專利名稱：：Betv1特異性抗體及其在預(yù)防和治療Betv1誘導(dǎo)的疾病中的用途的制作方法Betv1特異性抗體及其在預(yù)防和治療Betv1誘導(dǎo)的疾病中的用途本發(fā)明涉及用于治療和預(yù)防過敏原引起的疾病的抗體和藥物組合物。幾乎100,000，000個過敏病人被主要樺樹(白樺，Betulaverrucosa)花粉過敏原Betv1致敏，其為17kDa的蛋白，存在于屬于殼斗目(Fagales)的樹的花粉中并廣泛分布于歐洲、北美洲、俄羅斯和澳大利亞(Breiteneder等人，1989)。編碼Betv1的cDNA已被分離(Breiteneder等人，1989)。相當(dāng)于天然Betv1野生型的重組Betv1在大腸桿菌(Escherichiacoli)中被表達(dá)(Valenta等人，1991;Ferreim等人，1993)。對樹花粉和食物過敏的病人的IgE抗體對Betvl的識別平均為大約95%，他們中的幾乎60%專門被Betv1致敏(Jarolim等人，1989)，而過敏原的識別依賴于構(gòu)象的表位，因此需要折疊的分子。由于以前的體外和體內(nèi)的廣泛描述，重組Betv1分子經(jīng)常被用于診斷和治療目的(Valenta等人，1995，1996)。近來，生產(chǎn)出了主要樺樹花粉過敏原的非致敏的表面暴露的肽，被鑒定為大小(25-32個氨基酸)足以誘導(dǎo)體內(nèi)抗體反應(yīng)(活性免疫)的肽。這些肽缺少折疊和過敏原性活性。但是，肽疫苗誘導(dǎo)了多克隆Betvl特異性IgG的產(chǎn)生(Focke等人，2004)。WO94/10194涉及源自殼斗目的樹的肽。在EP1219300中描述了過敏原衍生物在生產(chǎn)用于治療過敏癥的藥物中的用途。本發(fā)明的目標(biāo)是提供治療和預(yù)防樺樹花粉過敏原Betv1或其片段引起的過敏性反應(yīng)的方式和方法。因此，本發(fā)明涉及一種抗體或其衍生物在生產(chǎn)一種用于個體的被動免疫的藥物中的用途，該被動免疫用于治療和/或預(yù)防所述個體中因暴露于樺樹花粉過敏原而引起的過敏性反應(yīng)，其中該抗體結(jié)合至Betv1片段，其包含30-59個氨基酸(SEQIDNo.l)或75-104個氨基酸(SEQIDNo.2)。令人驚奇的是，結(jié)合至BetV1片段的抗體或其衍生物能夠特異性地結(jié)合至樺樹花粉過敏原Betv1，并且這種分子可用于抑制Betv1特異性IgE與所述樺樹花粉過敏原的結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明，抗體與表位的結(jié)合在Betv1的主要IgE結(jié)合位點和/或過敏原構(gòu)象修飾的內(nèi)部或與其緊密相關(guān)，以致IgE表位或僅其一部分對IgE來說不再是可接近的，導(dǎo)致IgE與所述過敏原的結(jié)合降低或甚至完全降低。實驗數(shù)據(jù)表明帶有不同的表位特異性的兩個肽-特異性抗體的混合物不會產(chǎn)生較強的對IgE結(jié)合的抑制，這表明-一個抗體改變過敏原的構(gòu)象可抑制第二個抗體(也是IgE)與所述過敏原的結(jié)合。為了生產(chǎn)抗體，各種宿主動物可通過注射Betv1抗原或其片段來免疫，特別是Betvl片段，其由氨基酸30-59(SEQIDNo.l)或氨基酸75-104(SEQIDNo.2)所組成。這些宿主動物可能包括例如豬、兔、小鼠、山羊和大鼠。最優(yōu)選的多克隆抗體分離自人類個體。這種抗體的使用減少了免疫系統(tǒng)對來自抗原的"外源"抗體反應(yīng)的風(fēng)險。抗體可分離自這些動物的血清。根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可制成靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、表皮下和局部使用。獲得這些制劑的程序?qū)夹g(shù)人員來說是己知的。當(dāng)然根據(jù)本發(fā)明也可以直接從暴露于Betv1過敏原的人類個體分離針對Betv1片段的抗體。從人類個體分離Betv1特異性抗體可由本領(lǐng)域已知的方法獲得。這里所用的"抗體"是指完整的免疫球蛋白或通過例如各種肽酶消化或者重組而由其產(chǎn)生的片段。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明，一個分子，其包含與融合至其它蛋白或其片段的免疫球蛋白結(jié)合的抗原，也是本發(fā)明所指的抗體。"抗原結(jié)合區(qū)域"是指免疫球蛋白分子參與抗原結(jié)合的部分。抗原結(jié)合區(qū)域由重鏈和輕鏈可變區(qū)的N末端氨基酸殘基形成。因此術(shù)語"抗體"是指，但不限于Fab，(例如通過胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)二硫鍵下消化一個抗體而產(chǎn)生的或通過重組方法產(chǎn)生的)，單鏈抗體(作為單多肽鏈存在的抗體)，更優(yōu)選的單鏈Fv抗體(scFV)，其中一條可變重鏈和一條可變輕鏈被連起來(直接地或通過肽連接子)以形成連續(xù)肽、嵌合分子、人源化分子等等。本發(fā)明的抗體也包括通過化學(xué)、重組DNA技術(shù)、酶法修飾的衍生物，導(dǎo)致例如"技術(shù)修飾的抗體"例如合成抗體、嵌合或人源抗體，或其混合物，或抗體片段，其缺少部分或完全缺少恒定區(qū)，例如Fv、Fab、Fab，或F(ab)'2等。在這些技術(shù)修飾的抗體中，例如例如，輕鏈和/或重鏈的一部分或幾部分可被取代。這些分子可能包括例如由一條人源化重鏈和一條未修飾輕鏈(或嵌合輕鏈)組成的抗體、或反之亦然。術(shù)語Fv、Fc、Fd、Fab、Fab，或F(ab)2在現(xiàn)有文獻(xiàn)中有描述(HarlowE.禾口LaneD.,在"Antibodies,AlaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratory,1988)。本文中的抗體的"衍生物"是指蛋白質(zhì)分子，其包括與本發(fā)明所述的全長抗體相關(guān)的一個或多個功能性活性。因此，根據(jù)本法明的衍生物也能夠結(jié)合至Betv1片段，其包含氨基酸30-59(SEQIDNo.l)或氨基酸75-104(SEQIDNo.2)。本發(fā)明的抗體也包括經(jīng)修飾的衍生物，即通過任何類型的分子與抗體的共價連接。例如，但不限于，抗體衍生物包括經(jīng)過以下修飾的抗體，例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、由已知保護(hù)/封閉基團(tuán)衍生、蛋白水解切割、與細(xì)胞配體或其它蛋白相連等。任何的各種化學(xué)修飾可通過已知技術(shù)來實現(xiàn)，包括但不限于特定化學(xué)切割、乙?；?、甲?；⒁旅顾氐拇x合成等。另外，衍生物可能含有一個或多個非經(jīng)典氨基酸。根據(jù)本發(fā)明所述的衍生物可能也包含片段，其仍能夠結(jié)合Betvl片段，其包含氨基酸30-59(SEQIDNo.l)或氨基酸75-104(SEQIDNo.2)。(例如本發(fā)明所述的抗體的CDR區(qū)域)。根據(jù)本發(fā)明所述的抗體優(yōu)選為單克隆抗體。這些抗體，其為針對特定抗原的抗體的均一群體，可通過任意技術(shù)獲得，其可通過培養(yǎng)的持續(xù)細(xì)胞系生產(chǎn)蛋白。這些包括，例如，K5hler和Milstein的雜交瘤技術(shù)(1975，Nature256:495-497和美國專利號4,376,110)，人類B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等人，1983，ImmunologyToday4:72;Cole等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:2026-2030)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等人，1985，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,Inc.，77-96頁)。這些抗體可以是任何免疫球蛋白類別包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和任何其亞類。產(chǎn)生本發(fā)明的mAb的雜交瘤可在體外或體內(nèi)培養(yǎng)。體內(nèi)生產(chǎn)高效價的mAb使其稱為目前優(yōu)選的生產(chǎn)方法。當(dāng)然，也可以在真核、酵母、昆蟲和植物細(xì)胞以及在植物中通過重組技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體。這些表達(dá)系統(tǒng)和從所述細(xì)胞中分離所述抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的。令人非常驚奇的是，本發(fā)明所述的針對Betv1片段的抗體表現(xiàn)出與通過表達(dá)針對整個Betv1過敏原的哺乳動物(參見例如Focke等人2004)。特別考慮到多克隆抗體通常為針對多于一個表位。生產(chǎn)單克隆抗體導(dǎo)致比由抗血清獲得的多克隆抗體更均一和純的因此可再生的產(chǎn)物。為生產(chǎn)單克隆抗體而選擇合適的肽，其可用于治療和/或預(yù)防由于暴露于Betv1而引起的過敏性疾病，這不是微不足道的。例如，Lebeque等人(1997)研究了針對Betvl而制成的各種單克隆個體在與來自對所述過敏原過敏的病人的IgE的Betv1結(jié)合上的功效。這些研究在沒有披露針對Betv1過敏原的區(qū)域生產(chǎn)的抗體的特異性的情況下，揭示出這些單克隆抗體增強了IgE與Betv1的結(jié)合，而不是減少了所述結(jié)合。因此令人驚奇的是，本發(fā)明所述的抗體強烈地抑制IgE與野生型Betv1的結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明所說的抗體和包含所述抗體的疫苗制劑不僅可被用于治療樺樹花粉過敏原Betv1引起的過敏反應(yīng)，也可預(yù)防這些反應(yīng)，或?qū)⒁粋€個體對于Betv1過敏原致敏。也可能用木發(fā)明所述的抗體或疫苗制劑在兒童或新生兒與樺樹花粉接觸前免疫兒童或新生兒。這種方法可防止Bevv1特異性IgE抗體的形成，因此防止在所述兒童或新生兒中對Betv1的敏感。特別有利的是向1至3歲內(nèi)的兒童使用本發(fā)明所述的抗體，因為在這個年齡兒童對樺樹花粉過敏原過敏。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，抗體為IgG抗體，特別是IgGl或IgG4同位型的.IgG抗體。Sellge等人(Clin.Exp.Allergy(2005)35:774-781)表明針對Betv1的IgG抗體通過形成較大的過敏原集合激活大多數(shù)細(xì)胞或嗜堿細(xì)胞而增強過敏性反應(yīng)(JImmunol(1996)157:4953-4962)禾BDenepoux等人(FEBSletters(2000)465:39-46)。但是，使用本發(fā)明所述的針對Betv1片段的IgG抗體未表現(xiàn)出這些效果。因此可根據(jù)本發(fā)明使用IgG抗體。根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的抗體為非補體激活抗體，像人IgG4或鼠IgGl。根據(jù)本發(fā)明所述的抗體優(yōu)選為鼠或人抗體。根據(jù)本發(fā)明的另外一個優(yōu)選實施方式，該抗體為嵌合抗體?？梢允褂脼樯a(chǎn)"嵌合抗體"(Morrison等人，1984,Proc.Natl.Acad,Sci.,81:6851-6855;Neuberger等人，1984,Nature,312:604-608;Takeda等人，1985,Nature,314:452-454)而發(fā)展的技術(shù)，即通過將來自具有合適的抗原特異性的鼠抗體分子的基因和來自具有合適的生物活性的人抗體分子的基因接合。嵌合抗體為一個分子，其中不同的部分來自不同的生物種，免疫類別，亞類(同位型)，型和亞型，例如，那些具有來自鼠mAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的。而且，本發(fā)明所述的嵌合蛋白可能包含大于一種特異性(二聚體(diabody)或四聚體(tetrabody))。根據(jù)本發(fā)明所述的抗體優(yōu)選為人源化抗體。人源化抗體的方法或生產(chǎn)較低免疫性的非人類抗體的方法是熟知的。人源化的抗體為其中只有抗原識別位點或高變互補決定區(qū)(CDR)是非人源的，而所有的可變域的框架區(qū)域(FR)均為人類基因產(chǎn)物。非人類抗體可通過本領(lǐng)域巳知的任何方法人源化。在一個方法中，非人類的CDR被插入一個人類抗體或共有抗體框架序列。進(jìn)一步的變化可被引入抗體框架以改變親和性或免疫原性。接下來是為改善針對樺樹花粉過敏原Betvl的片段的抗體，作為人類中的治療，通過"人源化"單克隆抗體以改善其血清半衰期并使其在人類宿主中有較低的免疫原性(即防止人類抗體對非人類抗體反應(yīng))。人源化的原理在文獻(xiàn)中己有描述，并為抗體蛋白的模的排列所促進(jìn)。為了最小化結(jié)合補體的可能性，IgGl同位型的人源化抗體為優(yōu)選。例如，一個人源化水平可通過產(chǎn)生嵌合蛋白實現(xiàn)，其包含感興趣的非人抗體的可變區(qū)和人的抗體分子的恒定區(qū)(例如，Morrison等人，Adv.Immunol"1989,44，65-92)。Betv1特異性抗體的可變區(qū)可克隆自cDNA，其產(chǎn)生自由感興趣的雜交瘤分離的mRNA?？勺儏^(qū)基因片段被聯(lián)接至編碼人類抗體恒定區(qū)的外顯子，并在合適的哺乳宿主細(xì)胞(例如骨髓瘤或CHO細(xì)胞)中表達(dá)結(jié)果產(chǎn)物。為達(dá)到更高水平的人源化，只有編碼非人單克隆抗體基因的抗原結(jié)合互補決定區(qū)(CDR)可變區(qū)基因片段部分被克隆至人類蛋白序列(例如，Jones等人，Nature,1986,321,522-525，Riech-mann等人，Nature,1988,332,323-327，Verhoeyen等人，Science,1988,，Bio/Technology,1991,9,266-71)。圍繞CDR3區(qū)域的人類抗體的(3疊片框架也可被修改以更接近地反映最初單克隆抗體的抗原結(jié)合域的三維結(jié)構(gòu)(參見Kettle-borough等人,ProteinEngin.,1991,4,773-783,和Foote等人，J.Mol.Biol.，1992，224,487-499)。在可選的方法中，感興趣的非人單克隆抗體的表面通過改變所選非人抗體的表面殘基而被人源化，例如，通過定點突變，而保持所有的非人抗體的內(nèi)部的和接觸殘基(Padlan,MolecularImmunol,1991,28,489-98)。本發(fā)明的另一個方面涉及與Betv1的片段結(jié)合的抗體或其片段，其特征為所述Betvl的片段由氨基酸30-59(SEQIDNo.l)或氨基酸75-104(SEQIDNo.2)組成。根據(jù)本發(fā)明所述的抗體優(yōu)選為由雜交瘤分泌的單克隆抗體，其根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2006年5月9日保藏于DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen,Braunschweig,Germany),其保藏號為DSMACC2782,DSMACC2783，DSMACC2785,DSMACC2784和DSMACC2786。本發(fā)明的另一個方面涉及疫苗制劑，其包含本發(fā)明所述的抗體。本發(fā)明的抗體可通過眾多方式制成向哺乳動物特別是人使用。在一些實施方式中，抗體處于消毒的水溶液或在生物體液例如血清中。水溶液可為緩沖的或未緩沖的并且具有另外的活性或非活性成分。另外的成分包括用于調(diào)節(jié)離子強度的鹽，防腐劑，包括但不限于抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑試劑和類似的，營養(yǎng)包括葡萄糖(glucose),葡萄糖(dextrose),維他命和礦物質(zhì)?；蛘撸贵w可制成以固體形式使用?？贵w可與一些惰性載體或賦形劑結(jié)合，包括但不限于；結(jié)合劑例如微晶纖維素，黃蓍膠或凝膠；賦形劑例如淀粉或乳糖；分散劑例如褐藻酸，Primogel，或玉米淀粉；滑潤劑例如硬脂酸鎂；助流劑例如膠體二氧化硅；甜味劑例如蔗糖或糖精；或香味劑例如薄荷油或甲基水楊酸鹽?？贵w或其制劑可通過任何有效輸送抗體到靶位的方法向哺乳動物使用。這些方法包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、口、鼻內(nèi)、粘膜或皮膚劑型。根據(jù)本發(fā)明局部使用抗體或疫苗制劑為優(yōu)選。磷酸緩沖液(PBS)為用于注射制劑和鼻內(nèi)使用的優(yōu)選載體。得到藥學(xué)上有效量的治療試10劑的抗體的劑量取決于眾多因素。例如，年齡、敏感性、耐受性和病人的其它特質(zhì)將影響劑量。而且，所用抗體的血漿水平和半衰期以及其對識別位點的親和性，和其它類似因素在有效開藥時需要被考慮。對于全身使用本發(fā)明所述的抗體，可使用介于大約1mg/kg-病人/天至大約500mg/kg-病人/天，優(yōu)選為從大約5mg/kg-病人/天至大約250mg/kg-病人/天，更優(yōu)選為從大約10mg/kg-病人/天至大約100mg/kg-病人/天的劑量，雖然由于其易于使用和成本合算，處于該范圍低端的劑量為優(yōu)選。劑量可被調(diào)整，例如，為了提供抗體的特定的血漿水平，例如在大約0.05至200嗎/ml，更優(yōu)選為大約0.1至100嗎/ml的范圍，并且為了保持該水平，例如持續(xù)一段時間或直至達(dá)到臨床效果。嵌合的和人源化的抗體，其預(yù)想為被更緩慢的清除，需要較低的劑量以保持有效的血漿水平。同樣，具有Betvl高親和性的抗體優(yōu)選為以相對于低親和性抗體較低頻率和較低劑量使用。抗體的藥學(xué)上有效量可通過在治療過程中表現(xiàn)出過敏反應(yīng)較少來確定。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的疫苗制劑和藥物在花粉季之前一或二周向個體使用。疫苗制劑優(yōu)選為適合于肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)或粘膜使用。根據(jù)本發(fā)明所述的制劑可以各種方式使用，其中肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)或粘膜使用為優(yōu)選。特異性與由氨基酸30-59(SEQIDNo.l)或氨基酸75-104(SEQIDNo.2)組成的Betv1結(jié)合的抗體可向個體使用以治療或預(yù)防有Betvl引起的過敏性反應(yīng)。特別地，粘膜使用本發(fā)明所述的抗體具有相對于傳統(tǒng)免疫狀況的一些優(yōu)勢。其中極為重要的是對呼吸道的局部粘膜免疫系統(tǒng)有效的刺激，以及疫苗攝取速率將被增高的可能性，因為與注射相關(guān)的恐懼和不安將被避免。使用本發(fā)明所述的結(jié)合至過敏原的抗體可通過抑制IgE與過敏原的結(jié)合而對抗過敏性反應(yīng)。作為這個抑制的結(jié)果，通常一經(jīng)與過敏原接觸即增高的IgE的產(chǎn)生被減少。本發(fā)明的另一個方面涉及核酸分子，包括選自SEQIDNo.3至298的核苷酸序列。核苷酸序列SEQIDNo.3至298來自編碼IgE分子可變區(qū)的mRNA，所述IgE分子可單獨結(jié)合至Betv1，因此編碼結(jié)合至所述過敏原的多肽。本發(fā)明的另一個方面涉及核酸分子編碼的多肽，所述核酸分子包含選自SEQIDNo.3至298的核苷酸序列。本發(fā)明的另外一個方面涉及抗體或其片段，包含核酸分子編碼的多肽，所述核酸分子包含選自SEQIDNo.3至298的核苷酸序列。本發(fā)明的多肽和核酸分子可被引入(例如通過分子生物學(xué)方法)抗體或其片段，以使所述抗體或其片段也可以單獨結(jié)合至Betv1。這些抗體或片段可用于例如針對Betv1的被動免疫。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，該抗體是選自IgGl、IgG2、IgG3禾nIgG4的免疫球蛋白。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方式，該片段是免疫球蛋白的恒定區(qū)，免疫球蛋白的可變區(qū)，單鏈Fv(scFv)，二聚體(dsFv)，F(xiàn)ab或其組合。木發(fā)明由以下實施例和附圖進(jìn)一步說明，但不被限制于此。圖1顯示了實驗設(shè)計。在第1、14和28天，兩組Balb/c小鼠(n=4/組)經(jīng)腹腔注射rBetv1/Al(OH)3。在第36天收集血液(前血清ante-serum)。在同一天第一組以腹腔注射rBetv1特異性IgG而第二組為不相關(guān)過敏原(Phlp5)。24小時后(第37天)收集血液(后血清post-serum)。圖2顯示了rPhlp5特異性IgG抗體對P-己糖胺酶的釋放的抑制。濃度增加的rPhlp5(0.02pg/ml-0.5|ig/ml)以鼠前血清和后血清分別預(yù)溫育，暴露于RBL細(xì)胞，測定卩-己糖胺酶的釋放。P-己糖胺酶的釋放以總(3-己糖胺酶的釋放的百分率表示。圖3顯示了rBetv1特異性IgG抗體對P-己糖胺酶的釋放的抑制。濃度增加的rBetvl(0.02pg/ml-0.5|ig/ml)以鼠前血清和后血清分別預(yù)溫育，暴露于RBL細(xì)胞，測定(3-己糖胺酶的釋放。P-己糖胺酶的釋放以總P-己糖胺酶的釋放的百分率表示。圖4顯示了編碼能夠結(jié)合至Betv1的IgE可變區(qū)的DNA序列。實施例實施例1:雜交瘤分泌的過敏原特異性的IgGl封閉抗體的產(chǎn)生和鑒定^^惑,/U:雜交瘤分泌的過敏原特異性的IgGl封閉抗體的產(chǎn)生重組樺樹花粉過敏原BetV1在人腸桿菌中表達(dá)并通過以前所描述的方法(Hoffmann-Sommergmber等人，1997)來純化。在AppliedBiosystemspeptidesynthesizerModel433A(FosterCity,CA,USA)上合成肽，在原始序列之外向每個合成的肽附著一個半胱氨酸，以促進(jìn)與載體的結(jié)合(Focke等人，2004)。表1總結(jié)了源自非過敏性Betv1的合成肽的特征。表l.源自非過敏性Betvl的合成肽的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>在最后一次免疫3大后收取脾細(xì)胞，通過稍作修改的常規(guī)雜交瘤技術(shù)(K5hler和Milstein，1975)，使用HAT-敏感的，非分泌骨髓瘤細(xì)胞系X63Ag8.653(Keamey等人，1979)作為融合伴侶(ftisionpartner)來引起雜交瘤。骨髓瘤生長于雜交瘤生長培養(yǎng)基，其由補充了L谷氨酸(200mM)的RPMI1640，10%胎牛血清，二性霉素B(200U/ml)和青霉素/鏈霉素(10000U/ml)組成。小鼠的脾臟按照所述的方法除去，將細(xì)胞懸于無血清的雜交瘤生長培養(yǎng)基。在1750rpm(5分鐘，4。C)離心后以細(xì)胞裂解緩沖液(8.3g/1氯化銨，1.0g/1重碳酸鉀，0.037g/lEDTA四鈉，pH7.4;在室溫持續(xù)兩分鐘)裂解紅血細(xì)胞，通過1750rpm(5分鐘，4°C)離心洗滌細(xì)胞3此，每次將細(xì)胞沉淀輕輕地重懸于無血清的雜交瘤生長培養(yǎng)基。然后活的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞(在對數(shù)生長期)以2:l的比例(脾骨髓瘤)混合在一起，離心后，在l分鐘內(nèi)將1.5ml預(yù)熱的(37°C)41.3。/。w/v聚乙二醇(PEG)4000加入到緩慢攪動起的細(xì)胞沉淀。然后在800rpm(5分鐘，4°C)離心細(xì)胞，懸于補充了飼養(yǎng)細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基，分散于96孔板，在37'CC02溫育箱(5%)里溫育。讓細(xì)胞生長2周，然后在酶免疫檢測中篩選上清的抗體產(chǎn)生。以在PBS中稀釋的rBetv1(10昭/ml)在4。C過夜溫來包被ELISA板。以PBS-T(PBS+0.05%Tween20)中的0.5°/。w/v牛血清蛋白(BSA)在37。C封閉1個小時，以未稀釋的雜交瘤上清溫育板，在37。C反應(yīng)2小時。對于檢測，以l:1000稀釋的檢測一抗(純化的兔子抗-鼠IgGl)在37'C溫育2小時，然后以l:2000稀釋的酶聯(lián)二抗(抗-兔子IgG，辣根過氧物酶偶聯(lián)的物種特異性全抗體)，各在37。C和4。C溫育30分鐘。在溫育歩驟之間，以PBS-T反復(fù)洗滌板。最后，以ABTS(2,2'-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(Sigma-Aldrich)在室溫下溫育并在405nm測定吸光度。以限制稀釋方法來克隆分泌Betv1特異性IgGl抗體的雜種細(xì)胞，即陽性雜交瘤被擴(kuò)展、亞克隆以保證單克隆性并冷凍保藏。雜交瘤分泌的過敏原特異性的IgGl封閉抗體的鑒定為了通過ELISA鑒定所獲得的單克隆IgGl抗體的具體的結(jié)合特異性，以在PBS中稀釋的濃度為5嗎/ml的rBetv1、月太2(aa30-59)、肽6(aa75-104)、Betvl-三體、Betvl-片段l(aa1-74)、Betvl-片段2(aa75-160)、KLH和rPhlp1包被微量滴定板。通過加入PBS-T(PBS+0.05%Tween20)中的0.5%w/v牛血清蛋白(BSA)在37。C封閉1.5個小時，然后未稀釋的雜交瘤上清在37。C溫育2小時。如上所述，以檢測一抗然后以酶聯(lián)二抗來檢測mAb的特異性結(jié)合。根據(jù)個案史，總共選擇了44個來自樺樹花粉過敏性病人(總IgE水平24.1-〉5000kUA/L;樺樹花粉特異性IgE:10.7->100kUA/L)的血清，包括了來自一個非過敏性病人員的血清作為對照目的。樺樹花粉過敏性病人由19個女性和25個男性組成，平均年齡為37(介于21-70歲)。表3總結(jié)了來自所選的樺樹花粉過敏性病人的血清特征。表3.來自樺樹花粉過敏性病人的血清特征<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>個體如表6-9中編號。人口統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示了用于抑制實驗的樺樹花粉過敏性病人的性別和年齡。血清學(xué)鑒定顯示了總IgE、樺樹花粉特異性IgE和RAST類。NS，未明。以rBetv1(1(ig/ml)在4""C包被ELISA板過夜。以PBS-T(PBS+0.05°/。Tween20)中的0.5%w/v牛血清蛋白(BSA)在37。C封閉1個小時，板以未稀釋的單獨的(克隆2(DSMACC2782)、4(DSMACC2783)、10(DSMACC2785)、12(DSMACC2784)、13(DSMAC-C2786))和混合的(克隆2和克隆13)產(chǎn)生IgGl抗體的雜交瘤培養(yǎng)物上清在4。C預(yù)溫育過夜。最后，板以來自44個樺樹花粉過敏性病人的1:5稀釋的血清溫育(4。C過夜)，以l:IOOO稀釋的堿性磷酸酶偶聯(lián)的鼠單克隆抗-人IgE抗體檢測所結(jié)合的IgE抗體。在溫育步驟之間，以PBS-T反復(fù)洗滌板。在以IgGl單克隆抗體預(yù)溫育之后的IgE與rBetv1結(jié)合的抑制百分率通過如下計算％抑制=100-(ODpx100/OD叩)。ODp和ODnp分別代表以雜交瘤培養(yǎng)物上清預(yù)溫育(ODp)和不以雜交瘤培養(yǎng)物上清預(yù)溫育(ODnp)后的消失。^"》f,/7.3:結(jié)果如上所述，在植板和溫育融合的脾細(xì)胞后，每個微量孔的上清均以ELISA分析，以分離免疫活性的雜交瘤。陽性雜交瘤的進(jìn)一步增殖導(dǎo)致14個穩(wěn)定的、單克隆的、肽特異性抗體的選擇。每一個屬TlgGl同位型并表達(dá)K輕鏈。表4列出了所獲得的克隆。克隆2、4、10、12和13根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2006年5月9日保藏于DeutscheSammlungfUrMikroorganismenundZellkulturen(DSM,DSMZ),Braunschweig,德國，保藏兮為DSMACC2782(克隆2)、DSMACC2783(克隆4)、DSMACC2785(克隆10)、DSMACC2784(克隆12)、DSMACC2786(克隆13)。表4.克隆的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>進(jìn)一歩測試14個產(chǎn)生肽特異性抗體的克隆與rBetv1、Betv1肽和Betv1衍生物，像由共價連接的三個拷貝的rBetv1組成的Betv1-三體(Vrtala等人2001)以及兩個rBetv1片段，其包含Betv1的aa1-74(1)和aa75-160(2)(Vrtala等人2000)相結(jié)合的特性。而且，確定了單克隆抗體與陰性對照例如KLII和rPhlp1的結(jié)合。表5總結(jié)了14個單克隆抗體的結(jié)合特性。14個肽特異性抗體沒有一個表現(xiàn)出對于KLH或rPhlp1的反應(yīng)活性，但是，所有的都表現(xiàn)出對于rBetv1和Betvl,三體的強烈的反應(yīng)活性。根據(jù)免疫原，克隆編號l-ll，其產(chǎn)生肽2-特異性(aa30-59)抗體，表現(xiàn)出對于此肽(肽2)的抗體反應(yīng)活性，不與肽6(aa72-104)反應(yīng)。由克隆編號12-13所產(chǎn)生的肽6-特異性(aa72-104)抗體，證明與免疫原的結(jié)合，缺少與肽2(aa30-59)的結(jié)合。使用Betvl片段l(aal-74)和片段2(aa75-106)進(jìn)行的進(jìn)一歩檢測確定肽2-特異性抗體(克隆l-]l)對于片段1(aal-74)表現(xiàn)出反應(yīng)活性而肽6-特異性抗體(克隆12-13)對于片段2(aa75-106)顯示出反應(yīng)活性。表5.IgGl單克隆抗體的結(jié)合特性rBetv1片段l片段2肽2~~肽6克隆rBetvl三體aaaaaaaarPhplKLH1-7475-16030-5975-1041+++-+-2+++-+-3+++-+-4+++-+-5+++-+-6+++-+-7+++-+-8+++-+-9+++-+-10+++-+-11+++-+-12++一+-+13++—+-+14++—+■+表6表明單克隆抗體也抑制過敏性病人的IgE結(jié)合至Betv1交叉反應(yīng)過敏原例如來自榿木花粉Alng1的主要過敏原或來自蘋果Mald1主要過敏原。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>顯示了以IgGlmAb(克隆2、4、10)所獲得的來自10個樺樹花粉過敏性病人血清的IgE與完全rBetv1結(jié)合的抑制百分率。平均抑制百分率顯示于圖表下端。肽-特異性抗體抑制過敏性病人的IgE與完全rBetv1結(jié)合的能力通過ELISA競爭實驗，使用來自44個樺樹花粉過敏性病人的血清來確定(表7-9)。在病人IgE暴露之前，選取總共14個克隆中的5個以rBetvl預(yù)溫育。以肽6-特異性(aa75-104)抗體預(yù)溫育后觀察到最強的對IgE結(jié)合的抑制(克隆12:平均抑制60.4%-74.8%;克隆13:平均抑制58.5%-72.6%)，而肽2-特異性(aa30-59)抗體(克隆2:平均抑制46.2%-62.7%;克隆4:平均抑制44.3%和58.7%，克隆10:平均抑制41.0%和52.4%)也抑制了病人IgE與rBetvl的結(jié)合，雖然程度較低。有趣的是，肽2-特異性單克隆抗體(克隆2)和肽6特異性單克隆抗體的混合物相對于單獨的單克隆抗體沒有表現(xiàn)出更強的對IgE結(jié)合的抑制(表7-9)。表7.IgGl單克隆抗體抑制樺樹花粉過敏性病人的血清IgE與rBctvl的結(jié)合無mAb有mAb的OD值抑制％的OD病人克隆2克降4克隆10克降12克隆13克降2克隆4克降10克降12克隆13al0.450.340.340.370.360.362325172019a20.740.340.360.400.210.2054514672730.930.490.520.580.610.664745383429a40.610.230.230.260.150.136262577678a51.190.810.870.860.430.583227286452a60.410.200.220.240.120.135147427169a70.620.330.350.380.190.2248443870650.630.310.320.330.170.205049477369a90.420.190.190.190.100.095554547678a100.380.230.230.220.190.184039434954對昭■>、、、0.060.090.090.090.140.1500000平均46.2344.2540.9760.4258.53顯示了以IgGlmAb(克隆2、4、10、12、13)所獲得的來自10個樺樹花粉過敏性病人(al-alO)血清的IgE與完全rBetv1結(jié)合的抑制百分率。來自一個非過敏性人員的血清作為對照。平均抑制百分率顯示于表的下端。表8.IgGl單克隆抗體抑制樺樹花粉過敏性病人的血清IgE與rBetvl的結(jié)合,t有mAb的OD值抑制％的D病人克隆2克隆4克隆10克隆12克隆13克隆2克隆4克隆10克隆12克隆13bl0.350.090.100.130.060.067572638484b20.290.090.110.130.070.077064567775b30.520.130.180.230.080.127466558577b41.050.250.240.360.100.127677669089b50.700.260.310.370.090.126255468782b60.120.040.060.060.040.047051457067b70.730.290.290.380.130.186160478275b80.130.060.060.070.050.055756496365b90.330.090.100.130.060.067371618382blO0.110.060.070.070,060.064739374747Ml1.240.280.300.400.080.127876689491bl20.170.040.060.060.030.047566637978bl30.880.160.160.220.080.088281759190b141.610.760.770.950.290.465352418272bl50.300.150.160.180.120.125148406160bl61.520.800.850.890.350.564844427763bl70.250.080.090.110.040.066763568275M80.160.090.090.110.070.084543345954bl90.510.130.140.170.060.067572668988b200.110.070.080.080.060.063330294242b210.540.170.210.240.060.096862548983b220.210.120.120.120.090.094244405657b230.520.130.140.170.060.067573678989b240.300.080.090.100.040.047370658686b250.400.150.150.180.100.116361557473b260.160.090.090.090.080.074644425055b270.420.140.150.170.070.076865598484b280.160.060.070.080.050.056157537071b290.310.130.140.170.070.095955477671b300.120.050.070.070.050.065338375552b310.350.150.160.180.110.125553496866b320.250.070.080.090.060.057370657579b330.110.050.050.060.040.045552486565b340.390.120.130.160.060.066967608485對照0.030.030.040.030.040.0840000甲.均62.6958.6852.3774.8472.64顯示了以IgGlmAb(克隆2、4、10、12、13)所獲得的來自34個樺樹花粉過敏性病人(bl-b34)血清的IgE與完全rBetv1結(jié)合的抑制百分率。來自一個非過敏性人員的血清作為對照。平均抑制百分率顯示于表的下端o表9.樺樹花粉過敏性病人的血清IgE與rBetv1的結(jié)合的抑制兩個單獨單克隆抗體和其混合物的抑制能力的比較無mAb有mAb的OD值抑制％的OD病人克隆2克隆13克隆2/13混合克隆2克隆13克隆2/13混合0.300.130.070.07567575a20.290.110.070.076176740.190.070.050.04637678a40.170.080.050.055672700.030.030.030.0515600.140.090.070.093648370.250.090.060.06647575a90.240.180.300.100.060.160.080.040.110.070.040.09606547687664727770平52.3663.5662.88抑制百分率與以IgGlmAb的混合物(克隆2/13混合)的抑制的比較。顯示了來自IO個樺樹花粉過敏性病人(al-a10)血清的抑制。平均抑制百分率顯示于表的下端。過敏性反應(yīng)的關(guān)鍵事件是結(jié)合至效應(yīng)細(xì)胞的IgE抗體與多價過敏原的交聯(lián)。這導(dǎo)致顆粒胞外分泌和生物調(diào)節(jié)子的釋放(即，組胺，白細(xì)胞三烯)，然后這又引起急性過敏反應(yīng)和過敏性鼻炎、結(jié)膜炎和哮喘。在這個方面，過敏原-IgE抗體的相互作用是可能的過敏原特異性被動免疫治療的靶點，治療的目標(biāo)為抑制過敏原和IgE抗體之間的相互作用(Valenta等人，1998)。由于這個原因，IgE表位的定義是治療的特定形式的發(fā)展的重要先決條件。如果是帶有連續(xù)IgE表位的主要過敏原，例如Phlpl，則可能將過敏原切開為結(jié)合IgE的半抗原，所述半抗原在暴露于過敏原之前將結(jié)合至效應(yīng)細(xì)胞的IgE飽禾U，因此防止了交聯(lián)和效應(yīng)細(xì)胞的激活(Bali等人1994)(同時參見第一章半抗原的原理)。相反，主要樺樹花粉Betv-1的IgE表位主要屬于構(gòu)象(非連續(xù))型。在這種情況下，過敏原-IgE抗體的相互作用口J被治療性過敏原特異性抗體所抑制，所述治療性過敏原特異性抗體與病人IgE競爭過敏原上的結(jié)合位點，從而防止了效應(yīng)細(xì)胞的激活。這種治療方法是合理的，特別是當(dāng)病人僅僅致敏于幾個主要過敏原。在本實施例中，14個單克隆Betv1肽-特異性抗體，其均屬于IgGl亞類，他們的表位特異性結(jié)合特性和干擾過敏性病人的IgE與Betv1過敏原結(jié)合的能力被鑒定。根據(jù)他們的結(jié)合特異性，單克隆抗體可被分成兩組第I組(克隆1-11)單克隆抗體強烈識別肽2(aa30-59)而第二組(克隆12-13)單克隆抗體強烈結(jié)合肽6(aa75-104)。所有的單克隆抗體強烈結(jié)合rBetv1和rBetvl三體并表現(xiàn)出特異性，因為他們未能識別不相關(guān)對照蛋白，例如KLH禾HrPh1p1。當(dāng)測試對病人IgE與Betv1結(jié)合的干擾時，每個單克隆抗體均在相當(dāng)大的程度上抑制IgE的結(jié)合，在一些病人中有些達(dá)到了94%。有趣的是，這些結(jié)果表明單獨的單克隆抗體足以與病人多克隆IgE結(jié)合競爭。肽6-特異性單克隆抗體相對于肽2-特異性單克隆抗體表現(xiàn)出更強的抑制能力。將具有不同表位特異性的個別單克隆抗體(克隆2:肽2-特異性；克隆13:肽6-特異性)與具有不同特異性的兩個抗體的混合物相比較，沒有發(fā)現(xiàn)抗體混合物具有更強的對病人IgE結(jié)合的抑制。基本上，可以考慮肽-特異性IgGl抗體的封閉活性的兩種解釋。第一，抑制可通過一個事實解釋所獲得的單克隆抗體在Betv1的主要IgE結(jié)合位點內(nèi)或緊鄰Betv1的主要IgE結(jié)合位點來識別表位。第二，封閉活性可由過敏原構(gòu)象的修飾引起，從而IgE表位或僅其一部分對于IgE來說不再是可接近的。較好的解釋將符合抑制實驗結(jié)果，所述實驗結(jié)果表明具有不同的表位特異性的兩個肽-特異性單克隆抗體的混合物相對于個別的單克隆抗體沒有產(chǎn)生更強的抑制。這個理論可通過過敏原-抗體復(fù)合物的結(jié)果分析來確定。使用來自過敏性病人或免疫的老鼠為來源，通過經(jīng)典組織培養(yǎng)和組合克隆技術(shù)，己經(jīng)分離了幾個具有治療潛力的人和鼠單克隆抗體(Sim等人，1995;Visco等人，1996;Lebeque等人，1997;Flicker等人，2002)。這些抗體能夠抑制過敏原-IgE的相互作用并防止過敏原誘導(dǎo)的嗜堿粒細(xì)胞脫粒。Betv1特異性人類封閉抗體也已經(jīng)通過產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞系而生產(chǎn)，所述細(xì)胞系來自經(jīng)免疫治療的病人(Visco等人1996)。Betvl特異性鼠單克隆抗體已經(jīng)由經(jīng)典雜交瘤技術(shù)分離(Lebeque等人1997)。與較早前獲得的Betv1特異性單克隆抗體相比，本實施例中描述的抗體已經(jīng)被分離自鼠，以具有一定氨基酸序列的源自Betv1的肽免疫，因此在程序開始確定了特定表位。如上所述的封閉抗體也可以被人源化或以重組抗體片段來生產(chǎn)以減少其免疫原性。治療性過敏原特異性抗體可經(jīng)局部使用至過敏癥的靶器官(例如，鼻或支氣管粘膜，結(jié)膜)以建立穩(wěn)定的對抗入侵的過敏原的防線，或全身使用，例如被動接種(Valenta等人1997)?？傊?，本發(fā)明所述的單克隆抗體也可通過局部治療或被動接種用于防止過敏原誘導(dǎo)的在過敏癥靶器官中的調(diào)節(jié)子的釋放。實施例2:建立了一個小鼠模型來研究在體內(nèi)以過敏原特異性IgG抗體進(jìn)行的被動接種的效應(yīng)(圖1)。在第1、14和28天，小鼠(CharlesRiver，Germany)用吸附到Al(OH)3(Alu-Gel-S;Serva,Germany)的5嗎的主要樺樹花粉過敏原rBetv1(Biomay，Austria)以腹腔內(nèi)(i.p.)致敏。在第36天從致敏的小鼠的尾靜脈取血液樣品(前血清)。對Betvl的過敏性致敏通過測定這些血清中的Betvl特異性抗體來確定(Vrtala等人，1998)。所有的八個血清中的Betvl特異性抗體的水平是相當(dāng)?shù)?表IO，前血清)。然后將小鼠分成兩個組第一組用0.5ml的Betv1特異性抗體以腹腔內(nèi)處理。第二組(對照組)以0.5ml的直接針對不相關(guān)過敏原Phip5的IgG注射。在第37天從兩個組的小鼠的尾靜脈取血(后血清)，并比較相對于前血清IgE對rBetv1的反應(yīng)活性。為了這個目的，將5嗎/ml的rBetvl過夜包被至ELISA板，板以3%的BSA/TBST(50mMTris，150m國aCl，0.5%w/v的BSA，0.05%v/vTween)。在TBST中以1:10稀釋小鼠血清，過夜溫育，分別以單克隆的兔抗小鼠IgE抗體(BDPharmingen;USA)禾口HRP標(biāo)記的羊抗大鼠抗血清(Amersham，U.K.)來檢測所結(jié)合的IgE。表9顯示了結(jié)果，其代表二次重復(fù)測定的平均值，差異小于10%。第一欄和第二欄表明了在IgG處理前(前血清)和處理后(后血清)，小鼠的IgE與rBetvl的結(jié)合。在后血清(第三欄)IgE與rBetv1結(jié)合的抑制百分率按如下計算百分率抑制％二100-OD后血潔x100/OD阮血ffl:。抑制率介于23.4-54.6%(表10)。表10顯示了rBetv1特異性IgG抗體對小鼠IgE與rBetv1結(jié)合的抑制。顯示了以rBetv1特異性IgG抗體或Phip5特異性IgG處理前(前血清；第一欄)和處理后(后血清；第二欄)IgE與rBetvl的結(jié)合。在第三欄顯示了后血清IgE結(jié)合的抑制百分率。表10小鼠的IgE與rBetv1結(jié)合的抑制個體OD4。5nmIgE與rBetv1的結(jié)合IgE與rBetv1前血清后血清結(jié)合的抑制％第一組11.1100.85023.420.7380.33554.630.4170.22047.240.3620.19745.6第二組51.8841.7845.360.5080.5031.070.2000.17512.580.4680.497+6.2第二組中的小鼠中幾乎沒有觀察到IgE與rBetvl的結(jié)合，所述小鼠獲得了具有針對Phip5的特異性的IgG。在一個相似的針對Phip5過敏性小鼠進(jìn)行的實驗中，通過Phip5特異性IgG處理達(dá)到的IgE結(jié)合的抑制百分率介于7.7-58%(表ll)。表11顯示了rPhlp5特異性IgG抗體對小鼠IgE與rPhlp5結(jié)合的抑制。顯示了以rPhlp5特異性IgG或rBetv1特異性IgG處理前(前血清；第一欄)和處理后(后血清；第二欄)IgE與rPhlp5的結(jié)合(OD值)。在第三欄顯示了后血清IgE結(jié)合的抑制百分率。表11小鼠的IgE與rPhlp5結(jié)合的抑制個體OD4Q5nmIgE與rPhlp5的結(jié)合IgE與rPhlp5前血清后血清結(jié)合的抑制％~~第一組10.7010.6477.72O扁0.38743.130.8020.41648.140.6690.28158.0;二組50.6870.711+3.5^0.8280.7736.770.9440.80914.480.8280.7568.7通過大鼠嗜堿白血病細(xì)胞(RBL)中(3-己糖胺酶的釋放分析了過敏原特異性IgG抗體是否能抑制過敏原誘導(dǎo)的劑型過敏反應(yīng)。將RBL-2H3細(xì)胞(Eccleston等人，1973)植板于96孔組織培養(yǎng)板(4x104/孔)并在37"C下5%C02中培養(yǎng)24小時。以Tyrode緩沖液(Sigma-Aldrich,Austria)(137mMNaCl,2.7mMKC1,0.5mMMgCl2,1.8mMCaCl2,0.4mMNaH2P04,5.6mMD-葡萄豐唐，12mMNaHC03,10mMN-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)和0.1。/。w/v牛血清蛋白，pH7.2)洗滌細(xì)胞兩次。以不同濃度(0.5嗎/ml;0.1嗎/ml;0.02(ig/ml)的過敏原分別溫育前血清和后血清(以Tyrode緩沖液1:IO稀釋)。將過敏原/IgE和過敏原Ig/G復(fù)合物暴露于RBL細(xì)胞并在37。C下加濕的空氣中溫育2小時。以熒光光譜(CYTOFLUOR2350，Millipore,USA)測定P-己糖胺酶的釋放水平。結(jié)果以通過加入1%v/vTritonX-100所達(dá)到的總(3-己糖胺酶釋放的百分率來表示。圖2和3顯示，當(dāng)細(xì)胞以過敏原加后血清溫育時，相對于以過敏原加前血清，RBL細(xì)胞中P-己糖胺酶的釋放較低。在進(jìn)一步的實驗中，封閉抗體的概念被延伸至另一個季節(jié)性的重要的過敏原，主要草花粉過敏原Phlpl，和終年的過敏原例如Derp2，一個來自屋塵螨的主要過敏原和主要魚過敏原Cypcl。而且，研究了單一的IgG抗體注射對小鼠的過敏原特異性IgE結(jié)合的效應(yīng)。表12顯示了rPhlp1特異性IgG抗體對小鼠IgE與rPhlp1結(jié)合的抑制百分率。后血清的抑制率介于63.3%-39.5%。在一個相似的針對Derp2致敏的小鼠進(jìn)行的實驗中，通過rDerp2特異性IgG處理達(dá)到的抑制百分率介于63.5-27.5%(表13)。對于rCypc1致敏的小鼠，特異性IgE結(jié)合的抑制率達(dá)到59.8-36%(表14)。表12rPhlp1特異性IgG抗體對小鼠的IgE與rPhlp1結(jié)合的抑制在rPhlp1特異性IgG(第一組)或Betv1特異性IgG(第二組)處理后的不同的時間點，顯示了后血清的IgE與Phip1的結(jié)合的百分率。前血清的IgE結(jié)合計算為達(dá)到100%反應(yīng)。小鼠IgE與rPhlp1結(jié)合的抑制％24小時后72小時后1周后2周后3周后163.344.529.839.139.5248.346.245.6nd54.7表13rDerp2特異性IgG抗體對小鼠的IgE與rDerp2結(jié)合的抑制在rDerp2特異性IgG(第一組)或Betvl特異性IgG(第二組)處理后的不同的時間點，顯示了后血清的IgE與Derp2的結(jié)合的百分率。前血清的IgE結(jié)合計算為達(dá)到100%反應(yīng)。小鼠IgE與rDerp2結(jié)合的抑制％24小時后72小時后1周后2周后3周后150.952.275.743.327.5263.550,836.634.348.3表14rCypc1特異性IgG抗體對小鼠的IgE與rCypc1結(jié)合的抑制在rCypc1特異性IgG(第一組)或Betv1特異性IgG(第二組)處理后的不同的時間點，顯示了后血清的IgE與Cypc1的結(jié)合的百分率。前血清的IgE結(jié)合計算為達(dá)到100%反應(yīng)。小鼠IgE與rCypc1結(jié)合的抑制24小時后72小時后1周后2周后3周后I^^^^836.0實施例3:為了獲得其它Betvl特異性抗體，IgE反應(yīng)專有地針對主要樺樹花粉過敏原Betv1的病人被鑒定。通過逆轉(zhuǎn)錄和使用家族特異性性引物(VH1,VH6)和位于第一恒定s區(qū)的引物的PCR從這些病人中獲取了IgE可變區(qū)的DNA序列?？偣茶b定了336個這些過敏性病人的Betv1特異性重鏈可變序列(圖4)，所述序列識別Betvl的IgE表位，因此作為封閉抗體起反應(yīng)。微微纖絲個沐游微使用多過敏原檢測系統(tǒng)(MASTCLAallergen-specificIgEassay,HitachiChemicalDiagnostics),所述系統(tǒng)含有46中過敏原源(榿木花粉、杏樹、交鏈包屬、蘋果、曲霉菌、樺樹花粉、胡蘿卜、酪蛋白、貓皮屑、芹菜、分子孢子菌屬、蟑螂、鱈、粉塵螨(Dwmatop/7"go/^s/an'"ae)、屋塵螨(De^mato//2ago/^^ptera"j^/wM)、狗皮屑、草混合物、天竺鼠皮屑、倉鼠皮屑、榛樹花粉、榛實、馬皮屑、刺柏屬、乳膠、牛奶蛋白、艾屬植物、橄欖樹、墻草屬、桃樹、花生、青霉菌、松樹混合物、車前草、羽毛混合物、馬鈴薯、兔子、豚草屬、黑麥、黑麥面粉、芝麻、小蝦、大豆、番茄、胡桃、小麥面粉、整雞蛋)從500個過敏性個體中鑒定了6個對樺樹花粉具有專有性過敏性致敏的個體。在2002和2005年春季和夏季獲取了來自這6個過敏性個體的血液樣品。在每次約見，通過CAT-RAST測定(Phadia)對Betv1特異性IgE的水平進(jìn)行定量，記錄過敏性癥狀和抗過敏性藥物治療。所選個體沒有一個接受任何種類的過敏原特異性免疫治療。如DrachenbergKJ等人，Allergy56(2001):498-505所描述記錄個體居住區(qū)的樺樹花粉暴露情況。i^敎嚴(yán)淳^絲/^叛銀游鑒定為了詳細(xì)說明所選過敏性個體的過敏原圖解，以重組Betv1進(jìn)行了抑制實驗。根據(jù)生產(chǎn)商指示，將從Biomay購買的重組Betv1以5mg蛋白/ml介質(zhì)的濃度偶聯(lián)至CNBr-激活的瓊脂糖4B(GEHealthcareBio-SciencesAB)。在4。C以500jil的過敏原偶聯(lián)的凝膠通過直立旋轉(zhuǎn)(end-over-endrotation)的方式溫育6個過敏性人員的1500[il的血漿。通過離心(4。C，5分鐘，5000g)重新獲得血清。在CAT-RAST測定(Phadia)損耗之前和之后，測定了針對食物過敏原混合物(蛋白、牛奶蛋白、鱈、小麥面粉、花生和大豆)和呼吸混合物(艾屬植物、樺樹花粉、墻草屬、貓尾草和長葉車前草)的IgE水平，以及針對樺樹花粉提取物和rBetv1的IgE水平(EibensteinerP等人，Immunology101(2000):112-9)。以三個對樺樹花粉中的Betv1專有性反應(yīng)的個體進(jìn)行了進(jìn)一步實驗。尸層C游分辭〃妙斧錄預(yù)燈-PC7iT潛在收集血清時，通過Ficoll濃度梯度離心分離外周單核細(xì)胞。使用胍異硫氰酸鹽方法和CsCl梯度離心分離總細(xì)胞RNA。使用家族特異性性引物(VH1-VH6)和特異性針對IgE重鏈第一恒定區(qū)的引物以帶有PlatinumTaq的SuperscriptOne-StepRT-PCR(Iiwitrogen)來產(chǎn)生IgE轉(zhuǎn)錄子(表15)。表15:名稱特異性5'-3'序列Vifi人類VH1基因家族VH2人類VH2基因家族VH3人類VH3基因家族VH4人類VH4基因家族VH5人類VH5基因家族VH6人類VH6基因家族IgECl人類s-鏈第一恒定區(qū)PCR擴(kuò)增程序由以下組成47。C下30分鐘和94"C下5分鐘的起始?xì)i驟，然后94'C下20秒鐘、59。C下30秒鐘和72。C下1分鐘的的40個循環(huán)，和72。C下5分鐘的最后延伸。根據(jù)生產(chǎn)商的指示，使用WizardSVGd和PCRClean-UpSystem(Promega)將所有符合預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠純化。然后，將cDNA克隆至AccepTorTM載體(Novagen)并轉(zhuǎn)錄至大腸桿菌(」&c/2en'c/7/aco/Z)XLl-blue。使用WizardP/zSVMiniprepDNAPurificationSystem(Promega)，從3ml含有100(ag/ml氨比西林的過夜培養(yǎng)物中純化質(zhì)粒DNA并以限制性內(nèi)切酶Kpnl和SacI(Roche)消化。帶有正確大小的插入物的質(zhì)粒以MicrosynthAG(Switzerland)測序。參考文獻(xiàn)GGAATTCACTCCCAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGGGAATTCGTCTGTGCCGAGGTGCAGCTGCTCGAGCTCGGGGAATTCGTCCTGTCACAGGTACAGCTGCTCGAGTCAGGBallT,等人J.Biol.Chem.1994;269:28323-8.BreitenederH,等人EMBOJ.1989;8:1935-8.EccelstonE，等人NatNewBiol1973;244:73-76.FerreiraFD，等人J.Biol.Chem.1993;268:19574-80.Flickers,等人Eur.J.Immunol.2002;32:2156-62.FockeM,等人Clin.Exp.Allergy.2004;34:1525-33.Hoffmann-SommergmberK,等人Expr.Purif.1997;9:33-9.JarolimE,等人Allergy.1989;44:385-95.KearneyJF,等人J.Immunol.1979;123:1548-50.K5hlerG,MilsteinC.Nature1975;256:495.LebecqueS,等人J.AllergyClin.Immunol.1997;99:374-84.SunLK,等人Biotechnology.1995;13:779-86.ValentaR,等人J.Allergy.Clin.Immunol.1991;88:889-94.ValentaR,等人Curr.Opin.Immunol.1995;7:751-6.ValentaR,等人Immunol.Cell.Biol.1996;74:187-94.ValentaR,等人Biol,Chem.1997;378:745-9.ValentaR,等人Int.Arch.AllergyImmunol.1998;116:167-76.ViscoV，等人J.Immunol.1996;157:956-62.VrtalaS,等人J.Immunol.2000;165:6653-9.VrtalaS,等人FASEBJ.2001;15:2045-7.VrtalaS，等人JImmunol1998;60:6137-6144.權(quán)利要求1、一種抗體或其衍生物在制備用于個體的被動免疫的藥物中的用途，以預(yù)防和/或治療所述個體中由于暴露于樺樹花粉過敏原而引起的過敏性反應(yīng)，其特征為，該抗體與Betv1片段結(jié)合，所述Betv1片段包含氨基酸30至59(SEQIDNo.1)或氨基酸75至104(SEQIDNo.2)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征為，該抗體是IgG抗體，特別是IgGl或IgG4同位型的IgG抗體。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征為，該抗體是鼠抗體。4、根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的用途，其特征為，該抗體是嵌合抗體。5、根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的用途，其特征為，人源化該抗體。6、根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的用途，其特征為，該抗體是單克隆抗體。7、根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的用途，其特征為，該抗體是由雜交瘤分泌產(chǎn)生的單克隆抗體，所述雜交瘤于2006年5月9日保藏于布達(dá)佩斯條約下的DSMZ，其保藏號為DSMACC2782，DSMACC2783,DSMACC2785,DSMACC2784禾BDSMACC2786。8、結(jié)合至Betv1片段的抗體或其衍生物，其特征為所述Betv1片段由氨基酸30至59(SEQIDNo.l)或氨基酸75至104(SEQIDNo.2)組成。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體或其衍生物，其特征為該抗體是IgG抗體，特別是IgGl或IgG4同位型的IgG抗體。10、根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的抗體或其衍生物，其特征為，該抗體是鼠抗體。11、根據(jù)權(quán)利要求8或10所述的抗體或其衍生物，其特征為，該抗體是嵌合抗體。12、根據(jù)權(quán)利要求8或11任一項所述的用途，其特征為，人源化該抗體。13、根據(jù)權(quán)利要求8至12任一項所述的抗體或其衍生物，其特征為，該抗體是單克隆抗體。14、根據(jù)權(quán)利要求8至12任一項所述的抗體或其衍生物，其特征為，該抗體是由雜交瘤分泌產(chǎn)生的單克隆抗體，所述雜交瘤于2006年5月9日保藏于布達(dá)佩斯條約下的DSMZ，其保藏號為DSMACC2782,DSMACC2783,DSMACC2785,DSMACC2784禾卩DSMACC2786。15、包含權(quán)利要求8至14的任一項所述的抗體的疫苗制劑。16、根據(jù)權(quán)利要求15所述的疫苗制劑，其特征為該制劑適合于肌肉內(nèi)、皮下、靜脈或粘膜使用。17、包含選自SEQIDNo.3至298的核苷酸序列的核酸分子。18、由權(quán)利要求17所述的核酸分子編碼的多肽。19、包含權(quán)利要求18所述的多肽的抗體或其片段。20、根據(jù)權(quán)利要求19所述的抗體或其片段，其特征為該抗體是選自IgGl、IgG2、IgG3或lgG4的免疫球蛋白。21、根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的抗體或其片段，其特征為該片段是免疫球蛋白的恒定區(qū)、免疫球蛋白的可變區(qū)、單鏈Fv(scFv)、二聚體(diabody)、Fab或其組合。全文摘要本發(fā)明涉及Betv1特異性抗體或其片段，及其在預(yù)防和治療過敏原誘導(dǎo)的疾病中的用途，其中該抗體阻斷IgE與Betv1的結(jié)合。文檔編號C07K16/16GK101448855SQ200780017364公開日2009年6月3日申請日期2007年5月18日優(yōu)先權(quán)日2006年5月18日發(fā)明者A·吉拉斯,K·馬特,O·毛伊迪克,P·科爾,R·瓦倫塔,S·弗利克申請人:碧歐美公司