專利名稱：：基于hpv-18的乳頭瘤病毒疫苗的制作方法基于HPV-18的乳頭瘤病毒疫苗本發(fā)明涉及一種組合物在制備預(yù)防或治療由除HPV-18之外的至少一種乳頭瘤病毒引起的感染或病理狀態(tài)的藥物中的用途，該組合物包含人乳頭瘤病毒(HPV)-18的一種或多種早期多肽或編碼HPV-18的一種或多種早期多肽的核酸。本發(fā)明對(duì)免疫療法具有特殊興趣，尤其是在預(yù)防或治療可能引起宮頸上皮內(nèi)瘤形成(CIN)并最終引起宮頸癌的HPV持續(xù)感染中。乳頭瘤病毒是已在很多高等生物，包括人類中鑒定到的小DM病毒(參見例如Pfister，1987，inThepapovaviridae:ThePapillomaviruses,SalzmanandHowleyedition,PlenumPress,NewYork,pl-38)。它們與良性到惡性腫瘤的病理狀態(tài)有關(guān)。在良性腫瘤中，病毒基因組是游離型的，而在惡性腫瘤中，HPVDNA被整合到宿主染色體中(Stoler，2000，Int.J.Gynecol.Path.19，16-28)。乳頭瘤病毒具有大約7900個(gè)堿基對(duì)的雙鏈環(huán)狀DNA，該DM被蛋白衣殼圍繞。該基因組包括含閱讀框El-E7的早期(E)區(qū)和晚期(L)區(qū)。晚期區(qū)編碼結(jié)構(gòu)LI和L2蛋白，它們形成病毒衣殼，而早期基因編碼主要在細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)蛋白。El編碼在病毒基因組維持和復(fù)制中重要的兩個(gè)蛋白。E2編碼調(diào)節(jié)指導(dǎo)E6和E7轉(zhuǎn)錄的病毒啟動(dòng)子的活化和阻遏蛋白(Bechtoldetal.，2003，J.Virol.77，2021-2028)。E4編碼的蛋白結(jié)合和分裂胞質(zhì)角蛋白網(wǎng)，且可能在病毒成熟中起作用。E5蛋白的作用仍有爭(zhēng)議，其在宿主染色體中病毒整合期間常常喪失表達(dá)。癌癥相關(guān)HPV基因型的E6和E7編碼的基因產(chǎn)物參與受感染細(xì)胞的致癌性轉(zhuǎn)化(Kandaetal.，1988，J.Virol.62，610-613;Vousdenetal.，1988，OncogeneRes.3，l-9jBedelletal.，1987，J.Virol.61，3635-3640),這大概是由于這些病毒蛋白分別結(jié)合細(xì)胞腫瘤抑制基因產(chǎn)物p53和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(Rb)的能力。已經(jīng)清楚地確定了參與天然HPV-16E6多肽與p53結(jié)合的氨基酸殘基是從殘基118至122(+1是第一個(gè)Met殘基，或從優(yōu)選使用的第二個(gè)Met殘基開始，從殘基111至115)(Crooketal.,1991，Cell67，547-556)，和參與天然HPV-16E7多肽與Rb結(jié)合的那些殘基位于殘基21至26(Mungeretal.，1989，EMBOJ.8，4099-4105;Hecket5al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89，4442-4446)。這種結(jié)合區(qū)在HPV-18的E6和E7中也是保守的(Pirnetal.，1994，Oncogene9，1869-1876;Hecketal.，1992，Proc,Natl.Acad.Sci.USA89，4442-4446)。目前，已經(jīng)克隆了IOO個(gè)以上人乳頭瘤病毒(HPV)基因型并進(jìn)行了測(cè)序(Stoler，2000，Int.J.Gynecol.Path19，16—28)。只有40個(gè)HPV基因型感染生殖器粘膜，其中大約15個(gè)使女性處于生殖道惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)中。更具體地說，在70°/。以上的侵入性宮頸癌中檢測(cè)到兩個(gè)最流行的基因型-HPV-16和HPV-18,而HPV-31、HPV-33和HPV-45加起來占到這種情況的10°/。(Cohenetal.，2005,Science308，618-621)。盡管存在宮頸篩選程序，但是根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)的資料，每年全世界近五十萬女性被診斷為宮頸癌和270，000以上死亡。常規(guī)方法仍然是手術(shù)和放療，但是最近15年已經(jīng)設(shè)計(jì)了新的疫苗策略，例如基于肽的疫苗(Feltkampetal.，1993，Eur.J.Immunol.23，2242-2249)、病毒樣顆粒(VLP)疫苗、DNA疫苗(Osenetal，2001，Vaccine19，4276-4286;Smaheletal.，2001，Virology281，231-238)和病毒載體疫苗(EP462,187，Daemenetal.，2000，GeneTher.7:1859-1866;Heetal.，2000，Virology270，146-161;Borysiewiczetal.，1996，Lancet347，1523-1527)。從概念上講，針對(duì)HPV疫苗有兩個(gè)方法預(yù)防性的和治療性的。預(yù)防性方法設(shè)法預(yù)防病毒感染，即在病毒穿透宿主細(xì)胞前主要通過誘導(dǎo)中和抗體來阻止病毒。通常，預(yù)防性疫苗靶向在病毒表面表達(dá)的衣殼蛋白。它們中大多數(shù)依賴于重組產(chǎn)生的LI蛋白的VLP或最流行的HPV類型的VLP混合物。Merck和GlaxoSmithKline(GSK)最近已經(jīng)報(bào)道了成功的III期臨床試驗(yàn)，在預(yù)防特殊類型宮頸癌感染中具有100%的功效。在給予HPV-16和HPV-18VLP的混合物之后，已描述了針對(duì)致癌的HPV-31和HPV-45基因型的交叉保護(hù)(WO2004/056389)。然而，預(yù)期基于VLP的預(yù)防性疫苗不能誘導(dǎo)HPV感染后發(fā)生的病理狀態(tài)逆轉(zhuǎn)。治療性方法設(shè)法治療確定的HPV感染，并主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)而誘導(dǎo)HPV相關(guān)的癌癥前期和癌癥病理狀態(tài)逆轉(zhuǎn)。通常，治療策略依賴于針對(duì)HPV誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的E6和/或E7癌蛋白的免疫作用。迄今為止，E6和E7HPV抗原提供的免疫被認(rèn)為是基因型特異性的，和目前臨床和臨床前開發(fā)的治療性疫苗主要集中于最流行的致癌HPV-16和相對(duì)較少擴(kuò)展的HPV-18。然而，理想的治療性疫苗應(yīng)該允許不僅提供針對(duì)最流行的HPV基因型的保護(hù)，而且提供針對(duì)參與仍有30%宮頸癌的其他較少HPV基因型的保護(hù)。這可以通過開發(fā)針對(duì)每種致癌HPV基因型的選擇性候選疫苗來實(shí)現(xiàn)。然而，考慮到管理當(dāng)局所需臨床和臨床前開發(fā)的成本與接觸次要HPV基因型的有限數(shù)量的患者相比，這個(gè)策略可能不是特別有吸引力。人們可以預(yù)料到由于這種感染的慢性和持續(xù)的性質(zhì)、它的高流行性和HPV誘導(dǎo)癌癥的顯著的發(fā)病率，HPV將是持續(xù)多年的嚴(yán)重的全球健康威脅因素。因此，需要開發(fā)一種提供更寬覆蓋范圍的疫苗，其能夠針對(duì)多種HPV基因型提供保護(hù)和/或治療，包括除HPV-18外的其他次要的和潛在的致癌性HPV基因型。因此，本發(fā)明代表了在改善工業(yè)化國(guó)家以及發(fā)展中國(guó)家中乳頭瘤病毒感染或乳頭瘤病毒相關(guān)惡性前和惡性損害的預(yù)防和治療方面的顯著進(jìn)步。如權(quán)利要求書中限定的實(shí)施方案解決了這個(gè)技術(shù)問題。根據(jù)下列本發(fā)明目前優(yōu)選實(shí)施方案的描述，本發(fā)明的其他和更多方面、特征和優(yōu)點(diǎn)將顯而易見。為了公開的目的給出了這些實(shí)施方案。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種組合物在制備預(yù)防或治療由除HPV-18之外的至少一種乳頭瘤病毒引起的感染或病理狀態(tài)的藥物中的用途，該組合物包含HPV-18的一種或多種早期多肽或編碼HPV-18的一種或多種早期多肽的核酸。更特別地，本發(fā)明涉及一種組合物在制備治療由除HPV-18之外的至少一種人乳頭瘤病毒引起的感染或病理狀態(tài)的藥物中的用途，該組合物包含人HPV-18的一種或多種早期多肽或編碼HPV-18的一種或多種早期多肽的核酸。本發(fā)明還涉及治療由除HPV-18之外的至少一種人乳頭瘤病毒引起的感染或病理狀態(tài)的方法，該方法包括給宿主生物施用一種組合物，該組合物包含HPV-18的一種或多種早期多肽或編碼HPV-18的一種或多種早期多肽的核酸。貫穿整個(gè)申請(qǐng)，本文所使用的術(shù)語"一個(gè)"和"一種"，除非上下文另外規(guī)定，其意思是它們意味著"至少一個(gè)(種)"、"至少第一個(gè)(種)"、"一個(gè)(種)或多種(種)"或"艮多"提及的化合物或步驟。例如，術(shù)語"一個(gè)細(xì)胞"包括包含其混合物的很多細(xì)胞。更具體地說，"至少一個(gè)(種)"和"一個(gè)(種)或多種(種)"意思是一個(gè)(種)或大于一個(gè)(種)的數(shù)字，特別優(yōu)選一個(gè)(種)、兩個(gè)(種)或三個(gè)(種)。本文無論什么地方使用的術(shù)語"和/或"包括"和"、"或"和"由所述術(shù)語連接的要素的全部或任何其他組合"的意思。本文使用的術(shù)語"大約"或"近"意思是給定值或范圍的20%以內(nèi)，優(yōu)選10°/。以內(nèi)，和更優(yōu)選5%以內(nèi)。術(shù)語"氨基酸"和"殘基"是同義詞。這些術(shù)語涉及天然、非天然和/或合成氨基酸，包括D或L光學(xué)異構(gòu)體、修飾的氨基酸和氨基酸類似物。在本文中術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白"可以互換使用，是指氨基酸殘基的聚合物，其包含由肽鍵結(jié)合的九個(gè)或更多個(gè)氨基酸。該聚合物可以是線性的、分支的或環(huán)狀的，和可以包括天然存在的和/或氨基酸類似物，且也可以被非氨基酸間斷。作為一般表示，如果氨基酸聚合物長(zhǎng)(例如50個(gè)以上氨基酸殘基)，那么優(yōu)選被稱為多肽或蛋白。在本發(fā)明的上下文內(nèi)，術(shù)語"核酸"、"核酸分子"、"多核苷酸，，和"核苷酸序列"可以互換使用，和定義多脫氧核糖核酸(DM)(例如cDNA、基因組DNA、質(zhì)粒、載體、病毒基因組、分離的DM、探針、引物和其任何混合物)或多核糖核酸(RNA)分子(例如mRNA、反義RNA)或混合的多核糖核酸-多脫氧核糖核酸的任何長(zhǎng)度聚合物。它們包括單鏈或雙鏈、線性或環(huán)狀、天然或合成多核苷酸。此外，多核苷酸可以包含非天然存在的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物(參見US5,525,711、US4,711,955或EPA302175，如修飾實(shí)例)和可以被非核苷酸成分間斷。如果存在的話，核苷酸的修飾可以在聚合前或后給予。如本文使用的術(shù)語"包含"當(dāng)用于限定產(chǎn)品、組合物和發(fā)放是，用來指該產(chǎn)品、組合物和方法包括參考化合物或步驟，但是不排除其他的。"基本上由……組成"意思應(yīng)該排除任何必需意義的其他化合物或步驟。因此，一種組合物基本上由敘述的化合物組成不會(huì)排除痕量染污物和藥物可接受載體。由......組成意思應(yīng)該排除超過微量的其他化合物或步驟的成分。例如，當(dāng)多肽除了敘述的氨基酸序列外，不含任何氨基酸時(shí)，則該多肽"由氨基酸序列組成"。當(dāng)這種氨基酸序列與僅少數(shù)(典型地約1至約50個(gè)左右另外的殘基)另外的氨基酸序列一起存在時(shí)，則該多肽"基本上由氨基酸序列組成"。當(dāng)氨基酸序列至少是多肽的最終氨基酸序列的一部分時(shí)，則該多肽"包含"氨基酸序列。這種多肽可以具有幾個(gè)直至幾百個(gè)另外的氨基酸殘基。這種另外的氨基酸殘基可以在多肽運(yùn)輸、促進(jìn)多肽生產(chǎn)或純化；尤其是延長(zhǎng)半衰期中起作用。同樣的情況可以應(yīng)用于核苷酸序列。如本文使用的術(shù)語"分離的，，是指蛋白、多肽、肽或核酸是從其自然環(huán)境中純化的或脫離了其自然環(huán)境。術(shù)語"純化的"是指蛋白、多肽、肽或核酸與其天然結(jié)合的至少一種其他成分分離。術(shù)語"宿主細(xì)胞"應(yīng)該寬泛理解，不限制組織、器官或分離的細(xì)胞中的特殊結(jié)構(gòu)。這種細(xì)胞可以是一種獨(dú)特類型的細(xì)胞或一組不同類型的細(xì)胞，和包括培養(yǎng)的細(xì)胞系、原代細(xì)胞和增殖細(xì)胞。術(shù)語"宿主生物"是指脊推動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物物種的成員，和尤其是家畜、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物和靈長(zhǎng)目動(dòng)物，包括人。"HPV"是指"人乳頭瘤病毒"。它們的分類基于它們基因組的相關(guān)性程度。目前已經(jīng)鑒定了IOO個(gè)以上HPV基因型和已經(jīng)根據(jù)它們分離的時(shí)間順序?qū)λ鼈冞M(jìn)行了編號(hào)。按照慣例，如果它們?cè)谄浠蚪M含可讀框E6、E7和L1的約2000個(gè)核苷酸長(zhǎng)的部分中享有小于90%的同一性，則兩個(gè)分離抹構(gòu)成不同的類型。根據(jù)可得到的核苷酸序列的比對(duì)建立了系統(tǒng)演化樹(VanRanstetal.，1992，J.Gen.Virol.73，2653;DeVilliersetal.，2004，Virology324，17-27)。本文使用的術(shù)語"早期多肽"是指本領(lǐng)域認(rèn)可的非結(jié)構(gòu)蛋白，優(yōu)選選自中E1、E2、E4、E5、E6和E7的多肽。在本發(fā)明上下文中，包一種或多種早期多肽來源于HPV-18(術(shù)語"來源于"是指分離、克隆、衍生或相關(guān)的。因此，根據(jù)本發(fā)明，一種或多種HPV-18早期多肽可以來源于天然HPV-18早期多肽或其衍生物。"天然HPV-18早期多肽"是指天然來源中發(fā)現(xiàn)或分離的蛋白、多肽或肽，與人工修飾的或在實(shí)驗(yàn)室人為改變的不同。這種天然來源包括生物樣品(例如感染HPV-18的患者血液、血漿、血清、陰道和宮頸液、組織切片、活組織檢查、婦科樣品)、培養(yǎng)細(xì)胞，以及重組材料(例如HPV-18病毒或基因組、基因組或cDNA文庫、含HPV-18基因組片段的質(zhì)粒、HPV-18重組早期多肽等等)。因此術(shù)語"天然HPV-18早期多肽"將包括天然存在的HPV-18早期多肽及其片段。該片段優(yōu)選是至少9個(gè)氨基酸殘基和包含至少一個(gè)免疫原性表位，特別是T表位。這種片段可以單獨(dú)或組合(例如融合)使用。文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了HPV-18早期基因/多肽的核苷酸和氨基酸序列，并且可以從專業(yè)數(shù)據(jù)庫獲得，例如Genbank登錄號(hào)分別是NC-001357和X05015。然而，天然早期HPV-18多肽不限于這些示例的序列。實(shí)際上，不同HPV-18分離林之間氨基酸序列可以變化，和這種自然范圍的遺傳變異包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。HPV-18早期多肽的衍生物包括相對(duì)于天然HPV-18早期多肽包括一種或多種修飾，例如下面限定的那些。修飾可以通過突變和/或添加化學(xué)部分(例如烷化、乙?；Ⅴ０坊?、磷酸化等等)或標(biāo)記部分而產(chǎn)生。突變包括缺失、置換或添加一種或多種氨基酸殘基或這些可能事物的任何組合。當(dāng)包括幾個(gè)修飾時(shí)，它們可以涉及連續(xù)殘基和/或非連續(xù)殘基?？梢砸员绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的很多方法進(jìn)行修飾，例如定點(diǎn)誘變(例如使用Amersham，LesUl1is，法國(guó)的Sculptor(TM)體外誘變系統(tǒng))、PCR誘變和DNA改組。有利地，修飾的HPV-18早期多肽與相應(yīng)天然HPV-18早期多肽在全長(zhǎng)氨基酸序列或其較短片段(例如長(zhǎng)度至少9、20、30、40、50、100個(gè)氨基酸)上保留高程度氨基酸序列同一性，同一性優(yōu)選大于75%，有利地大于80%、最好大于85°/。，優(yōu)選大于90%,更優(yōu)選大于95°y4，更優(yōu)選大于97%(例如100%序列同一性)。兩個(gè)多肽之間同一性百分比是序列享有相同位置數(shù)量的函數(shù)，考慮為了獲得最佳比對(duì)需要引入的缺口數(shù)量和每個(gè)缺口的長(zhǎng)度。本領(lǐng)域可以利用各種計(jì)算機(jī)程序和數(shù)學(xué)算法，以確定氨基酸序列之間同一性百分比，例如可在NCBI上得到的W2HHUSAR軟件和Blast程序(例如Altschuletal.，1997，NucleicAcidsRes.25，3389-3402;Altschuletal.，2005，F(xiàn)EBSJ,272,5101-5109)。令人期望地，根據(jù)本發(fā)明使用的修飾的HPV-18早期多肽保留天然HPV-18早期多肽的免疫原性活性，例如刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物用于治療由除HPV-18外的至少一種HPV基因型引起的HPV感染和/或病理狀態(tài)，特別是肛門與生殖道、皮膚或口腔。在一個(gè)方面，至少一種人乳頭瘤病毒的基因組與編碼E6或E7多肽的HPV-18基因組的部分享有小于90°/。，有利地小于87%和期望地小于86。/。的核苷酸序列同一性，但是與編碼E6或E7多肽的HPV-18基因組的部分享有超過50%，有利地超過55%和期望地超過60°/。的核苷酸序列同一性。優(yōu)選它與完整HPV-18E6或E7ORF享有大約61°/。到大約86。/。的核苷酸同一性。HPV基因組的各部分之間同一性百分比是兩個(gè)序列享有的相同位置的數(shù)量的函數(shù)，考慮為了獲得最佳比對(duì)需要引入的缺口數(shù)量和每個(gè)缺口的長(zhǎng)度。本領(lǐng)域可利用各種計(jì)算機(jī)程序和數(shù)學(xué)算法確定核苷酸序列之間的同一性百分比。這種HPV基因型的代表性實(shí)例包括但不限于HPV-13、HPV-18、HPV-30、HPV-32、HPV-39、HPV-40、HPV-42、HPV-44、HPV-45、HPV-51、HPV-56、HPV-59、HPV-61、HPV-64、HPV-68、HPV-70和HPV-85。優(yōu)選，除HPV-18之外的至少一種人乳頭瘤病毒選自HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV_56、HPV-59、HPV_68、HPV-70和HPV-85或其任何可能組合，特別優(yōu)選HPV-45。文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了這些HPV基因型的核苷酸和氨基酸序列并可以在專利數(shù)據(jù)庫中獲得，如表I舉例說明。表I:Genbank登錄號(hào)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的組合物包含或編碼HPV-18E6多肽、HPV-18E7多肽，或HPV-18E6多肽和HPV-18E7多肽二者。已知以上對(duì)E6和E7多肽轉(zhuǎn)化能力檢索的觀察結(jié)果，優(yōu)選使用修飾的HPV-18E6和/或E7多肽，它們分別是在與細(xì)胞腫瘤抑制基因產(chǎn)物p53和Rb相互作用中所涉及的區(qū)域發(fā)生突變的非致癌變體。本發(fā)明包括與p53結(jié)合改變或至少顯著減少的任何HPV-18E6多肽的用途和/或與Rb結(jié)合改變或至少顯著減少的任何HPV18E7多肽的用途(Pirnetal.，1994，Oncogene9，1869-1876;Hecketal.,1992，Proc.Natl.Acad，Sci.USA89，4442-4446)。適于本發(fā)明目的的非致癌HPV-18E6變體缺失了位于大約113位至大約117位的一種或多種氨基酸殘基(從天然HPV-18E6多肽的第一個(gè)甲硫氨酸殘基開始)，特別優(yōu)選完全缺失113至117位殘基(NPAEK)。最優(yōu)選的HPV-18E6多肽的非致癌變體包含與SEQIDNO:1所示氨基酸序列同源或相同的氨基酸序列，或基本上由該序列組成，或由該序列組成。適于本發(fā)明目的的非致癌HPV-18E7變體缺失了位于大約24位至大約28位的一種或多種氨基酸殘基(+l代表天然HPV-18E7多肽的第一個(gè)氨基酸)，特別優(yōu)選完全缺失24至28位殘基(DLLCH)。最優(yōu)選的HPV-18E7多肽的非致癌變體包含與SEQIDNO:2所示氨基酸序列同源或相同的氨基酸序列，或基本上由該序列組成，或由該序列組成。在優(yōu)選方面，本發(fā)明使用的一種或多種HPV-18早期多肽被進(jìn)一步修飾，以便提高I型MHC和/或1I型MHC呈遞和/或刺激抗HPV免疫。HPV-18E6和E7多肽是核心蛋白，以前已經(jīng)表明膜呈遞允許提高相應(yīng)HPV-16多肽的治療效能(參見例如W099/03885)。因此，修飾至少一個(gè)HPV-18早期多肽以便固定于細(xì)胞膜也許是適當(dāng)?shù)?。膜錨定可以通過將膜錨定序列引入，和如果天然多肽缺乏分泌序列(即信號(hào)肽)的話，將分泌序列引入HPV-18早期多肽而很容易地實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選通過引入膜錨定序列和分泌序列修飾HPV-18E6和/或E7多肽。膜錨定和分泌序列是本領(lǐng)域已知的。簡(jiǎn)言之，分泌序列存在于存在或隱匿多肽的膜的N末端并啟動(dòng)它們穿過進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。它們通常包含15至35個(gè)基本上疏水氨基酸，然后被位于ER的特異性肽鏈內(nèi)切酶除去從而得到成熟多肽。膜錨定序列性質(zhì)上通常是高度疏水的并用來將多肽固定在細(xì)胞膜上(參見例如BrandenandTooze，1991，inIntroductiontoProteinStructurep.202-214，NYGarland)。可用在本發(fā)明的上下文中的膜錨定和分泌序列的選擇廣泛。它們可以從包含它(例如細(xì)胞或病毒多肽)的任何膜錨定和/或分泌多肽獲得，例如狂犬病病毒糖蛋白、HIV病毒包膜糖蛋白或麻疹病毒F蛋白的，或可以是合成的。插入根據(jù)本發(fā)明使用的每個(gè)HPV-18早期多肽中的膜錨定和/或分泌序列可以是共同或不同的來源。分泌序列優(yōu)選的插入位點(diǎn)是翻譯起始密碼子下游的N-末端，和膜錨定序列優(yōu)選的插入位點(diǎn)是C末端，例如就在終止密碼子上游。此外，可使用接頭肽連接分泌序列和本發(fā)明使用的HPV-18早期多肽，或連接HPV-18早期多肽和膜錨定序列。接頭肽是本領(lǐng)域已知的。典型地，它們含有2至20個(gè)氨基酸，和包括丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸和/或絲氨酸。本發(fā)明使用的HPV-18E6多肽優(yōu)選通過插入麻滲病毒F蛋白的分泌和膜錨定信號(hào)而被修飾，特別優(yōu)選包含與SEQIDNO:3所示氨基酸序列同源或相同的多肽，或基本上由該序列組成，或由該序列組成的多肽。任選地或組合地，本發(fā)明使用的HPV-18E7多肽優(yōu)選通過插入狂犬病病毒糖蛋白的分泌和膜錨定信號(hào)而被修飾，特別優(yōu)選包含與SEQIDNO:4所示氨基酸序列同源或相同的多肽，或基本上由該序列組成，或由該序列組成的多肽。在另一個(gè)和更優(yōu)選方面，也可以通過使用一種或多種免疫增強(qiáng)多肽或編碼這種多肽的一種或多種核酸來提高本發(fā)明使用的組合物的治療功效。例如，將HPV-18早期多肽與多肽連接可能是有利的，例如肌釣網(wǎng)蛋白(Chengetal.，2001，J.Clin,Invest.108，669-678)、結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白70鵬70)(Chenetal.，2000，CancerRes.60，1035-1042)、泛素(Rodriguezetal.，1997，J.Virol.71，8497-8503)或細(xì)菌毒素，例如銅綠假單胞菌外毒素A的易位結(jié)構(gòu)域(ETA(dll))(Hungetal.，2001CancerRes,61，3698-3703)。作為選擇，本領(lǐng)域使用的組合物可以進(jìn)一步包含細(xì)胞因子或編碼細(xì)胞因子的核酸。適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子包括但不限于白介素(IL)-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21和IFNg，特別優(yōu)選IL-2。根據(jù)另一個(gè)和優(yōu)選實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明使用的組合物包含編碼一種或多種如上限定的HPV-18早期多肽的核酸。優(yōu)選的是編碼至少下列的核酸o包含與SEQIDNO:1所示氨基酸序列同源或相同的氨基酸序列，或基本上由該氨基酸序列組成，或由該氨基酸序列組成的HPV-18E6多肽；和o包含與SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所示氨基酸序列同源或相同的氨基酸序列，或基本上由該氨基酸序列組成，或由該氨基酸序列組成的HPV-18E7多肽。如果需要，本發(fā)明使用的核酸分子可以被優(yōu)化以使HPV-18早期多肽在特定宿主細(xì)胞或生物，例如人宿主細(xì)胞或生物中高水平表達(dá)。典型地，用哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中更經(jīng)常使用的編碼同一氨基酸的一個(gè)或多個(gè)密碼子取代相當(dāng)于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中很少使用的密碼子的一個(gè)或多個(gè)"天然"(例如HPV)密碼子來進(jìn)行密碼子優(yōu)化。這可以通過常規(guī)誘變或化學(xué)合成技術(shù)(例如產(chǎn)生合成核酸)來實(shí)現(xiàn)。沒有必要取代全部相應(yīng)于很少使用的密碼子的天然密碼子，因?yàn)榧词共糠秩〈嗫梢詫?shí)現(xiàn)表達(dá)增加。此外，可以進(jìn)行一些背離嚴(yán)格忠實(shí)于優(yōu)化密碼子的衍化以容納引入限制性位點(diǎn)。優(yōu)選，本發(fā)明使用的編碼HPV-18早期多肽的核酸是適于其在宿主細(xì)胞或生物中表達(dá)的形式，意思是編碼E6多肽的核酸序列和/或編碼E7多肽的核酸序列位于在宿主細(xì)胞或生物中表達(dá)所需的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控元件的控制下。本文使用的術(shù)語"調(diào)控元件"是指任何序列允許、有助于或調(diào)節(jié)核酸在給定宿主細(xì)胞中表達(dá)的任何序列，包括核酸或其一種衍生物(即mRNA)的復(fù)制、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯、穩(wěn)定性和/或運(yùn)輸入宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到調(diào)控元件的選擇可以取決于諸如宿主細(xì)胞、載體和期望的表達(dá)水平等因素。啟動(dòng)子特別重要，本發(fā)明包括使用指導(dǎo)核酸在很多類型宿主細(xì)胞中表達(dá)的組成型啟動(dòng)子，和僅指導(dǎo)在某些宿主細(xì)胞中表達(dá)或?qū)μ囟ㄊ录蛲獠恳蛩?例如溫度、營(yíng)養(yǎng)添加劑、激素或其他配體)作出反應(yīng)的啟動(dòng)子。文獻(xiàn)中廣泛描述了合適的啟動(dòng)子，且更具體地說人們可以引用病毒啟動(dòng)子例如RSV(魯斯氏肉瘤病毒)、SV40(猿猴病毒-40)、CMV(巨細(xì)胞病毒)和MLP(主要晚期啟動(dòng)子)啟動(dòng)子。痘病毒栽體中使用的優(yōu)選啟動(dòng)子包括但不限于牛痘啟動(dòng)子7.5K、H5R、TK、p28、pll和K1L，早期和晚期痘病毒啟動(dòng)子的嵌合啟動(dòng)子，以及合成啟動(dòng)子，例如Chakrabarti等(1997，Biotechniques23，1094-1097)、Hammond等(1997，J.VirologicalMethods66，135-138)和Kumar和Boyle(1990Virology179，151-158)描述的那些。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到控制核酸表達(dá)的調(diào)控元件可以進(jìn)一步包含用于正常啟動(dòng)、調(diào)節(jié)和/或終止轉(zhuǎn)錄(例如polyA轉(zhuǎn)錄終止序列)、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)(例如核定位信號(hào)序列)、加工(例如剪接信號(hào))、穩(wěn)定性(例如內(nèi)含子和非編碼5'和3'序列)和翻譯(例如三聯(lián)前導(dǎo)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、Shine-Dalgamo序列等等)的另外元件到宿主細(xì)胞或生物中。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明使用的核酸包括在栽體中。本文使用的術(shù)語"載體"是指病毒以及病毒(例如質(zhì)粒DM)栽體，包括染色體外的(例如游離體)、多拷貝和整合型載體(即摻入宿主染色體中的)。本發(fā)明范圍內(nèi)特別重要的是基因治療載體(即其能夠?qū)⒑怂徇f送到宿主生物中)以及在各種表達(dá)系統(tǒng)中使用的表達(dá)栽體。合適的非病毒載體包括質(zhì)粒，例如pREP4、pCEP4(Invitrogene)、pCI(Promega)、pCDM8(Seed，1987，Nature329，840)、pVAX和pgWiz(GeneTherapySystemInc;Himoudietal.，2002，J.Virol.76，12735-12746)。合適的病毒載體可以來源于各種不同的病毒(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、AAV、痘病毒、皰滲病毒、麻滲病毒、泡沫病毒等等)。本文使用的術(shù)語"病毒載體，，包括載體DNA以及其產(chǎn)生的病毒顆粒。病毒栽體可以是復(fù)制型的，或可以是喪失遺傳能力的以致成為復(fù)制缺陷型的或復(fù)制受損的。本文使用的術(shù)語"復(fù)制型的"包括選擇性復(fù)制型和有條件復(fù)制型病毒載體，其被工程改造而在特殊宿主細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)中更好或選擇性地復(fù)制。在一個(gè)方面，本發(fā)明中使用的栽體是腺病毒載體(對(duì)于綜述，參見"Adenoviralvectorsforgenetherapy",2002，EdD.CurielandJ.Douglas,AcademicPress)。它可以來源于各種人或動(dòng)物來源，和可以使用來自腺病毒血清型1直至51的任何血清型。特別優(yōu)選的是人腺病毒2(Ad2)、5(Ad5)、6(Ad6)、11(Adll)、24(Ad24)和35(Ad35)。這種腺病毒可以從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，Md.)獲得并且一直是描述它們的序列、結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)方法，允許本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用它們的很多出版物的主題(參見例如US6,133,028;US6，110，735;WO02/40665;WO00/50573;EP1016711;Vogelsetal.，52003，J.Virol.77，8263-8271)。本發(fā)明中使用的腺病毒栽體可以是復(fù)制型的。很多復(fù)制型腺病毒載體的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得的(Hernandez-Alcocebaetal.，2000，H醒nGeneTher.11，2009-2024;Nemunaitisetal.，2001，GeneTher.8，746-759;Alemanyetal.，2000，Nature0Biotechnology18，723-727)。例如，它們可以從野生型腺病毒基因組通過缺失E1ACR2結(jié)構(gòu)域(例如WO00/24408)和/或用組織、腫瘤或細(xì)胞狀態(tài)特異性啟動(dòng)子取代天然El和/或E4啟動(dòng)子而被工程改造(例如US5，998，205，W099/25860,US5，698'443，WO00/46355,W000/15820和W001/36650)。作為選擇，本發(fā)明中使用的腺病毒載體是復(fù)制缺陷型的(參見例如W094/28152;Luskyetal.，1998，J.Virol72，2022-2032)。優(yōu)選的復(fù)制缺陷型腺病毒載體是El缺陷型的(例如US6，136，594和US6，013，638),El缺失從大約459位延伸至3328或從大約459位延伸至3510(參考GeneBank中公開的人腺病毒5型的序列，登錄號(hào)M73260和Chroboczeketal.，1992，Virol.186，280-285)?？寺∧芰梢酝ㄟ^刪除腺病毒基因組的另外的部分(全部或部分非必需的E3區(qū)或其他必需的E2、E4區(qū))而進(jìn)一步提高。核酸的插入可以通過在腺病毒基因組的任何位置同源重組來進(jìn)行，如Chartieretal(1996，J.Virol.70，4805-4810)描述。例如，編碼HPV-18E6多肽的核酸可以插入取代E1區(qū)，和編碼HPV-18E7多肽的核酸可以插入取代E3區(qū)，反之亦然。在另一個(gè)和優(yōu)選方面，本發(fā)明使用的載體是痘病毒載體(參見例如Coxetal.in"VirusesinHumanGeneTherapy"EdJ.M.Hos，CarolinaAcademicPress)。它可以從痘病毒科的寸壬何成員獲得，尤其是金絲雀痘病毒、禽痘病毒和牛痘病毒，后者是優(yōu)選的。合適的牛痘病毒包括但不限于Copenhagen林(Goebeletal.，1990,Virol.179，247-266and517-563;Johnsonetal.，1993,Virol.196，381-401)、Wyeth林和高度減毒的改變的Ankara(MVA)林(Mayretal.，1975，Infection3，6-16)。MVA基因組的全序列的確定和與(I至VII)(Antoineetal.，1998，Virology244，365-396)，其任何一個(gè)都可以用來插入編碼HPV-18早期多肽的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的許多文件中描述了用于將核酸和表達(dá)所需相關(guān)調(diào)控元件插入痘病毒基因組中的基本技術(shù)(Pauletal.，2002，CancergeneTher.9，470-477;Piccinietal.，1987,MethodsofEnzymology153，545-563;US4，769，330;US4，772，848;US4,603,112;US5,100,587andUS5,179,993)。通常，人們通過病毒基因組和攜帶要插入核酸的質(zhì)粒中都存在的重疊序列間的同源重組(即期望插入位點(diǎn)的側(cè)翼)來進(jìn)行。為了使重組痘病毒仍然有活力和有感染性，優(yōu)選核酸插入痘病毒基因組的非必需位點(diǎn)。非必需區(qū)是非編碼基因間隔區(qū)或其失活或缺失不明顯損害病毒生長(zhǎng)、復(fù)制或感染的任何基因。人們還可能想到插入必需的病毒位點(diǎn)，只要病毒顆粒生產(chǎn)過程中缺陷功能被反式補(bǔ)充，例如通過使用攜帶相當(dāng)于痘病毒基因組中被刪除的那些序列的互補(bǔ)序列的輔助細(xì)胞系。當(dāng)使用Copenhagen牛痘病毒時(shí)，優(yōu)選編碼HPV-18早期多肽的核酸被插入胸苷激酶基因中(tk)(Hrubyetal.，1983，Proc.Natl.Acad.SciUSA80，3411-3415;Weiretal.，1983，J.Virol.46,530-537)。然而，其他插入位點(diǎn)也是合適的，例如血球凝集素基因中(Guoetal.，1989，J.Virol.63，4189-4198)、K1L位點(diǎn)中、u基因中(Zhouetal.，1990，J.Gen.Virol.71，2185-2190)或牛痘病毒基因組左側(cè)末端，這些情況下，文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了各種自發(fā)或工程改造的缺失(Altenburgeretal,，1989，ArchivesVirol.105，15-27;Mossetal.1981，J,Virol.40，387-395;Panicalietal.，1981，J.Virol.37，1000-1010;Perkusetal，1989，J.Virol.63，3829-3836;Perkusetal，1990，Virol.179，276-286;Perkusetal，1991，Virol.180，406-410)。當(dāng)使用MVA時(shí)，編碼HPV-18早期多肽的核酸可以插入鑒定的缺失I至VII以及D4R位點(diǎn)的任一個(gè)，但是優(yōu)選插入缺失II或III(Meyeretal.，1991，J.Gen.Virol.72，1031-1038;Sutteretal.,1994，Vaccine12，1032-1040)。當(dāng)使用禽痘病毒時(shí)，盡管認(rèn)為可以插入胸苷激酶基因內(nèi)，但是優(yōu)選編碼HPV-18早期多肽的核酸被引入位于ORF7和9之間的基因間隔區(qū)(參見例如EP314569和US5,180,675)。如上所述，本發(fā)明使用的組合物可以進(jìn)一步表達(dá)細(xì)胞因子的核酸。它可以由編碼HPV-18的一種或多種早期多肽的載體或可具有相同或不同來源的單獨(dú)載體攜帶。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及組合物的用途，該組合物包含編碼位于7.5K啟動(dòng)子下的HPV-18E6多肽，和位于7.5K啟動(dòng)子下的HPV-18E7多肽和位于H5R啟動(dòng)子控制下的人IL-2基因的MVA載體。優(yōu)選，編碼HPV-18E6多肽、HPV-18E7多肽和人IL-2的核酸插入MVA基因組的缺失III區(qū)。此外，為了保持組合物在動(dòng)物/人體內(nèi)降解和/或提高載體轉(zhuǎn)染/感染宿主細(xì)胞或生物，本發(fā)明使用的組合物可以包括一種或多種穩(wěn)定物質(zhì)，例如脂質(zhì)(例如陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)體、如W098/44143中描述的脂質(zhì))、核酸酶抑制劑、水凝膠、透明質(zhì)酸酶(W098/53853)、膠原酶、陽離子聚合物、多糖、螯合劑(EP890362)。這種物質(zhì)可以單獨(dú)或組合(例如陽離子和中性脂類)使用。包含上述核酸或栽體的有感染力病毒顆?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法生產(chǎn)。示例方法包括步驟(a)將病毒載體導(dǎo)入合適的細(xì)胞系，(b)在合適的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞系，使得允許產(chǎn)生所述有感染力的病毒顆粒，(c)從所述細(xì)胞系的培養(yǎng)物中回收產(chǎn)生的有感染力的病毒顆粒，和(d)任選純化所述回收的有感染力的顆粒。當(dāng)病毒載體是缺陷型載體時(shí)，通常在互補(bǔ)細(xì)胞系中或經(jīng)使用提供反式無功能病毒基因的輔助病毒生產(chǎn)有感染力的顆粒。例如，補(bǔ)充E1缺失腺病毒載體的合適細(xì)胞系包括293細(xì)胞(Grahametal.，1997，J.Gen.Virol.36，59-72)以及PER-C6細(xì)胞(Fallauxetal.，1998，HumanGeneTher.9，1909-1917)。適于繁殖痘病毒栽體的細(xì)胞是鳥細(xì)胞，且最優(yōu)選從受精蛋獲得的小雞胚胎制備的原代小雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)?？梢詮呐囵B(yǎng)上清液或從裂解后的細(xì)胞回收有感染力的病毒顆粒(例如通過化學(xué)方法、凍/融、滲透壓休克、mecanic休克、超聲等等)?？梢酝ㄟ^連續(xù)多輪的噬斑純化，然后使用本領(lǐng)域的技術(shù)(層析法、氯化銫或蔗糖梯度上超速離心法)而分離病毒顆粒。本發(fā)明還包括已被修飾而允許優(yōu)先靶向特定靶向宿主細(xì)胞的栽體或病毒顆粒的用途(參見例如Wickametal.，1997，J.Virol.71，8221-8229;Arnbergetal.，1997，Virol.227，239-244;Michaeletal.，1995，GeneTherapy2，660-668;WO94/10323;WO02/96939和EP1146125)。靶向載體和病毒顆粒的特征是在其表面存在能夠識(shí)別和與細(xì)胞和暴露表面的成分結(jié)合的配體，例如細(xì)胞特異性標(biāo)記(例如感染HPV的細(xì)胞)、組織特異性標(biāo)記(例如宮頸特異性標(biāo)記)，以及病毒(例如HPV)抗原。合適的配體實(shí)例包括針對(duì)HPV抗原結(jié)構(gòu)域的其抗體或片段。該配體通常遺傳插入病毒表面上存在的多肽中(例如腺病毒纖維、五鄰體、pIX或牛痘pl4基因產(chǎn)物)。本發(fā)明使用的組合物可以通過任何合適的方法生產(chǎn)，例如標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)肽合成技術(shù)(例如Bodanszky，1984inPrinciplesofpeptidesynthesis,Springer-Verlag)和在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中重組醒技術(shù)。例如，可以從含HPV的細(xì)胞、cDNA和基因組文庫、病毒基因組或已知包括它的任何現(xiàn)有載體，通過常規(guī)分子生物學(xué)或PCR技術(shù)直接分離編碼HPV-18E6和E7早期多肽的核酸。如果需要，可以通過常規(guī)誘變技術(shù)進(jìn)一步修飾它。作為選擇，本發(fā)明使用的核酸還可以以自動(dòng)方法通過化學(xué)合成產(chǎn)生(例如Edge,1981，Nature292，756;Nambairetal.，1984，Science223，1299;Jayetal.，1984，J.Biol.Chem.259，6311)中描述的從重疊合成寡核苷酸組配)而產(chǎn)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知可用于在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞生產(chǎn)HPV-18早期多肽的許多表達(dá)系統(tǒng)和將載體或有感染力的病毒顆粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明組合物的優(yōu)選用途是治療各種疾病和病理狀況，尤其是與由上列至少一種HPV基因型引起的HPV感染相關(guān)的。盡管本發(fā)明也包括預(yù)防，但是它特別是對(duì)治療有用，例如治療感染HPV的患者可能發(fā)展成的HPV持續(xù)感染、癌癥前期以及癌癥。HPV相關(guān)癌癥的實(shí)例包括宮頸癌、肛門癌和口腔癌。HPV相關(guān)癌癥前期病情是從包括1、2或3級(jí)宮頸內(nèi)上皮細(xì)胞的瘤形成(CIN)的低度到高度損害遷延而來。優(yōu)選，在根據(jù)本文描述的形式給予宿主生物時(shí)，本發(fā)明的組合物對(duì)所治療宿主生物提供治療益處。治療益處可以通過與治療前相比的很多方法證明，例如在群體水平，通過HPV感染頻率下降，典型地與HPV感染相關(guān)的病理狀態(tài)發(fā)展延緩(例如CIN損害或?qū)m頸癌發(fā)展延緩)，或在個(gè)體水平，通過HPV病毒血癥降低、和/或病毒基因表達(dá)抑制(例如表達(dá)HPVE6或E7的RNA降低)和/或臨床后果改善(例如HPV相關(guān)損害穩(wěn)定、部分或全部逆轉(zhuǎn))和/或刺激免疫系統(tǒng)引起抗HPV反應(yīng)增強(qiáng)發(fā)生，無論反應(yīng)是體液反應(yīng)或細(xì)胞反應(yīng)或二者都有(例如產(chǎn)生抗HPV抗體和/或T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫)和/或宿主生物對(duì)常規(guī)治療的反應(yīng)改善。例如，當(dāng)給予HPV陽性女性時(shí)，根據(jù)本發(fā)明使用的組合物提供益處，(i)一次或多次陽性檢測(cè)后，HPV檢測(cè)結(jié)果陰性，(ii)高度CIN2/3損害逆轉(zhuǎn)至低度CIN1或(iii)侵入性宮頸癌穩(wěn)定或逆轉(zhuǎn)。推薦治療后常規(guī)隨訪患者最少6個(gè)月以上?？梢詼y(cè)定生物流體(例如陰道或?qū)m頸流體、血液、血清、血漿)、使用常規(guī)宮頸取樣裝置收集的婦科樣品、組織切片和活組織檢查中HPV的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用各種方法評(píng)價(jià)樣品中HPVDNA和RNA的存在，例如LiPA系統(tǒng)(W099/14377;LaboBiomedicalproducts,Netherlands)、PreTectHPVProofer(NorChipAS，Norway)、HybridCaptureII系統(tǒng)(DigeneCorp，USA)、ThinPrep系統(tǒng)(CytycCorporate;Marlborough,MA)和PCR/RT-PCR系統(tǒng)。合適的引物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或可以根據(jù)感興趣HPV基因型的核苷酸序列而容易地合成。人們也可以使用合適的抗體用免疫原性試驗(yàn)(例如ELISA)來進(jìn)行。HPV誘發(fā)的損害逆轉(zhuǎn)或穩(wěn)定可以通過測(cè)定一段時(shí)間內(nèi)損害的實(shí)際大小來確定。可以使用直接觀察法(例如陰道鏡檢查)、放射成像法、免疫成像法或超聲來估計(jì)損害隨著時(shí)間改變的大小。此外，為了預(yù)測(cè)宿主生物中HPV相關(guān)損害的穩(wěn)定或逆轉(zhuǎn)，可以使用各種體外方法，例如細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)分析，以評(píng)估不正常細(xì)胞的存在?？笻PV免疫反應(yīng)的刺激可以通過很多常規(guī)技術(shù)來估計(jì)，例如如下在該組合物用于誘導(dǎo)或刺激免疫反應(yīng)方面描述的那些。適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包含藥物可接受載體以提供藥物組合物。本文使用的"藥物可接受載體"旨在包括與藥物給藥相容的任何和所有載體、溶劑、稀釋劑、賦形劑、助劑、分散劑、包衣、抗菌劑、抗真菌劑和吸收延遲劑等等。組合物中包括的藥物可接受栽體還應(yīng)該允許保持它在制造和長(zhǎng)期保存(即至少一個(gè)月)條件下在水凍(例如-70x:、-20x:)、冷藏(例如4t:)或環(huán)境溫度(例如2ox:)或凍干狀態(tài)下的穩(wěn)定性。為了適于生理或略堿性pH下(例如大約pH7至大約pH9之間)供人使用，適當(dāng)?shù)鼐彌_本發(fā)明使用的組合物。合適的緩沖液包括但不限于磷酸鹽緩沖液(例如PBS)、碳酸氫鹽緩沖液和/或Tris緩沖液。此外它可以包含適于人或動(dòng)物使用的稀釋劑。這種稀釋劑優(yōu)選是等滲、低滲或弱高滲的，并且具有相對(duì)低的離子強(qiáng)度。代表性的實(shí)例包括無菌水、生理鹽水(例如氯化鈉)、林格氏溶液、葡萄糖、海藻糖或蔗糖溶液、Hank's溶液及其他生理平衡鹽水溶液(參見例如最近的版本Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,A,Gennaro該組合物還可以含有提供期望的藥物或藥物動(dòng)力特性的其他藥物可接受賦形劑，包括例如改變或維持滲透壓度、粘性、透明度、顏色、無菌、穩(wěn)定性、制劑的溶解速度，改變或維持釋放或吸收入人或動(dòng)物體，促進(jìn)通過血液屏障轉(zhuǎn)運(yùn)或滲透入特定的器官(例如肝)。合適的賦形劑包括氨基酸。此外，該組合物可以與適于在人的全身或粘膜應(yīng)用的常規(guī)佐劑組合。該組合物可以通過各種給藥方式給予宿主生物，包括全身、局部和定位給予。合適的給藥途徑包括但不限于皮下、真皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹內(nèi)、腫瘤內(nèi)、血管內(nèi)和動(dòng)脈內(nèi)注射?？梢杂贸Ｒ?guī)注射器和針，或本領(lǐng)域可利用的任何其他合適裝置進(jìn)行注射。作為選擇，可以通過粘膜途徑給予組合物，例如口/消化道、鼻、氣管內(nèi)、肺內(nèi)、陰道內(nèi)或肛門內(nèi)途徑。也可以使用透皮方法(例如貼劑等等)進(jìn)行局部化給藥。在本發(fā)明的上下文中，肌內(nèi)和皮下給藥構(gòu)成優(yōu)選途徑?？梢詥蝿┝炕蛞砸惶斓揭荒觊g變化的一定時(shí)間間隔重復(fù)一次或數(shù)次的劑量進(jìn)行給藥。最好，間隔是一周至一月。適當(dāng)?shù)膭┝靠梢愿鶕?jù)各種參數(shù)的作用改變，尤其是給藥方式；所使用的組合物；宿主生物的年齡、健康和體重；癥狀的性質(zhì)和程度；同時(shí)進(jìn)行的治療類型；治療的頻率；和/或預(yù)防或治療的需要。專業(yè)人員可以根據(jù)有關(guān)情況常規(guī)進(jìn)一步細(xì)化測(cè)定適當(dāng)劑量所需的計(jì)算。作為一般的指導(dǎo)，含牛痘組合物的合適劑量從大約104至109pfu(噬斑形成單位)變化，期望從大約105至108pfu，而含腺病毒的組合物從大約105至1013iu(感染單位)變化，期望從大約107至1011iu?；谳d體質(zhì)粒的組合物可以以10pg至20mg的劑量給予，有利地lOOMg至2mg。蛋白組合物可以以10ng至20mg的劑量給予，特別優(yōu)選每公斤體重大約0.lMg至大約2mg的劑量。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的組合物包含上述MVA栽體，并以5xl05pfu至5xl07pfu的三個(gè)劑量每隔一星期通過皮下途徑給予。如果期望，本發(fā)明的應(yīng)用可以與一種或多種常規(guī)治療形式(例如放療、化療和/或手術(shù))一起進(jìn)行。多種治療方法對(duì)患者提供了廣泛的干預(yù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以在HPV相關(guān)損害手術(shù)切除(例如宮頸錐切術(shù))之前，或優(yōu)選在其后。在另一個(gè)實(shí)施方案中，它可以在放療(例如Y輻射)之前或之后。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地制定適當(dāng)?shù)姆暖熞?guī)程和可以使用的參數(shù)(參見例如PerezandBrady,1992，PrinciplesandPracticeofRadiationOncology,2ndEd.JBLippincottCo;使用對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的適當(dāng)改變和改進(jìn))。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法或應(yīng)用與含有常規(guī)用來治療或預(yù)防HPV感染、HPV相關(guān)病理狀態(tài)的一種或多種藥物的化療聯(lián)合。該組合物還可以與其他HPV多肽聯(lián)合使用，例如HPV-16的一種或多種早期多肽，期望地優(yōu)選如本領(lǐng)域所述修飾為非致癌性和膜呈遞的HPV-16E6和/或E7多肽(參見WO99/03885)。這種包含HPV-16和HPV-18的E6和/或E7多肽或編碼HPV-16和HPV-18的E6和/或E7多肽的核酸的組合物尤其可以用于治療由除了HPV-16和HPV-18之外的至少一種乳頭瘤病毒引起的感染或病理狀況，例如除HPV-39、HPV-45HPV-51、HPV-56、HPV-59、HPV-68、HPV-70和HPV-85任一種之外的HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-52、和HPV-58中任一種，或其任何組合(例如HPV-31和HPV-45)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，按照初次加強(qiáng)治療形式進(jìn)行本發(fā)明的應(yīng)用，該形式包括連續(xù)給予一種或多種致敏組合物和一種或多種加強(qiáng)組合物。典型地，致敏和加強(qiáng)組合物使用包含或編碼至少共同免疫原性結(jié)構(gòu)域的不同載體。致敏組合物初次給予宿主生物和在一天至十二個(gè)月內(nèi)變動(dòng)的一段時(shí)間將加強(qiáng)組合物隨后給予。此外，可以在相同部位或可替換部位通過相同途徑或通過不同給藥途徑給予致敏和加強(qiáng)組合物。例如，可以通過粘膜途徑給予基于HPV-18早期多肽的致敏組合物，而優(yōu)選注射基于核酸栽體的加強(qiáng)組合物，例如皮下注射MVA載體，肌內(nèi)注射DM質(zhì)粒和腺病毒載體。本發(fā)明還涉及一種組合物誘導(dǎo)或刺激針對(duì)除HPV-18之外的至少一種人乳頭瘤病毒的免疫反應(yīng)的用途，該組合物包含HPV-18的一種或多種早期多肽或編碼HPV-18的一種或多種早期多肽的核酸。本發(fā)明還涉及在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)或刺激針對(duì)除HPV-18之外的至少一種人乳頭瘤病毒的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給該哺乳動(dòng)物施用一種組合物，該組合物包含HPV-18的一種或多種早期多肽或編碼HPV-18的一種或多種早期多肽的核酸。優(yōu)選該免疫反應(yīng)是針對(duì)HPV早期多肽的細(xì)胞免疫反應(yīng)，優(yōu)選CD4+、CD8+,或CD4+和CD8+介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。可以使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的各種測(cè)定法在體外或體內(nèi)評(píng)價(jià)給予動(dòng)物或人體時(shí)誘導(dǎo)或刺激抗HPV免疫反應(yīng)的能力。評(píng)價(jià)免疫反應(yīng)開始和刺激的可利用的技術(shù)的一般描述，參見例如Coligan等(1992and1994，CurrentProtocolsinImmunology;edJWiley&SonsInc，NationalInstituteofHealth)。細(xì)胞免疫的測(cè)量可以通過下述進(jìn)行，測(cè)量活化效應(yīng)細(xì)胞包括來源于CD4+和CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子譜(例如通過ELIspot定量產(chǎn)生IL-IO或IFNg的細(xì)胞)，測(cè)定免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化狀態(tài)(例如通過經(jīng)典的[311]胸苷攝取進(jìn)行的T細(xì)胞增殖測(cè)定)，測(cè)定致敏受試者中的抗原特異性T淋巴細(xì)胞(例如細(xì)胞毒性測(cè)定中的肽特異性裂解)，例如通過51Cr釋放測(cè)定確定的淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤活性。可以通過抗體結(jié)合和/或竟?fàn)幗Y(jié)合(參見例如Harlow，1989，Antibodies,ColdSpringHarborPress)或通過體外產(chǎn)生腫瘤特異性抗體介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制來確定刺激體液反應(yīng)的能力(Gazitetal.，1992，CancerImmunol.Immunother35，135-144)。還可以在用適當(dāng)?shù)哪[瘤誘導(dǎo)劑(例如表達(dá)HPV-18E6和E7的TCI細(xì)胞)攻擊的動(dòng)物模型中測(cè)定抗腫瘤活性從而進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明的方法，反映了誘導(dǎo)或刺激抗-HPV免疫反應(yīng)。已經(jīng)以說明性方式描述了本發(fā)明，應(yīng)理解所使用的術(shù)語旨在具有描述的詞語的性質(zhì)，而不是限制。顯而易見，根據(jù)上述教導(dǎo)可能對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種改進(jìn)和改變。因此應(yīng)理解在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)，可以用與本文具體描述的方式不同的方式實(shí)施本發(fā)明。以上引用的全部專利、出版物和數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目以其整體具體地引入本文作為參考，達(dá)到如同每篇單獨(dú)的該專利、出版物或項(xiàng)目具體和逐一被指出而引入作為參考的程度。下列實(shí)施例用來舉例說明本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1:表達(dá)HPV-18E6和E7多肽的病毒的構(gòu)建根據(jù)Maniatis等(1989,LaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarborNY)詳述的普通遺傳工禾呈和分子克隆技術(shù)或當(dāng)使用商業(yè)試劑盒時(shí)根據(jù)廠家的建議進(jìn)行如下所述的構(gòu)建。PCR擴(kuò)增技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見例如PCRprotocols-Aguidetomethodsandapplications,1990，publishedbyInnis，Gelfand，SninskyandWhite,AcademicPress)。根據(jù)本領(lǐng)域上面引用文件種的常規(guī)技術(shù)和Mackett等(1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79，7415-7419)和Mackett等(1984，J.Virol.49，857-864)實(shí)施重組牛痘病毒的構(gòu)建。使用大腸桿菌的選擇基因gpt(黃噪呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)(FalknerandMoss,1988，J.Virol.621849-1854)利于重組牛痘病毒的選擇?？梢匀鏦099/03885和US6，884，786(描述了表達(dá)HPV-16E6和E7多肽的膜錨定和非致癌變體的MVATG8042)描述構(gòu)建表達(dá)HPV-18E6和E7多肽的膜錨定和非致癌變體的重組MVA病毒(E6"MF和E7*TMR)。優(yōu)選，兩條HPV-18基因序列都位于p7.5K啟動(dòng)子控制下并插入MVA基因組的ni切除區(qū)。如果構(gòu)建體包括免疫增強(qiáng)基因，優(yōu)選給予由H5R啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的IL-2基因。所產(chǎn)生的構(gòu)建體命名為MVA-HPV-18。可以根據(jù)常規(guī)方法在CBF細(xì)胞中產(chǎn)生MVA-HPV-18的病毒顆粒。病毒原液保持在-80^C直到注射那天?？焖偃诮獠《緫乙?，和為了得到100pl體積中5xl07pfu的病毒劑量，給藥前在合適的緩沖液中稀釋，該緩沖液含有例如Tris-HCl10mMpH8，蔗糖5%(w/v)，和50mMNaCl。實(shí)施例2:HPV-18E6和E7多肽提供的交叉反應(yīng)性可以在從如下所述用MVATGHPV-18免疫的小鼠獲得的脾細(xì)胞上進(jìn)行IFNgELISP0T試驗(yàn)，估計(jì)交叉反應(yīng)性。使用HUSAR多序列比對(duì)程序(CLUSTAL)(https://genius,embnet,dkfz-heidelberg.de/menu/cgi-bin/w2h/w2h.start)比對(duì)來自不同HPV基因型的E6和E7氨基酸序列。.dcrt.nih.gov/molbio/hlabind/)上可得到的BIMAS肽結(jié)合軟件鑒定預(yù)測(cè)的T細(xì)胞識(shí)別肽(H2b限制)。結(jié)合得分等于或超過用本領(lǐng)域描述的參照肽荻得的得分的被E7特異性CTL識(shí)別的肽將凈皮進(jìn)一步分析。選擇相對(duì)于HPV-18E6和E7多肽氨基酸序列顯示出一個(gè)或兩個(gè)氨基酸差異的多肽進(jìn)行這種交叉反應(yīng)性分析?？梢酝ㄟ^常規(guī)合成技術(shù)合成所選擇的肽，并可以如下測(cè)定它們與從HPV-18E6和E7多肽免疫小鼠得到的脾細(xì)胞交叉反應(yīng)的能力。從商業(yè)供應(yīng)商獲得SPF健康雌性C57B1/6小鼠并在控制條件(單獨(dú)的、獨(dú)占的房間，有空調(diào)以提供最少每小時(shí)ll次空氣變換，溫度和相對(duì)濕度范圍分別在18匸至221C和40至70%以內(nèi)。光源自動(dòng)控制以產(chǎn)生12小時(shí)白天和12小時(shí)黑夜的周期。貫穿本研究，提供隨意可得的食物和水)下飼養(yǎng)。從商業(yè)供應(yīng)商獲得并在上述限定條件下飼養(yǎng)的七周齡無特殊病原體(SPF)C57B1/6雌性小鼠可以在第0、7和14天用5xl07pfu的MVATGN33或MVATGHPV-18皮下免疫3次。優(yōu)選每次在動(dòng)物右側(cè)的不同部位進(jìn)行皮下注射。在最后一次免疫后的第24天取出脾臟。可以使用本領(lǐng)域常規(guī)方法制備新鮮脾細(xì)胞?？梢杂煤?|ig/ml大鼠抗小鼠IFNg單克隆抗體(克隆R4-6A2;Pharmingen，目錄號(hào)551216,100p1/孔)的碳酸鈉緩沖液包被96孔硝化纖維素板。該板可以在4匸孵育過夜或37匸孵育1小時(shí)。板可以用DMEM10%FCS洗滌三次，并用100jalDMEM10%FCS/孔在37^C浸透2小時(shí)。脾細(xì)胞可以以106細(xì)胞/100|^1的濃度鋪板?？梢韵蚩字刑砑訚舛葹?U/50jLil/孔的IL-2(R&DSystems;10ng/ml)。通常使用伴刀豆球蛋白A作為陽性對(duì)照(5jug/ml)?？梢院铣深A(yù)測(cè)的帶有T表位的肽，并以10mg/ml提供于DMS0中，4'C保存。使用HPV-18參照肽作為陽性對(duì)照和不相關(guān)肽作為陰性對(duì)照?？梢韵蚩字刑砑訚舛葹?jLig/ml的肽并在37匸，5%0)2下孵育48小時(shí)。用lxPBS洗滌一次和用0.05%PBS-吐溫洗滌五次后，可以添加濃度為0.3/ag/lOOn1/孔的生物素化的抗小鼠IFNg(克隆XMG1.2,Pharmingen)并在室溫下緩慢攪動(dòng)孵育2小時(shí)。板用0.05%PBS-吐溫洗滌5次。還可以向孔中添加以1/5000稀釋于0.05n/。PBS-吐溫-FCSlM中的ExtravidinAKP(Sigma,St.Louis，MO)(100ja1/孑L)。該板在室溫下孵育45分鐘，然后用0.05%PBS-吐溫洗滌5次。用Biorad試劑盒可以揭示IFNg分泌。每孔可以添加100p1底物(NBT+BCIP)并將板留在室溫下0.5小時(shí)。該板可以用水洗滌并在室溫下干燥過夜。可以使用ElispotreaderBioreader4000Pro-X(BIOSYS-Gmbh'，SerlaboFrance)計(jì)數(shù)斑點(diǎn)?？梢灶A(yù)期在HPV-18參照肽存在下的免疫脾細(xì)胞培養(yǎng)物刺激IFNg產(chǎn)生，而在脾細(xì)胞培養(yǎng)物中添加非交叉反應(yīng)肽(諸如不相關(guān)肽)沒有明顯的作用(IFNg的產(chǎn)生低于基礎(chǔ)水平)。當(dāng)非HPV-18肽被免疫小鼠的CTL識(shí)別時(shí)顯示交叉反應(yīng)性，提示用HPV-18E6和/或E7多肽或表達(dá)載體(例如MVATGHPV-18)接種也可以有效治療其他的HPV基因型感染。權(quán)利要求1.一種組合物在制備預(yù)防或治療由除HPV-18之外的至少一種乳頭瘤病毒引起的感染或病理狀態(tài)的藥物中的用途，該組合物包含HPV-18的一種或多種早期多肽或編碼HPV-18的一種或多種早期多肽的核酸。2.—種組合物在制備治療由除HPV-18之外的至少一種人乳頭瘤病毒引起的感染或病理狀態(tài)的藥物中的用途，該組合物包含HPV-18的一種或多種早期多肽或編碼HPV-18的一種或多種早期多肽的核酸。3.—種組合物在誘導(dǎo)針對(duì)除HPV-18之外的至少一種人乳頭瘤病毒的免疫反應(yīng)中的用途，該組合物包含HPV-l8的一種或多種早期多肽或編碼HPV-18的一種或多種早期多肽的核酸。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的用途，其中所述除HPV-18之外的至少一種人乳頭瘤病毒選自HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-56、HPV-59、HPV-68、HPV-70和HPV-85。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的用途，其中所述HPV-18的一種或多種早期多肽是E6多肽、E7多肽，或E6多肽和E7多肽。6.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中所述HPV-18E6和/或E7多肽是非致癌變體。7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述HPV-18E6多肽的非致癌變體包含與SEQIDNO:1所示氨基酸序列同源或相同的氨基酸序列。8.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述HPV-18E7多肽的非致癌變體包含與SEQIDNO:2所示氨基酸序列同源或相同的氨基酸序列。9.根據(jù)權(quán)利要求5至8的任一項(xiàng)的用途，其中所述HPV-18E6和/或E7多肽是修飾的，以致通過摻入膜錨定序列和分泌序列而固定于細(xì)胞膜。10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中所述膜錨定序列和/或分泌序列是從狂犬病病毒糖蛋白、HIV病毒包膜糖蛋白或麻滲病毒F蛋白獲得的。11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中所述HPV-18E6多肽包含與SEQIDNO:3所示氨基酸序列同源或相同的氨基酸序列。12.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中所述HPV-18E7多肽包含與SEQIDNO:4所示氨基酸序列同源或相同的氨基酸序列。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物進(jìn)一步包含細(xì)胞因子或編碼細(xì)胞因子的核酸。14.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其中所述細(xì)胞因子是IL-2。15.根據(jù)權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)的用途，其中所述編碼一種或多種HPV-18早期多肽的核酸包括在栽體中。16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中所述載體是牛痘病毒。17.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，其中所述牛痘載體是MVA載體。18.根據(jù)權(quán)利要求17的用途，其中所述MVA載體包含位于7.5K啟動(dòng)子下的編碼HPV-18E6多肽的核酸，和位于7.5K啟動(dòng)子下的編碼HPV-18E7多肽的核酸和位于H5R啟動(dòng)子控制下的人IL-2基因。19.根據(jù)權(quán)利要求18的用途，其中所述編碼所述HPV-18E6多肽、所述HPV-18E7多肽的核酸和所述人IL-2基因插入MVA基因組的缺失III區(qū)。20.根據(jù)權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)的用途，其中所述病理狀態(tài)是HPV持續(xù)感染、癌癥前期或癌癥。21.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中所述HPV相關(guān)癌癥是宮頸癌、肛門癌或口腔癌。22.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中所述HPV相關(guān)癌癥前期病情是1、2或3級(jí)宮頸上皮內(nèi)瘤形成(CIN)。23.根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物通過皮下或肌內(nèi)途徑給予。24.根據(jù)權(quán)利要求20至23任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物以包含5xl05pfu至5xl07pfu牛痘栽體的劑量給予。25.根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其中所述組合物包含權(quán)利要求17，18或19限定的MVA栽體，和以5xl05pfu至5xl07pfu的三個(gè)劑量通過皮下途徑每隔一星期給予。全文摘要本發(fā)明涉及一種組合物在制備預(yù)防或治療由除HPV-18之外的至少一種乳頭瘤病毒引起的感染或病理狀態(tài)的藥物中的用途，該組合物包含人乳頭瘤病毒(HPV)-18的一種或多種早期多肽或編碼HPV-18的一種或多種早期多肽的核酸。本發(fā)明對(duì)免疫療法具有特殊興趣，尤其是在預(yù)防或治療可能引起宮頸上皮內(nèi)瘤形成(CIN)并最終引起宮頸癌的HPV持續(xù)感染方面。文檔編號(hào)C07K14/025GK101426810SQ200780014385公開日2009年5月6日申請(qǐng)日期2007年4月17日優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日發(fā)明者R·魯克,S·保爾申請(qǐng)人:特朗斯吉恩股份有限公司