專利名稱：從黑刺菝葜植物中制備拉肖皂苷元的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從黑刺菝葜植物中制備拉肖皂苷元(laxogenin)的方法， 屬于天然產(chǎn)物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黑刺菝葜(5"冊(cè)7o^co6/m'caMtoC.H. Wright)又名短梗菝葜，是菝葜科 菝葜屬植物，生于低山灌叢或山谷河岸，主產(chǎn)于陜西、甘肅各省，廣泛分 布于北方地區(qū)，資源十分豐富。其根莖在我國(guó)北方代替威靈仙入藥，商品 上稱為"鐵絲威靈仙"、"金剛刺"、"金剛藤"等。具除風(fēng)濕、活血解毒、 鎮(zhèn)驚息風(fēng)和抗癌等功效，臨床上用于治療風(fēng)濕性腰腿病、小兒驚風(fēng)腸炎、 瘰疬，瘡癤、癌腫等病癥。在對(duì)黑剌菝葜進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分分離研究中 發(fā)現(xiàn)，黑刺菝葜主要的化學(xué)成分為含拉肖皂苷元的甾體皂苷，是制備拉肖 皂苷元極好的植物資源。
矛立肖皂苷元[(25R)-3y5-Hydroxy-5a-spirostan-6-one]，英文名為L(zhǎng)axogenin， 是一種非常重要的具有多種用途的甾體皂苷元。
(1) 拉肖皂苷元具有顯著的藥理活性，是一種治療心血管疾病和抗腫瘤 藥物的生理活性物質(zhì):①?gòu)?qiáng)烈的抑制二磷酸腺苷及血小板活化因子誘導(dǎo)的 血小板聚集活性(何祥久等，藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003,38(6): 433-437)。②顯著的抑制 cAMP磷酸二脂酶的活性(Mimaki Y等，phytochemistry， 1993,34:799)。③在體 外及肺癌體內(nèi)二階段癌發(fā)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)癌發(fā)促進(jìn)劑顯示了強(qiáng)烈的抑制活性(松 田匡由等，日木生藥學(xué)會(huì)第41回年會(huì)講演要旨集，2A-5(1994;日本扎幌)。
(2) 拉肖皂苷元是一種天然茶甾酮型油菜素內(nèi)酯類植物激素。在極低濃 度下，具有強(qiáng)烈促進(jìn)植物生長(zhǎng)和種子萌發(fā)的作用(Martin A等.J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 2001， 261—266; K. Wada等，Agric. Biol. Chem., 1984, 48, 719.)
(3)拉肖皂苷元還是一種合成薤白皂苷1和合成油菜素甾醇類植物激 素類似物的重要原料(Biao Yu等，J.Org. Chem., 2002,67 (25), 9099-9102;Martin A等.J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2001, 261—266)。
然而拉肖皂苷元是一種稀有甾體皂苷元，僅在幾個(gè)植物中發(fā)現(xiàn)含拉肖皂 苷元的甾體皂苷，只從華東菝葜(6Vm7似w'e6o/^')和薤C4〃/Mm cfe'朋ra^)中 分離出單體游離拉肖皂苷元，拉肖皂苷元多以糖苷的形式存在。由于資源 和含量限制，目前較多量的拉肖皂苷元一般是通過(guò)薯蕷皂苷元經(jīng)過(guò)多步化 學(xué)反應(yīng)合成獲取(Martin A等，J, Braz. Chem. Soc., 2005. 16GA) :381-385)。 化學(xué)合成拉肖皂苷元技術(shù)復(fù)雜，產(chǎn)率低，生長(zhǎng)成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從黑刺菝葜植物中制備拉肖皂苷元的方法。 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是，從黑刺菝葜植物中制備拉肖皂苷元。其特征在于干燥粉碎處理黑刺菝葜植物材料后，對(duì)材料利 用溶劑提取，提取溶劑為乙醇、甲醇、丙酮和水以不同比例組成的溶劑，材料與提取溶劑的重量比為1:5 20，提取溫度為10 100°C，每次提取時(shí) 間為0.5 5h，提取2 5次，合并提取液。提取液濃縮后得濃縮液或浸膏， 將濃縮液或浸膏溶于水，用弱極性或中等極性的有機(jī)溶劑如汽油、石油醚、 環(huán)己烷、正己烷、氯仿或乙酸乙酯等作為萃取劑萃取，萃取后的水相再用 與水不互溶C4 ,。的低碳醇類溶劑如正丁醇、l-戊醇、環(huán)戊醇、環(huán)己醇或異 辛醇等作為萃取劑萃取，分別濃縮回收溶劑，得萃取浸膏。通過(guò)以下兩種 途徑獲得純品拉肖皂苷元。
一是取上述弱極性或中等極性的有機(jī)萃取劑如氯仿或乙酸乙酯萃取 物，選擇非極性或弱極性大孔樹脂如HP-20、 D-101、 XDA-1、 AB-8型等樹 脂進(jìn)行純化，先用水洗柱，再用醇水體系洗脫劑洗脫，洗脫液濃縮后，經(jīng) 葡聚糖凝膠SephadexLH-20純化，氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)洗脫劑洗脫得拉肖皂 苷元。
另一種方法是取低碳醇萃取浸膏，選擇弱極性或極性大孔樹脂如D101 、 AB-8、 NKA-9等類型大孔樹脂分離純化，先用水洗柱，再用醇水體系洗脫 劑洗脫，洗脫液濃縮后制備得含拉肖皂苷元的總留體皂苷，在含拉肖皂苷
元的總甾體皂苷中加入O. 5 15倍量(g/mL)濃度為0.5 8 mol/L硫酸或 鹽酸溶液水解總皂苷，待反應(yīng)液冷卻后，濃縮除去反應(yīng)液中有機(jī)溶劑，再 用環(huán)己烷或二氯乙烷、氯仿萃取，回收溶劑，干燥得到拉肖皂苷元。 本發(fā)明具體包括下列步驟
1. 原料選擇
以黑剌菝葜(S/w7"x^^^/cawfc C.H. Wright)植物的地下部分的塊根、 須根和根莖及地上部分的莖、巻須和葉子等為提取材料。
2. 原料處理
去除原料中雜物，通風(fēng)處陰干，或10(TC以下低溫烘干，粉碎成粗粉， 干燥保存待用。
3. 拉肖皂苷元的提取
取粉碎干燥的黑剌菝葜原料，加入乙醇、甲醇、丙酮和水以不同比例 組成的溶劑浸提或回流提取，材料與提取溶劑的重量比為1:5 20，提取溫 度為10 1(XrC，每次提取時(shí)間為0. 5 5h,提取2 5次，合并提取液。 提取液濃縮后得濃縮液或浸膏，將濃縮液或浸膏溶于水，用弱極性或中等 極性的有機(jī)萃取劑如石油醚、環(huán)己烷、正己烷、氯仿或乙酸乙酯等萃取， 萃取后的水相再用與水不互溶CV^的低碳醇類萃取劑如正丁醇、l-戊醇、 環(huán)戊醇、環(huán)己醇或異辛醇等萃取，分別濃縮回收溶劑，得萃取浸膏。
4. 拉肖皂苷元的分離和純化
純品拉肖皂苷元可通過(guò)以下兩個(gè)途徑獲取 (1)純化弱極性或中等極性的有機(jī)溶劑萃取物，分離得拉肖皂苷元
取上述弱極性或中等極性的有機(jī)溶劑如氯仿或乙酸乙酯萃取物，選擇
非極性或弱極性大孔樹脂如HP-20、D-101、XDA-l、AB-8型等樹脂純化，先 用水洗柱，再用醇水體系洗脫劑洗脫，洗脫液濃縮后，經(jīng)葡聚糖凝膠柱 Sephadex LH-20柱純化，氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)洗脫劑洗脫得拉肖皂苷元。 (2)純化醇萃取物得含拉肖皂苷元的總皂苷，水解總皂苷制備拉肖皂苷元
取低碳醇萃取部分如正丁醇萃取浸膏，選擇弱極性或極性大孔樹脂如
DlOl、 AB-8、 NKA-9型等大孔樹脂分離純化，先用水洗柱，再用醇水體系洗 脫劑洗脫，洗脫液濃縮后制備得含拉肖皂苷元的總皂苷。
總皂苷中加入0.5 15倍量(g/mL)的濃度在0.5 8mol/L硫酸、鹽 酸、甲酸或醋酸等酸水溶液，酸水溶液中可加入甲醇、乙醇、二氧雜環(huán)乙烷 等助溶劑，20 10(TC水浴回流水解0.5 6h，反應(yīng)液冷卻后，減壓濃縮除 去溶劑，再用與水不相混溶的弱極性有機(jī)溶劑，如環(huán)己烷、苯、二氯乙烷 或氯仿等從水解液中萃取皂苷元，回收溶劑，干燥得拉肖皂苷元。
本發(fā)明提供的方法與化學(xué)合成拉肖皂苷元技術(shù)相比，制備工藝簡(jiǎn)單， 制作方便，技術(shù)易掌握，能耗小，主要以醇-水體系為溶劑，無(wú)環(huán)境污染， 萃取劑和洗脫劑都可回收，循環(huán)使用，提取率高，生產(chǎn)成本低。生產(chǎn)的拉 肖皂苷元可用于開發(fā)治療心血管和抗腫瘤等藥物及植物激素產(chǎn)品，也可作 為化學(xué)合成的原料。 具體實(shí)施例1
取黑刺菝葜地下根莖lkg，干燥，研磨成粗粉，加入4L70X乙醇(V/V) 溶液室溫浸提4次，每次4h，合并提取液，將濾液濃縮成浸膏，將其懸浮 于水，依次用等體積的石油醚、正丁醇分別萃取5次，分別減壓回收溶劑 得萃取物。正丁醇萃取物用去離子水溶解，按照樣品與填料1:7比例在D-101 型大孔樹脂上純化，先用去離子水洗脫除雜，直至cc-萘酚反應(yīng)檢測(cè)洗脫液 成陰性為止，然后用30%乙醇洗脫，收集該乙醇洗脫液，減壓回收乙醇， 干燥得含拉索皂苷元的總皂苷2.4g。將總皂苷溶解在12mL，濃度為2mol/L HCI (MeOH:H20=l:l)溶液中，9(TC熱水浴回流水解2h，反應(yīng)液冷卻后， 減壓濃縮除去甲醇，再用氯仿萃取，回收溶劑，N2干燥得拉肖皂苷元1.2g, 純度97%。 具體實(shí)施例2
取粉碎干燥的黑刺菝葜塊根lkg，加入5L甲醇溶劑，60。C水浴回流提 取3次，每次3h，提取3次，合并提取液，將浸膏用去離子水溶解，在 DIAIONHP-20大孔樹脂上進(jìn)行純化，按照樣品與填料1:6比例上樣，裝柱，
70%甲醇(V/V)溶液洗脫除雜后，收集80%甲醇洗脫液，干燥得2.8g總 皂苷。將總皂苷溶解在15 mL，濃度為lmol/L H2S04 (MeOH:H20= 1:1) 溶液中，8(TC熱水浴回流水解lh，反應(yīng)液冷卻后，減壓濃縮除去甲醇，再 用環(huán)己烷萃取，回收溶劑，N2干燥得拉肖皂苷元1.4g，純度96.6%。 具體實(shí)施例3
取粉碎干燥的黑刺菝葜莖lkg，加入4L丙酮，65。C水浴加熱回流提取 3次，每次2h，共提取3次，合并提取液，減壓回收丙酮，濃縮成浸膏， 將浸膏用純凈水溶解，依次用等體積的石油醚、氯仿、正丁醇萃取4次， 分別減壓回收溶劑得萃取物。氯仿萃取物經(jīng)DIAION HP-20大孔樹脂純化， 先用水洗柱，收集90%甲醇溶液洗脫液，洗脫液濃縮干燥后，經(jīng)葡聚糖凝 膠Sephadex LH-20柱純化，按氯仿:甲醇=1:1配置的洗脫劑洗脫，收集洗 脫液，干燥得拉肖皂苷元0.5g，純度96%。
可通過(guò)物理化學(xué)性質(zhì)及質(zhì)譜或波譜數(shù)據(jù)鑒定拉肖皂苷元。 性狀白色晶體(CHCb-MeOH)，可溶于氯仿、丙酮，不溶于石油醚， 365nm紫外燈下顯淡蘭色熒光。Liebermann-burchard反應(yīng)陽(yáng)性，A試劑反應(yīng) 顯黃色，對(duì)E試劑不顯色。
質(zhì)譜'EI-MS顯示w/z(rel. int.): 430[M]+(8)， 358(23)， 316(45)， 301(25)， 287(55)， 139(100)， 122(8)， 115(41)，相對(duì)分子質(zhì)量為430。譜圖中出現(xiàn)來(lái) 自螺甾垸側(cè)鏈產(chǎn)生的很強(qiáng)的139的基峰，中等強(qiáng)度的115的碎片離子峰和甾 核及甾核加E環(huán)產(chǎn)生的碎片離子離子峰358、 316、 301、 287、 122。
氫譜'H-NMR高場(chǎng)區(qū)有山峰型4個(gè)甲基尖峰信號(hào)及C-26位兩個(gè)相似氫的
化學(xué)位移(S3.50和S3.46)等特征信號(hào)。波譜數(shù)據(jù)為0.77 (3 H， s, H-18)， 0.77 (3 H, s， H-19), 0.79 (3 H， d, J 6.3, H-27), 0.97(3 H, d, J 6.7, H-21), 2.20 (1 H, dd, J 3.0， J 12.8， 5-H), 3.35(1 H, t， J 10.4, 26-Hax)， 3.48 (1 H, m， 26-Heq), 3.56 (1 H, m,3-H), 4.41 (1 H, m, 16-H)。
碳譜"C-NMR譜存在螺甾皂苷元C-22連氧碳信號(hào)S109.5、 C-16和26位 連氧碳信號(hào)S80.6和S67.0等特征信號(hào)。波譜數(shù)據(jù)為36.6(C-1)， 30.6 (C-2)， 70.5 (C-3)， 30.0 (C-4)， 56.8 (C-5)， 210.6 (C-6)， 46.7 (C-7)， 37.3 (C-8)， 53.9 (C醒9)， 40.9(C-10)， 21.3(C-11)， 39.5 (C-12)， 40.9 (C-13)， 56.5 (C-14)， 31.5(C-15)， 80.4(C-16)， 62.0 (C-17), 16.4(C-18)， 13.2 (C-19)， 41.6(020)， 14.4 (C-21)， 109.3 (C-22)， 31.3 (C-23)， 28.7 (C-24)， 30.2 (C-25)， 66.8 (C-26)， 17。1 CC-27)。
權(quán)利要求
1.從黑刺菝葜植物中制備拉肖皂苷元(laxogenin)的方法，其特征在于干燥粉碎處理黑刺菝葜植物材料后，對(duì)材料利用溶劑提取，提取溶劑為乙醇、甲醇、丙酮和水以不同比例組成的溶劑，提取液濃縮后得濃縮液或浸膏，將濃縮液或浸膏溶于水，用弱極性或中等極性的有機(jī)溶劑作為萃取劑萃取，萃取后的水相再用與水不互溶C4～10的低碳醇類溶劑作為萃取劑萃取，分別濃縮回收溶劑，得萃取浸膏。拉肖皂苷元可通過(guò)以下兩個(gè)途徑獲取取弱極性或中等極性的有機(jī)萃取劑的萃取物，選擇非極性或弱極性大孔樹脂進(jìn)行純化，用醇水體系洗脫劑洗脫，洗脫液濃縮后，經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20純化，氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)洗脫劑洗脫得拉肖皂苷元。另一種途徑是取低碳醇萃取部分如正丁醇萃取浸膏，選擇弱極性或極性大孔樹脂分離純化，用醇水體系洗脫劑洗脫，洗脫液濃縮后制備得含拉肖皂苷元的總甾體皂苷，在總甾體皂苷中加入稀酸溶液水解，濃縮除去反應(yīng)液中有機(jī)溶劑，再用與水不相混溶的弱極性有機(jī)溶劑萃取皂苷元，回收溶劑，干燥得到拉肖皂苷元。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從黑刺菝葜植物中制備拉肖皂苷元的方法，其 特征在于材料為黑刺菝葜植物地下部分的塊根、須根和根莖及地上部分的 莖、巻須和葉子等。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從黑刺菝葜植物中制備拉肖皂苷元的方法， 其特征在于原料必須干燥除雜，通風(fēng)處陰干，或10(TC以下低溫烘干，粉碎 成粗粉，干燥保存。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從黑刺菝葜植物中制備拉肖皂苷元的方法， 其特征在于提取溶劑為乙醇、甲醇、丙酮和水以不同比例組成，材料與提 取溶劑的重量比為l:5 20，提取溫度為10 10(TC，每次提取時(shí)間為0. 5 5h，提取2 5次。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從黑刺菝葜植物中制備拉肖皂苷元的方法， 其特征在于弱極性和中極性的有機(jī)溶劑萃取劑為石油醚、環(huán)己烷、正己烷、 氯仿或乙酸乙酯等，與水不互溶<formula>see original document page 2</formula>的低碳醇類萃取劑為正丁醇、1-戊醇、環(huán)戊醇、環(huán)己醇或異辛醇等。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從黑刺菝葜植物中制備拉肖皂苷元的方法， 其特征在于弱極性或中等極性的有機(jī)溶劑萃取物，選擇的非極性或弱極性大孔樹脂為HP-20、 D-101、 XDA-1、 AB-8等類型樹脂，洗脫劑為醇水體系 洗脫劑，洗脫液的純化使用Sphadex LH-20柱純化，洗脫劑為氯仿-甲醇 溶劑系統(tǒng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的從黑刺菝葜植物中制備拉肖皂苷元的方法，其 特征在于純化低碳醇醇萃取物選擇的大孔樹脂為DlOl、 AB-8、 NKA-9型等 類型的弱極性或極性大孔樹脂，洗脫劑為醇水體系。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的從黑刺菝葜植物中制備拉肖皂苷元的方法，其 特征在于總皂苷的水解加入的酸為0.5 8mol/L硫酸、鹽酸、甲酸或醋酸 等稀酸溶液，稀酸溶液中加入的助溶劑為甲醇、乙醇、二氧雜環(huán)乙烷等溶 劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的從黑刺菝葜植物中制備拉肖皂苷元的方法，其 特征在于總皂苷水解酸的加入量為0.5 15倍(g/mL)，水解溫度為20 100℃，水解時(shí)間為0.5 6h，皂苷元的萃取劑為與水不相混溶的弱極性有機(jī)溶 劑，如環(huán)己烷、苯、二氯乙烷或氯仿等。
全文摘要
本發(fā)明公開了從黑刺菝葜植物中制備拉肖皂苷元(laxogenin)的方法。對(duì)黑刺菝葜利用溶劑提取，提取物溶于水，依次用弱極性和中極性有機(jī)溶劑及與水不互溶的C_4～10低碳醇溶劑萃取得萃取物。兩種途徑獲得純品皂苷元一是取弱極性或中極性溶劑萃取物經(jīng)非極性或弱極性大孔樹脂分離，分離物經(jīng)SephadexLH-20純化，干燥得拉肖皂苷元；另一種方法是取低碳醇萃取物，經(jīng)弱極性或極性大孔樹脂制備總皂苷，總皂苷中加入稀酸水解，再用弱極性溶劑萃取，干燥得拉肖皂苷元。本法制備拉肖皂苷元，工藝簡(jiǎn)單，技術(shù)易掌握，能耗小，提取率高，純度好，生產(chǎn)成本低，為開發(fā)治療心血管和抗腫瘤藥物、植物激素產(chǎn)品及化學(xué)合成提供原料。
文檔編號(hào)C07J71/00GK101205249SQ20071019922
公開日2008年6月25日 申請(qǐng)日期2007年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月14日
發(fā)明者光 蘭, 張存莉, 瑋 朱, 熠 王, 樺 管, 蘇寶鋒, 金玉鑫 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)