專利名稱：：含膽固醇的化合物以及其用作針對伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)的免疫原的應用的制作方法
技術(shù)領域：
：本申請是2004年4月2日提交的申請?zhí)枮?00480009311.9(國際申請?zhí)朠CT/US2004/010007)，發(fā)明名稱為"含膽固醇的化合物以及其用作針對伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)的免疫原的應用"的分案申請。此處的公開涉及含膽固醇的脂領域，并且涉及這些含膽固醇的脂在產(chǎn)生針對伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi)的免疫應答中的應用。
背景技術(shù)：
：萊姆癥是一種蜱媒的伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi)引起的人畜共患疾病(Steere等，N.Engl.J.Med.，308:733-740，1983)。當易受感染的寄主被硬蜱咬過后，伯氏疏螺旋體進入皮膚內(nèi)。伯氏疏螺旋體是具有圍繞原生質(zhì)圓柱復合體的外細胞膜的螺旋狀游動細胞，所述復合體由細胞質(zhì)，細胞壁，內(nèi)細胞膜和不位于細胞表面而是位于外細胞膜和原生質(zhì)圓柱之間的周質(zhì)空間中的纖毛組成。外細胞膜和纖毛被認為在疾病過程中寄主-寄生蟲相互作用中起重要作用，并己經(jīng)進行多個研究，鑒定主要的表面暴露的作為重要的免疫原的蛋白質(zhì)(Barbour等，J.Clin.Invest.72:504-515，1983)。初期人的皮膚表現(xiàn)叫作慢性游走性紅斑(ECM)，而皮膚的長期感染產(chǎn)生慢性萎縮性肢皮炎(Asbrink等，ActaDers.Vene7-eol.64:506-512，1984)。疏螺旋體還進入寄主的循環(huán)系統(tǒng)并分布到各種器官，包括腦和關節(jié)(Barbour等，Microbiol.Rev.50:381-400，1986)。病原體的二次傳播產(chǎn)生各種臨床綜合癥，包括淋巴細胞腦膜神經(jīng)根炎(Pfister等，J.Neurol.118:1-4,1984)，心肌炎(Steere等，Ann.Intern.Med.93:8-10,1980)和慢性關節(jié)炎(Steere等,Ann.Intern.Med.90:286-291,1979)。在許多病人體內(nèi)，一些組織，尤其是腦和關節(jié)的感染持續(xù)多年并可以嚴重的致殘。這些形式的慢性萊姆癥是寄主不能除去自身的傳染物的后果，并也許是自身免疫作用發(fā)展的結(jié)果(Steere等，alvin.Iiiteri7.Med.99:76-82,1983)。已經(jīng)顯示針對伯氏疏螺旋體B31株抗原最早形成的IgM抗體，其在1983年保存在美國典型培養(yǎng)物中心，獲取號ATCC35210，是直接針對屬特異性的分子量41kd的叫做鞭毛蛋白(flagellin)的纖毛多肽(Craft等,J.Clin.Invest.78:934-939,1986)，并且其與單克隆抗體H9724反應(Barbour等，Infect.Immun.52:549-554，1986)。此外IgG抗體首先針對41kd鞭毛蛋白，但是更嚴重的疾病時IgG抗體形式針對其它的免疫原，尤其是針對兩個分子量31kd和34kd的大量的蛋白。這兩個蛋白，已經(jīng)命名為OspA(31kd)和OspB(34kd)，被發(fā)現(xiàn)位于伯氏疏螺旋體表面并深入其外部液體細胞膜(Barbour等，J.Clin.Invest.72:504-515,1983)。US專利4,721,617公開了滅活的完整伯氏疏螺旋體作為針對萊姆癥的疫苗的應用。此外，US專利6,203,798教導了蛋白質(zhì)抗原，OspA和OspB作為候選疫苗的應用。然而，2002年2月25日生產(chǎn)商宣布包含OspA的LYMErixTM萊姆癥疫苗將不再市場上可買到。因此，需要一種可用于產(chǎn)生針對伯氏疏螺旋體的免疫應答，比如保護性的免疫應答的試劑，以生產(chǎn)有效的疫苗防止萊姆癥。發(fā)明簡述此處公開獨特的化合物和其類似物比如其治療用鹽。根據(jù)一個方面，此處公開的是以下通式A的新型化合物，或其藥物用鹽或復合物。<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中Ri選自疊氮基，氨基，取代氨基，聯(lián)氨基(例如-NHNH2)，酰肼(例如-C(0)NHNH2)，氨基脲(例如-NHC(0)NHNH2)，或碳酰肼(例如，-NHNHC(0)NHNH2);W選自含有1到25個碳原子的飽和或不飽和的碳鏈，尤其是5到20個碳原子，或含有1到25個碳原子飽和到不飽和取代碳鏈，尤其是5到20個碳原子；并且L選自O，N,S,P,或亞烷基(例如，亞甲基(-CH2-)。根據(jù)另一個方面，此處公開一種純化的具有通式B的復合物，其中"16"表示直鏈烷基取代基中碳原子數(shù)量。此處這個具體的純化的化合物僅是為了方便起見稱作"BBGL-II"(g卩，伯氏疏螺旋體糖脂-II)。在另一方面，此處公開包含(i)載體和(ii)通式A或B的化合物的共軛物，其中通式A或B的化合物與載體結(jié)合。公開的化合物和共軛物(通式A和B)可被用于在受試者中通過施用治療有效量的化合物或共軛物到受試者而誘導針對伯氏疏螺旋體的免疫應答。這種施用尤其可用于防止或治療受試者的萊姆癥(Lymedisease)。所述化合物，和其治療用鹽可以配制成藥物或免疫原性組合物。上述及其他特征和優(yōu)點從以下多個參考附圖的實施方案詳細說明將變得更明顯。圖1是來自伯氏疏螺旋體的脂類提取物的TLC分析的數(shù)字圖像。來自B31(A道)，N40(B道)，和BL303(C道)的總脂類提取物暴露于碘蒸汽，用蒽酮試劑噴霧(D道)，和用小鼠抗BBGL-II抗血清免疫染色(E道)?；蛘?，超聲處理的B31細胞上樣到Detoxi-凝膠柱，用脫氧膽酸洗脫結(jié)合的物質(zhì)，并將其脂類暴露于碘蒸汽(F道)。圖2是BBGL-II和BBGL-III鈉加成物的MALDI-TOF質(zhì)譜的部分數(shù)字圖像。在m/z809.87和835.87的兩個假分子離子主峰[M+Na+]表示具有BBGL-II(A)的棕櫚酸(M1)和油酸的(MH)衍生物的膽固醇基半乳糖，在m/z780.1和806.1的假分子離子[M+Na]+表示用二棕櫚酰^111)和棕櫚酰油酰(M^衍生物(B)取代的單半乳糖基二酰基甘油(BBGL-m)。圖3A-B是糖脂BBGL-II在CDC13中在126MHz的DEPT13CNMR譜的數(shù)字圖像。圖3A僅僅是通過DEPT-90試驗獲得的CH信號的數(shù)字圖像。圖3B是從DEPT-150-fxDEPT-90計算的陽性CH3和陰性CH2的數(shù)字圖像，其中f是試驗性的校準因子。圖4顯示糖脂BBGL1I-AC3在CDC13中在500/126MHz的部分2D^/。CHMBCNMR譜，顯示殘基間，^/"C對Gal/乙酰碳酰基13C,Ga^H/脂肪酸酯碳?；?C，和膽固醇H-3/GalC-l組合物的結(jié)合性。此外顯示兩個殘基內(nèi)的結(jié)合性。圖5顯示BBGL-II-Ac3在CDC13中在500MHz的2D'H"HCOSY-30NMR譜，顯示鄰近和成對的&/lH結(jié)合性。圖6顯示糖脂BBGL-m在CDC13中在500MHz的2D&/HTOCSYNMR譜。鑒定了Gal，Gro，和脂肪酸18:1子譜的特征。圖7顯示糖脂BBGL-III-Ac4在CDCl3中在500/126MHz的部分2D^/"CHMBCNMR譜，顯示四個Gal質(zhì)子與乙酰碳?；?3C核，三個甘油基質(zhì)子與脂肪酸酯碳酰基13C核，以及兩個甘油基質(zhì)子與Gal的c-r的殘基間^/13(:結(jié)合性。圖8是天然BBGL-II主要的級分，膽固醇基6-0-棕櫚酰-b-d-半乳糖吡喃糖苷的結(jié)構(gòu)示意圖圖9是天然BBGL-III的主要級分，l-油基，2-棕櫚酰，3--sn-甘油的結(jié)構(gòu)示意圖。圖10是顯示來自用通式B的糖脂免疫的兔子血清的抗體滴度的圖?？贵w滴度通過ELISA按如下所述測量，并且代表四個1:100稀釋的不同兔子血清的平均值，各自以三個獨立的分析檢驗?？招臈l，IgG滴度；灰色條，IgM滴度；丁字符號，標準偏差。圖11是顯示來自用通式B的糖脂冰免疫的血清的抗體滴度的圖。小鼠(IO個小鼠為一組)按如下所述用弗氏佐劑(CFA)，PBS;DMSO，或角鯊浠中的通式B的糖脂免疫?？贵w滴度通過1:100稀釋血清的酶聯(lián)免疫吸測定，并表示為三個獨立分析的平均值。丁字符號，標準偏差。圖12-15圖示了制備此處描述的合成脂的例子的合成方案。發(fā)明詳述I.術(shù)語除非另有說明，技術(shù)術(shù)語根據(jù)常規(guī)的用法使用。分子生物學常見的術(shù)語的定義可以參見BenjaminLewin，GenesV,由牛津大學出版社出版，1994(ISBN0-19-854287-9);Kendrew等編輯，TheEncyclopediaofMolecularBiology,由Blackwell科學有限公司出版1994(ISBN0-632-02182-9);和RobertA.Meyers(主編)，MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference,由VCH出版公司出版,1995(ISBN1-56081-569-8)。為便于對本發(fā)明各種實施方案的評估，提供以下專用名詞的解釋:"施用"化合物應該理解為提供一種化合物，化合物的前體藥物，化合物的共軛物，或包括此處描述的化合物的藥物組合物。類似物:一種分子，其與母化合物在化學結(jié)構(gòu)上不同，例如同系物(不同在于化學結(jié)構(gòu)的增加，比如垸基鏈長度的差異)，一種分子片段，一種通過一種或者多種官能團而不同的結(jié)構(gòu)，或離子化的改變。結(jié)構(gòu)類似物通常使用定量結(jié)構(gòu)活性關系(QSAR)發(fā)現(xiàn)，使用比如那些公開在Remington:TheScienceandPracticeofPharmacology,第十九版(1995)，28章中的技術(shù)?？乖?能夠刺激免疫應答的化合物，組合物，或物質(zhì)，比如在動物中產(chǎn)生抗體或T細胞應答，包括注入或吸收到動物體內(nèi)的組合物?？乖c特異性的包括那些通過異源的免疫原誘導的體液或細胞免疫的產(chǎn)物反應。術(shù)語"抗原"包括所有相關的抗原決定簇?？贵w:免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含特異性結(jié)合(與抗原免疫反應)到抗原的抗原結(jié)合部位的分子。天然存在的抗體(如，IgG,IgM，IgD)包括四個多肽鏈，通過二硫鍵相互連接的兩個重(H)鏈和兩個輕(L)鏈。然而，已經(jīng)表明抗體的抗原結(jié)合功能可以通過天然存在的抗體的片段來進行。因此，這些抗原結(jié)合片段也通過所述術(shù)語"抗體"來定義。包括在術(shù)語抗體之內(nèi)的結(jié)合片段特定的非限制的例子包括(i)由VL,VH,CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iii)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成Fv片段，(iv)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等,Nature341:544-546，1989);(v)分離的互補決定區(qū)(CDR);和(vi)F(ab')2片段，包含兩個通過二硫鍵在絞鏈區(qū)連結(jié)的Fab片段的二價片段。動物活的多細胞脊椎動物，這一類包括，例如，哺乳動物和鳥類。術(shù)語哺乳動物包括人和非人哺乳動物。類似的，術(shù)語"受試者"包括人和獸類受試者。伯氏疏螺旋體一種螺旋菌，首先被Johnson等在1984年描述。伯氏疏螺旋體可以從在稱作BSK(Barbour-Stoenner-Kelly)修飾的Kelly介質(zhì)中培養(yǎng)的其節(jié)肢媒介動物或脊椎動物寄主中獲得。已經(jīng)成功在BSK中培養(yǎng)來自蜱和來自萊姆癥病人血液，皮膚和腦脊髓液的疏螺旋體。用1.3。/。瓊脂糖固化的BSK允許從單個生物體生產(chǎn)克隆。伯氏疏螺旋體與大多數(shù)細菌相比較生長緩慢。各螺旋菌在12到24小時的延長之后分裂成兩個細胞。這種感染人類的疏螺旋體在US稱作狹義的伯氏疏螺旋體。在歐洲狹義的伯氏疏螺旋體和此外兩個相關疏螺旋體，B.garillii和B.afzelii也導致萊姆癥。在亞洲，只有B.garinii和B.afzelii導致人萊姆癥。疏螺旋體，包括伯氏疏螺旋體，是由細胞膜包圍的原生質(zhì)圓柱體，7到11根周質(zhì)空間纖毛和與下面的結(jié)構(gòu)松散連系的外膜組成的柔韌的螺旋狀細胞。伯氏疏螺旋體B31典型株的DNA序列發(fā)表在1997年，并且包含950千堿基的線性染色體，9個線型質(zhì)粒，和12個環(huán)狀質(zhì)粒。伯氏疏螺旋體和其它的疏螺旋體的外膜獨特之處在于編碼蛋白質(zhì)的基因位于線型質(zhì)粒上；這些染色體外基因決定這些生物體的抗原性同一性并且估計可能幫助細菌在蜱和不同溫血動物寄主中適應和存活。共軛物"共軛物"是包括此處公開的連結(jié)到藥用載體的免疫原性化合物的任何構(gòu)建物。因此，"共軛物"不局限于共價結(jié)合到蛋白載體的免疫原性的化合物的共軛物(共軛物的特定類型通常在本領域稱作"共軛物疫苗")。衍生物衍生物是來源于基本分子結(jié)構(gòu)的生物學活性分子。免疫應答:免疫系統(tǒng)細胞的應答，比如B細胞，T細胞或單核細胞對剌激的應答。在一個實施方案中，所述應答是特定針對具體抗原的應答("抗原特異性應答")。在一個實施方案中，免疫應答是T細胞應答，比如CD4+應答或CD8+應答。在另一個實施方案中，所述應答是B細胞應答，并導致特異性抗體的產(chǎn)生。"免疫原性組合物"是當免疫原性組合物被注入或別的方式引入溫血動物寄主時引發(fā)免疫應答的任何組合物。所述免疫應答可以是體液的，細胞的，或兩者。"加強免疫"是指在隨后將哺乳動物寄主暴露到相同的免疫原性組合物后針對免疫原性組合物的增強的免疫應答。分離的"分離的"生物組分(比如脂類)已經(jīng)基本與天然存在組分的生物體細胞中其它的生物學組分，即其它的染色體或染色體外DNA禾口RNA，蛋白質(zhì)，脂類和細胞器分離或純化。已經(jīng)"分離的"脂類包括通過標準提純法純化的脂類。該術(shù)語還包含化學合成的脂類和其它的化合物。標記直接地或間接地結(jié)合到另外的分子以促進該分子檢測的可檢測化合物或組合物。標記的具體非限制性的例子包括熒光標簽，酶連接，和放射性同位素。萊姆癥萊姆癥是由細菌伯氏疏螺旋體感染引起的。這些細菌是通過被感染的鹿蜱叮咬而傳遞到人并每年在美國導致超過16,000例感染。萊姆癥大多數(shù)通常特征為"靶心"皮疹，游走性紅斑，伴隨非特異性癥狀比如發(fā)熱，不適，疲勞，頭痛，肌肉痛(myalgia)，和關節(jié)痛(arthralgia)。從感染到游走性紅斑的潛伏期通常7到14天但是也許短至3天和長至30天。一些被感染的個體沒有明顯的疾病(無癥狀感染，通過血清學試驗確定)，或僅僅顯示非特異性癥狀比如發(fā)熱，頭痛，疲勞和肌痛。萊姆癥螺旋菌從蜱叮咬部位通過皮膚，淋巴和血液攜帶途徑散布。早期彌散性的感染體征通常發(fā)生在單發(fā)性游走性紅斑損傷外觀出現(xiàn)后數(shù)天到數(shù)周。在多發(fā)的(二次的)游走性紅斑損壞之外，早期的彌散性感染可以顯示神經(jīng)系統(tǒng)，肌骨胳系統(tǒng)，或心臟的疾病。早期的神經(jīng)病學表現(xiàn)包括淋巴細胞性腦膜炎，顱側(cè)神經(jīng)病(尤其是面神經(jīng)麻痹)和神經(jīng)根神經(jīng)炎。肌骨胳的表現(xiàn)可以包括有或沒有關節(jié)發(fā)脹體征的移動性關節(jié)和肌肉痛。心臟的表現(xiàn)很少，但是可以包括心肌炎和不同程度的一過性房室傳導阻滯。未經(jīng)治療或不適當治療的病人的伯氏疏螺旋體感染可以發(fā)展為感染之后數(shù)周到數(shù)月的遲發(fā)彌散性疾病。遲發(fā)彌散性萊姆癥最常見的表現(xiàn)是一個或幾個關節(jié)間斷的發(fā)脹和疼痛，通常是大的，負擔重量的關節(jié)比如膝關節(jié)。有些病人發(fā)展慢性軸突多發(fā)性神經(jīng)病，或腦病，后者通常通過認知異常，睡眠障礙，疲勞，和人格改變而表現(xiàn)。罕見的是，萊姆癥病態(tài)可以是嚴重的，慢性的，和致殘性的。一些人在接受治療萊姆癥之后發(fā)生原因不明的萊姆癥后綜合癥。淋巴細胞一種參與機體免疫防御的白細胞。有兩個主要類型的淋巴細胞B細胞和T細胞。藥用載體"載體"是一種生理可接受的物質(zhì)，與此處公開的治療的或生物學活性化合物有聯(lián)系。所述載體可以促進治療的或生物學活性化合物的某一種施用和/或增強通過治療的或生物學活性化合物誘導的免疫應答。通常，載體的性質(zhì)取決于所采用的施用的具體模式。例如，胃腸外的制劑通常包括包含藥用和生理可接受的作為介質(zhì)的液體比如水，生理鹽水，平衡鹽液，水性葡萄糖，甘油等可注射的液體。對于固體組合物(如，粉末，藥丸，藥片，或膠囊形式)而言，常規(guī)的非毒性的固體載體可以包括，例如，藥物等級的甘露糖醇，乳糖，淀粉，或硬脂酸鎂。除生物學中性載體之外，被施用的藥物組合物可以包含較少量的無毒助劑物質(zhì)，比如潤濕或乳化劑，防腐劑，和pH緩沖劑等，例如乙酸鈉或單月桂酸山梨醇酯。E.W.Martin的Remington'sPharmaceuticalScience,Mack出版公司，Easton，PA,15版(1975)，描述了適于此處公開的BBGLII藥物遞送的組合物和制劑。本發(fā)明公開的化合物的"藥物用鹽"包括那些由陽離子形成的化合物，所述陽離子比如鈉，鉀，鋁，鈣，鋰，鎂，鋅，和從比如氨，乙二胺，N-甲基-谷氨酰胺，賴氨酸，精氨酸，鳥氨酸，膽堿，N，N'-二芐乙烯二胺，氯普魯卡因，二羥乙基胺，普魯卡因，N-芐基苯乙胺，二乙胺，哌嗪，三(羥甲基)氨基甲烷，和羥化四甲銨的堿形成的化合物。這些鹽可以通過標準方法制備，例如通過游離酸與合適的有機或無機堿反應。本說明書列舉的任何化合物可以作為其藥物用鹽替換地施用。"藥物的用鹽"此外還包括游離酸，堿，和兩性離子形式。合適的藥物用鹽的描述可以參見"HandbookofPharmaceuticalSalts,Properties,SelectionandUse"，WileyVCH(2002)。本發(fā)明公開的雌激素試劑的"藥用復合物"包括由金屬離子形成的復合物或配位化合物。這樣的復合物可以包括用于與雌激素因子結(jié)合的配體或螯合劑。多肽:任何氨基酸鏈，不管長度或翻譯后修飾(如，糖基化或磷酸化)。純化的:術(shù)語純化的不要求絕對純；而是作為相對的術(shù)語。因此，例如，純化肽制劑是其中肽或蛋白質(zhì)比細胞內(nèi)自然環(huán)境下肽或蛋白更富集的制劑。在一個實施方案中，純化化合物制劑使得此處公開的脂類表現(xiàn)所述化合物制劑至少50%，尤其是至少大約90%，和尤其至少大約98%的總脂類含量。"飽和的或不飽和碳鏈"包括垸基，烯基，炔基，二烯或環(huán)垸基團。"取代氨基"是指基團-NZ122，其中Z'或ZZ至少之一獨立地選自垸基，環(huán)烷基，雜環(huán)烷基，芳基，雜芳基，烷氧基，芳氧基和其組合。"取代碳鏈"是指碳鏈的一個或者多個氫原子被另外的基團比如鹵素，芳基，環(huán)烷基，氨基及其組合取代的碳鏈。T細胞:免疫應答關鍵的白細胞。T細胞包括，但是不局限于，CD4+T細胞和CD8+T細胞。CD4+T淋巴細胞是表面攜帶被稱為"分化簇4"(CD4)的標示物的免疫細胞。這些細胞，又名T輔助細胞，幫助調(diào)節(jié)免疫應答，包括抗體反應以及T殺傷細胞應答。CD8+T細胞攜帶"分化簇8"(CD8)標記物。在一個實施方案中，CD8T細胞是細胞毒性T淋巴細胞。在另一個實施方案中，CD8細胞是T抑制細胞。治療活性劑:引起誘導免疫應答的因子，通過臨床的反應測量(例如免疫細胞群數(shù)目的增加，特異性結(jié)合的抗體的產(chǎn)生，或可測量的伯氏疏螺旋體感染的抵抗力)。治療活性劑還可以包括模擬BBGL-II效果的有機的或其它的化合物。上述術(shù)語描述只提供對讀者的幫助，而將不會解釋為比本領域普通技術(shù)人員的理解小的范圍，或作為對權(quán)利要求書范圍的限制。除非另外說明，此處使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學名詞具有本發(fā)明領域的一般技術(shù)人員所通常理解的相同的含意。單數(shù)詞語"一種"、"一""所述"，除非上下文清晰的顯示其他內(nèi)容，否則包括復數(shù)對象。相似的，詞語"或"除非上下文清晰的顯示另外含意，用來包括"和"。進一步應當理解對化合物給出的所有的堿基大小或氨基酸大小，和所有的分子重量或分子量值是大約的，提供用作描述。雖然與此處描述的那些相似的或等效的方法和材料可被用于本發(fā)明實踐或檢驗，下面描述合適的方法和材料。術(shù)語"包含"表示包括。此外，材料，方法，和例子僅僅是例證性的而不意指限制。此處公開的所有化合物包括(+)和(-)立體異構(gòu)體(以及(+)或(-)立體異構(gòu)體)，和其任何互變異構(gòu)體。如上所述，此處公開的是生物學活性的(例如，免疫原性的)通式A的糖脂。這些糖脂是BBGL-II合成類似物，也就是它們是通過與從B.burgdorferi中提取和純化相反的化學合成獲得的。通式B的化合物，另一方面，可以通過從伯氏疏螺旋體提取獲得(換句話說，天然的BBGL-II)。天然的BBGL-II這里指"膽固醇基6-0-棕櫚酰-P-D-半乳糖基吡喃糖"。提取的天然的BBGL-II被分離和純化。例如，純化的天然BBGL-II分離物基本上沒有來自B.burgdorferi其他的脂類，化合物或分子片段。在一個例子中，純化的天然BBGL-II分離物包括小于一個重量百分數(shù)的核酸和小于一個重量百分數(shù)的蛋白。此處公開的BBGL-II的類似物(參見通式A)也具有治療作用。例如，在這樣一個類似物中BBGL-II化學式顯示的?；?例如，棕櫚酰)可能被其他的飽和或不飽和的含碳基團或包含1到25碳原子的鏈取代，尤其是被其他的來源于有機脂肪酸的?；?。膽固醇基和半乳糖基吡喃糖環(huán)狀結(jié)構(gòu)可能在任何環(huán)位置包括取代基團例如烷基(尤其來源于脂肪酸的?；?，羧基，取代的羧基(-COR其中R是烷基或羧酸或酯)，芳基，烷氧基，雜環(huán)，鹵素，或氨基。橋連膽固醇基和半乳糖基吡喃糖環(huán)的O雜原子可以用烷基(如，-012-)或雜原子例如N，S或P代替。在通式A的化合物中，R2(與-C(O)O-基團一起)可以是來源于有機脂肪酸的?；?。這樣的?；ㄗ貦磅?，月桂酰，硬脂酰，十四酰，油酰和亞油?；Ｋ鲺；难苌饔每梢蕴峁┕矁r結(jié)合到載體蛋白的位點(例如，?；B氮)。在某個變體中，W基團能夠形成與載體蛋白的共價鍵(換言之，共軛連接到載體蛋白)，以下更詳細地敘述。共軛連接到載體蛋白可以通過至少一個烷基或膽固醇基部分的鏈的衍生作用完成。這樣的衍生作用按如下所述完成?；蛘?，可以使用小分子例如己二酸二酰肼或1,6-二氨基己烷。BBGL-II和/或它的類似物可以分離或純化自如下所述的B.burgdorferi培養(yǎng)物，或它們可以化學合成。例如化學式A的化合物可以通過首先獲得其中半乳糖環(huán)的羥基已經(jīng)具有保護基的半乳糖基鹵化物而合成。該半乳糖基鹵化物然后與膽固醇起反應提供半乳糖基膽固醇。半乳糖環(huán)上的保護基然后被除去，并替換為替代的保護基。分別地制備疊氮?；嶂虚g物。該疊氮?；岬闹虚g物與半乳糖基膽固醇濃縮以提供疊氮?；哪懝檀糚-D-半乳糖基吡喃糖。在這里公開的一個例子中，治療有效量的純化，天然的BBGL-II(化學式B)或BBGL-II(化學式A)化學合成類似物是用于產(chǎn)生免疫應答的量，或用于治療或預防受試者伯氏疏螺旋體感染的量。治療指緩解伯氏疏螺旋體感染的病征或癥狀，或萊姆癥病征或癥狀的治療干預。免疫原性組合物及其應用在一個實施方案中，提供了感染伯氏疏螺旋體的受試者的治療方法，或預防或抑制感染，或臨床的萊姆癥發(fā)展的方法?；蛘?，該方法可用于抑制已經(jīng)存在的感染的發(fā)展。該方法包括給予受試者治療有效量的純化的天然BBGL-II或化學式A的化合物，從而治療或預防感染，或延遲或逆轉(zhuǎn)臨床疾病。在形成在受試者中產(chǎn)生免疫應答的組合物，或為受試者接種時，使用BBGL-II或化學式A的化合物。本發(fā)明公開的這些免疫原性的組合物引發(fā)哺乳動物宿主，包括人和其他的動物針對伯氏疏螺旋體的免疫應答。該免疫應答可能是細胞依賴的反應或抗體依賴的反應，或兩者，并此外該反應可以為哺乳動物宿主提供免疫記憶或加強效果或者兩者。借助于T細胞引發(fā)抗體的抗原被稱為T依賴的抗原。不要求T細胞幫助引發(fā)抗體生成而是能直接激活B細胞的抗原被稱作T-獨立的抗原。這些免疫原性組合物可以用作疫苗并且可以提供哺乳動物受試者或宿主對病原微生物感染的保護性應答。更具體地，此處描述的疫苗可以制備作為T細胞獨立的疫苗和/或T細胞依賴的疫苗。根據(jù)特別的變體，化學式A或B的活性化合物主要是T細胞獨立的但通過與載體(尤其是蛋白載體)結(jié)合被轉(zhuǎn)化為T細胞依賴的應答疫苗。載體提供給此處公開的化學式A或B的化合物。載體可以與免疫原性的化合物混合存在，或可以通過化學作用或鍵結(jié)合到免疫原性的化合物。例如該免疫原性的化合物可以結(jié)合到大分子載體。載體可以是免疫原性的化合物通過疏水性的非共價作用結(jié)合的聚合物，例如塑料，如聚苯乙烯，或與免疫原性的化合物共價結(jié)合的聚合物，例如多糖，或多肽，如牛血清白蛋白，卵清蛋白或匙孔血藍蛋白。載體優(yōu)選是無毒的和非過敏原性的。該免疫原性化合物可以多價結(jié)合到大分子的載體而提供增加的疫苗制劑免疫原性。在一個實施方案中，載體是氨基酸鏈(如多肽或蛋白)或其他的部分。在另一個實施方案中，載體是B.burgdorferi多肽氨基酸序列的二聚物，寡聚物，或高分子聚合物。有用的免疫原性載體的例子包括匙孔血藍蛋白(KLH);白蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白，PPD(結(jié)核菌素純化蛋白衍化物)；紅細胞；破傷風類毒素；霍亂類毒素；瓊脂糖珠；活性碳；或膨潤土。此處公開的脂類可以連接任何目標蛋白，包括但不限于，rARU，包含難治梭狀芽孢桿菌(Clostridiumdifficile)毒素A的重復單位的重組蛋白。選擇載體以增加多糖的免疫原性和/或引發(fā)針對載體的醫(yī)學上有益抗體。滿足這些標準的載體描述于現(xiàn)有技術(shù)中。聚合的載體可以是包含一種或多種可用于結(jié)合的官能團的天然的或合成材料，例如伯胺和/或仲胺，疊氮基，醛，酰肼，環(huán)氧化物，硫醇或羧基。該載體可以是水溶的或水不溶的。水溶性肽載體是優(yōu)選的，并包括但不局限于天然的或合成的多肽或蛋白，比如牛血清白蛋白，和細菌的或病毒蛋白質(zhì)或無毒的突變體或其多肽片段。如，破傷風毒素或類毒素，白喉毒素或類毒素，綠膿假單胞桿菌外毒素或類毒素，重組體綠膿假單胞桿菌外蛋白A，百日咳毒素或類毒素，產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)和韋氏梭菌(Clostridiumwelchii)外毒素或類毒素，突變的無毒的志賀毒素全毒素，志賀毒素i和2，志賀毒素1和2的B亞基，和乙型肝炎(hepatitisB)表面抗原和核心抗原。另外的載體是一些動物，植物，或礦物來源的物質(zhì)，其是生理可接受的并起呈遞BBGL-II脂類給免疫系統(tǒng)的作用。因此，可使用多種載體，包括惰性材料，或具有生物活性和/或促進免疫應答的材料。例如，蛋白載體的例子包括但不局限于匙孔血藍蛋白和血藍蛋白。多糖還可以被用作載體，包括分子量10,000到1,000，000的多糖，比如淀粉，葡聚糖，瓊脂糖，聚蔗糖，或其羧甲基衍生物和羥甲基化纖維素。聚氨基酸也被考慮作為載體，并且這些聚氨基酸包括，除了別的以外，聚賴氨酸，聚內(nèi)氨酰聚賴氨酸，聚谷氨酸，聚天冬氨酸和聚(C2-do)氨基酸。有機聚合物能被用作載體，這些聚合物包括，例如胺，酰胺，烯烴，乙烯基，酯，乙縮醛，聚酰胺，碳酸酯和醚的聚合物和共聚物等。一般而言，這些聚合物的分子量會顯著地不同。該聚合物可能具有從兩個直到數(shù)千個重復單位，如兩千重復單位。重復單位數(shù)目符合宿主動物中免疫組合物的使用。一般而言，這樣的聚合物具有低分子量，即在10,000和100,000之間(分子量通過超速離心法測定)。還可以采用無機聚合物。這些無機聚合物可以是包含有機部分的無機聚合物。尤其是，硅酸鹽和氫氧化鋁可被用作載體。優(yōu)選載體是免疫佐劑。在此情況下，特別考慮佐劑是胞壁酰二肽或其類似物。該載體還可以是用于相互連接許多合成的包含多肽的鏈的交聯(lián)劑的殘基。交聯(lián)劑以醛(例如戊二醛)，羧基，胺，氨基，亞氨基或疊氮苯基作為其官能團。尤其是，考慮利用丁醛作為交聯(lián)劑，二價的亞氨基酯或碳二亞胺。本公開內(nèi)容此外包括制備免疫原性的組合物的方法，包括將此處公開的脂類結(jié)合到載體。這樣的載體的例子包括如上所述那些以及可以作為載體或佐劑或與脂類結(jié)合具有其他的生物活性的多肽或非肽部分。化學式A或B的化合物可以通過在存在允許化合物和蛋白載體之間形成共價鍵的試劑的情況下與蛋白載體混合而結(jié)合到蛋白載體。示例的偶聯(lián)劑包括戊二醛，羥基琥珀酰亞胺和碳二亞胺。另外，小化學分子可以連接于蛋白載體化合物和該分子中任何一個，通過它的反應性充當化合物和蛋白載體之間的接頭分子。示例的接頭包括己二酸二酰肼，氨基己酸，氯己醇二甲基乙縮醛，D-葡糖醛酸內(nèi)酯和p-硝基苯胺。例如，化學式A或B的化合物可以通過許多方法之一結(jié)合到多肽，例如通過首先將多肽琥珀?；腿缓笸ㄟ^多肽與帶有l(wèi)-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽的反應將脂類成分結(jié)合到多肽。另外，脂類成分的活化可以通過利用幾個試劑中任何幾個，但優(yōu)選溴化氰實現(xiàn)。化學式A或B的化合物還可以通過脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)施用到受試者以便增強它們的穩(wěn)定性和/或免疫原性。化合物通過脂質(zhì)體遞送可能是特別有利的，因為脂質(zhì)體可以被吞噬細胞內(nèi)在化在治療的受試者體內(nèi)。這樣的細胞，在攝取脂質(zhì)體后，會消化脂質(zhì)體膜并隨后連同其他引發(fā)強烈的免疫應答所需的其他分子將多肽呈遞到免疫系統(tǒng)。該脂質(zhì)體系統(tǒng)可以是任何種類的單層泡囊，多層泡囊，或穩(wěn)定的多層泡囊，并可以根據(jù)本領域技術(shù)人員己知的方法制備和施用，例如根據(jù)美國專利5,169,637,4,762,915，5,000,958或5，185,154的教導進行。本發(fā)明公開內(nèi)容包括給受試者施用治療有效劑量的包含至少化學式A或B的化合物之一的藥物組合物。該藥物組合物可以包括藥用載體。本發(fā)明藥物組合物的施用可以由本領域技術(shù)人員公知的任何方法實現(xiàn)。受試者是指任何哺乳動物，包括人。藥物組合物優(yōu)選以劑量單位制備和施用。固體劑量單位是藥片，膠囊和栓劑。為治療受試者，根據(jù)化合物的活性，施用的方式，失調(diào)的性質(zhì)和嚴重度，病人的年齡和體重，必須有不同的每日劑量。然而在某種情況下，更高或更低的每日劑量可能是適當?shù)?。日劑量的施用既可以通過以單獨的劑量單位形式或幾個小劑量單位的單次施用，也可以通過以一定間隔多次施用細分的劑量施用。施用還可以通過連續(xù)的劑量持續(xù)比較久的時段而完成，例如1-10周。藥物組合物通?？陬^施用或腸胃外施用。腸胃外施用路線包括，但不局限于，皮下注射(SQ和depoSQ)，靜脈內(nèi)(IV)，肌肉(IM和depoIM)，椎管注射或輸注方法，鼻內(nèi)(吸入)，鞘內(nèi)，透皮，局部，和眼部的施用方式?；衔镞€可以由植入的儲液器或泵施用。適當?shù)墓腆w或液體藥物制劑形式是，例如，顆粒，粉末，藥片，糖衣片劑，(微)膠囊，栓劑，糖槳，乳劑，懸浮劑，乳膏劑，氣溶膠，安瓿形式的滴液或可注射的溶液，以及延緩釋放的活性化合物，在所述制劑中賦形劑和添加劑和/或輔劑比如崩解劑，粘合劑，涂層劑，膨脹劑，潤滑劑，調(diào)味劑，甜味劑或增溶劑照例按如上所述使用。該藥物組合物適合于在各種藥物遞送系統(tǒng)中使用。目前藥物遞送的方法的簡評，參見Langer,Science249:1527-1533,1990,其在此引作參考。接種材料一般成生理容許的(可接受的)稀釋劑例如水，鹽水，磷酸鹽緩沖液等的溶液從而制備形成水性藥物組合物。助劑，例如氫氧化鋁也可以包含在組合物中。藥物組合物通?？诜┯没蛉硎┯谩Ｖ委熓褂糜行У牧慨斎蝗Q于疾病的嚴重度和病人的體重和一般情況。一般地，用于體外的劑量可以提供用于藥物組合物原位施用量的有用指導，并且動物模型可以用來決定治療具體的病癥的有效劑量。不同的考慮描述于，例如，在Gilman等編輯，Goodman和Gilman的治療的藥物學基礎(PharmacologicalBasesoftherapeutics)，第8版，Pergamon出版社，1990;以及Remington'sPharmaceuticalScience,17版，Mack出版公司，Easton，Pa，1990，各自在此處引作參考。此處公開的化合物的有效劑量取決于被治療的疾病狀況的性質(zhì)和嚴重度，病人的年齡和體況和其他的臨床的因素而變化。因此，最終決定的合適的治療方案將由主治醫(yī)生決定。一般地，公開的化合物的劑量范圍從每千克體重大約0.1ug到每千克體重大約100mg/kg。其他適當?shù)姆秶壳Э梭w重大約lyg到10mg。施用方案可以從每周一次到每天一次變化，取決于許多臨床的因素，例如受試者對于脂類的敏感性。就更具攻擊性的疾病來說，優(yōu)選可以通過其他途徑包括靜脈內(nèi)或鞘內(nèi)施用如上所述的那些劑量。連續(xù)輸注也可能是合適的。對動物施用而言，純化的治療活性分子通常與藥用載體組合。藥物制劑可以只包含一種治療分子，或可以由幾種類型治療分子組成。通常，載體的性質(zhì)取決于所采用的具體施用方式。例如，腸胃外的制劑通常包含可注射的液體，包括藥物和生理可接受的液體比如水，生理鹽水，平衡鹽溶液，葡萄糖水溶液，甘油等等作為介質(zhì)。對于固體組合物(如，粉末，藥丸，藥片或膠囊形式)，傳統(tǒng)的無毒固體載體還可以包括例如藥用等級的甘露醇，乳糖，淀粉或硬脂酸鎂。除生物學中性的載體之外，施用的藥物組合物可以包含較小量的無毒助劑物質(zhì)，例如濕潤劑或乳化劑，防腐劑和pH緩沖劑等，例如醋酸鈉或單月桂酸山梨醇酯?，F(xiàn)有技術(shù)已知，基于蛋白質(zhì)的藥物只可以通過攝取而效率不高地遞送。然而，基于藥丸形式的藥物蛋白質(zhì)可以皮下地施用，尤其是如果配制在緩釋的組合物中。緩釋劑型可以通過目標蛋白質(zhì)與生物相容的基質(zhì)，比如膽固醇組合而生產(chǎn)。另一個可能的施用蛋白質(zhì)藥物的方法是通過利用縮型滲透泵。如上所述，生物相容的載體也可與這些遞送方法結(jié)合使用。該藥物組合物可以任何實現(xiàn)它們的預定目的的方式施用。施用治療分子的量和方案可以通過臨床
技術(shù)領域：
治療萊姆癥和任何其他的與伯氏疏螺旋體感染的狀況有關的一般技術(shù)人容易地確定。為治療這些癥狀，分子以有效抑制伯氏疏螺旋體i復制的量施用。典型的最初施用量是足以在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)實現(xiàn)體外預期效果的作用位點獲得組織濃度的量。化學式A或B的化合物可以活體內(nèi)施用到宿主，例如通過全身性施用，例如靜脈內(nèi)的或腹膜內(nèi)的施用。此外，化學式A或B的化合物可以損傷部位內(nèi)施用即將肽或蛋白質(zhì)直接注射進損傷部位。為了增強免疫應答，最初的注射大約4到6周后施用繼發(fā)的或加強劑量。繼發(fā)的劑量可以如此處指明的方式施用，或按照醫(yī)師指導施用。通過下列非限制的實施例說明本發(fā)明。實施例實施例1材料和方法生物體和生長條件-伯氏疏螺旋體B31(ATCC35210)，BL303和N40株在BSK-H培養(yǎng)基(Sigma)中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中接種2%(體積)的冰凍培養(yǎng)物并在37'C靜止培養(yǎng)72小時到指數(shù)生長中期(pH7.0)。通過在12,000g離心30分鐘收獲細胞，用冷PBS洗三次并在-20。C保存?zhèn)溆谩Ｖ愄崛『头治?脂類從洗滌過的細胞中通過Bligh和Dyer(14)的方法提取。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)氯仿相，繼之以氮流，并且將干燥的脂類(0.1-0.2mg/ml細胞蛋白質(zhì))再溶解在1-2ml氯仿中。BBGLs的定量分離通過硅膠吸附柱層析法實現(xiàn)。5ml氯仿的總脂類提取物(10mg)被上樣到硅膠柱(20x3cm，Kieselgel60,Merk,230-400目)，順序地用IO倍床體積氯仿(級分1);2.5%甲醇氯仿(體積體積；級分2);5%甲醇氯仿(體積體積；級分3)，10%甲醇氯仿(體積體積；級分4)和甲醇(級分5)洗脫。這些級分在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器和氮流中被蒸干，再溶解在1毫升氯仿并保存在-2(TC。級分3幾乎只包含BBGL-II，而級分4包含BBGL-in。為定性分析脂類，總脂類級分(20ul含200ug)在硅膠HR包被的鋁板(Merck，Darmstadt,德國)上進行層析并使用氯仿甲醇(體積比9:1)展開。脂類斑點通過碘蒸氣檢出，糖脂通過蒽酮噴顯劑檢出。放射性標記-伯氏疏螺旋體的膽固醇標記通過在接種的時候添加[4-"C]膽固醇(AmershamPharmacia,GB，W.Prinz惠贈，NIDDK，NIH)到100ml培養(yǎng)基中而完成。標記的膽固醇(比放射性58.0mCi/mmo1)以0.1uCi/ml被添加到Tween80:乙醇(1:1體積比)最終容積50u1的混合物中。如所述提取脂類。為測定脂斑點的放射性，總脂在TLC板上分離，板然后短暫暴露于碘蒸氣，斑點被刮入含1ml閃爍液的閃爍室。在PerkinElmer閃爍計數(shù)器(1450microbeta型號)中測量放射性并表示為每分鐘的衰變(dpm)。親和層析-使用Detoxi-凝膠去除內(nèi)毒素凝膠(Pierce,Rockford,IL)親和層析純化BBGL-II。疏螺旋體細胞用PBS洗5次，再懸浮在相同緩沖液中，并通過在Branson超聲波儀在50%工作循環(huán)在100W超聲波處理30分鐘進行破碎。膜從可溶組分通過在37000g離心30分鐘而分離，上清液(lml含lmg總蛋白)被上樣到detoxi凝膠(瓊脂糖固相化的多粘菌素B)柱(0.9xl0cm)。柱用IO倍床體積PBS洗滌。通過用10倍床體積包含ly。脫氧膽酸(w/v)PBS根據(jù)廠家說明書洗滌進行共軛物質(zhì)的洗脫。結(jié)合的級分用蒸餾水透析，凍干并如所述提取脂類。免疫和免疫染色-10只一組的雌性NIH瑞士白化小鼠(5-6周齡，通常)腹膜內(nèi)免疫2劑量的在完全弗氏佐劑中乳化的(第一劑量)或弗氏不完全佐劑中乳化的(第二劑量)BBGL-II，時間間隔兩周。該劑量每O.lml包含10ygBBGL-n，并以0.1mlIP施用。替代地，小鼠被免疫三次，間隔為2周，用0.1mlDMSO，角鯊烯或PBS中乳化的10ngBBGL-II免疫。小鼠在第二劑量之后2周取血，并將獲得的血清保存在-20°。備用。兔(雌性，新西蘭白兔，8周齡)用兩個劑量BBGL-II免疫，各75ixg，在弗氏佐劑中，i.m.和i.c.施用20x0.05ml。膜脂的免疫染色按前述方法(15)進行。包含脂類斑點的展開的層析板，用聚異丁基-異丁烯酸溶液(0.05%的己烷溶液)涂布并干燥。該板然后用包含"/。BSA和0.05。/。tween20的PBS封閉15分鐘，然后用以1:100在PBS-BSA緩沖液中稀釋的抗BBGL-II抗血清在22。C孵育l小時。該板用PBS-BSA緩沖液沖冼5次，并用1:25,000在PBS-BSA中稀釋的堿性磷酸酶結(jié)合的大鼠抗小鼠IgG(KPL,MD)在22'C孵育1小時。然后洗滌該板，并使用BCIP/NBT(KPL,MD)顯色。分析方法-糖分析根據(jù)SawardekCT等(16)方法進行。簡單地說，0.5mgBBGL-II或BBGL-III在1MHC1中在IO(TC水解4小時，在還原和過乙?；?，通過使用具有HP-5型玻璃毛細管柱的Hewlett-Packard儀器(HP6890型號)的GLC-MS(0.32mm30分鐘)，溫度程控在8'C/分鐘，從125-25(TC以電子電離方式(106eV)進行分析。在干燥的糖脂用1MHCl/MeOH在8(TC甲醇醇解5小時之分析脂肪酸。在氮流下除去溶劑，并用氯仿提取游離脂肪酸甲基酯。用GLC-MS在上述條件下進行分析。雙鍵定位-雙鍵在不飽和脂肪酸中的位置由4,4-二甲基噁唑啉衍生化作用(17)之后通過GLC-MS確定。氯仿相在氮氣流下干燥，然后與500ul的2-氨基-2-甲基丙醇混合并在15(TC加熱過夜。冷卻后，反應混合物被溶于3ml二氯甲烷，并用2ml蒸餾水洗兩次。甲基化分析-天然的和0-脫?；奶侵鶕?jù)(18)進行甲基化。甲基化的產(chǎn)物用1MHC1在IOO'C水解4小時，變?yōu)樘谴家宜狨?，并用GLC-MS分析。0-脫酰作用-糖脂(2mg)用0.33ml甲醇的0.25MNaOCH3在37°CO-脫酰。該反應通過TLC監(jiān)控。2小時后，沒有發(fā)現(xiàn)表示原始的，未改性的糖脂斑點。溶劑在氮氣流下蒸發(fā)，產(chǎn)物用氯仿水(l:l體積)提取。通過GLC-MS分析有機和無機相的糖和脂肪酸。絕對構(gòu)型的確定-BBGL-II用1MHC1在IO(TC水解4小時。干的中性樣品中的D-半乳糖通過使用半乳糖氧化酶(19)酶促方法進行定量。甘油絕對構(gòu)型的確定根據(jù)(l)用在前的糖脂O-脫酰作用(20)完成。這些方法中糖脂皂化后釋放的甘油的伯醇羥基通過TEMPO氧化并轉(zhuǎn)化為甘油酸殘基。在酸水解之后甘油酸用(R)-(-)-2-丁醇酯化，乙?；⒂肎LC-MS分析。保留時間與從D和L甘油酸獲得的基準試樣的相比。FAB質(zhì)譜分析法-使用6keV原子從3-硝基芐醇或甘油作為基質(zhì)的樣品記錄質(zhì)譜。樣品的泛乙?；饔冒碊dl(21)的描述進行?；|(zhì)輔助的激光解吸/離子化飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF)-使用PerSeptiveBioSystemsVoyagerEliteDE-STR(PE-Biosystems，F(xiàn)ramingham,MA)MALDI-TOF儀器獲得質(zhì)譜。質(zhì)譜在2600的衰減積累100次激光照射。儀器以20kV加速電壓和150毫微秒離子提取延遲時間的線性模型運轉(zhuǎn)。樣品和基質(zhì)按以前的描述(22)制備。簡單地說，BBGL-II和BBGL-III溶于氯仿甲醇(l:l體積)至濃度4ug/ul，并用作0.5ul小滴施加以分隔多個樣品板中心的位置。相等體積的基質(zhì)，2,5-二羥基苯甲酸，10mg/mL水被應用到各樣品，并在插入到質(zhì)譜儀之前干燥。核磁共振光譜學-單半乳糖基甘油二酯(MGDG，主要是1，2-二-0-硬脂酰-3-0-e-D-半乳糖吡喃糖基甘油)獲自Matreya,州立大學，PA。1，2-二-0-棕櫚酰甘油(1，2-二棕櫚精)獲自NuChek，NewElysian,MN。自身制備甲基a-D-半乳糖吡喃糖苷，甲基-P-D-半乳糖吡喃糖苷獲自Aldrich，Milwaukee,WI。氖化溶劑購買自劍橋同位素實驗室，Andover，MA。在300K不自旋，利用裝配5mm寬帶(BBO)探針BrukerDRX-500光譜計獲得核磁共振光譜。5-10毫克化合物的CDCl3溶液(0.5mL，99.96原子％D)或它與(CD3)2CO(99.9原子％D)或CD3OD(99.8原子％D)的混合物用于脂類，用四甲基硅垸作為^和13CNMR光譜化學位移的參考。檢驗異頭的甲基D-半乳糖吡喃糖苷(11毫克)以其在D20(0.4mL，99.96原子。/。D)中的溶液，用4，4-二甲基-4-硅雜戊酸-2,2，3,3-d4(TSP)作為^和13CNMR譜的內(nèi)部參照。通過在數(shù)據(jù)通過在SGI02或Octane2處理器上運行的BrukerXWINNMR程序3.0版本處理和獲得數(shù)據(jù)。32,768點數(shù)據(jù)用于1D譜，在有些情況下清零(zerofilling)到32，768或65，536點。在500MHz用4.25kHz譜寬，30°脈沖(3.2ixs)和再循環(huán)時間6s記錄1D^NMR譜。在126MHz通過使用25.1kHz譜寬，45。脈沖(3ns)和循環(huán)時間1s獲得ID13CNMR譜，另外為密集的13C膽固醇共振高分辨率研究，使用65,536點數(shù)據(jù)，清零到131,072點。通過DEPT方法使用30°，90°和150°在&頻率閱讀脈沖獲得的譜的組合編輯1D"CNMR譜。在其它情況下，135°iH讀數(shù)脈沖被用于產(chǎn)生具有反相CH2共振，連同正相CH和CH3共振的"CNMR譜。用核奧弗豪澤效應使用gated照射在頻率在3.42s松弛延遲中獲得^偶連的13CNMR譜。通過包含z-梯度相干性選擇的脈沖序列獲得大部分2DNMR數(shù)據(jù)。以2048x512點據(jù)系列收集2DCOSY&NMR譜，使用30°或者45。閱讀脈沖清零到2048x2048點。傅里葉變換之前在兩個維數(shù)應用無位移的正弦bdl方格紙函數(shù)，其后以量度方式顯示頻率數(shù)據(jù)。使用16384x256點據(jù)獲得2DTOCSY&NMR譜，使用梯度挑選的相位靈敏的回聲/反回聲協(xié)議清零到16384x2048點。在兩個維數(shù)應用被"/2rad位移的正弦bell方格紙。個別殘基的1D&NMR子譜(subspectra)通過從2DTOCSY譜提取F2切面而得到。對一些&NMR譜，賦值還通過數(shù)字的選擇性的同核的]H去耦確認。2DHSQC和HMBC'H/"CNMR譜以2048x512點據(jù)被記錄，清零到2048x2048點，對HSQC使用梯度選擇的，靈敏度增強的，相敏的回聲/反回聲方式，對HMBC使用梯度選擇的，低通濾波器遠程的非去耦脈沖序列，數(shù)據(jù)以量度方式展示。用83ms進化延遲獲得2DHMBCNMR譜，即為"Jch6.0Hz而猶化。使用在兩個維數(shù)位移的i/2rad正弦bdl方格紙函數(shù)獲得最佳靈敏度。根據(jù)需要通過平均排減法在BrukerAURELIA程程序(版本2.8.12)中除去2D譜tl維數(shù)的脊。在202MHz處的31PNMR測量表明在調(diào)査的樣品中沒有磷。實施例2BBGL-II禾口BBGL-III的分離通過Bligh和Dyer提取法由2.17g干細胞獲得伯氏疏螺旋體(B31株)的糖脂。它們通過硅膠吸附柱(20X3cm)和用氯仿和甲醇的混合物以增加的極性逐步洗脫純化到均一。來自0.7g總脂質(zhì)的BBGL-II的產(chǎn)量為163mg(23.2%),BBGL-III的產(chǎn)量為87mg(12.4%)，因此BBGL-II和BBGL-III是B.burgdorferi中主要的脂類。從臨床分離株BL303和N40獲得類似的產(chǎn)量，其脂類儲量類似B31株(圖1)。因為來自B31株的生物量高很多，全部后續(xù)實驗用此菌株進行。實施例3親和層析BBGL-II結(jié)合到Detoxi凝膠內(nèi)毒素除去凝膠(Pierce)。該樹脂由瓊脂糖上固相化的多粘菌素B組成，用于通過結(jié)合LPS的脂類A部分而去除內(nèi)毒素。當超聲處理后的細胞B.burgdorferi被上樣到該柱時，通過TLC以及免疫標記顯示共軛物質(zhì)中用1%脫氧膽酸從柱上洗脫的BBGL-II的存在(圖1)。共軛物質(zhì)中沒有檢測到BBGL-III的存在。實施例4BBGL-II的放射性標記在"C膽固醇存在的情況下培養(yǎng)時，總數(shù)脂類提取物中發(fā)現(xiàn)的80。/。的放射性歸于BBGL-II(表1)。在對應于BBGL-III，游離膽固醇或膽固醇酯的脂類條帶中沒有檢測到放射性。表l伯氏疏螺旋體糖脂的化學組成<table>complextableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>3通過GLC-MS測定摩爾比b雙鍵的定位e總脂級分中放射標記相對量(參見實施例1詳細描述)實施例5組成分析兩個糖脂的糖分析顯示半乳糖作為僅有的單糖存在。只在BBGL-III中檢出甘油。甲醇醇解鑒定兩個主要的酯結(jié)合的脂肪酸的存在:C16:0和C18:l和幾個次要的脂肪酸C14:0，C18:0C18:2(表1)。雙鍵分別定位在C18:l和C18:2的位置A9和A9，12，表明這些脂肪酸為油酸和亞油酸。半乳糖氧化酶分析表示半乳糖部分處于D構(gòu)象。BBGL-III甘油部分C-2位置碳的絕對構(gòu)型，與C-3位置糖殘基和C-l和C-2位置脂肪酸的絕對構(gòu)型被確定為L。這與碳被立體特異的編號的sn結(jié)構(gòu)相符合。實施例6甲基化分析天然的BBGL-II甲基化分析顯示1，5二-0-乙酰-2,3,4，6-四-0-甲基半乳糖醇和1,5,6-三-0-乙酰基2，3,4-四甲基半乳糖醇摩爾比為1.0到0.9，鑒別末端和6-取代的半乳糖殘基。在前樣品的去-O-?；饔卯a(chǎn)生缺失6-取代的半乳糖和末端半乳糖是僅有的檢出成分。這表明在根據(jù)(23)進行甲基化期間未完全地除去的脂肪酸鏈，位于半乳糖的C6位置。BBGL-m的甲基化分析檢出表明末端半乳糖存在的1,5-二-0-乙酰-2，3,4,6-四-0-甲基-半乳糖醇。實施例7質(zhì)譜分析以陽離子方式記錄的BBGL-II的MALDI-TOF譜檢出兩個810.1和836.1大小的分子。分子量之間的差異(Am/z-26)表明脂類成分的變異性，表示膽固醇基半乳糖的鈉加合物被棕櫚酸或者油酸脂肪酸取代(圖2)。這與通過GLC-MS獲得的結(jié)果一致，顯示脂肪酸作為主要的部分。天然的BBGL-IIFAB-MS分析檢出分子質(zhì)量809.7和835.7，而泛?；腂BGL-II分析檢出分子量935.7和961.7?！鱩/z=126分子量的增加表示三個乙?；膿饺?，證實BBGL-II存在三個游離羥基。為證實BBGL-II的成分，記錄高分辨率FAB-MS。該化合物的銫加合物的理論的m/z值，包括己糖，膽固醇和油酸(CH8607Cs)，計算為943.5428。觀察到的m/z重量為943.5469。這證實C^HmC^Cs的理論成份(誤差[ppm/mmu]=+4.3/+4.1)。BBGL-III的MALDI-TOF譜顯示質(zhì)量780.1和806.1的兩個離子，其表示具有兩個16:0脂肪酸或分別具有16:0和18:1脂肪酸的單半乳糖酰二酰基甘油的鈉加合物(圖2)。實施例8核磁共振光譜通過在500MHz處的一維的(1D)和二維的(2D)NMR譜進一步研究BBGL-II和BBGL-III和它們的泛酰化派生物的結(jié)構(gòu)。力NMR分布(表II)通過2D關聯(lián)能譜法(COSY)，總相關光譜(TOCSY)或選擇性的自旋-去耦試驗確認，而13CNMR賦值(表III)通過2D雜環(huán)的單個量子相關(HSQC)根據(jù)已經(jīng)測定的&NMR賦值確定。殘基內(nèi)連通性和"C分布進一步的證據(jù)獲自2D雜環(huán)的多重鍵相關(HMBC)。表n糖脂及相關化合物的半乳糖和甘油殘基的'H化學位移(ppm)站Q1^1，BBOUt-AC'BSCUI"BBO^[IMCt13-二棕櫚酸Mc^0"SsktKc^IH^甘油^QaD)OJ紐00)4J274.541(外34.ZJZ《M《33JH.2'—"M"fldl饑l加H.y-"171770"171JIZ13H—'WT7U7fl4加iUfl加H-P3腳II"1HT7"031S10IMSl加H'，'l"Sl.加"071129V7M翩敝加H-1—《XTTO(O"II.""H.l"b"""47""',ZMiiH5.w，，.rw，加H-T-il糾II"W"It3.T3IH-3"bWM1flD17217Hl加HOCa可商業(yè)獲得的"單半乳糖基甘油二酯"，主要是1^2-二-0-e-D"半乳糖吡喃糖基甘油b1^-二^0-棕櫚欲甘油表瓜糖脂和相關化合物的"C化學位移(ppm)BBGL>aBBQL>U-AqiQwkat。rotBBGL>QIBBGL^AefMGDG坎艇紐油酸lA-二棟摘酸Me^EMWpMiHWMWp(M(Onl)J7.3037,加0*23U93"，WCO9."，TO."U>71_抑"39.73汰7J4133C3140J7"W3140.71W12X12UZ1，121.71C-731.973L鄰31,12表III<table>complextableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>a-c命名可互換f該基團的位移指硬脂酰取代基，而非棕櫚酰g-s命名可互換表IV顯示糖脂主要的同型和異型核的耦合常數(shù)的值。幾個參考化合物或糖脂的結(jié)構(gòu)組分的NMR數(shù)據(jù)也顯示在表II-IV中。13CNMR共振的分布進一步的通過極化傳遞(DEPT)NMR譜編輯實驗的1D不失真的增強而得到支持，其中辨別具有不同數(shù)目連接的氫原子的碳核。<table>complextableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實施例9BBGL-II氯仿-d溶液中的BBGL-II的ID&NMR譜被不完全地分散在500MHz，糖殘基的H-2'和H-3'信號在3.62ppm顯著地重疊。也觀察到H-l',H-6'a，和H-6'b多重峰2的重疊，通過在2DTOCSY譜這些信號lD切面產(chǎn)生包含全部七個糖鏈質(zhì)子信號(H-l'-H-6'b)的譜，推測上作為兩個由H-l'-H-4'和H-5'-H-6'b子群組成的子集。根據(jù)那些甲基-3-D-半乳糖基吡喃糖糖(表II)的脂糖亞甲基質(zhì)子去屏蔽0,55ppm表明糖的O-6'被酰化。TOCSY實驗也證明1:2:1三聯(lián)體的1:2:1三聯(lián)體的53.553不是糖質(zhì)子自旋系統(tǒng)的一部分，這些多重峰分配給膽固醇部分的H-3，特別因為它也在1DT0CSY切面通過BBGL-II的烯烴質(zhì)子信號觀察到。通過集成，由于膽固醇部分單個的烯烴質(zhì)子(H-6)信號與分離的糖脂中一部分不飽和脂肪酸的烯烴質(zhì)子信號重合，后者信號在1D^NMR譜中達到2.5個質(zhì)子。支持這個賦值的是，TOCSY切面烯烴質(zhì)子信號在該脂肪族的質(zhì)子區(qū)(S2.8-0.9)由于膽固醇和不飽和脂肪酸的脂肪族質(zhì)子也包含很多多重峰。BBGL-II的13CNMR譜顯示59個主要的，解析的共振，其中五個是由于四價的"C核，g卩，未被"CDEPT檢出的。從低場到高場(表III)，五個四價的13C共振被歸因于兩個酯羰基共振，和膽固醇部分的C-5(烯烴)，C-13,和C-10共振?？?C共振的總數(shù)量而言，15可以通過DEPT譜編輯(圖3a)鑒定為CH，連同27個CH2和六個CH3基團(圖3b)。五個CH3共振分配給膽固醇殘基(表in)，較弱的第六個共振在Sc14.13到脂肪酸酯基團"甲基碳的信號的組合，其典型地可以不必彼此解析。該兩個主要的在B0ppm的烯烴CH共振分配給主要的不飽和脂肪酸酯基(油酸，18:1)，盡管在該區(qū)另外的弱的共振表明存在較小比例的其他不飽和脂肪酸酯基。在122.12和79.46卯m的CH共振分別地分配給膽固醇部分的C-6和C-3。在BBGL-II的13C化學位移和它的脂類成分，膽固醇，棕櫚酸和油酸的"C化學位移之間獲得良好的匹配，除接近殘基附著點的核之外(表III)。氯仿-d溶液的膽固醇的13C分配基于那些吡啶-ds溶液的報道(24)，而保證該賦值與DEPT實驗的結(jié)果一致。1膽固醇，半乳糖，棕櫚酸，油酸和甘油殘基被分別地標記作為未致敏(uiiDrimed)的，和單倍，兩倍，三倍，和四倍的致敏。2質(zhì)子標記為a和b，a標記指在較低場共振的質(zhì)子，而b標記指高場質(zhì)子。剩余的五個101.43-68.32卯m范圍的CH共振分配給半乳糖的C-l'—C-5'，其也顯示出CH2信號在61.3ppm(表III)。觀察到半乳糖C-4'，C-5',和C-6信號的加倍，其可以分配到在半乳糖的0-6'帶有不同的脂肪酸酯基團(棕櫚酰和油?；?的兩個糖脂的存在。觀察到的膽固醇C-3信號的加倍較難以用這種方式解釋，因為C-3比C-4'，C-5'和C-6'更遠離半乳糖的0-6'取代基。這個加倍可能是由于C-l'--0-l'鍵(25)周圍的旋光異構(gòu)。膽固醇基團在BBGL-II半乳糖(Gal)殘基的O-l'的定位通過在2DHMBC譜在3.556/101.49卯m觀測到H-3/C-l'/交叉峰來顯示。同樣地，酰氧基在半乳糖C-6'的定位根據(jù)在HMBC譜分別在4.351/173.86ppm和4.297/173.86ppm觀察到H-6'a/OO和H-6'b/C=0交叉峰而推定。BBGL-II!HNMR譜的膽固醇H-3多重峰的分析產(chǎn)生常數(shù)J2eq,3=J4eq,3=4.7Hz,和J2ax,3=J4ax,3=11.4Hz的偶連。這些值限定H-3的方向為軸向，因此附著于C-3的氧原子(O-l')是平展的。所以，C-3具有在膽固醇發(fā)現(xiàn)的通常的立體化學結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)。BBGL-II的NMR數(shù)據(jù)與兩個結(jié)構(gòu)的混合物一致，就是，3—(6-0-棕櫚酰-e-D-半乳糖吡喃糖基)膽固醇，和3-0-(6-0-油?；?e-D-半乳糖吡喃糖基)膽固醇。糖環(huán)大小的分配基于BBGL-II糖環(huán)與甲基-P-D-半乳糖吡喃糖(表IV)的偶連常數(shù)的相似性。BBGL-II的異頭構(gòu)象在下面討論。實施例10糖脂BBGL-II-Ac3證明BBGL-II中存在半乳糖的有說服力的NMR證據(jù)通過其泛?；@得，其產(chǎn)生三乙酰衍生物，其^NMR譜比BBGL-II的^NMR譜分散和解析得更好。該譜顯示半乳糖結(jié)構(gòu)特征性的窄的H-4'四重峰(J3,，4,3.5Hz，J4.，5,l.OHz)，和預計H-2'和H-3'寬的四重峰。這些全部三個信號根據(jù)它們在非乙?；腂BGL-II的位置(表II)顯著地去屏蔽(+1.41-1.57ppm)，表明在HO-2'，HO-3',和HO-4'發(fā)生乙?；?。三個乙?；恢玫拇_認通過觀察H-2'，H-3',H-4'和三個不同的13〔=0基團之間的2DHMBC交叉峰而獲得(圖4)。該譜也顯示Gal的C-l'和膽固醇的H-3和Gal的H-6'a/H-6'b和脂肪酸酯C=0之間的交叉峰，從而證實膽固醇基定位在Gal的O-l'，和脂肪酰氧基定位在C-6'。iH信號賦值通過2DCOSY確認(參見圖5)。分別觀察到BBGL-II和BBGL-II-Ac3的Jr2,7.5Hz和8.0Hz的大值(表IV),表明H-l'和H-2'在這些糖脂中具有反式方向并且，因此它們具有18異頭結(jié)構(gòu)。這分別通過測量BBGLII和BBGL-II-Ac3的、.1，,h.1，158.7Hz和157.4Hz值而確認(表IV)，其落在e異頭結(jié)構(gòu)(26)合適的范圍內(nèi)，通過觀察到甲基-3-D-半乳糖吡喃糖(Me-P-D-Galp,表IV)的4"，,iM，160.6Hz的值而舉例說明。BBGL-II和BBGL-II-AC3糖環(huán)大小的賦值基于糖環(huán)常數(shù)偶連到甲基-13-D-半乳糖吡喃糖(表IV)的那些常數(shù)的相似性進行。一個方面BBGL-II和BBGL-II-Ac3和甲基fi-D-半乳糖吡喃糖苷的5.^和J5.,6，b值的差異可以導致由于糖脂O-6'出現(xiàn)大的取代基而產(chǎn)生的C-5'-C-6'鍵的不同旋轉(zhuǎn)分布。BBGL-II-AC3的NMR數(shù)據(jù)與其作為混合物的特征相符合，所述混合物是3-0-(2,3，4-三-0-乙?；?6-0-棕櫚?；?J3-D-半乳糖吡喃糖基)膽固醇，和3-0-(2，3,4-三-0-乙?；?6-0-油?；?J3-D-半乳糖吡喃糖基)膽固醇的混合物。實施例11BBGL-III氯仿-d溶液的BBGL-III的'HNMR譜分散良好；尤其是，甘油質(zhì)子在500MHz完全分散，并且2DCOSY譜和2DTOCSY譜(圖6)含有代表(從低場到高場)甘油質(zhì)子H-2"",H-r"a,H-r"b,H-3""a,和H-3""b的五個多重峰系列。這些2D譜具有相似的外觀，因為H-2""旋轉(zhuǎn)偶連到甘油碳鏈上所有其他質(zhì)子，從而在與TOCSY譜相似的COSY譜產(chǎn)生一系列交叉峰。后一譜(圖5)還顯示半乳糖構(gòu)型特征性的H-l'-H-4'多重峰系列，H-4'到H-5',H-6'a,和H-6'b的磁化轉(zhuǎn)移，通常被J4,，5，小幅度抑制(參見表IV)。結(jié)果，Gal殘基的H-4'多重峰特征性是窄的(J3,,4.3.2Hz,J4,,5,1.1Hz)。2DTOCSY譜的七重峰系列代表烯烴質(zhì)子(S5.344)和不飽和脂肪酸(18:l)的脂肪族質(zhì)子之間磁化的相互交換。BBGL-m的DEPT-13513CNMR譜在糖區(qū)域顯示六個CH共振和三個CH2信號，與存在一個甘油殘基和一個醛糖殘基相符合，以及在分配到脂肪酸的脂肪碳鏈碳區(qū)域25個不完全解析的CH2信號和一個CH3共振。在5c130.06和129.70的兩個強烈的共振顯示存在一個主要的不飽和脂肪酸殘基。然而，在烯烴碳區(qū)域觀察到兩個弱的信號對顯示較少比例的其他不飽和脂肪酸的存在。在C=0區(qū)域觀察到三個強烈的13C共振(表III)，和一個弱的共振。BBGL-III甘油基殘基的H-l""a,H-l""b,和H-2""質(zhì)子的基本去屏蔽(分別+0.724,+0.567,和+1.470ppm)，參考母甘油對應的質(zhì)子(SH在D20中，3.653，H-l""a;3.561，H-l""b;3.783,H-2'"')指出甘油基殘基O-l'"'和0-2""的乙酰化(表11)。通過觀察BBGL-III的2DHMBC譜中的H-l""a/C=0,H-l""b/C=0,和H-2"7C=0交叉峰確認乙酰基團的位置。該譜還顯示H-3""b/C-l'交叉峰，其將半乳糖基殘基定位于甘油部分的0-3""。實施例12BBGL-III-Ac4BBGL-III泛酰化產(chǎn)生的產(chǎn)物其^和13CNMR譜分別顯示四個強烈的乙酰甲基質(zhì)子信號，和四個乙酰甲基碳和羰基碳信號，表明形成了四-O-乙酰衍生物。GalH-2'，H-3'，和H-4'的基本去屏蔽(+1.266到+1.547ppm)，和H-6'a和H-6'b更限制性的去屏蔽(+0.180到+0.255ppm，表II)指示Gal殘基0-2',0-3'，0-4',和O-6'的乙?；?。這通過在BBGL-III-Ac4的2DHMBC譜(圖6)檢測H-2VC=0,H-3VC=0，H-4VC=0，H-6'a/C=0，和H-6'b/C-0交叉峰而證實，這種情況下，乙酰和脂肪酸酯基團的羰基碳信號很容易通過它們分別在170卯m和173ppm區(qū)域的"C化學位移而區(qū)分(表m)。在173ppm區(qū)域，BBGL-III-AC4的2DHMBC譜還顯示具有脂肪酸酯羰基碳的H-r"a，H-l""b，和H-2""的交叉峰，連同H-3""a/C-l'交叉峰，證明了在甘油單元中Gal殘基分配在0-3""的位置。BBGL-III禾卩BBGL-III-Ac4(參見表IV)的小值分別為^,2'3.8Hz和3.7Hz，顯示H-1'和H-2'在衍生物中的左方向，這表明它們的Gal殘基具有異頭構(gòu)型。這通過BBGL-III和BBGL-III-Ac4(表IV)的大值J",，h.,，170.5Hz和172.4Hz分別得到證實，所述值落在異頭體(26)預期的范圍內(nèi)，其在甲基a-D-半乳糖吡喃糖苷(Me-a-D-Galp,表IV)中觀察到。BBGL-III的NMR數(shù)據(jù)與3-0-a。-半乳糖吡喃糖基-1(2)-0-油?；?2(l)-O-棕櫚酰基-甘油的結(jié)構(gòu)一致，并且BBGL-III-AC4的數(shù)據(jù)支持了3-0-(2，3,4，6-四-0-乙?；?a-D-半乳糖吡喃糖基)-l(2)-0-油?；?2(l)-O-棕櫚?；?甘油的結(jié)構(gòu)。此外，糖環(huán)大小的賦值基于糖環(huán)偶連常數(shù)與甲基a-D-半乳糖吡喃糖苷偶連常數(shù)的相似性(表IV)。實施例13單半乳糖甘油二酯本發(fā)明人認識到商業(yè)獲得的單半乳糖甘油二酯(MGDG)是BBGL-ni結(jié)構(gòu)非常相似的類似物，該產(chǎn)物因此被研究用作參考化合物，并完善此處描述的分析技術(shù)。MGDG的iHNMR譜在500MHz分散非常好，并且容易識別來自Gal殘基的七個旋轉(zhuǎn)多重峰的方向，包括半乳糖構(gòu)型特征性的窄的H-4'四重峰(J3,，4，3.3Hz,J4,5，1.1Hz)。此外，環(huán)質(zhì)子偶連常數(shù)(表IV)顯示半乳糖殘基以吡喃糖基環(huán)存在，和此前論述的糖脂衍生物相對應。沒有觀察到MGDG的烯烴質(zhì)子信號。MGDG的2DCOSY和TOCSY111NMR譜包含在C-l""和C-2""帶有酰氧基的甘油殘基特征性的相同高度分散的五個多重峰系列，是被H-l""a,H-r"b,和H-2""的低場位移支持的替代的模式(表11)。DEPT-13513CNMR譜顯示在糖區(qū)域(Gal+Gro)六個主要的CH共振和三個主要的CH2信號，連同在代表兩個脂肪酸酯殘基的脂肪族區(qū)域14個解析的CH2信號和一個CH3共振，這通過在通常的13CNMR譜Sc174.31和174.01檢測兩個C-0信號而證實。酰氧基基團在C-1""和C-2""的定位通過在MGDG的2DHMBC譜觀察H-l""a/C-0,H-l""b/C=0,和H-2"7C-0交叉峰而證實。該譜還顯示H-3""a/C-l'和H-3""b/C-l'交叉峰，其證實Gal殘基的C-l'連接到甘油部分的0-3""。MGDG，BBGL-III，和BBGL-III-Ac4的所有三個甘油基碳獲得13C化學位移之間良好的匹配(參見表III)，但對于1,2-二棕櫚精，C-3""位移基本是對應的其他化合物的位移的高場，這是由于在甘油二酯中缺乏甘油基取代基的去屏蔽。大值Jr，2.7.3Hz和小值J。-rH-p，160.2Hz(表IV)證明MGDG具有P異頭構(gòu)型，即，與糖脂BBGL-III相反的構(gòu)型。MGDG的NMR和GC-MS數(shù)據(jù)一起表明其主要由1，2-二-0-硬脂酰-3-0-e-D-半乳糖吡喃糖基甘油組成，盡管NMR和GC-MS譜中弱的峰指示少量其他組分的存在。MGDG和BBGL-III非對映異構(gòu)關系和MGDG缺少不飽和脂肪酸殘基不足以導致這兩個糖脂具有不同的溶解性。與其他所研究的脂質(zhì)不同的是，MGDG在CDC13中的溶解需要添加大約20%的CD3OD。因此，BBGL-II和BBGL-III分離自伯氏疏螺旋體B31,N40和BL303(15)株，由硅膠柱層析純化到幾乎均一。使用不同的分析方法(GLC,MALDI-TOF,FAB，和NMR譜法)，伯氏疏螺旋體主要的極性膜糖脂的結(jié)構(gòu)被鑒定為膽固醇6-0-酰基-e-D-半乳糖吡喃糖苷(BBGL-n，圖8),和1,2-二酰基-3--sn-甘油(BBGL-m,圖9)。BBGL-III顯示與BOLIP-7的高度結(jié)構(gòu)同源性，BOLIP-7是以前描述的單半乳糖基二酰基甘油。然而，獲得的結(jié)果清楚地顯示BBGL-II的末端半乳糖部分實際上連接到膽固醇，而不像BBGL-III中半乳糖連接到甘油。BBGL-II中膽固醇部分進一步的證據(jù)通過用14C膽固醇培養(yǎng)細胞后而代謝標記該糖脂而獲得。在這些實驗中，總脂級分中80%的放射性來自于BBGL-ll。在這些實驗中，沒有觀察到顯著量的游離膽固醇，顯示膜脂庫中缺少游離膽固醇，以及其快速摻入到BBGL-ll中。游離膽固醇，或膽固醇酯被顯示摻入到許多種類細菌的膜中，包括支原體，幽門螺旋菌(Helicobacterpylori),Micrococcuslysodeilcticus，巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)，禾卩奇異變形菌(Proteusmirabilis)。然而，從頭合成的膽固醇基葡萄糖苷顯示只在支原體、幽門螺旋菌、和B.hermsi中發(fā)現(xiàn)，上述所有微生物的碳水化合物為葡萄糖，在所述膽固醇基葡萄糖苷中來自生長培養(yǎng)基的膽固醇被摻入從而與糖和/或脂部分連接。以前的研究表明膽固醇是高度免疫原性的分子。因此，伯氏疏螺旋體膜中含膽固醇的BBGL-III大量存在能導致在萊姆癥發(fā)病期間抗膽固醇抗體滴度的升高。聚陽離子環(huán)狀肽多粘菌素B，被用作去除內(nèi)毒素，主要為LPS和脂A的親和吸附劑。當超聲過的伯氏疏螺旋體細胞被上樣到含固化的多粘菌素B的柱上，可以在用脫氧膽酸洗脫結(jié)合的物質(zhì)后顯示BBGL-II的存在。有意思的是在相同條件下，BBGL-m不結(jié)合到柱。內(nèi)毒素結(jié)合到多粘菌素B的動力是這兩種結(jié)構(gòu)之間的疏水相互作用。可以假設BBGL-II的一些結(jié)構(gòu)元素顯示與脂A相似的特征。BBGL-II對脂A的分子模擬還通過在用含BBGL-II的各種伯氏疏螺旋體制劑刺激細胞培養(yǎng)物后激發(fā)前炎性介質(zhì)例如白介素-1，IL-6、TNF-a，和PGE2而證實。不限于理論，因此有可能BBGL-II在伯氏疏螺旋體中用作"功能LPS"。實施例14免疫學結(jié)果在用不同的通式B的化合物(BBGL-11)的制劑注射的小鼠和兔中誘導了特異性的抗體(參見圖10和11)。BBGL-m誘導的抗體，主要是IgM,其與兩種糖脂都反應(數(shù)據(jù)未顯示)。PBS中的BBGL-II(可能是微膠粒)比其作為DMSO或角鯊烯中的溶解物更有免疫原性。用弗氏佐劑獲得最高的梯度。令人驚奇的是，盡管尺寸不大，BBGL-II在小鼠和兔體內(nèi)引發(fā)抗體，多數(shù)是IgM同種型。這些抗體對同源的糖脂是特異性的。作為對比，BBG-III引發(fā)與兩個糖脂都反應的抗體。實施例15BBGL-II類似物("疊氮基BBGL-n")的合成目標化合物("疊氮基BBGL-II"，化合物19,參見圖15)與天然糖脂BBGL-II的區(qū)別在于其在棕櫚?；鶊F末端含有取代質(zhì)子的疊氮基。19的合成通過主要的中間產(chǎn)物半乳糖基溴4，膽固醇5和共-疊氮基棕櫚酸16獲得。化合物4(參見圖12)從用特戊酰氯的吡啶溶液處理過的半乳糖1制備得到。并非預期的五特戊酰衍生物，部分特戊?；幕衔?以高得率和高純度無需層析純化而獲得。化合物2的游離羥基被乙?；鶊F(—3)保護。隨后用溴化氫的乙酸溶液處理以提供半乳糖基溴4。溴化物4與膽固醇5在銀三氟甲垸磺酸鹽的二氯甲垸溶液的促進下偶連以立體選擇的方式提供所需的e-半乳糖基-膽固醇6(參見圖13)。l-Hnmr譜顯示e-異頭構(gòu)型。o-保護基團隨后通過用甲醇鈉的無水二氯甲烷和甲醇的混合溶液處理以提供非結(jié)晶固體形式的膽固醇基fi-D-半乳糖吡喃糖苷。嘗試大量的保護基團組合以在四醇7的HO-6位置引入特戊酰部分。根據(jù)經(jīng)驗，使用?；惐Ｗo基團，包括乙?；厶酋?、氯乙?；鶊F被證明多數(shù)是不成功的，因為這些基團在半乳糖部分中的移動不可控制。最終，這個問題通過使用丙烯基、異亞丙基和甲硅垸基保護基團的組合而得到克服。因此，7中伯醇羥基被叔-丁基-二苯基甲硅烷基保護以提供化合物8而不影響其他的羥基。其次，三元醇8用二甲氧基丙垸在存在樟腦磺酸的情況下處理以向HO-3和HO-4引入異亞丙基從而提供化合物9。隨后，中間產(chǎn)物9用烯丙基溴/NaH的二甲基甲酰胺溶液處理以提供完全保護的衍生物10，從10中選擇性除去甲硅烷基保護基團而不影響該分子的其他部分以提供化合物11。該衍生物的特征是游離HO-6羥基，其是棕櫚酰部分連接點。16-疊氮基棕櫚酸中間產(chǎn)物16的合成顯示于圖14。因此，商業(yè)可獲得的16-羥基棕櫚酸12用疊氮甲垸處理以定量的產(chǎn)量提供甲基酯13。然后，醇13用p-甲苯磺酰氯的吡啶溶液處理以提供磺酸鹽14，其隨后用疊氮鈉的二甲基甲酰胺處理以提供疊氮基酯15。然后，甲基酯用氫氧化鉀的二噁垸和水的混合溶液除去以提供酸16。膽固醇基棕櫚酰半乳糖吡喃糖苷19通過在存在二環(huán)己基碳二亞胺的乙酸乙酯溶液的情況下以定量的產(chǎn)量(—17)濃縮化合物ll與疊氮棕櫚酸16(參見圖15)。隨后，以兩個步驟除去保護基團。首先化合物17用乙酸/水處理以除去異亞丙基基團從而提供二醇18。然后用銥復合物(MePh2)2(C8Hu)IrPFe的四氫呋喃溶液處理，并使用鋨四氧化物和三甲胺N氧化物的組合氧化除去得到的丙烯基基團，以提供非結(jié)晶固體形式的疊氮化物19。ELISA和TLC薄層分析表明針對合成的化合物19的抗體產(chǎn)生的程度與針對純化的天然BBGL-II產(chǎn)生的程度一樣。明顯的是所述方法或組合物精確的細節(jié)可能是變化或修飾的只要不離開本發(fā)明的精神。我們主張所有這些修改和變化落在以下權(quán)利要求書的范圍和精神中。參考文獻1.Orloski,K.A.,Hayes,E.B.，Campbell,G.L.,andDennis,D.T.(2000)i^MPRCZX7^"rvei7/Swm挑.49，l誦l12.Steere,A.C.(2001)W五"g/.j:Med345，115-1253.Sadziene,A.andBarbour,A.G.(1996)/"/ec加w24，195-2024.Rahn,D.W.(2001)/n/ecf.Z)&.C7i>UVbrt/^m.15，171-1875.Lathrop,S.L.，Ball,R.，Haber,P.，Mootrey,G.T.，Bra叫M.M.,Shadomy,S.V.，Ellenberg,S.S.，Chen，R.T.，andHayes,E.B.(2002)Facc/ne20，1603-應6.Vinh,T.U.,Shi,M.H.,Adler,B:，andFai加,S.(1989)y.Ge汰iW!'cro6z'o/.135(Pt10)，2663-26737.Halter，M.R.andJoens,L,A.(1988)ih/ec"miww.56，3152-31568.TakayamajK.,Rothenberg,R.J.,andBarbour,A.G.(1987)ih/ec"7朋諷55，2311-23139.Cinco，M.,Banfi,E.,Balanzin,D.，Godeas，C.，andPanfili，E.(1991)i^EMS1McroWo/./附附wwo/.3，33-3810.E近ert，H.,Lotter,H"Jarecki-Khan,K"andThomssen，R.(1991)Medilf!'cra6z'o/.力ra7nM"oZ.(Be^180，229-23711.Wheeler,C.M.，GarciaMonco,J.C.，Benach，J.L.,GoUghtly,M,G.,Habich仁G.S.,andSteere,A.C.(1993)JJ"/e".IXs.167，665-67412.Radolf,J.D.,Goldberg,M.S"Bourell,K.,Baker,S.I"Jones,J.D.,andNorgard,M.V.(1995)/"/ec"/w附MM.63,2154-2163D.Hossain,H.,Welensiek，H,J"Geyer，R.,andLochnit^G.(2001)JWoc/j/wfe83，683-69214.Bligh，E.G.andDyer,W.J.(1969)Ca".J!及'octe附.i^"iW.37，911-91715.BenMenachem，G.，Wagner,F.,Zahringer，U"Rietschel,E.T.，andRottem，S.(1997)F五MyMi'cro&!'oLLett.154,363-36916.Sawardeker，J.S.，Sloneker,J.H.,andJeanes，A.(1965)及'ocfe附.J37，1602-廳17.Fay,L.andRichli,U.(1991)J:c;wo,加f05np;y541，89-9818.Rasley，A.,Anguita,J.，andMarriott,I.(2002)J.WewWww,Z.130，22-3119.Roth,h"Segal，S.,andBertoli，D.(1965)爿7MZ.5!.oc/ie附.10,32-5220.PasciakjM.，Ekiel，L,Grzegorzewicz,A.,Mordarska,H.，andGami叫A.(2002)5/油.附.歷0*"加1594，199-20521.Dell,A.(1987)JA.aw"6o/^o&'.C72ew._S/ocfewz.45，19-7222.Zahringer,U.，Wagner,R,Rietschel,E.T.,BenMenachem，G.，Deutsch,J.,andRottem,S.(1997)J.Bzo/.Ctew.272，26262-2627023.Ciucanu，I.andKerek^F.(1984)Ow^o/o^n及e;s131,209-21724.Reich,H.J"Jautelat，M.，Messe,M.T.,WeigeitRJ.,andRoberts,J.D.(1969)JbwmaZo/決ej加e"'c朋c力柳fcaZjoc/e^91，7445-745325.Hirai，Y.,Haque,M.,Yoshida，T.，Yokota，K.，Yasuda，T.,andOguma，K.(1995)j:5acterz'o/.177，5327-533326.Bock,K.andPedersen,C.(1975)j加CA柳/ca5fc。"c/"flWc。529，258-26427.Honarvar,N.,Schaible,U.E.,Galanos，C.，Wallich,R.,andSimon,M.M.(1994)/廳""o/ogy82，389-39628.Beck,G.，Benach,J.L.,andHabicht,G.S.(1990)丑z'oc/ze肌及'op/^j.igjCo卿肌167，89-9529.BeckjG.,Habicht,G.S.,Benach，J.L.,andColeman,J.L.(1985)//"/e",Z)&,152,108-11730.HabichtG.S.,Beck，G.,Benach,J.L.，andColeman,J.L.(1986)2^咖歸。to/o/.MAro嵐孫g./4/263，137-14131.Rottem,S.(2002)5/ocAe肌5/o/;^j.及ej.awK歷w汰292，1289-129232.Razin,S.(1975)J.JBa咖'oZ.124，570-57233.Mayberry,W.R.加dSmith,P.F.(1983)5/oc/z/肌萬/c!p/z;^乂cto752，434-44334.Livermore,B.P.，Bey,R.F.,andJohnson,R.C.(1978)/"戶"./加ww".20，215-22035.Alving,C.R.andSwartz,G.M,Jr.(1991)CnYiev.i"加加w"oZ.10，441-45336.Anspach，F(xiàn).B.(2001)J!J/oc/z柳.胸/7/^j.逾Wj49，665-68137.Srhnal,S.,Surolia,N,Balasubramanian,S.,andSurolia,A.(1996)5/oc/2e77z.Z315(Pt2)，679-68638.Habicht,G.S.,Beck^G.,Benach,J.L.,Coleman,LL.,andLeichtling,K.D.(1985)J/wmmo/.134,3147-315權(quán)利要求1.如下通式A的化合物，或其藥用鹽或復合物，其中通式A的化合物包括，其中R1選自疊氮基，氨基，取代氨基，聯(lián)氨基，酰肼，氨基脲，或碳酰肼；R2選自含有1到25個碳原子的飽和或不飽和碳鏈，或含有1到25個碳原子的飽和的到不飽和的取代碳鏈；和L選自O，N，S，P或亞烷基。2.權(quán)利要求1的化合物，其中Ri選自疊氮基，氨基或酰肼；R2是含有5到20個碳原子的飽和或不飽和的碳鏈；并且L是O。3.權(quán)利要求2的化合物，其中所述化合物是化學合成的。4.權(quán)利要求1的化合物，其中L是O。5.包括權(quán)利要求l的化合物與至少一種蛋白載體的共軛物，其中權(quán)利要求1的化合物共價結(jié)合于蛋白載體。6.包括權(quán)利要求2的化合物與至少一種蛋白載體的共軛物，其中權(quán)利要求2的化合物共價結(jié)合于蛋白載體。7.權(quán)利要求5的共軛物，其中權(quán)利要求1的化合物通過W基團共價結(jié)合于蛋白載體。8.權(quán)利要求6的共軛物，其中權(quán)利要求2的化合物通過W基團共價結(jié)合于蛋白載體。9.權(quán)利要求5的共軛物，其中所述蛋白載體包含牛血清白蛋白，卵清蛋白，匙孔血藍蛋白，結(jié)核菌素純蛋白衍化物，破傷風類毒素，霍亂類毒素，白喉類毒素，綠膿假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa)類毒素，梭狀芽胞桿菌(Clostridium)類毒素，志賀毒素，乙型肝炎抗原，或伯氏疏螺旋體(Borreliaburdorferi)多肽的氨基酸序列。10.權(quán)利要求6的共軛物，其中所述蛋白載體包含牛血清白蛋白，卵清蛋白，匙孔血藍蛋白，結(jié)核菌素純蛋白衍化物，破傷風類毒素，霍亂類毒素，白喉類毒素，綠膿假單胞桿菌類毒素，梭狀芽胞桿菌類毒素，志賀毒素，乙型肝炎抗原，或伯氏疏螺旋體多肽的氨基酸序列。11.制備權(quán)利要求1的化合物的方法，其中Ri是疊氮基，L是O,所述方法包括將半乳糖基鹵素與膽固醇反應提供半乳糖基膽固醇；和將疊氮?；崤c半乳糖基膽固醇反應提供權(quán)利要求1的化合物。12.包含治療有效量的權(quán)利要求1的化合物和藥用載體的藥物組合物。13.包含治療有效量的權(quán)利要求2的化合物和藥用載體的藥物組合物。14.包含治療有效量的權(quán)利要求5的共軛物的藥物組合物。15.包含治療有效量的權(quán)利要求6的共軛物和藥用載體的藥物組合物。全文摘要本發(fā)明公開了通過施用治療有效量的糖脂到受試者而用于誘導受試者對伯氏螺旋體(Borreliaburdorferi)的免疫應答的獨特的化合物。這種施用尤其可用于防止或治療受試者的萊姆癥(Lymedisease)。所述化合物，及其治療用鹽可以配制成藥物或免疫原性的組合物。文檔編號C07JGK101195649SQ200710161290公開日2008年6月11日申請日期2004年4月2日優(yōu)先權(quán)日2003年4月2日發(fā)明者喬安娜·庫布勒-基爾布,吉爾·本-梅恩-阿凱姆,文斯·波日高伊,約翰·B·羅賓斯,雷切爾·施內(nèi)爾松申請人:美國政府健康及人類服務部