME表位的所有抗體在功能上是等同的。
這些具代表性的雜交培養(yǎng)的細(xì)胞分泌出相同的異型抗體，即所有分泌的抗體都能認(rèn)出ZME表位，它們保藏在美國(guó)保藏中心(ATCC)，保藏號(hào)為_(kāi)。
這些單克隆抗體可通過(guò)該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來(lái)制得。已詳細(xì)地闡述了制備產(chǎn)生這些抗體的雜交細(xì)胞培養(yǎng)物的特征及方法。(Wilson et al.，Int.J.Cancer 28293(1981);Imai et al.，Transplavt proc.12380-383(1980)).簡(jiǎn)而言之，用鼠骨髓瘤細(xì)胞系Sp2/0-Ag-14和如Imai et al.，(1980)Transplant Proc.12380-383)所述的用黑素瘤細(xì)胞系M21免疫的鼠脾細(xì)胞來(lái)建立雜交系。分泌單克隆抗體(MoAb)225.28s和465.12的雜交系已被亞克隆并在體內(nèi)和體外繁殖。兩種單克隆抗體都是IgG2a亞類，在使用前通過(guò)在蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠4B上(Pharmacia，Piscatawny，NJ，USA)吸附/洗脫而從小鼠腹水中進(jìn)行純化。
雜交產(chǎn)生的抗體與人體黑素瘤細(xì)胞反應(yīng)但不與人體正常細(xì)胞反應(yīng)，這種抗體被進(jìn)一步特異化。由ZME細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體及雜交產(chǎn)生的功能上等同的抗體與人體黑素瘤細(xì)胞上的ZME抗原反應(yīng)。它們也與70-80%隨機(jī)獲得的試驗(yàn)黑素瘤反應(yīng)，但是綜述在實(shí)施例4中表1的種種組織無(wú)反應(yīng)。
這里所用的關(guān)于例舉的鼠單克隆抗人體黑素瘤抗體方面，術(shù)語(yǔ)“功能上等同”表示一種單克隆抗體(a)橫向劃分例舉的單克隆抗體;(b)有選擇性地結(jié)合到諸如人體黑素瘤細(xì)胞的表達(dá)ZME抗原的細(xì)胞上;(c)具有G或M等型基因;(d)通過(guò)免疫沉淀或夾心免疫分析來(lái)測(cè)定與ZME抗原的結(jié)合;(e)當(dāng)與gelonin結(jié)合，則顯示組織培養(yǎng)抑制劑量(TCID)，對(duì)AAB-527或A375系中至少一種最低抑制50%(所用劑量是80-100單位/ml)。
用N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPPP)或2-亞氨基硫羥烷(IT)作為連接劑使抗體ZME與gelonin結(jié)合。結(jié)合物在72小時(shí)組織培養(yǎng)分析中進(jìn)行抗AAB-527和A375細(xì)胞試驗(yàn)。這兩種細(xì)胞系的抗體結(jié)合物表現(xiàn)出可接受的抗增殖活性(TCID50%在少于100單位毫升時(shí))。
下面實(shí)施例給出抗體的進(jìn)一步詳細(xì)特征，。
免疫化學(xué)劑本發(fā)明首要的免疫化學(xué)衍生物是免疫毒素(ZME抗體與細(xì)胞毒素部分或生物應(yīng)答修飾劑的結(jié)合物)以及標(biāo)記的衍生物(例如，放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記或熒光標(biāo)記的衍生物)，其中標(biāo)記提供了識(shí)別包括標(biāo)記了的抗體的免疫復(fù)合物的方法。
免疫毒素的細(xì)胞毒素部分可以是細(xì)胞毒素藥物或源于細(xì)菌或植物(gelonin)的酶活性毒素或是這類毒素的酶活性片段(“A鏈”)。酶活性毒素及其片段較為優(yōu)選，其例子為gelonin、白喉菌A鏈、未結(jié)合的白喉毒素的活性片段、外毒素A鏈(從Pseudomonas aerugmosa中得到)、蓖麻蛋白A鏈、相思豆素A鏈、modeccin A鏈、α-次黃嘌呤、Aleurites fordii蛋白質(zhì)、dianthin蛋白質(zhì)、Phvtoiacca americana蛋白質(zhì)(PAPI，PAPII和PAP-S)、苦瓜屬沙位提(momordica charamria)抑制劑、瀉果素、巴豆毒蛋白、藥用肥皂草屬抑制劑、絲裂吉菌素、局限曲霉素、酚霉素和伊諾霉素。首先的是與gelonin的結(jié)合物。
可與ZME抗體結(jié)合且用于本發(fā)明的生物應(yīng)答修飾因子包括，但不局限于，諸如IL-1、IL-2干擾素(α、β或γ)TNF、LT、TGF-β和IL-6的淋巴細(xì)胞激活素和細(xì)胞激活素。這些生物應(yīng)答修飾因子對(duì)腫瘤細(xì)胞有種種作用。這些作用是通過(guò)直接作用增加腫瘤細(xì)胞殺死率及通過(guò)增加宿主體防御調(diào)節(jié)機(jī)制而增加腫瘤細(xì)胞的殺死率?？贵wZME與這些生物應(yīng)答修飾因子的結(jié)合使之在腫瘤內(nèi)選擇性定位，因而增加了坑增殖作用，同時(shí)抑制了引起對(duì)非靶向細(xì)胞毒素性的非特異性作用。
在本發(fā)明中有用的細(xì)胞毒素藥包括，但不限于，阿霉素(及其衍生物)、順一鉑絡(luò)合物(及其衍生物)、爭(zhēng)光霉素和氨甲葉酸(及其衍生物)。這些細(xì)胞毒素藥有時(shí)對(duì)于臨床治療腫瘤復(fù)發(fā)特別是黑素瘤是有用的，但它們有嚴(yán)重的副作用并危及非靶細(xì)胞而使其使用復(fù)雜化?？贵wZME可作為這類藥物的有用載體，為藥物釋放至腫瘤并增加其進(jìn)入腫瘤細(xì)胞提供了一種有效的手段。另外，將載有細(xì)胞毒素藥物的特定抗體釋放至腫瘤可以保護(hù)諸如肝臟、腎和骨髓敏感區(qū)域免受化療劑的毒性作用。由于所有藥物部分與在腫瘤內(nèi)濃集的抗體結(jié)合，故采用藥物與抗體ZME結(jié)合的釋放系統(tǒng)可以降低藥物本身的劑量。
單克隆抗體的結(jié)合物可采用種種雙功能蛋白連接劑而制得。這類反應(yīng)劑的例子是SPDP、IT、諸如膽影酸二甲酯的亞氨基酯·HCl的雙功能衍生物、諸如辛二酸二琥珀酰亞氨酯的活性酯、諸如戊二醛的醛、諸如雙(對(duì)-二氮鎓苯甲基)-己二胺的雙-二氮鎓衍生物、諸如雙(對(duì)-重氮基苯甲?；?-乙二胺的雙重氮基衍生物、諸如2，6-二異氰酸苯亞甲酯的二異氰酸酯及諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯的二-活性氟化合物。
當(dāng)結(jié)合物用來(lái)在體外治療或診斷目的下殺死人體黑素瘤細(xì)胞，典型地將結(jié)合物加至細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)中，濃度至少約10mM。體外使用的配方及給藥模式是不苛刻的。通常使用與培養(yǎng)基或灌注基能混溶的水液制劑。
用作診豆和治療帶有諸如黑素瘤ZME抗原的細(xì)胞毒素放射藥物可通過(guò)將高線性能量轉(zhuǎn)段(LET)的放射同位素結(jié)合至抗體上而制得。這里所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒素部分”也包括這類同位素。
用來(lái)制備標(biāo)記抗體的標(biāo)記物包括可被直接檢測(cè)的部分，例如熒光鉻和放射標(biāo)記物以及諸如酶的必須經(jīng)反應(yīng)或衍生化后而檢測(cè)的部分。這類標(biāo)記物的例子是32P、12G、3H、14C熒光茨及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹酰、7-羥基香豆素、熒光素、2，3-dihydrophthalzainediones，辣根過(guò)氧化酶、堿性磷酸酯酶、溶菌酶和葡萄糖-6-磷酸酯脫氫酶。抗體可通過(guò)已知方法用這類標(biāo)記物標(biāo)記。例如，諸如醛、碳化一亞胺、雙馬來(lái)酰亞胺、imidates、琥珀酰亞胺、雙-重氮化的苯啶等的連接劑可用來(lái)使抗體與上述的熒光、化學(xué)發(fā)光劑和酶標(biāo)記物進(jìn)行連接。
抗體和標(biāo)記抗體可用于許多免疫成像或免疫分析方法中以檢測(cè)病人或監(jiān)視已診斷出患有癌癥者中表過(guò)ZME抗原的諸如黑素瘤的腫瘤的存在。當(dāng)用來(lái)監(jiān)測(cè)癌癥的狀態(tài)時(shí)可采用定量免疫分析方法。這類監(jiān)測(cè)分析定期地進(jìn)行，比較結(jié)果以決定病人的腫瘤是否增加或減少?？捎玫钠胀ǚ治黾夹g(shù)包括直接和間接分析。直接分析包括將采自病人的組織或細(xì)胞樣品與帶有標(biāo)記的抗體一起孵育。如果樣品細(xì)胞包括黑素瘤細(xì)胞ZME抗體帶有標(biāo)記的抗體就與這些細(xì)胞結(jié)合。洗滌組織或細(xì)胞以除去未結(jié)合的標(biāo)記抗體后，組織樣品即可測(cè)定標(biāo)記免疫復(fù)合物的存在。
診斷用的抗體典型地為配套形式。這些典型的配套物包括在合適容器中標(biāo)記形式的抗體、用來(lái)孵育和洗滌的試劑以及視標(biāo)記物性質(zhì)而定的基礎(chǔ)物質(zhì)或派生劑。也可包括抗原ZME的對(duì)照物及指令。
給已診斷出帶有ZME抗原決定簇的腫瘤病人使用本發(fā)明的免疫毒素可以使細(xì)胞毒素劑定位并濃縮在殺死腫瘤細(xì)胞所需的部位。通過(guò)使細(xì)胞毒素劑如此定向，可以消除或減少其它器官、組織和細(xì)胞的非特定毒性。
當(dāng)用于體內(nèi)治療時(shí)，給病人使用治療有效量的免疫毒素(治療有效量即是消除或減少病人腫瘤的量)。它們通常是非腸道給藥，較好地是靜脈內(nèi)給藥。劑量及療程視癌癥的性質(zhì)(初期或轉(zhuǎn)移性的)及其種類、特定免疫毒素的特征(例如其治療指數(shù))、病人及病史而定。所用免疫毒素量典型的范圍為0.1-10/ng/Kg病人的體重。
非腸道使用的免疫毒素輔以藥學(xué)上可接受的非腸道的賦形劑而配成單位劑量的注射劑(溶液、懸浮液、乳劑)。這類賦形劑本身無(wú)毒且無(wú)療效。這類賦形劑的例子是水、鹽水、Ringer's溶液、右旋糖溶液和5%血清白蛋白。也可使用諸如不揮發(fā)油和油酸乙酯的非水性賦形劑。磷脂可用作載體。賦形劑可含有微量的諸如增加等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的添加物，例如緩沖液和防腐劑。免疫毒素在這類賦形劑中典型地配成濃度為0.1mg/ml至10mg/ml。
通過(guò)Stirpe，et al的方法從gelonium muiltiflorum的種子中均化Gelorin。簡(jiǎn)單地說(shuō)，通過(guò)在緩沖鹽水溶液(pH7.4)中均化而使gelonin從種子中萃取出來(lái)。在5mM磷酸鈉(pH6.5)中滲析后濃縮上清液，gelonin再用如實(shí)施例1所述的離子交換色譜層析純化用高壓液相色譜(HPLC)和十二烷基硫酸鈉-聚乙酰胺凝膠電泳(SDS-Page)分析gelonin毒素的純度。Gglonin毒素遷移成一單區(qū)帶，其分子量為29-30，000道爾頓。
如實(shí)施例2所述通過(guò)在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)合成抑制不測(cè)量Gelonin素素活性。
如實(shí)施例5所述的用SPDP修飾的抗體ZME-018與實(shí)施例3和6所述的亞氨基硫羥烷修飾的gelonin相結(jié)合。如實(shí)施例7所述通過(guò)在Sephadex G-75柱上的柱色譜層析純化結(jié)合抗體的gelonin。
通過(guò)蛋白質(zhì)合成抑制來(lái)決定gelonin配對(duì)的抗體的毒性，用體外和體內(nèi)試驗(yàn)測(cè)定其抗增殖活性。
下列實(shí)施例詳細(xì)敘述了本發(fā)明免疫毒素單克隆抗體的制備、特征及其使用。這些實(shí)施例不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1gelonin的純化將Gelonium multiflorum的種子去殼，用8倍體積含5mM磷酸鈉的0.14M NaCl液(pH7.4)在均化器中研磨硬果。使均化物在4℃下過(guò)夜。在0℃下及冰冷卻和攪拌下以35，000次g速度離心20分鐘。除去上清液在5mM磷酸鈉液中滲析并用pm10濾器濃縮，樣品在用5mM磷酸鈉平衡的CM-52和離心交換柱上(20×1.5cm)分層。結(jié)合至離子交換樹(shù)脂上的物質(zhì)用400ml 0-0.3M線性NaCl溶液梯度在4℃下以25ml/小時(shí)的速率洗脫。每次收集餾份5ml，在分光光度機(jī)上于280nm處觀察鎦份。gelonin約在55-70鎦份流出，是最后的流出高峰。收集鎦份55-70，在重蒸水中滲析，通過(guò)冷凍干燥濃縮。在高壓效相色譜中用TSK3000凝膠滲透柱用50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)洗脫以及15%十二烷基硫酸鈉-聚乙酰胺凝膠電泳(SDS-page)來(lái)檢查每個(gè)制備產(chǎn)品的純度及分子量。Gelonin遷移成一個(gè)單一區(qū)帶，分子量約為29-30，000道爾頓。
實(shí)施例2Gelonin活性的分析在無(wú)細(xì)胞的質(zhì)白質(zhì)合成抑制分析中監(jiān)測(cè)Gelonin的活性。在使用前馬上解凍免網(wǎng)狀細(xì)胞溶解物，并在50ml免疫網(wǎng)狀細(xì)胞溶解物中依次加入下列組分0.5ml 0.2M Tris HCl(ph7.8)、8.9ml乙二醇和0.25ml 1M HCl.每次加入后混合來(lái)進(jìn)行無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成抑制分析。
取20微升組成為0.375MKCl、10mM Mg(CH3CO2)2、15mM葡萄糖、0.25-10mM氨基酸(亮氨酸除外)、5mM ATP、1mM GTP、50mM TMS-HCl(pH7.6)、10μl肌酸酐磷酸酯-肌酸酐磷酸酯酚、8μl14C亮氨酸(Amersham 348毫居里/mmol)的鹽一氨基酸一能量混合物(SAEM)并加入含有不同濃度gelonin混合物的1.5μl溶液。使混合物在30℃下孵充60分鐘。通過(guò)在玻璃纖維過(guò)濾器上沉淀出所合成的蛋白質(zhì)，用10%TCA和丙酮洗滌，在β-計(jì)數(shù)器上用Aguasol閃爍流體測(cè)定放射活性而測(cè)得與混合物成倍數(shù)關(guān)系的摻入的14C-亮氨酸。不低于4×109μ/mg的有特定活性的Gelonin用來(lái)與抗體結(jié)合。gelonin活性單位是在無(wú)細(xì)胞分析中引起摻入[14C]亮氨酸50%抑制的gelonin蛋白質(zhì)的量。
實(shí)施例3用亞氨基硫羧烷修飾的Gelonin使在磷酸鹽緩沖鹽水中的Gelonin于Centricon 10微型濃縮器中濃縮至約2mg/ml。加入三乙醇胺氯化氫(TEA/HCl)、(pH8.0)和EDTA直至最后的TEA/HCl濃度為60mM及1mM EDTA，pH8.0。將2-亞氨基硫羥烷貯存溶液(20mM)加至最終濃度為1mM，使樣品在氮?dú)饬飨掠?℃下孵育90分鐘。
在預(yù)先用含有50mM NaCl和1mM EDTA的雙-三乙酸鹽緩沖液pH5.8預(yù)平衡的Sephadex G-25柱上凝膠過(guò)濾而除去過(guò)量的亞氨基硫羥烷。用Badford染料結(jié)合分析在微滴定板上分析鎦份中蛋白質(zhì)的含量。簡(jiǎn)而言之，在每個(gè)坑中加入40μl樣品、100μl磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)和40μl樣品、100μl磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)和40μl染料濃縮物。在Dynatech Micritlisa自動(dòng)讀出器中讀出600nm處的吸光度。Gelonin在空隙體積處流出(約在鎦份14-20)。收集這些鎦份并用Gentricin-10微濃縮器濃縮。
實(shí)施例4對(duì)ZME黑素瘤抗原的單克隆抗體的制備及特征分泌抗體的雜交系用107人黑素瘤M21細(xì)胞腹腔內(nèi)注入8周齡雌性BALB/C鼠(SCRF喂養(yǎng)繁殖La Jolla，Calif)，2周后再用5×106M21細(xì)胞增加腹腔內(nèi)注射。對(duì)50周齡的雄性NZB/B鼠(SCRF喂養(yǎng)繁殖)先注入5×106BW5黑素瘤細(xì)胞，每隔一個(gè)分別再用5×106BW5、M51、Colo38、BW5和M21增加注射5次，增加注射后三天，殺死小鼠，取出脾臟，用手術(shù)刀分離出脾細(xì)胞而制成細(xì)胞懸浮液。用0.17NH4Cl在0.01M Tns pH7.2中處理脾細(xì)胞懸浮液10分鐘以溶去紅血球細(xì)胞。然后，如Gefter et al.(1977)Somat，Cell Genet 3731)所述用下列微小修飾使SP2/OAg14細(xì)胞與這些脾細(xì)胞融合5×107脾細(xì)胞和107SP2/OAg14細(xì)胞用0.3ml 30%(V/V)聚乙二醇1000(PEG)(Baker化學(xué)公司，phillipsburg N.J.)在MEM中進(jìn)行雜交。用PEG孵育后洗滌細(xì)胞，在2×106細(xì)胞/每毫升D-MEN濃度中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天使細(xì)胞懸浮液在40ml HAT基質(zhì)中并吸進(jìn)約微滴定板400克中(0.1ml/坑)(Costar ＃ 3596，Cambridge Mass)間隔一周如一滴(約25ml)MAT基質(zhì)。2-3周后，選作進(jìn)一步研究的雜交物在含10%FBS的D-MEN中培育。雜交物放在組織培養(yǎng)物中并在已注射0.5ml Pristane(Pfaltz和Bauer，Inc.Stamfofd，Conn)的BALB/C鼠的腹腔內(nèi)生長(zhǎng)。投入使用的培養(yǎng)基和腹水可用作抗體來(lái)源。
根據(jù)諸如Cotten et al，Eur，J.Immumol.3.136(1973)所述的組織培育技術(shù)在體外使雜交細(xì)胞的無(wú)性繁殖細(xì)胞系生長(zhǎng)。
與人黑素瘤細(xì)胞反應(yīng)但不與正常人細(xì)胞反應(yīng)的產(chǎn)生抗體的雜交物被進(jìn)一步特異化。
如表1所示，它們與大多數(shù)正常受試的組織不反應(yīng)。由ZME細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體及功能上相等的形成雜交物的抗體與諸如M-21的人黑素瘤上的ZME抗原反應(yīng)。
表 1抗體ZME-018(225.285)＊的正常組織反應(yīng)活性組織反應(yīng)活性＊＊膀胱 0/3大腦皮層 0/2軟骨 0/2結(jié)腸 0/2乳頭 1/2十二指腸 0/1子宮內(nèi)膜 0/1腎 0/2肝 0/1肺 0/4淋巴節(jié) 0/3乳腺 0/3卵巢 0/1胰臟 0/1外周血管淋巴細(xì)胞 0/4外周神經(jīng) 0/1
前列腺 0/2唾液腺 0/3骨骼肌 0/1皮膚 0/5脾 0/1胃 0/3甲狀腺 0/2扁桃體 0/1睪丸 0/5＊ 來(lái)自P.Giacomini，et al.Cancer Research 441281-1287，1984＊＊陽(yáng)性抗原樣品數(shù)/試驗(yàn)樣品數(shù)實(shí)施例5用SPDP修飾單克隆抗體ZME-018將N-琥珀酰亞氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)在無(wú)水二甲基甲酰胺中制成3mg/ml的貯存溶液。由于結(jié)晶SPDP可進(jìn)行水解，通過(guò)分析在260nm處雙束分光光度計(jì)的吸光度，用分光光度方法測(cè)定化學(xué)活性交聯(lián)劑的真正濃度。SPDP貯存的濃度用下式來(lái)計(jì)算(吸光度的改變(260nm))/(0.02×103ml/mmol) × (3.01)/0.01 ＝毫摩爾數(shù)/ml/SPDP將在1.0ml磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中的1mg單克隆抗體ZME加至玻璃管中。不斷混合攪拌下;將5-倍摩爾過(guò)量SPDP貯存溶液(約10μl貯存溶液)的慢慢加入試管中。在室溫下使混合物孵化30分鐘，在孵化期間每5分鐘攪拌一次。
通過(guò)在用含0.5mM EDTA的100mM磷酸鈉緩沖液pH7.4(緩沖液A)預(yù)平衡的Sephdex G-25柱(1×24cm)上的凝膠過(guò)濾色譜層析從樣品中除去過(guò)量未反應(yīng)的SPPP。收集組份(0.5ml)，用Bradford染料結(jié)合分析(Bradford Aral.Biochem.72248-254(1976)進(jìn)行蛋白質(zhì)含量分析。用Bio-TEK微板自動(dòng)讀出器測(cè)出96-坑板上的吸光度(600nm)。抗體在空隙體積處流出(鎦份14-20)，匯集這些鎦份并保持在4℃下。使蛋白質(zhì)在Centricon-30微濃縮器中濃縮蛋白質(zhì)。用100mM含EDTA(0.5mM)的磷酸鈉緩沖液pH7.0洗Centricon的保留物。使抗體濃縮成最終體積0.5-0.75ml。
實(shí)施例6SPDP修飾的單克隆抗體ZME-018與亞氨基硫羥烷修飾的Gelonin結(jié)合如實(shí)施例3所述，將如實(shí)施例1所述的而制得的1mg純化gelonin(2mg/ml在PBS中)用亞氨基硫羥烷進(jìn)行修飾。如實(shí)施例4所述同修飾的單克隆抗體ZME與等重量如實(shí)施例3所述的修飾的gelonin相混合。與抗體相比該部分過(guò)量5倍摩爾的gelonin通過(guò)加入0.05MTEA/HCl緩沖液pH8.9而將混合物調(diào)節(jié)至pH7.0，在氮?dú)庀掠?℃下使混合物孵化20小時(shí)。將碘代乙酰胺(0.1M)加至最后濃度為2mM以封閉任何剩余的游離巰基。在25℃下繼續(xù)孵化1小時(shí)。使該反應(yīng)混合物在4℃下貯存直至用凝膠過(guò)濾純化。
實(shí)施例7Gelonin-單克隆抗體15A8復(fù)合物的純化通過(guò)用PBS預(yù)平衡的Sephadex 3-300柱(1.6×31cm)上的凝膠過(guò)濾而從實(shí)施例6的反應(yīng)混合物中除去未結(jié)合的Gelonin及低分子量產(chǎn)物。
在進(jìn)入Sephadex柱前使實(shí)施例6的反應(yīng)混合物在Centricon 30微型濃縮器中濃縮至1ml。柱用PBS洗滌。鎦份每次收集1ml，用Bradford染料結(jié)合分析(Badford，Anal.Biochem 72248(1976))分析50μl等分試樣的蛋白質(zhì)。
如圖2所示，在空隙體積(約為鎦份28-40)中洗脫出游離的抗體和結(jié)合gelonin的抗體，而來(lái)結(jié)合的gelonin在約鎦份45-65處洗脫出來(lái)。
為了除去未結(jié)合的ZME-018，用在用含0.1M NaCl的10mM磷磷酸鈉緩沖液(pH7.2)預(yù)平衡的蘭瓊脂糖凝膠Cl-6B(1×24m)和色譜柱上層析來(lái)自S-300柱的高分子量峰(鎦份28-40)。進(jìn)樣后，用30ml緩沖液洗滌柱，徹底洗脫出來(lái)結(jié)合的抗體。用在10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)中的0.1-2M NaCl液的線性鹽梯度洗脫柱。用Bradford染料結(jié)合分析來(lái)測(cè)定鎦份的蛋白質(zhì)含量。
圖2表明S-300柱的洗脫分布，它表明gelonin可從其與抗體的結(jié)合物和未結(jié)合的抗體中分離出來(lái)，而后二者都在第一個(gè)峰中洗脫出現(xiàn)(約為組份28-40)。該洗脫類型可通過(guò)如圖4所示的50μl等分試樣在5-20%梯度非還原SDS聚丙烯酰胺凝膠上的電泳來(lái)證實(shí)。連接的混合物負(fù)載于通路3。這里顯示出游離gelonin(通路2)、游離抗體(通路1)和一份子gelonin與一分子抗體連接的區(qū)帶及兩分子gelonin與一分子抗體連接的區(qū)帶。S-300柱的空隙體積峰含有游離抗體和抗體-gelonin結(jié)合物，它們負(fù)載在通路4上。
用含0.1M NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液pH7.2預(yù)平衡蘭瓊脂糖凝膠CL-6B柱(1×24cm)在此柱上親和層析從gelonin結(jié)合的抗體中除去來(lái)結(jié)合的抗體。在S-300洗脫樣品進(jìn)樣后，柱用30ml相同的緩沖液徹底洗脫出來(lái)結(jié)合的抗體。
gelonin結(jié)合的抗體結(jié)合至柱上并用0.1-2M NaCl在10mM磷酸鈉緩沖液pH7.2中的線性鹽梯度溶液洗脫?？贵w-gelonin復(fù)合物在用約0.7M NaCl液時(shí)洗脫出來(lái)如圖3所示，圖3展示了蘭瓊脂糖凝膠柱的洗脫簡(jiǎn)圖。用Bradford染料結(jié)合分析不測(cè)定洗脫鎦份中蛋白質(zhì)的含量。匯集含蛋白質(zhì)的組份，洗脫模式用在5-20%梯度非還原的聚丙烯酰胺凝膠上的電泳來(lái)證實(shí)。ZME-gelonin復(fù)合物的電泳模式如圖4所示。完全流出峰(鎦份14-20)只含游離抗體(圖4、通路5)，而用高鹽洗脫出的組鎦份(鎦份50-80)含有ZME-gelonin結(jié)合物而無(wú)未結(jié)合的gelonin或抗體(圖4，通路6)。最后的產(chǎn)物含有與1，2和3gelonin分子連接的ZME抗體。平均的gelonin含量是1.5分子/每抗體分子。
如實(shí)施例2所述在體外的免網(wǎng)狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化系統(tǒng)被用來(lái)估算基本純凈的gelonin-ZME抗體復(fù)合物的gelonin活性。在此分析中的一個(gè)活性單位定義為與未處理對(duì)照物相比蛋白質(zhì)合成50%抑制所需的蛋白質(zhì)量，用此分析，天然gelonin和ZME-gelonin結(jié)合物的特異活性依次是2×108u/mg和8.2×105u/mg。在網(wǎng)狀細(xì)胞分析中基本純凈的gelonin-ZME抗體是活性的。原始樣品以11000釋釋可產(chǎn)生約50%蛋白質(zhì)合成的抑制，即減少了50%14C-亮氨酸摻入蛋白質(zhì)。這樣，原始制備物的活性是1000U/ml。
實(shí)施例8細(xì)胞培養(yǎng)方法將ZME抗原陽(yáng)性的人膀胱癌(T-24)人頸癌或2ME抗原陽(yáng)性的人轉(zhuǎn)移性黑素瘤腫瘤細(xì)胞A375M或AAB-527保存在添加了10%加熱失活的胎牛血清、100mM不必需的氨基酸、2mM L-谷氨酸、1mM丙酮酸鈉、維生素和抗生素的最小必需基質(zhì)(MEM)培養(yǎng)物中。培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)篩造，未發(fā)現(xiàn)真菌性感染。
A.細(xì)胞增殖分析在37℃下，將細(xì)胞系保存5%CO2-潮濕空氣孵化器中的完全基質(zhì)內(nèi)培育。在與TNF、免疫毒素、IFNα和IFNγ結(jié)合的分析中，洗滌培養(yǎng)物，并用依地酸分離，然后以25×103細(xì)胞/毫升的密度再懸浮于全基質(zhì)。將200ml等分試樣分散配入96-坑的微滴定板中，然后讓細(xì)胞粘附。這引起了細(xì)胞的廣泛播種。24小時(shí)后該基質(zhì)用含不同濃度的免疫毒素、TNF、IFNg或IFNa的基質(zhì)所代替。讓細(xì)胞孵育72小時(shí)并通過(guò)結(jié)晶紫染色來(lái)分析相對(duì)細(xì)胞的增殖。
B.結(jié)晶紫染色用含有適量鈣和鎂的PBS洗滌細(xì)胞三次并用含0.5%(V/V)結(jié)晶紫的甲醇染色。用150μl sorenson's構(gòu)櫞酸鹽緩沖液(0.1M構(gòu)櫞酸鈉，pH4.2 50%(V/V)乙醇)在室溫下使結(jié)合的染料洗脫1小時(shí)。用Bio-Teck微板讀出計(jì)測(cè)量600nm處的吸光度。相對(duì)的增殖(RCP)由下式算出RCP＝ (平均吸光度(藥物處理過(guò)))/(平均吸光度(未經(jīng)藥物處理)) ×100C.人體腫瘤克隆分析在臨床所指的活組織檢查過(guò)程中從黑素瘤病人中得到腫瘤組織檢查的樣品。在無(wú)菌操作下，制備腫瘤細(xì)胞懸浮液(Leibovitz，et al.，Int.J.Cell Coloning 1478-485(1983))。另外，也對(duì)來(lái)自美國(guó)保藏中心(馬里蘭州洛克維爾)的A375P黑素瘤和CEM白血病細(xì)胞系進(jìn)行試驗(yàn)。采用標(biāo)準(zhǔn)化方法將腫瘤細(xì)胞平皿接種到含10%胎牛血清的全基質(zhì)存在下的半固體基(瓊脂糖)上，對(duì)新鮮腫瘤而言每0.5ml培養(yǎng)板含100，000細(xì)胞，細(xì)胞系則含10，000細(xì)胞，這樣在HTCA中測(cè)定ZME-gelonin對(duì)新鮮腫瘤細(xì)胞懸浮液和細(xì)胞系的作用。(Hamburger，et a〕1.，Science 197461-463(1977);Salmon，et al.，N.Engl.J.Med.2981321-1327(1978);Salmon，et al.，J.Clin.Oncol.71346-1350(1989)).在腫瘤細(xì)胞平皿接種后將上述制得的ZME-gelonin馬上加至培養(yǎng)皿中進(jìn)行試驗(yàn)。平皿中加入ZME-gelonin，四個(gè)濃度0.025ng/ml至250ng/ml的每個(gè)一式三份。除了未處理對(duì)照平皿外，也對(duì)未結(jié)合的ZME-18單克隆抗體和游離gelonin進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。在37℃含5%CO2的空氣潮濕孵育器中使細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)平均10天，用生存染色和調(diào)節(jié)至最佳的自動(dòng)分析計(jì)數(shù)儀來(lái)評(píng)估克隆形成(Shoemader，et al.Cancer Res.45 2145-2153(1985))(Salmon，et al.，Int.J.Cell Clouing 2142-160(1984)。在相同的實(shí)驗(yàn)中測(cè)定相關(guān)于未處理對(duì)照物的ZME-018處理培養(yǎng)物的存活百分率。然后作圖畫出劑量一反應(yīng)曲線。
實(shí)施例9連接Gelonin的和未連接Gelonin的ZME抗體與靶細(xì)胞結(jié)合的比較分析結(jié)合gelonin的和未結(jié)合gelonin ZME抗體與靶細(xì)胞結(jié)合的能力。通過(guò)ELISA分析來(lái)試驗(yàn)ZME-gelonin免疫毒素與抗原陽(yáng)性(AAB-527細(xì)胞)或抗原陰性(T-24細(xì)胞)的結(jié)合。
在微滴定板的每個(gè)坑中加入5萬(wàn)個(gè)靶細(xì)胞(AAB-527)或非靶細(xì)胞(T-24)。在37℃下使細(xì)胞在板上干燥過(guò)夜。然后細(xì)胞用冷PBS洗滌三次并通干燥空氣過(guò)夜。處理后細(xì)胞表面抗原決定子的有抗原活性。
細(xì)胞貼住后，用洗滌緩沖液(9.68克Tris、64.8克Tris、64.8克氯化鈉、16ml吐溫20、800mg乙基汞硫代水楊酸鈉在8升重蒸水中)洗滌平板。將抗體樣品在含有1%牛血清白蛋白(W/V)的洗滌緩沖液(稀釋緩沖液)中稀釋，將0.02至50μg/ml各種濃度的結(jié)合或不結(jié)合ZME抗體的50μl物質(zhì)加至坑中。在4℃下孵育1小時(shí)后，除去上清液，坑用洗滌緩沖液洗滌兩次。
將從Bio-Rad(生物放射)中所得的且在稀釋緩沖液中稀釋11000(V/V)的辣根過(guò)氧化酶結(jié)合的山羊抗鼠IgG(HPGAM)50μl加至每個(gè)坑中。在4℃將平板孵育1小時(shí)并用洗滌緩沖液將坑洗滌兩次。在室溫下于黑暗中將每坑50μl基質(zhì)溶液(80mM枸櫞酸鹽磷酸鹽(pH5.0)，1mM2，2'-連氮基-雙(3-乙基苯-噻呋啉-6-磺酸)(ABTS)二銨鹽(SIGMA CHEMICAL CO)和4μl30%過(guò)氧化氫)的平板孵育30分鐘后，向每個(gè)坑中加入25μl 4N硫酸。在Elisa讀出計(jì)上測(cè)定492nm的吸光度。
如圖5所示，60分鐘暴露后天然的ZME和ZME gelonin結(jié)合物與靶細(xì)胞結(jié)合得均很好。令人驚奇地是，ZME-gelonin結(jié)合物與靶細(xì)胞的結(jié)合比天然的ZME好。這個(gè)結(jié)合性的增加并非歸功于SPOP對(duì)抗體的修飾，因?yàn)镾POP修飾的ZME和天然ZME行為一致。此結(jié)合性的增加也不是由于靶細(xì)胞對(duì)分子中g(shù)elonin部份的結(jié)合，因?yàn)橛锰烊籫elonin對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行預(yù)先處理表明對(duì)抗體或免疫毒素與其結(jié)合均無(wú)影響。如ELISA試驗(yàn)所估計(jì)，ZME和ZME-gelonin都不和抗原陰性T-24細(xì)胞結(jié)合。
實(shí)施例10Gelonin和Gelonin-ZME抗體復(fù)合物的細(xì)胞毒性在抗原陽(yáng)性細(xì)胞連續(xù)(72小時(shí))暴露于免疫毒素成天然gelonin后，進(jìn)行ZME-gelonin結(jié)合物的細(xì)胞毒性研究。如圖6所示，當(dāng)抗原陽(yáng)性的AAB-527細(xì)胞暴露于約0.1/mM ZMEgelonin時(shí)，可觀察到50%細(xì)胞死亡。當(dāng)細(xì)胞暴露于天然gelonin，要求100nM濃度gelonin不減少相對(duì)于未處理對(duì)照的50%細(xì)胞數(shù)。
然后用實(shí)施例2所決定的單位基礎(chǔ)，將靶細(xì)胞用種種濃度的ZME-gelonin或種種濃度的gelonin處理。如圖7所示，用50單位/mlZME-gelonin結(jié)合物可得到50%細(xì)胞毒性，而游離的gelonin要1×107單位/ml才能達(dá)到相同效果。
在對(duì)數(shù)相培養(yǎng)期中測(cè)定ZME-gelonin抗原-陰性T-24細(xì)胞的作用。如圖8所示，只用gelonin要100μg/ml濃度來(lái)產(chǎn)生在AAB-527細(xì)胞中的50%細(xì)胞毒性，這與AAB-S27細(xì)胞中所發(fā)現(xiàn)的相似。濃度為10μg/ml的ZME-gelonin在靶T-24細(xì)胞中產(chǎn)生50%細(xì)胞毒性。但是，ZME-gelonin免疫毒素對(duì)非靶T-24細(xì)胞即使在最高試驗(yàn)濃度時(shí)也無(wú)細(xì)胞毒性。
為了進(jìn)一步表明ZME-gelonin細(xì)胞毒素性是通過(guò)ZME細(xì)胞表面抗原傳遞的，將能達(dá)到80%細(xì)胞毒性的ZME-gelonin固定劑量加至存在有游離ZME抗體或一個(gè)不相關(guān)抗體(15A8，不與黑素瘤細(xì)胞結(jié)合的抗體)的靶對(duì)數(shù)期黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中。如圖9所示，ZME抗體存在量增加抑制了ZME-gelonin結(jié)合物的細(xì)胞毒性，而15A8抗體無(wú)此作用。因此，ZME-gelonin結(jié)合物的細(xì)胞毒性是直接通過(guò)ZME抗體結(jié)合至靶細(xì)胞上的ZME抗原而傳遞的。
實(shí)施例11用IFNα、IFNγ和TNF調(diào)節(jié)ZME-gelonin的細(xì)胞毒性為了表明種種生物應(yīng)答修飾因子對(duì)免疫毒素細(xì)胞毒性的影響，將對(duì)數(shù)期的黑素瘤細(xì)胞用固定劑量的IFNα(200μ/ml)、IFNγ(20，000μ/ml)或γTNF-α(20，000μ/ml)處理24小時(shí)。預(yù)先確定這些劑量對(duì)這些細(xì)胞的細(xì)胞毒性效果最小(約20%)。然后用各種劑量ZME-gelonin處理細(xì)胞72小時(shí)。如圖10所示，用γIFNγ處理引起對(duì)ZME-gelonin免疫毒素的敏感性增加2倍。但是，用γIFNα和TNF預(yù)處理則均引起免疫毒素敏感性2-對(duì)數(shù)增加。向抗原陽(yáng)性細(xì)胞中加入固定劑量的γIFNα、γIFNγ或γTNF導(dǎo)致ZME-gelonin毒素的細(xì)胞毒性增加?？僧a(chǎn)生免疫毒素細(xì)胞毒性的最大增加，其余依次為γIFNα和γIFNγ。
用γIFNα和γTNF預(yù)處理但不用γIFNα觀察到ZME-gelonin細(xì)胞毒性作用的實(shí)際增長(zhǎng)。盡管已觀察到IFNα和IFN-γ可以向上調(diào)節(jié)一些諸如p-97黑素瘤表面抗原，但它們對(duì)能被ZME認(rèn)出的高分子量抗原(GP240)幾乎無(wú)作用。(Murray，et al.，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.27313(1986);Greiner，et al.，Cancer Res.443208-3214(1984);Greiner，et ak.，Cancer Res.464984-4990(1986);Groacomini，et al.，J.Immunol.1331649-1655(1984);Imai，et al.，J.Immunol.127505-509(1981);Murray，et al.，J.Biol.Res.Mod.7172-161(1988.).因此，TNFα和IFNα誘導(dǎo)的ZME-gelonin活性增加的機(jī)制是不清楚的，但可能涉及抗體內(nèi)在化速率的改變、免疫毒素的細(xì)胞化過(guò)程的改變或任何一個(gè)干擾一傳遞酶的調(diào)節(jié)。
由于只有表面含ZME抗原的細(xì)胞被gelonin ZME免疫毒素殺死，故該免疫毒素是高效的方法來(lái)定向并殺死ZME抗原相關(guān)的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)最大限度地減少或防止對(duì)正常非腫瘤相關(guān)抗原細(xì)胞的損傷。
實(shí)施例12人體腫瘤克隆分析(HTCA)中ZME-gelonin免疫毒素的作用用人體腫瘤克隆分析，也可分析ZME-gelonin對(duì)四個(gè)黑素瘤病人活體取出的細(xì)胞的活性。
如實(shí)施例8C所述在HTCA中也分析對(duì)人體細(xì)胞在培養(yǎng)物中的體外細(xì)胞毒性。將各種劑量的ZME-gelonin免疫毒素加至抗原陽(yáng)性(A-375黑素瘤)和抗原陰性CME細(xì)胞系中。加入后72小時(shí)分析克隆的存活率。如圖11所示，0.25和2500mg/ml間的免疫毒素劑量引起幾乎抗原陽(yáng)性細(xì)胞系克隆存活的完全抑制(滿圈)。單獨(dú)的ZME-018和游離的gelonin或其兩者的結(jié)合物都無(wú)細(xì)胞毒性。甚至免疫毒素試驗(yàn)的最高濃度對(duì)抗原陰性系(CEM)無(wú)作用(空心方塊)。
ZME-gelonin對(duì)4種不同的新鮮活體樣本的作用如圖12所示。在試驗(yàn)的最高免疫毒素劑量(250ng/ml)時(shí)，在兩種樣本中發(fā)現(xiàn)黑素瘤克隆形成細(xì)胞的存活率減少80-90%。在此劑量下有一個(gè)病人顯示50%細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，而另一個(gè)病人不顯示出免疫結(jié)合物的細(xì)胞毒性。第三樣本僅顯示克隆數(shù)的少許減少。用最高細(xì)胞毒性劑量處理的第四個(gè)樣本則出現(xiàn)生長(zhǎng)的增加。另外，低劑量時(shí)在一個(gè)樣本中觀察到生長(zhǎng)的增加，而較高劑量則產(chǎn)生實(shí)際的細(xì)胞毒性。如同在細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中，以試驗(yàn)劑量加入未結(jié)合的ZME-018和游離的gelonin是無(wú)細(xì)胞毒性的。
既然HTSCA分析不是正確無(wú)疑的，在此試驗(yàn)系統(tǒng)中約75%臨床活性抗腫瘤劑是陽(yáng)性的。在HTSCA中無(wú)活性的試劑已經(jīng)證明臨床上是非活性的。因此，在HTSCA中ZME-gelonin結(jié)合物的活性有75%的臨床陽(yáng)性概率。
實(shí)施例13ZME抗體的組織分布將125I標(biāo)記的ZME抗體的組織分布與相關(guān)的免疫毒素(ZME-gelonin)和不相關(guān)免疫毒素(158A-gelonin)相比較。給5只有人體黑素瘤異體移植物的裸鼠的尾部靜脈靜注每個(gè)抗體或抗體結(jié)合物。每個(gè)動(dòng)物接受用0.5μCi125I標(biāo)記的在100μl總體積磷酸鹽緩沖的鹽水中的10mg總蛋白質(zhì)。
如圖13所示，不相關(guān)15A8-gelonin結(jié)合物不是特定地至腫瘤組織內(nèi)(J/B比率0.5)。相反，相關(guān)ZME和ZME-gelonin結(jié)合物表明特異地進(jìn)入腫瘤組織(T/B比率依次為2.0和1.5)。在使用ZME或ZME-gelonin后，腫瘤對(duì)125I的吸收無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。該技術(shù)領(lǐng)域的內(nèi)行將欣然認(rèn)為本發(fā)明可以很好地執(zhí)行上述目的并得到結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)及其中利益。這里所述的化合物、方法、過(guò)程和技術(shù)是優(yōu)選的代表實(shí)例，只是例舉而不是來(lái)限制本發(fā)明的范圍。該技術(shù)領(lǐng)域人員所作出的改變及其它使用也包括于本發(fā)明精神中并被權(quán)利要求書(shū)所定義。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其特征在于它包括ZME抗體和選自由細(xì)胞毒素部分和可檢測(cè)標(biāo)記的部分的結(jié)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于其中所述的部分是選自由毒素、殺細(xì)胞劑、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)藥物、生物應(yīng)答修飾因子及可檢測(cè)的標(biāo)記所組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于其中所述部分是gelonin。
4.治療細(xì)胞增殖疾病的方法，其特征在于它包括給需要所述治療的個(gè)體使用殺細(xì)胞有效劑量的權(quán)利要求1組合物。
5.一種治療黑素瘤的方法，其特征在于它包括給需要所述治療的個(gè)體使用定向ZME抗原的單克隆抗體-gelonin配對(duì)物。
6.一種防止黑素瘤復(fù)發(fā)的方法，其特征在于它包括給診斷出帶有ZME腫瘤抗原的腫瘤個(gè)體使用gelonin配對(duì)的單克隆抗體ZME。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6所述的方法，其特征在于其中所述的個(gè)體是人。
8.一種增加免疫毒素的細(xì)胞活性的方法，其特征在于它包括在使用免疫毒素前使用生物應(yīng)答修飾因子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于其中所述的免疫毒素選自由gelonin結(jié)合單克隆抗體、蓖麻蛋白結(jié)合的抗體及TNF結(jié)合的抗體所組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于其中所述的抗體是選自由趨向于黑素瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原的抗體、乳房癌細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原及頸癌細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原所組成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于其中所述抗體是ZME-018。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于其中所述的生物應(yīng)答修飾因子選自由IFNa和TNFa所組成的組。
13.一種增加免疫毒素細(xì)胞毒素活性的方法，其特征在于它包括在使用免疫毒素的同時(shí)使用生物應(yīng)答修飾因子。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備與240KD黑素瘤相關(guān)抗原對(duì)應(yīng)的抗體的免疫結(jié)合物。諸如ZME-018抗體結(jié)合物的細(xì)胞毒素免疫結(jié)合物在治療諸如黑素瘤及帶有ZME-018抗原的其它腫瘤的增殖性細(xì)胞疾病是有用的。這里也揭示了將測(cè)定的標(biāo)記組合物用于這類疾病的診斷。
文檔編號(hào)C07K16/30GK1055879SQ9110260
公開(kāi)日1991年11月6日 申請(qǐng)日期1991年4月19日 優(yōu)先權(quán)日1990年4月19日
發(fā)明者米歇爾G·羅森布侖 申請(qǐng)人:研究發(fā)展基金會(huì)