專利名稱：2-氨基嘧啶-4-酮類化合物及其用于治療或預(yù)防Aβ相關(guān)病理的用途的制作方法
24ijj^r本酮類^^^及其用于治療或預(yù)防AP相關(guān)病理的用途 狄領(lǐng)域
本發(fā)明涉及新穎的化合物及其藥物組合物。此外，本發(fā)明涉及用于治療
和/或預(yù)防以下疾病的治療方法A卩相關(guān)病理(A(3-related pathology),例如唐 氏綜合征(Downs syndrome)和(3-淀粉樣血管病，例如但不限于腦淀粉樣血管 病、遺傳性腦出血、與認(rèn)知缺損相關(guān)的障礙例如但不限于MCI("輕度認(rèn)知缺 損")、阿爾茨海默病(AlzheimerDisease)、記憶喪失、與阿爾茨海默病相關(guān)的 注意力缺陷癥狀、與例如阿爾茨海默病那樣的疾病相關(guān)的神經(jīng)變性或包括混 合型血管起源和變性起源的癡呆、早老性癡呆、老年性癡呆和與帕金森病 (Parkinson's disease)相關(guān)的癡呆在內(nèi)的癡呆、進(jìn)行性核上麻痹或皮質(zhì)基質(zhì)變 性。
背景技術(shù)：
數(shù)個(gè)小組已經(jīng)鑒定和分離出具有(3-分泌酶活性的天冬氨酸蛋白酶 (Hussain et al.， 1999、 Lin et. al， 2000、 Yan et. al, 1999、 Sinha et. al.， 1999和 Vassar et. al., 1999)。卩-分泌酶在相關(guān)文獻(xiàn)中也稱為Asp2(Yan et. al， 1999)、 (3 位APP裂解酶(BACE)(Vassar et. al., 1999)或切割酶-2(memapsin-2) (Lin et al., 2000)。 BACE的鑒定采用了多種實(shí)驗(yàn)手段，例如EST數(shù)據(jù)庫(kù)分析(Hussain etal. 1999)、表達(dá)克隆(Vassar et.al.， 1999)、從所預(yù)測(cè)的C. e/egara蛋白的公共數(shù)據(jù) 庫(kù)鑒定人類同系物(Yan et al. 1999)和最終使用抑制劑來純化源自人腦的蛋白 (Sinha et al. 1999)。因而，五個(gè)小組采用三種不同的實(shí)驗(yàn)手段鑒定出相同的 酶，因而堅(jiān)信BACE為(3-分泌酶。也提及以下專利文獻(xiàn)WO96/40885、 EP871720 、美國(guó)專利5,942,400和5,744,346 、 EP855444 、 US6，319,689 、 W099/64587、 W099/31236、 EP1037977、 WO00/17369、 WO01/23533 、 WO0047618、 WO00/58479、 WO00/69262、 WO01/00663、 WO01/00665和 US6,313,268。
所發(fā)現(xiàn)的是，BACE為胃蛋白酶樣天冬氨酸蛋白酶，這種成熟的酶由N-末端催化結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和小胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。BACE在pH為4.0-5.0時(shí)
6具有最佳活性(Vassaretal, 1999)，并且被標(biāo)準(zhǔn)的胃蛋白酶抑制劑(例如胃酶抑 素)輕微抑制。已經(jīng)顯示的是，去掉跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的催化結(jié)構(gòu)域 對(duì)底物肽具有活性(Lin et al， 2000)。 BACE為膜結(jié)合的1型蛋白，其是作為部 分活性的酶原而合成的，并且在腦組織中大量表達(dá)。它被認(rèn)為代表主要的卩-分泌酶活性，并且被認(rèn)為是產(chǎn)生淀粉樣-P-蛋白(Ap)的限速步驟。因而，BACE
特別關(guān)注。
A(3或淀粉樣-P-蛋白是腦斑的主要成分，而腦斑是阿爾茨海默病所特有 的(De Strooper et al, 1999)。 A卩是由I類跨膜蛋白(稱為APP或淀粉樣前體蛋白) 的特異性裂解所形成的39-42個(gè)殘基的肽。A(3-分泌酶活性使這種蛋白在殘基 Met671和Asp672(對(duì)APP的770aa同工型進(jìn)行編號(hào))之間發(fā)生裂解，從而形成 A卩的N-末端。所述肽的二次裂解與y-分泌酶相關(guān)，從而形成A卩肽的C-末端。 阿爾茨海默病(AD)據(jù)估計(jì)折磨世界上兩千萬以上的人，并且相信其是最普遍 的癡呆形式。阿爾茨海默病是一種進(jìn)行性癡呆，其中由積聚的蛋白質(zhì)分解產(chǎn) 物所形成的大塊沉積物即淀粉樣斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)積聚在腦中。淀粉樣斑 被認(rèn)為是造成在阿爾茨海默患者中發(fā)現(xiàn)智力衰退的原因。
發(fā)展成阿爾茨海默病的可能性隨年齡而增大，并且隨著發(fā)達(dá)國(guó)家老齡人 口的增加，這種疾病成為日益嚴(yán)重的問題。除此之外，阿爾茨海默病存在家 族性關(guān)聯(lián)，因此具有雙重APP突變(稱為Swedish突變，其中突變的APP構(gòu)成 BACE的相當(dāng)大改進(jìn)的底物)的任何個(gè)體發(fā)展成AD的可能性要大得多，并且 在年輕時(shí)發(fā)展成AD的可能性也要大得多(另外參見US 6，245，964和US 5,877,399，其涉及包括APP-Swedish的轉(zhuǎn)基因嚙齒動(dòng)物)。因此，也強(qiáng)烈需要 開發(fā)出能以預(yù)防性方式用于這些個(gè)體的化合物。
發(fā)現(xiàn)編碼APP的基因位于21號(hào)染色體上，所述21號(hào)染色體也是在唐氏綜 合征中所發(fā)現(xiàn)的作為額外副本的染色體。唐氏綜合征患者趨于在年輕時(shí)患有 阿爾茨海默病，40歲以上的唐氏綜合征患者幾乎都顯示出阿爾茨海默型病理 (Oyamaetal.， 1994)。這被認(rèn)為是由于在這些患者中所發(fā)現(xiàn)的APP基因的額外 副本，它引起了APP的過度表達(dá)，因此增加了APPI3水平，從而導(dǎo)致阿爾茨海 默病在這類人群中的高發(fā)病率。因而，BACE的抑制劑可用于減少唐氏綜合 征患者的阿爾茨海默型病理。
因此，降低或阻斷BACE活性的藥物應(yīng)當(dāng)能夠在腦中或在沉積有A(3或其
7片段的其它地方降低Ap水平和A(3片段的水平，因而延緩淀粉樣斑的形成和 AD或牽涉A(3或其片段沉積的其它病患的進(jìn)展(Yankner, 1996; De Strooper andKonig, 1999)。因此，BACE就開發(fā)用于治療和/或預(yù)防以下疾病的藥物而 言是重要的候選靶標(biāo)A(3相關(guān)病理，例如唐氏綜合征和(3-淀粉樣血管病，例 如但不限于腦淀粉樣血管病、遺傳性腦出血、與認(rèn)知缺損相關(guān)的障礙例如但 不限于MCI("輕度認(rèn)知缺損，，)、阿爾茨海默病、記憶喪失、與阿爾茨海默病 相關(guān)的注意力缺陷癥狀、與例如阿爾茨海默病那樣的疾病相關(guān)的神經(jīng)變性或 包括混合型血管起源和變性起源的癡呆、早老性癡呆、老年性癡呆和與帕金 森病相關(guān)的癡呆在內(nèi)的癡呆、進(jìn)行性核上麻痹或皮質(zhì)基質(zhì)變性。
因此，通過用抑制劑(例如本申請(qǐng)所提供的化合物)抑制BACE，對(duì)抑制AI3 及其部分的沉積是有用的。
抑制A(3沉積的治療意義已經(jīng)激發(fā)了許多團(tuán)隊(duì)分離并表征分泌酶以及識(shí)別它們 的潛在抑制劑(參見，例如，^W001/23533 A2， EP0855444, WO00/17369, WO00/58479, WO00/47618 , WO00/77030 ， WO01/00665 , WO01/00663 , WO01/29563 , WO02/25276, US5,942，400， US6，245，884， US6,221，667， US6，211,235， WO02/02505, WO02/02506 ， WO02/02512 , WO02/02518 , WO02/02520 ， WO02/14264 , WO05/0583U， WO05/097767, WO06/041404, WO06/041氛WO06/0065204, US2006287294, WO0，/138265, WO06/138217, WO06/138230, WO06/138264, WO06/138266, WO06/099379, US20070004786, US20070004730, WO07/011833, WO07/011810)。
與本領(lǐng)域已知的潛在抑制劑相比，本發(fā)明^^物顯示出改善的性質(zhì)，例如改善 了hERG的選擇性。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)?zhí)峁┬滦偷氖絀化合物，其為游離堿形式或者其藥學(xué)上可接受的 鹽、溶劑化物或者鹽的溶劑化物其中
P為p比咬環(huán)； Q為鍵或CH2CH2;
R'獨(dú)立地選自氰基、鹵素、dj^f口曱氧基； m為l或2。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了藥物組合物，其包括作為活性成分的、治療有效量 的式I化合物以及包括藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或者稀釋劑。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了調(diào)節(jié)BACE活性的方法，包括^BACE酶與式I^^4勿接觸。 本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療或者預(yù)防患者與Ap-相關(guān)的病理(pathlology)的方法，
包括給予患者治療有效量的ia^^勿。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了本申請(qǐng)披露的4給物，將其用作藥物。 本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種iCPH^物，其為游離堿形式或者其藥學(xué)上可接 受的鹽、溶劑化物或者鹽的溶劑化物
其中
P為p比咬環(huán)'， Q為鍵或CH2CH2;
W獨(dú)立^it自tt、卣素、C^^^曱絲； m為l或2;
制牛是不包括下述^4勿；
2-#^-6-[3-(5-溴他咬-3-基)苯基]隱3,6^二曱基-5，6-二氬嘧。定4(3H)-酮； 2-#S-6-[3-(2-氟p比咬-3-基)苯基]-3,6畫二曱基-5，6-二氫嘧咬-4(3H)-酮； 2-#^-6-[3-(2-氯-3畫氟p比咬-4隱基)苯基]陽(yáng)3，6畫二曱基陽(yáng)5,6-二氫嘧咬-4(3H)"酮。 本發(fā)明的另一個(gè)方面，揭:供了一種力^^4勿，其中C^^i^^曱基。 本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種iU^^4勿，其中Q^4直^4超directbond)。 本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種式I化合物，其中m為l，以及W為氰 基、曱氧基或者鹵素。在該方面的一個(gè)具體實(shí)施方案中，W為卣素，所述囟素為連接在吡啶環(huán)
2-位上的氯。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種式I化合物，其中m為2，以及W代表
一個(gè)卣素和一個(gè)曱基。
在該方面的 一個(gè)實(shí)施方案中，所述卣素為連接到吡啶環(huán)6-位上的氟。 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種式I化合物，其中m為2，以及R'代
表兩個(gè)卣素原子。
在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)卣素原子代表下列卣素組合中的 任一個(gè)組合連接在吡咬環(huán)2-和3-位上的氯；連接在吡啶環(huán)2-位上的氟和連 接在吡啶環(huán)5-位上的溴；連接在吡啶環(huán)2-位上的氯和連接在吡啶環(huán)5-位上的 氟；連接在吡啶環(huán)2-位上的氟和連接在吡啶環(huán)5-位上的氯。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種式I化合物，其中Q代表CH2-CH2。
在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，m為l, Ri選自卣素或者曱氧基，例如R1 為連接在吡啶環(huán)2-位上的氯。
在該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，m為2并且R'代表兩個(gè)卣素原子，例如 R'為連接在吡啶環(huán)2-位上的氟和連接在吡啶環(huán)5-位上的氯。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了式I化合物，其為游離堿形式或者其藥 學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者鹽的溶劑化物，所述化合物為
5-[3-(2-氨基-1,4-二曱基-6-氧代-1 ，4,5,6-四氫嘧啶-4-基)苯基]吡啶-3-曱腈 鹽酸鹽；
2-氨基-6-[3-(2，3-二氯吡啶-4-基)苯基]-3,6-二甲基-5,6-二氫嘧啶-4(3H)-酉同
乙酸鹽；
2-氨基-6-[3-(5-溴-2-氟吡啶-3-基)苯基]-3,6-二曱基-5，6-二氫嘧啶-4(3H)-
酮乙酸鹽；
2-氨基-6-[3-(2-氯-5-氟吡啶-4-基)苯基]-3,6-二甲基-5，6-二氫嘧啶-4(3印-
酮三氟乙酸鹽；
2-氨基-6-[3-(5-氯-2-氟吡啶-3-基)苯基]-3，6-二曱基-5，6-二氫嘧啶-4(3H)-酮鹽酸鹽；
2-氨基-6-[3-(6-氟-5-曱基吡啶-3-基)苯基]-3,6-二曱基-5,6-二氫嘧啶 -4(3H)-酮鹽酸鹽；
2-氨基-6-[3-(2-氯吡啶-4-基)苯基]-3，6-二曱基-5,6-二氫嘧啶-4(3H)-酮鹽
102-氨基-6-{2-[3-(2-氯吡啶-4-基)苯基]乙基}-3,6-二曱基-5，6-二氫嘧啶 -4(3H)-酮鹽酸鹽；
2-氨基-6-[3-(5-曱氧基吡啶-3-基)苯基]-3，6-二曱基-5,6-二氫嘧啶-4(3H)-酮鹽酸鹽；
2_氛基_6_(2_[3—(6_曱氧基吡啶_2_基)苯基]乙基}-3,6—二曱基-5，6-二氫嘧啶
-4(3H)-西同鹽酸鹽；和
2-氨基-6-{2-[3-(5-氯-2-氟吡啶-3-基)苯基]乙基}-3,6-二曱基-5,6-二氫嘧 咬-4(3H)-酮鹽酸鹽。
式I化合物中的一些可以具有立體中心和/或幾何異構(gòu)中心(E-和Z-異構(gòu) 體)，并且能夠理解的是，本發(fā)明包括所有這些光學(xué)異構(gòu)體、對(duì)映異構(gòu)體、 非對(duì)映異構(gòu)體、阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體。
本發(fā)明涉及上述定義的式I化合物及其鹽的用途。用于藥物組合物中的 鹽為藥學(xué)上可接受的鹽，但是其它鹽可以用于生產(chǎn)式I化合物。
可以理解的是，本發(fā)明涉及式I化合物的任何互變異構(gòu)形式以及所有互 變異構(gòu)形式。
本發(fā)明化合物可以用作藥物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式I化 合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、互變異構(gòu)體或者其體內(nèi)-可水解的前體，用作 藥物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本文描述的用作用于治療或預(yù)防AP-相關(guān)病理的藥物的化合物。在某些進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述Ap-相關(guān)病理 為唐氏綜合征、(3-淀粉樣血管病、腦淀粉樣血管病、遺傳性腦出血、與認(rèn)知 缺損相關(guān)的障礙、MCI("輕度認(rèn)知缺損")、阿爾茨海默病、記憶喪失、與阿 爾茨海默病相關(guān)的注意力缺陷癥狀、與阿爾茨海默病相關(guān)的神經(jīng)變性 (neurodegenemtion associated with Alzheimer disease)、'混合型血管起源的癡 呆、變性起源的癡呆、早老性癡呆、老年性癡呆、與帕金森病相關(guān)的癡呆、 進(jìn)行性核上麻痹或皮質(zhì)基質(zhì)變性。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、 互變異構(gòu)體或者體內(nèi)-可水解的前體在制備用于治療或者預(yù)防AI3-相關(guān)病理 的藥物中的用途。在某些進(jìn)一步實(shí)施方案中，Ap-相關(guān)病癥包括例如唐氏綜 合征、(3-淀粉樣血管病，例如但不限于腦淀粉樣血管病、遺傳性腦出血、與 認(rèn)知缺損相關(guān)的障礙，例如但不限于MCI("輕度認(rèn)知缺損")、阿爾茨海默病、記憶喪失、與疾病例如阿爾茨海默病相關(guān)的注意力缺陷癥狀、與阿爾茨海默 病相關(guān)的神經(jīng)變性或癡呆包括混合型血管起源的癡呆和變性起源的癡呆、早 老性癡呆、老年性癡呆、與帕金森病相關(guān)的癡呆、進(jìn)行性核上麻痹或皮質(zhì)基 質(zhì)變性。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制BACE活性的方法，包括使BACE 與本發(fā)明化合物相接觸。 一般認(rèn)為，BACE代表了主要(3-分泌酶活性，并且 其被認(rèn)為是淀粉樣-(3-蛋白(A(3)產(chǎn)生中的限速步驟。因此，通過抑制劑例如本 發(fā)明提供的化合物來抑制BACE將用于抑制A卩及其部分蛋白的沉積。由于A卩 及其部分蛋白的沉積與疾病例如阿爾茨海默病有關(guān)，因此BACE是重要的用 于開發(fā)藥物的候選者，所述藥物用于治療和/或預(yù)防A(3-相關(guān)病理，例如唐氏 綜合征、p-淀粉樣血管病，例如但不限于腦淀粉樣血管病、遺傳性腦出血、 與認(rèn)知缺損相關(guān)的障礙，例如但不限于MCI("輕度認(rèn)知缺損")、阿爾茨海默 病、記憶喪失、與阿爾茨海默病相關(guān)的注意力缺陷癥狀、與阿爾茨海默病相 關(guān)的神經(jīng)變性或癡呆包括混合型血管起源的癡呆和變性起源的癡呆、早老性 癡呆、老年性癡呆、與帕金森病相關(guān)的癡呆、進(jìn)行性核上麻痹或皮質(zhì)基質(zhì)變 性。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療A(3-相關(guān)病理的方法，所述A卩-相關(guān)病理例如唐氏綜合征和p-淀粉樣血管病，例如但不限于腦淀粉樣血管 病、遺傳性腦出血、與認(rèn)知缺損相關(guān)的障礙，例如但不限于MCI("輕度認(rèn)知 缺損")、阿爾茨海默病、記憶喪失、與阿爾茨海默病相關(guān)的注意力缺陷癥狀、 與如阿爾茨海默病相關(guān)的神經(jīng)變性或癡呆包括混合型血管起源的癡呆和變 性起源的癡呆、早老性癡呆、老年性癡呆、與帕金森病相關(guān)的癡呆、進(jìn)行性 核上麻痹或皮質(zhì)基質(zhì)變性，所述方法包括給予哺乳動(dòng)物(包括人)治療有效量 的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、互變異構(gòu)體或者體內(nèi)-可水解的前體。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防A(3-相關(guān)病理的方法，所述A卩-相關(guān)病理例如唐氏綜合癥和(3-淀粉樣腦血管病，例如但不限于腦淀粉樣血管 病、遺傳性腦出血、與認(rèn)知缺損相關(guān)的紊亂，例如但不限于MCI("輕度認(rèn)知 缺損")、阿爾茨海默病、記憶喪失、與阿爾茨海默病相關(guān)的注意缺陷癥狀、 與疾病例如阿爾茨海默病相關(guān)的神經(jīng)退行性變或者癡呆包括混合血管原性 和變性原性癡呆、早老性癡呆、老年性癡呆和與有關(guān)帕金森病、進(jìn)行性核上 性麻痹或者皮質(zhì)基底節(jié)變性有關(guān)的癡呆，所述方法包括給予哺乳動(dòng)物(包括人)治療有效量的式I化合物、或其藥學(xué)上可接受的鹽、互變異構(gòu)體或者體內(nèi) -可水解的前體。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過給予哺乳動(dòng)物(包括人)式I化合物 或其藥學(xué)上可接受的鹽、互變異構(gòu)體或者體內(nèi)-可水解的前體和認(rèn)知增強(qiáng)劑
和/或記憶增強(qiáng)劑來治療或預(yù)防A(3-相關(guān)病理的方法，所述A(3-相關(guān)病理例如 唐氏綜合征和P-淀粉樣血管病，例如但不限于腦淀粉樣血管病、遺傳性腦出 血、與認(rèn)知缺損相關(guān)的障礙，例如但不限于MCI("輕度認(rèn)知缺損")、阿爾茨 海默病、記憶喪失、與阿爾茨海默病相關(guān)的注意力缺陷癥狀、與疾病如阿爾 茨海默病相關(guān)的神經(jīng)變性或癡呆包括混合型血管起源的癡呆、變性起源的癡 呆、早老性癡呆、老年性癡呆、與帕金森病相關(guān)的癡呆、進(jìn)行性核上麻痹或 皮質(zhì)基質(zhì)變性。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過給予哺乳動(dòng)物(包括人)式I化合 物、或其藥學(xué)上可接受的鹽、互變異構(gòu)體或者體內(nèi)-可水解的前體(本發(fā)明在 此提供了組成成分)和膽堿酯酶抑制劑或者消炎劑來治療或預(yù)防A(3-相關(guān)病 理的方法，所述A(3-相關(guān)病理例如唐氏綜合征和(3-淀粉樣血管病，例如但不 限于腦淀粉樣血管病、遺傳性腦出血、與認(rèn)知缺損相關(guān)的障礙，例如但不限 于MCI("輕度認(rèn)知缺損")、阿爾茨海默病、記憶喪失、與阿爾茨海默病相關(guān) 的注意力缺陷癥狀、與疾病如阿爾茨海默病相關(guān)的神經(jīng)變性或癡呆包括混合 型血管起源的癡呆和變性起源的癡呆、早老性癡呆、老年性癡呆、與帕金森 病相關(guān)的癡呆、進(jìn)行性核上麻痹或皮質(zhì)基質(zhì)變性。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過給予哺乳動(dòng)物(包括人)本發(fā)明化 合物和一種非典型抗精神病藥來治療或預(yù)防Ap-相關(guān)病理的方法，所述A卩-相關(guān)病理例如唐氏綜合癥和P-淀粉樣腦血管病，例如但不限于腦淀粉樣血管 病、遺傳性腦出血、與認(rèn)知缺損相關(guān)的障礙，例如但不限于MCI("輕度認(rèn)知 缺損")、阿爾茨海默病、記憶喪失、與阿爾茨海默病相關(guān)的注意力缺陷癥狀、 與疾病如阿爾茨海默病相關(guān)的神經(jīng)變性或癡呆包括混合型血管起源的癡呆、 變性起源的癡呆、早老性癡呆、老年性癡呆、與帕金森病相關(guān)的癡呆、進(jìn)行 性核上麻痹或皮質(zhì)基質(zhì)變性，或者本文描述的任何其它疾病、紊亂或者病癥。 非典型抗精神病藥包括但不限于，奧氮平(商品名Zyprexa)、阿立哌唑(商品 名Abilify)、利培酮(商品名Risperdal)、奎硫平(商品名Seroquel)、氯氮平(商品 名Clozaril),齊拉西酮(商品名Geodon)和奧氮平/氟西汀(商品名Symbyax)。
13在某些實(shí)施方案中，用本發(fā)明化合物治療的哺乳動(dòng)物或者人類已經(jīng)被診 斷患有特定的疾病或紊亂，例如患有本文所描述的那些疾病。在這些情況下， 被治療的哺乳動(dòng)物和人類需要上述治療。然而，不必事先進(jìn)行診斷。
本發(fā)明還包括藥物組合物，其含有作為活性成分的 一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的
化合物及至少一種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或者輔料(excipent)。
本申請(qǐng)中闡明的定義用來明確本申請(qǐng)中使用的術(shù)語。術(shù)語"本文"意指整 個(gè)申請(qǐng)。
本申請(qǐng)中的多個(gè)化合物可以存在特定的幾何構(gòu)型形式或者立體異構(gòu)形 式。本發(fā)明涵蓋了所有這些化合物，包括順式和反式異構(gòu)體、R-和S-對(duì)映體、 非對(duì)映異構(gòu)體、(D)-異構(gòu)體、(L)-異構(gòu)體、其外消旋混合物，及這些化合物 的其它混合物，這些化合物都包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。在取代基例如烷 基中還可能存在另外的不對(duì)稱碳原子。所有這些異構(gòu)體，以及它們的混合物 都在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。本文描述的化合物可以具有不對(duì)稱中心?？梢砸?光學(xué)活性形式或者外消旋形式分離得到含有不對(duì)稱取代原子的本發(fā)明化合 物。本領(lǐng)域已經(jīng)熟知如何制備光學(xué)活性形式的化合物，例如通過拆分化合物 的消旋形式、通過從光學(xué)活性原料開始合成、或者使用光學(xué)活性試劑合成。 如果需要，可以通過本領(lǐng)域已知的方法完成外消旋物質(zhì)的拆分。本文描述的 化合物還可以存在許多烯烴、C二N雙鍵及類似結(jié)構(gòu)的幾何異構(gòu)體，并且所有 這些穩(wěn)定的異構(gòu)體都在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。本文描述了本發(fā)明化合物的順式 幾何異構(gòu)體和反式幾何異構(gòu)體，這些幾何異構(gòu)體可以以異構(gòu)體混合物的形式 分離或者以單獨(dú)的異構(gòu)體形式分離。某一種結(jié)構(gòu)的所有手性、非對(duì)映體、外 消旋形式以及所有幾何異構(gòu)體形式都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，除非特別指明 特定的立體化學(xué)或者異構(gòu)體形式不包括在內(nèi)。
當(dāng)連接取代基的鍵顯示為穿過連接同 一環(huán)上兩個(gè)原子的鍵的形式時(shí)，則 表示所述取代基可以連接到環(huán)上的任何原子上。當(dāng)列出取代基而未指出所述 取代基是通過哪個(gè)原子連接到給定通式化合物的剩余部分時(shí)，則所述取代基 可以通過該取代基中的任意原子連接。如果取代基的組合、取代基位置的組 合和/或變量的組合能夠形成穩(wěn)定化合物，則這樣組合也是可以的。
本文中的"烷基，，單獨(dú)使用或者作為后綴或前綴使用，用以包括具有l(wèi)至 12個(gè)碳原子的支鏈和直鏈飽和脂肪烴基團(tuán)，或者如果規(guī)定了特定數(shù)目的碳原 子則將指的是所述特定碳原子數(shù)的烷基。例如"Cw烷基"表示具有l(wèi)、 2、 3、4、 5或6個(gè)碳原子的烷基。烷基的例子包括但不限于曱基、乙基、正丙基、 異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基。
本文使用的"鹵代，，或"卣素"指的是氟、氯、溴和碘。
本文使用的"藥學(xué)上可接受的，，用來指那些在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適 用于與人類和動(dòng)物組織相接觸且無過度的毒性、刺激、過敏性反應(yīng)或者其它 問題或并發(fā)癥的化合物、物質(zhì)、組合物和/或劑型，與合理的受益/風(fēng)險(xiǎn)的比 率(benefit/risk ratio)匹面己。
本文使用的"藥學(xué)上可接受的鹽"指的是所公開化合物的衍生物，其中母 體化合物通過制成其酸鹽或堿鹽而得到修飾。藥學(xué)上可接受的鹽的例子包 括，但不限于，堿性殘基例如胺的無機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽；酸性殘基例如羧酸 的堿金屬鹽或有機(jī)鹽；依此類推。所述藥學(xué)上可接受的鹽包括常見的無毒鹽 或者母體化合物的季銨鹽，例如由無毒無機(jī)酸或有機(jī)酸形成的鹽。例如，所
述常見無毒鹽包括衍生自無機(jī)酸例如鹽酸的鹽。
本發(fā)明藥學(xué)上可接受的鹽可以從含有堿性或酸性部分的母體化合物采 用常規(guī)的化學(xué)方法合成。通常，上述鹽可以通過使游離酸或游離堿形式的這 些化合物與化學(xué)計(jì)算量的適當(dāng)?shù)氖蛩嵩谒蛟谟袡C(jī)溶液或兩者的混合溶 液中進(jìn)行反應(yīng)；通常使用無水介質(zhì)如二乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙 腈。
本文使用的"體內(nèi)可水解的前體"意指含有羧基或羥基的式(I)化合物的 體內(nèi)可分解(或可裂解)的酯。例如氨基酸酯、Cw烷氧基甲酯如甲氧基曱基；
d-6烷酰氧基曱基酯如特戊酰氧基曱基；C3-s環(huán)烷氧基羰基氧基d-6烷基酯如
1-環(huán)己基羰基氧基乙基、乙酰氧基曱氧基或氨基磷酸環(huán)脂(phosphoramidic cyclic esters)。
本文使用的"互變異構(gòu)體"意指由于氫原子的遷移形成的、存在平衡中的 其它結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體。例如，S同-烯醇互變異構(gòu)，其中得到的化合物既具有酮 的性質(zhì)也具有不飽和醇的性質(zhì)。
本文使用的"穩(wěn)定化合物，，和"穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，，是指足夠穩(wěn)固，能夠從反應(yīng)混合 物中經(jīng)受分離得到有效純度的化合物，并進(jìn)一步配制成有效治療劑。
本發(fā)明化合物進(jìn)一步包括水合物和溶劑化物。
本發(fā)明還包括同位素標(biāo)記的本發(fā)明化合物。"同位素標(biāo)記，，或"放射性標(biāo) 記，，的化合物是具有以下特征的本發(fā)明化合物其中 一個(gè)或多個(gè)原子^^皮原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同于自然界中常見原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)的(即天然存在的)原子
2h(也^寫作D，:示氘)、3H(也寫作t，表示氚)、uc、 13c、 14c、、 13n、 15n: 150、170、 180、 18F、 35S、 36C1、 82Br、 75Br、 76Br、 77Br、 123I、 124I、 1251和1311。結(jié)合在這些放射性標(biāo)記的化合物中的放射性核素取決于所述放射性標(biāo)記的化合物的具體應(yīng)用。例如，就體外受體標(biāo)記和竟?fàn)帨y(cè)定而言，結(jié)合有3！1、 14C、82Br、 125I、 1311或3、的化合物通常是最有用的。就放射性成像應(yīng)用而言，"C、18F、 125I、 123I、 124I、 131I、 75Br、 76Br或"Br通常是最有用的。
應(yīng)該理解的是，"放射性標(biāo)記的化合物"是結(jié)合有至少一個(gè)放射性核素的化合物。在一些實(shí)施方案中，放射性核素選自SH、 14C、 125I、 "S和"Br。
本申請(qǐng)所定義的抗癡呆治療可應(yīng)用為單獨(dú)的療法，或者應(yīng)用為包括本發(fā)明化合物在內(nèi)的常規(guī)化學(xué)療法。上述化療可以包括一個(gè)或多個(gè)下述試劑類型乙酰膽^5威酯酶抑制劑、消炎劑、認(rèn)知和/或記憶增強(qiáng)劑或者非典型抗精神病劑。
這種聯(lián)合治療可通過各個(gè)治療成分的同時(shí)、依次或分開給予來進(jìn)行。這些組合產(chǎn)品使用本發(fā)明的化合物。
本發(fā)明的化合物可按以下方式來給予口服、腸胃外、口腔、陰道、直腸、吸入、吹入、舌下、肌內(nèi)、皮下、局部、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸內(nèi)、靜脈內(nèi)、硬膜外、鞘內(nèi)、腦室內(nèi)和注射到關(guān)節(jié)中。
當(dāng)針對(duì)具體患者確定最合適的個(gè)體給藥方案和劑量水平時(shí)，劑量取決于給藥途徑、疾病的嚴(yán)重度、患者的年齡和體重及主治醫(yī)師所通?？紤]的其它因素。
本發(fā)明化合物用于治療癡呆的有效量為足以對(duì)癥緩解溫血?jiǎng)游?特別是人類)癡呆癥狀、減緩癡呆進(jìn)展或降低癡呆癥狀患者惡化危險(xiǎn)的量。
為了從本發(fā)明的化合物制備藥物組合物，惰性可藥用載體可以是固體或液體。固態(tài)制劑包括粉劑、片劑、可分散顆粒劑、膠嚢劑、扁嚢劑和栓劑。固體載體可以是一種或多種物質(zhì)，其也可作為稀釋劑、矯味劑、增溶劑、潤(rùn)
滑劑、助懸劑、粘合劑或片劑崩解劑，其也可以是包封材料。
在粉劑中，載體為微細(xì)粉碎的固體，其與微細(xì)粉碎的活性成分混合。在片劑中，活性成分與具有必要粘合性質(zhì)的載體按合適的比例混合，然后壓制成所期望的形狀和大小。為了制備栓劑組合物，首先將低熔點(diǎn)蠟(例如脂肪酸甘油酯和可可脂的混合物)熔化，然后例如通過攪拌，在其內(nèi)分散活性組分。然后，將熔化的均質(zhì)混合物傾倒到合適尺寸的^^具中，然后使其冷卻和固化。
合適的載體包括碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、乳糖、蔗糖、果膠、糊精、淀粉、黃蓍膠、曱基纖維素、羧曱基纖維素鈉、低熔點(diǎn)蠟、可可脂等。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式(I)化合物或其可藥用鹽，其用于對(duì)哺乳動(dòng)物(包括人類)進(jìn)行治療性處置(包括預(yù)防性處置)，其通常按照標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)實(shí)踐來配制成藥物組合物。
除本發(fā)明的化合物之外，本發(fā)明的藥物組合物也可包含一種或多種對(duì)一種或多種本申請(qǐng)所述病癥有治療價(jià)值的藥理成分，或與一種或多種對(duì)一種或多種本申請(qǐng)所述病癥有治療價(jià)值的藥理成分聯(lián)用(同時(shí)或依次給予)。
術(shù)語"組合物"意在包括活性成分或其可藥用鹽與可藥用載體的制劑。例
如，本發(fā)明可通過本領(lǐng)域所已知的方法來配制成以下形式例如片劑、膠嚢
劑、水性溶液劑或油性溶液劑、混懸劑、乳劑、膏劑、軟膏劑、凝膠劑、鼻噴霧劑、栓劑、用于吸入的微細(xì)粉碎的粉劑或氣霧劑或霧化劑及用于腸胃外使用(包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或輸注)的無菌水性溶液劑或油性溶液劑或混懸劑或無菌乳劑。
液態(tài)組合物包括溶液劑、混懸劑和乳劑。作為適于腸胃外給藥的液體制劑的實(shí)例，可提及活性化合物的無菌水溶液或無菌水-丙二醇溶液。也可將液體組合物配制成水性聚乙二醇溶液?？诜o藥用的水性溶液劑可通過以下
方法來制備將活性成分溶解在水中，并且根據(jù)需要來添加合適的著色劑、矯味劑、穩(wěn)定劑和增稠劑?？诜玫乃曰鞈覄┛赏ㄟ^以下方法來制備將微細(xì)粉碎的活性成分與粘性物質(zhì)(例如天然/合成樹膠、樹脂、甲基纖維素、羧曱基纖維素鈉和制藥領(lǐng)域所已知的其它助懸劑)一起分散在水中。
藥物組合物可以是單位劑型。就這種形式而言，將組合物分成含有適量活性成分的單位劑量。單位劑型可以是包裝制劑，所述包裝包含分開量的制劑，例如包裝在小瓶或安瓿中的片劑、膠嚢劑和粉劑。單位劑型也可以是膠嚢劑、扁嚢劑或片劑本身，或可以是合適數(shù)目的任意這些包裝形式。
可將組合物配制成用于任意合適的給藥途徑和方法?？伤幱幂d體或稀釋劑包括在適于以下給藥的制劑中所使用的那些物質(zhì)口服給藥、直腸給藥、鼻給藥、局部(包括口腔和舌下)給藥、陰道給藥或腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、
17靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)和硬膜外)給藥。出于方便的原因，制劑可以是單位劑型，并且可通過藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的任意方法來制備。
就固體組合物而言，可使用常規(guī)無毒性固體載體，包括例如藥物級(jí)的甘露醇、乳糖、纖維素、纖維素衍生物、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等?？捎糜诮o藥的液體組合物可例如通過以下方法來制
備將以上所定義的活性化合物及任選的藥物輔料溶解、分散等在載體(例如水、鹽水、葡萄糖水溶液、甘油、乙醇等)中，由此形成溶液或混懸液。如果需要，待給藥的藥物組合物也可包含少量無毒性輔助物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖劑等，例如乙酸鈉、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺乙酸鈉、脫水山梨醇單月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。制備這些劑型的實(shí)際方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，或?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的；例如參見Remington's Pharmaceutical Sciences,mack Publishing Company, Eastern,Pennsylvania, 15th Edition, 1975。
可按各種方法來對(duì)本發(fā)明的化合物進(jìn)行衍生。本申請(qǐng)所使用的化合物的"衍生物，，包括鹽(例如可藥用鹽)、任意復(fù)合物(例如與環(huán)糊精等化合物形成的包合物(inclusion complex)或螯合物，或與例如Mn"和Zn"等金屬離子形成的配合物)、游離酸或游離堿、化合物的多晶型、溶劑化物(例如水合物)、前藥或脂質(zhì)、偶聯(lián)伴倡(couplingpartner)和保護(hù)基。例如，"前藥"指可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成生物活性化合物的任意化合物。
本發(fā)明化合物的鹽優(yōu)選為生理上良好耐受和無毒性的鹽。鹽的許多實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。所有這些鹽都在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且所涉及的化合物包括化合物的鹽形式。
在化合物包含胺官能團(tuán)的情況下，這些化合物可例如通過以下方法來形成季銨鹽按照技術(shù)人員眾所周知的方法，使所述化合物與烷化劑反應(yīng)。這些季銨化合物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
包含胺官能團(tuán)的化合物也可形成N-氧化物。本申請(qǐng)所涉及的包含胺官能團(tuán)的化合物也包括N-氧化物。
在化合物包含若干胺官能團(tuán)的情況下，可將一個(gè)或多個(gè)氮原子氧化成N-氧化物。N-氧化物的具體實(shí)例為叔胺的N-氧化物或含氮雜環(huán)的氮原子的N-
氧化物。
N-氧化物可通過以下方法來制備相應(yīng)的胺用氧化劑(例如過氧化氫或過酸(例如過氧羧酸》處理，參見例如/^/va"ced Oga"/c C7^m^^y， byJerrymarch, 4th Edition, Wiley Interscience, pages。 更具體地，可通過L. W.Deady(&". Comm. 1977， 7， 509-514)的方法來制名-N-氧化物，在所述方法中，使胺化合物與間氯過氧苯曱酸(MCPBA)例如在惰性溶劑(例如二氯曱烷)中反應(yīng)。
在化合物包含手性中心的情況下，化合物的各種光學(xué)形式(例如對(duì)映異構(gòu)體、差向異構(gòu)體和非對(duì)映異構(gòu)體及外消旋混合物)都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。化合物可按多種不同的幾何異構(gòu)形式和互變異構(gòu)形式存在，并且所涉及的化合物包括所有這些形式。為了避免疑問，在化合物可按幾種幾何異構(gòu)形式或互變異構(gòu)形式之一存在并且只具體描述或顯示了 一種形式的情況下，所有其它形式都仍然包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
化合物的給藥量隨所治療的患者而變化，并且化合物的給藥量為每天約100ng/kg體重至100mg/kg體重，優(yōu)選為每天10pg/kg至10mg/kg。例如，劑量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本申請(qǐng)所公開的內(nèi)容和本領(lǐng)域的知識(shí)來容易地確定。因而，技術(shù)人員能夠容易地確定組合物中化合物和任選添加劑、媒介物和/或載體的量，也可容易地確定在本發(fā)明的方法中所給藥的量。
本發(fā)明的化合物已經(jīng)顯示出體外抑制P分泌酶(包括BACE)活性。已經(jīng)顯示的是，卩分泌酶的抑制劑可用于阻斷AI3肽的形成或積聚，因此在治療阿爾茨海默病和與A(3肽水平提高和/或Ap肽沉積相關(guān)的其它神經(jīng)變性疾病中具有有益的作用。因此，相信本發(fā)明的化合物可用于治療阿爾茨海默病和與癡呆相關(guān)的疾病。因此，預(yù)期本發(fā)明的化合物及其鹽具有對(duì)抗年齡相關(guān)疾病(例如阿爾茨海默病及其它A(3相關(guān)病理，例如唐氏綜合征和P-淀粉樣血管病)的活性。預(yù)期本發(fā)明的化合物最有可能作為單一的藥物來使用或與很多種認(rèn)知缺陷增強(qiáng)藥物聯(lián)用。
通用方法
使用的原料可以從商業(yè)來源獲得，或者根據(jù)文獻(xiàn)方法制備。使用在2450mHz產(chǎn)生連續(xù)輻射的Creator、 Initiator或者Smith合成器單才莫微波室中進(jìn)行微波加熱。
在指示氘化溶劑中在300mHz、 400mHz、 500mHz或者^0mHz下記錄!HNMR光譜。除非另有說明，否則可以使用裝配3mm流動(dòng)注射SE卜H/D"C探頭(Z-梯度(Z-gradients))的Bruker av400 NMR波譜儀獲得400mHz光譜，使用BEST 215液體裝置注射試樣，或者使用裝備有4-核氣動(dòng)探針頭(Z-梯度)的 Bruker DPX400 NMR波譜儀獲得光譜。使用裝備有5mm TXI探針頭(Z-梯度) 的Bruker DRX600 NMR波譜儀記錄600MHz 'HNMR。使用Varian INOVA, (magnet: Oxford AS500) 500 NMR波譜儀記錄500mHz lHNMR。在TMS的低 磁場(chǎng)和高磁場(chǎng)給出化學(xué)位移(ppm)。共振多重性用s、 d、 t、 q、 m和br表示， 其分別表示單峰、雙峰、三重峰、四重峰、多重峰和寬峰。
使用裝配有Waters X-TerramS、 C8-柱、(3.5 |im, 100mm x 3.0mm i.d.)的 Waters LCMS記錄LC-MS分析。流動(dòng)相系統(tǒng)由A: 10mM乙酸胺的水/乙腈 (95:5)溶液和B:乙腈構(gòu)成。釆用0。/。至100。/。B的線性梯度，運(yùn)行4-5分鐘、流 速為1.0mL/min 。質(zhì)譜儀裝配有在陽(yáng)離子或者陰離子模式操作的電噴霧離子 源(ESI)。毛細(xì)管電壓(capillary voltage)為3 kV并且質(zhì)譜儀典型地在w/z 100-700之間掃描?？商鎿Q地，LC-MShPLC條件如下所示柱AgilentZorbax SB-C8 2mm ID X 50mm;流速1.4mL/min;梯度95。/。A至90。/。B,運(yùn)行超 過3分鐘，保持1分鐘，斜線降至95。/。A，運(yùn)行超過l分鐘并保持l分鐘。其中 A = 2 %的乙腈水溶液并含有O.l %的甲酸和B = 2 %的乙腈水溶液并含有O.l %的曱酸溶液。使用具有大氣壓化學(xué)電離(APCI或CI)或電噴霧(+ESI)的自動(dòng) 體系測(cè)定UV-DAD 210-400 nm質(zhì)譜(MS)。通常，僅報(bào)告其中能觀察到母體化 合物質(zhì)量的光譜。針對(duì)分子報(bào)告了最低質(zhì)量主要原子，其中同位素裂分形成 多個(gè)質(zhì)譜峰(例如當(dāng)存在氯時(shí))。
使用Merch TLC-板(硅膠60 254)進(jìn)行薄層色譜分析(TLC)， spots是UV可 見的。使用Merck硅膠 60(0.040-0.063mm)或者采用Combi Flash CompanioiT體系利用RediSep 正相快速柱進(jìn)行快速色譜。
已經(jīng)使用ACD/Name 、譯本8.08或者9.0(來自Advanced Chemistry Development, Inc.(ACD/Labs)、 Toronto ON、 www.acdlabs.com、 2004的庫(kù)欠<牛) 命名化合物。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例
下面列舉了大量本發(fā)明化合物的非限定性實(shí)施例。
20實(shí)施例l
(2E)-3-(3-溴苯基)丁-2-烯酸叔丁面;
向攪拌的、-78"的二甲基磷?；宜崾宥□?21.911^, O.lllmol)的四氫 呋喃(150ml)溶液中加入正丁基鋰的己烷溶液(1.6m, 72.0mL， (U16mo1)，將 所得反應(yīng)物在-78°C攪拌10min 。在混合物中加入3，-溴苯乙酮 (3'-bromoacetophenone)(13.4mL， 0.100mol)且使反應(yīng)混合物升到室溫并攪拌 18h。減壓除去四氫呋喃得到固體。向所述固體中加入己烷(300mL)，研磨固 體1小時(shí)。通過硅藻土過濾混合物，減壓濃縮濾液得到28.9g標(biāo)題化合物。其 直接用于下一步反應(yīng)'HNMR (300mHz， DMSO-^): S 1.47 (s， 9h); 2.44 (s， 3h); 6.05 (s, lh); 7.36 (t， /= 7.8hz， lh); 7.53 (m， 2h); 7.71 (s, lh)。
實(shí)施例2
(2五)-3-(3-溴苯基)丁-2-烯酸
將(2五)-3-(3-溴苯基)丁-2-烯酸叔丁酯(28.9g)粗品的三氟乙酸二氯曱 烷(l:l， 300mL)溶液在室溫?cái)嚢?5min，然后減壓除去溶劑得到固體粗品。 在己烷(400mL)中研磨所得固體粗品，過濾并真空干燥，得到8,87g標(biāo)題化合 物(收率38%): !HNMR (300mHz, DMSO-^): S 2.46 (s， 3h); 6.11 (s， lh); 7.37 (t， /= 7.8hz, lh); 7.53 (m, 2h); 7.72 (t, /= 1.5hz, lh)。
實(shí)施例3
(2￡)-3-(3-溴苯基)丁-2-烯酰氯
在(2五)-3-(3-溴苯基)丁-2-烯酸(1.0g, 4.15mmol)的二氯甲烷(10mL)懸浮液 中加入草酰氯(434 pL, 4.98mmol)，接著加入A^iV-二曱基曱酰胺(15 pL，
210.207mmol)，在室溫?cái)嚢杷梅磻?yīng)物。2h后，減壓除去溶劑，得到標(biāo)題化合 物'HNMR (300mHz, DMSO-^): S 2.51 (s, 3h); 6,44 (s, lh); 7.29 (t, /= 7,8hz, lh); 7.43 (d， J= 7.8hz, lh); 7.57 (d， J= 8.7hz， lh); 7.63 (t, J= 1.8hz， lh)。 實(shí)施例4
(2￡)-3-(3-溴笨基)-1氰基-叢曱基丁J-烯酰胺
向-60°C并且攪拌的溴化氰(4.24g， 40.0mmol)的四氫呋喃(lOOmL)溶液中 加入碳酸鈉(6.36g， 60.0mmo1),接著滴加曱胺的四氪呋喃溶液(2.0m, 20.0mL 40.0mmo1)。浴溫保持低于-20。C2小時(shí)。氮?dú)獗Ｗo(hù)下使反應(yīng)物冷過濾通過硅藻 土，向?yàn)V液中加入(2五)-3-(3-溴苯基丁-2-烯酰氯(5.19g， 20.00mmol)的四氫呋 喃(100mL)溶液。向混合物中加AJV,7V-二異丙基乙胺(4.2mL， 24.0mmo1),將 所得反應(yīng)物在室溫?cái)嚢?h。減壓除去溶劑，將得到的油狀物在高真空下過夜。 所得粗品化合物通過在硅膠柱上用二氯曱烷洗脫來純化，得到4.29g標(biāo)題化合 物(收率75%):工HNMR (300mHz, DMSO畫^): 5 2.44 (s， 3h); 3.22 (s， 3h); 6.65 (s， lh); 7.42 (t， 《/= 7.8hz， lh); 7.58 (d, /= 8.4hz, lh); 7.65 (d， /= 7.8hz, lh); 7.76 (t， /= 1.8hz, lh)。
6-(3-溴苯基)-2-亞氨基-1-(4-甲氧基芐基)-3,6-二曱基四氫嘧啶-4(1//)-酮
在(2五)-3-(3-溴苯基)-A^-氰基-iV-曱基丁-2-烯酰胺(12.77g, 45.75mmol)的 A^V-二甲基曱酰胺(50mL)溶液中加入4-曱氧基千胺(14.9mL， 114.38mmo1)。 4h后，減壓除去溶劑，將得到的粘稠油在高真空中過夜。所得粗品化合物用 連續(xù)硅膠柱色譜來純化。首先用二氯甲烷和甲醇(2.5:97.5)/二氯曱烷、曱醇/ 二氯曱烷(5:95)洗脫來純化，得到18.96g粗產(chǎn)品。然后用乙醚、乙酸乙酯、曱 醇/乙酸乙酯(5:95)、甲醇/乙酸乙酯(10:90)洗脫進(jìn)行第二次純化，得到15.48 克標(biāo)題化合物(收率81%): 'HNMR (300mHz， DMSO-d/TFA-力S 1.65 (s， 3h);
實(shí)施例53.20 (s, 3h); 3.30 (d, /= 16.5hz， lh); 3.58 (d, /= 16.8hz, lh); 3.78 (s, 3h); 4.97 (dd,= 4.8hz, 2h); 6.96 (d， 《/ = 8.7hz， 2h); 7.34 (m, 4h); 7.57 (m， 2h);mS (APCI+)m/z 416.08 [M+l]+。 實(shí)施例6
2-氨基-6-(3-溴苯基)-3，6-二甲基-5,6-二氫嘧啶-4(3/7)-酉同
向6-(3-溴苯基)-2-亞氨基-1-(4-曱氧基芐基)-3，6-二曱基四氫嘧啶-4(1/^)-酮的乙腈(150mL)溶液中加入水(50mL)，接著加入硝酸鈰銨(61.15g ， 111.55mmo1),使所得反應(yīng)物攪拌18h。然后向其中加入硅藻土(32g)，接著加 入碳酸氬鈉(31.23g, 371.8mmo1),使反應(yīng)物攪拌2h。 lh后再加入珪藻土(15g)。 使反應(yīng)物過濾通過硅藻土，減壓濃縮濾液。將得到的橙色固體置于高真空中。 使用硅膠柱進(jìn)行粗提，洗脫液為曱醇/二氯曱烷/乙酸(15:85:0.1)。用甲醇研磨 所得的橙色固體，得到第一批標(biāo)題化合物。減壓除去濾液中的溶劑，得到的 橙色固體用乙醇研磨，得到第二批標(biāo)題化合物。合并兩批化合物得到8.75g 標(biāo)題化合物(收率79%): !HNMR (300mHz, DMSO-iVTFA-fiO: 5 1.64 (s, 3h); 3.14 (s, 3h); 3.19 (d, /= 16.5hz， lh); 3.49 (d， J= 16.2hz, lh); 7.39 (m， 2h); 7.55 (m, lh); 7.67 (s, lh);mS (APCI+)m/z 296.0 [M+l]+。
5-[3-(2-氨基-l ，4-二曱基-6-氧代-l ,4,5，6-四氫嘧啶-4-基)苯基]吡啶-3-曱腈
鹽酸鹽
向攪拌下的5-溴吡啶-3-曱腈(0.088g, 0.48mmol)的無水四氫呋喃(SmL) 溶液中加入硼酸三異丙基酯(0.33mL, 1.44mmo1)。將得到的溶液冷卻至-70°C
實(shí)施例7
23并且滴加正丁基鋰(0.59mL， 2.5m己烷溶液，1.49mmo1)。將所得混合物在-70 。C攪拌lh，然后使其升溫至室溫。向所得混合物中加入鹽酸水溶液(1.2mL， 2m, 2.4mmo1),然后將混合物攪拌5min，接著加入碳酸鈉水溶液(2.4mL， 2m, 4.8mmo1)。將混合物再攪拌10min后，向其中加入2-氨基-6-(3-溴苯基)-3，6-二 曱基-5,6-二氫嘧啶-4(3^)-酮(0.100g， 0.34mmol)和[l,l'-雙(二苯基膦)二茂鐵] 二氯化鈀(II)二氯曱烷加合物(0.047g, 0.057mmo1),使得到的混合物在65。C 加熱過夜。蒸去溶劑，使用乙腈/三乙胺(95:5)作為洗脫液在硅膠柱上純化殘 余物。通過制備性HPLC，使用Xterra柱(19x300mm)進(jìn)行額外的提純，O.lm 乙酸銨水溶液/乙腈(10至50%乙腈)作為洗脫液，得到0.022g堿。將得到的堿 溶解在氯仿和曱醇中，向所得混合物中加入鹽酸(4M乙醚溶液)，接著加入乙 醚直到產(chǎn)生沉淀。過濾收集固體并在70。C進(jìn)行真空干燥，得到10mg標(biāo)題化合 4勿(卄欠率8.3%): 'HNMR (DMSO-4 400mHz) 5 10.43 (s， lh)， 9.24 (d， 《/ = 2.3hz, lh), 9.05 (d,/= 1.8hz， lh)， 8.71 (t，^2.0hz， lh)， 8.72-8.62 (m, 2h)， 7.92 (s, lh): 7.82 (d， 《/ = 7.8hz, lh)， 7.59 (t， J = 7.8hz， lh), 7.50 (d, J = 8.0hz, lh)， 3.58 (d, J = 16.3hz, lh)， 3.22 (d， J = 16.6hz, lh)， 3.09 (s， 3h), 1.67 (s, 3h)。
2一氨基_6_[3—(2，3-二氯吡啶-4-基)苯基]-3,6-二甲基-5，6-二氫嘧啶-4(3^)-酉同
乙酸鹽
將2-氨基-6-(3-溴苯基)-3,6- 二曱基-5,6- 二氫嘧啶-4(3//)-酮(0.1 OOg ， 0.34mmo1)、 (2,3-二氯吡啶-4-基)硼酸(0.090g， 0.47mmo1)、 [l,l'-雙(二苯基膦) 二茂鐵]二氯化鈀(II).二氯曱烷加合物(0.027g, 0.034mmol和碳酸鈉水溶液 (0.59mL， 2m, 1.18mmol)溶解在四氫呋喃和水(9:l， 3mL)的混合物中，通過 微波輻射在140。C加熱10min。蒸去溶劑，將殘余物在水和二氯曱烷(3xlOmL) 之間分配。合并萃取物，用硫酸鈉干燥，真空除去溶劑得到0.1g殘余物。所
實(shí)施例8述殘余物通過制備性HPLC，使用Xterra柱(19x300mm)進(jìn)行提純，O.IM乙酸 銨水溶液/乙腈(25-65%乙腈)作為洗脫液。收集含有產(chǎn)物的部分，真空蒸發(fā)， 在25。C真空拒中干燥過夜，得到21mg標(biāo)題化合物(收率15。/。) 'HNMR (DMSO-4 400mHz) 5 8.44 (d， / = 4.8hz， lh)， 7.62-7.59 (m, lh)， 7.57 (d， 《/ = 8.3hz， lh)， 7.50-7.44 (m， 2h)， 7.36 (d, / = 7.8hz, lh)， 3.00 (s， 3h), 2.92 (d， J = 16.1hz, lh), 2.78 (d， J = 16.1hz, lh)， 1.89 (s， 3h), 1.41 (s， 3h)。
2-氨基-6-[3-(5-溴-2-氟吡啶-3-基)苯基]-3，6-二曱基-5，6-二氫嘧啶-4(3//)-
酮乙酸鹽
以2-氨基-6-(3-溴苯基)-3,6-二曱基-5,6-二氫嘧啶-4(3//)-酮和(5-溴-2-氟吡 啶-3-基)硼酸作為起始原料，按照實(shí)施例8描述的方法合成標(biāo)題化合物，得到 5mg標(biāo)題化合物(收率3 %): 'HNMR (DMSO-4 400mHz) 5 8.40-8.38 (m， lh)， 8.34 (dd, /= 8.8, 2.5hz， lh), 7.73-7.69 (m， lh), 7.57-7.53 (m, lh), 7.51-7.42 (m， 2h)， 3.00 (s, 3h), 2.91 (d, / = 15.8hz, lh), 2.78 (d, / = 16.1hz, lh), 1.89 (s， 2h)， 1.41 (s， 3h)。
2-氨基-6-[3-(2-氯-5-氟吡啶-4-基)苯基]-3，6-二曱基-5，6-二氫嘧啶-4(3/7>
酮三氟乙酸鹽
實(shí)施例9
實(shí)施例IO
25以2-氨基-6-(3-溴苯基)-3,6-二曱基-5，6-二氫嘧啶-4(3/i0-酮和(2-氯-5-氟吡 啶-4-基)硼酸作為起始反應(yīng)物按照實(shí)施例8描述的方法合成標(biāo)題化合物。用制 備性HPLC，使用Xterra柱(19x300mm)進(jìn)行提純，以O(shè).l %三氟乙酸緩沖液/曱 醇(20-60 %曱醇)作為洗脫液，得到16mg標(biāo)題化合物(收率5 % ): 'HNMR (DMS0-4 400mHz) 5 10.33 (br s， lh)， 8.66 ( br s， 2h)， 8.57 (d, / = 2,0hz， lh)， 7.80 (d, J = 5.8hz, lh), 7.73-7.69 (m， lh), 7.69-7.64 (m， lh), 7.60 (t, / = 7.6hz， lh)， 7.57-7.53 (m, lh), 3.53 (d, /= 16.6hz， lh), 3.21 (d， /= 16.3hz, lh), 3.08 (s， 3h), 1.67 (s， 3h)。
實(shí)施例ll
4-(3-溴苯基)丁-2_西同
向2,4-戊二酮(15.8mL， 0.154mol)的乙醇(150mL)溶液中加入碳酸鉀 (19.35g， 0.140mol)，接著加入3-溴千基溴化物(35.00g， 0.140mol)，將所得 混合物加熱回流?；亓?8h后，冷卻反應(yīng)物，過濾除去鹽。蒸發(fā)濾液，向殘 余物中加入乙酸乙酯和水(200:100mL)。乙酸乙酯層用鹽酸水溶液(lm， 100mL)洗滌兩次、用飽和碳酸氫鈉(100mL)洗一次、用飽和食鹽水(100mL) 洗滌一次，然后用硫酸鈉干燥。減壓除去乙酸乙酯，將得到的黃色油置于高 真空中。在過濾漏斗中加入硅膠(0.5kg)，用每次1000mL0-100。/c)己烷/二氯曱 烷不連續(xù)梯度洗脫(梯度每次變化5 %)純化所述油。減壓除去經(jīng)純化的產(chǎn)品中 的溶劑，得到18.5g標(biāo)題化合物(收率58。/。) 'HNMR (300mHz, DMSO-^) 5 2.10 (s， 3h), 2.79 (s, 4h), 7.22 - 7.24 (m, 2h), 7.35 - 7.39 (m, lh)， 7.43 (s, lh)。
實(shí)施例12
(2E)-5-(3-溴苯基)-3-曱基戊-2-烯酸叔丁酯
向-78。C、攪拌的叔丁基二甲基膦酰乙酸酯(19.5mL, 89.6mmol)的四氫呋 喃(100mL)溶液中加入正丁基鋰的己烷溶液(1.6m， 35.8mL， 89.6mmo1)，將 所得反應(yīng)物在-78。C攪拌25min。向所得混合物中加入4-(3-溴苯基丁-2-酮
26(18.50g， 8L46mmo1)，使所得反應(yīng)混合物升至室溫并攪拌1.5h。減壓除去四 氫呋喃，得到固體。向得到的固體中加入己烷(300mL)，并研磨固體lh。使 反應(yīng)物過濾通過硅藻土，減壓濃縮濾液，得到標(biāo)題化合物！HNMR(300mHz, DMSO-^)5 1.42 ((!, /= 3.2hz, 9h)， 1.86 (d, /= 1.3hz， lh)， 2.12 l.lhz， 2h)， 2.37 - 2.43 (m, 2h), 2.73隱2.78 (m, 2h)， 5.58 - 5.60 (m， lh)， 7.24 (d, J = 5.2hz, 2h)， 7.35 - 7.40 (m， lh), 7.45 (d， J = 5.4hz, lh)。 實(shí)施例13
(2E)-5-(3-溴苯基)-3-甲基戊-2-烯酸
將(2￡)-5-(3-溴苯基)-3-甲基戊-2-烯酸叔丁基酯粗品的三氟乙酸/二氯曱 烷(l:l, 100mL)溶液在室溫?cái)嚢?5min,然后減壓除去溶劑。將所得固體粗 品在己烷(100mL)中研磨，過濾并真空干燥，得到18.48g標(biāo)題化合物(收率 84%): 'HNMR (300mHz, DMSO-A) 5 1.88 (d， /= 1,3hz， lh), 2.14 (d， Uhz， 2h)， 2.43 (t， ■/= 8.1hz， 2h)， 2.71 - 2.80 (m, 2h)， 5.62 (d， 《/= l.lhz， 5h)， 5.66 (s, 5h)， 7.25 (d, 4.5hz, 2h)， 7.35 - 7.42 (m， lh), 7.47 (s, lh)。
實(shí)施例14
(2五)-5-(3-溴苯基)-7V-氰基-iV，3-二曱基戊-2-烯酰胺
向0。C和攪拌下的(2司-5-(3-渙苯基)-3-曱基戊-2-烯酸(18.48g,68.66mmo1) 的二氯曱烷(100mL)溶液中加入草酰氯(7.2mL， 82.10mmo1)，接著加入7/;, 二曱基曱酰胺(0.266mL， 3.43mmo1),使反應(yīng)混合物保持冷卻lh，然后升溫 至室溫，再攪拌反應(yīng)一個(gè)小時(shí)。減壓除去溶劑，得到21.78g相應(yīng)的酰氯。
向-78。C和攪拌下的溴化氰(14.55g, 0.137mmol)的四氫呋喃(100mL)溶液 中加入碳酸鈉(21.84g， 0.206mmo1)，接著向其中滴加曱胺的四氫吹喃溶液 (2.0m， 68.7mL， 0.137mol)。將所得混合物在-78。C攪拌1.5h。氮?dú)獗Ｗo(hù)下， 使反應(yīng)物冷過濾通過硅藻土，向?yàn)V液中加入上面制備的酰氯(19.75g， 0.0686mmol)的四氬呋喃(lOOmL)溶液。向形成的溶液中加入A/;iV-二異丙基乙胺(14.4mL， 0.082mol)，將所得反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2h。減壓除去溶劑， 將得到的油置于高真空中過夜。粗品化合物經(jīng)硅膠柱純化，二氯曱烷洗脫， 得到16.64g標(biāo)題化合物(收率79。/。) 'HNMR (300mHz， DMSO-^) 5 1.99 (d, /= 1.3hz， lh), 2.14 (d， 《/= l.lhz， 2h)， 2.52 (dd, /= 3.8, 2.0hz, 2h)， 2.79 (t， 《/ = 7.7hz, 2h)， 3.13 (s， 3h)， 6.22 (d, /= 6.6hz, lh), 7.24 - 7.27 (m， 2h), 7.37 - 7.41 (m: lh)， 7.49 (s， lh);mS (APCI+)m/z 307) [M+l]+。
6-[2-(3-溴苯基)乙基]-2-亞氨基-1-(4-曱氧基芐基)-3,6-二曱基四氫嘧啶 -4(1/^)-酮
向(2五)-5-(3-溴苯基HV-氰基-7V，3-二曱基戊-2-烯酰胺(15.00g, 48.83mmo1) 的7V，,二曱基曱酰胺(50mL)溶液中加入4-曱氧基千胺(l2.8mL， 97.66mmo1)。 4h后，減壓除去溶劑，將得到的粘稠油置于高真空過夜。所得粗品化合物通 過硅膠色譜純化，二氯曱烷/曱醇(95:5)洗脫，得到20.45g半純(semi-pure) 的標(biāo)題化合物，將其直接用于下一步驟'HNMR (300mHz, DMSO-d/TFA-力 5 1.34 (s， 3h), 1.93 ((!(!, /= 65.3， 6.0hz, 2h), 2.55 - 2.64 (m, 2h), 3.05 (dd, = 24.0, 16.8hz， 2h), 3.27 (d， ■/= 17.3hz， 3h)， 3.80 (d, 12.3hz， 3h), 4.87 (dd， / = 36.4， 18.5hz， 2h), 6.97 (d, /= 8.6hz, lh)， 7.14 - 7.34 (m， 6h), 7.38 (d， 《/= 1.6hz, lh);mS (APCI+)m/z 444 [M+l]+。
實(shí)施例16
2_氨基_6-[2-(3-溴苯基)乙基]-3,6-二曱基-5,6-四氫嘧啶-4(3//)-酮
向6-[2-(3-溴苯基)乙基]-2-亞氨基-l-(4-曱氧基芐基)-3,6-二曱基四氫嘧啶 -4(l//)-,(20.27g, 45.62mmol)的乙腈(132mL)溶液中加入水(33mL)，接著加 入硝酸鈰銨(75.03g, 136.86mmo1),將所得反應(yīng)物攪拌18h。然后加入硅藻土
實(shí)施例15
28(40g)，接著加入碳酸氫鈉(38.0g， 452mmol)，將所得反應(yīng)物攪拌lh。再向其 中加入額外的硅藻土(20g)，使反應(yīng)物過濾通過硅藻土，用乙腈洗滌硅藻土， 減壓濃縮濾液。將得到黃色膠狀物(gum)溶解在乙醇中，過濾除去鹽，減壓 除去溶劑。將所得固體用乙醚研磨，并將得到的棕褐色固體置于高真空中。 將所述棕褐色固體在乙酸乙酯(500mL)和飽和氯化鈉/水溶液(l:l, 500mL)中 分配。用飽和氯化鈉水溶液洗滌有機(jī)層，硫酸鈉干燥，然后減壓除去溶劑。 用硅膠柱色語純化粗品物質(zhì)，二氯曱烷/曱醇/乙酸(90:10:0.1)作為洗脫液。減 壓除去溶劑，將所得物質(zhì)置于高真空中過夜，得到13.3g標(biāo)題化合物(收率90 %): 1HNMR (300mHz, DMSO-cZ/TFA-J) 5 1.33 (s， 3h)， 1.86 (m， 2h)， 2.64 (t， / =8.5hz, 2h), 2.79 (d, J= 16.4hz, lh)， 2.94 (d, /= 16.4hz, lh), 3.20 (s, 3h), 7.26 (d， /= 5.0hz， 2h), 7.40 (td, /= 4.5， 1.9hz, lh)， 7.49 (s， lh);mS (APCI+)m/z 324 [M+l]+。
實(shí)施例17
2-氨基-6-[3-(5-氯-2-氟吡啶-3-基)苯基]-3，6-二曱基-5，6-四氫嘧啶-4(3//)-
酮鹽酸鹽
向2-氨基-6-(3-溴苯基)-3,6-二曱基-5,6-四氫嘧啶-4(3^-酮(1 OOmg, 0.338mmo1)、四氫呋喃PmL)和水(200 ^iL)的混合物中加入S-氯J-氟吡啶-3-硼酸(83mg, 0.473mmo1)、碳酸鈉(125mg， 1.18mmo1)、雙(三苯基膦)二氯 鈀(II)(30mg, 0.0367mmo1)。在140。C微波輻射反應(yīng)混合物10min。當(dāng)混合物 達(dá)到室溫時(shí)，向其中加入水(10mL)，用乙酸乙酯(20mL)萃取混合物。相分離， 用飽和碳酸鈉水溶液(20mL)洗滌有機(jī)相，硫酸鉀干燥，然后減壓濃縮。使用 制備性HPLC,利用Xterra柱(19x300mm)純化殘余物，0,1%三氟乙酸緩沖溶 液/曱醇(20-60%甲醇)作為洗脫液。將經(jīng)純化的餾分合并，減壓除去乙腈。向 剩余的溶液中加入飽和碳酸氫鈉溶液，直到獲得沉淀，所得混合物用乙酸乙 酯(20mL)萃取。用硫酸鈣干燥有機(jī)相，然后加壓濃縮得到白色固體。將得到 的固體溶于甲醇中(0.5mL),加入鹽酸的乙醚溶液(2m, 200 (iL)。加入乙醚直 到獲得沉淀，得到35mg標(biāo)題化合物(收率27。/0: !HNMR (400mHz, DMSO-^)5 10.78 (s, lh) 8.85 (s， 2h) 8.27 - 8.49 (m， 2h) 7.48 - 7.80 (m， 4h) 3.50 (d, / = 16.2hz, lh) 3.21 (d, /= 16,2hz， lh) 3.08 (s， 3h) 1.64 (s， 3h);mS (AP+)m/z 347 [M+l]+。
按照實(shí)施例17中描述的方法合成實(shí)施例18-23的化合物。 實(shí)施例18
2-氨基-6-[3-(6-氟-5-曱基吡啶-3-基)苯基]-3，6-二曱基-5，6-四氫嘧啶 -4(3/7>酉同鹽酸鹽
JHNMR (400mHz, DMSO畫^) 5 10,71 (s， lh) 8.82 (s, 2h) 8.39 (s, lh) 8.23 (dd， /= 9.6， 1.77hz, lh) 7.83 (s, lh) 7.67 (d, 7.6hz, lh) 7.52 (t, 7.7hz, lh) 7.44 (d， /= 7.8hz, lh) 3.55 (d, /= 16.4hz, lh) 3.21 (d， >/= 16.4hz, lh) 2.31 (s, 3h) 3.07 (s, 3h) 1.64 (s， 3h);mS (ES+)m/z 327 [M+l]+。
實(shí)施例19
2_氨基_6-[3-(2-氯吡啶-4-基)苯基]-3，6-二甲基-5,6-四氫嘧啶-4(3/7)-酮鹽
酸鹽
'HNMR (400mHz, DMSO-^) 5 10.84 (s, lh) 8.88 (s， 2h) 8.49 (d, / = 5.3hz, lh) 7.96 (d, J= 11.9hz, 2h) 7.78 - 7.86 (m， 2h) 7.53 - 7.60 (m, 2h) 3.58 (d, J= 16.4hz， lh) 3.22 (d, J= 16.4hz, lh) 3.07 (s， 3h) 1.64 (s, 3h);mS (ES+)m/z 329 [M+l]+.
實(shí)施例20
2—氨基-6-{2-[3-(2-氯吡啶-4-基)苯基]乙基}-3,6-二曱基-5,6-四氫嘧啶 -4(3^)-酮鹽酸鹽以2-氨基-6-[2-(3-渙苯基)乙基]-3,6-二曱基-5,6-四氫嘧啶-4(3//)-酮為起 始反應(yīng)物進(jìn)行制備'HNMR (400mHz, DMSO-^) 5 9.92 (s, lh) 8.46 (d, / = 5.0hz, 3h) 7.85 (d， 《/= l,Ohz, lh) 7.72 - 7.79 (m， 2h) 7.68 (d, /= 7.6hz, lh) 7.44 (d， 7.6hz， lh) 7.38 (d， 7.6hz, lh) 2.89 - 2.98 (m， lh) 3.16 (s, 3h) 2.78 (d, / =16.4hz, lh) 2.68 - 2.76 (m, 2h) 1.90 (dd, /= 11.2, 5.68hz， 2h) 1.32 (s, 3h);mS (ES+)m/z 357 [M+l]+。
實(shí)施例21
2-氨基-6-[3-(5-曱氧基吡啶-3-基)苯基]-3,6-二甲基-5,6-四氫嘧啶-4(377)-
酮鹽酸鹽
!HNMR (400mHz, DMSO-4) 5 10.91 (s， lh) 8.91 (s, 2h) 8.70 (d, / = 1.3hz, lh) 8.46 (d, 2.5hz, lh) 8.03 (s， lh) 7.96 (s， lh) 7.79 (d， 《/= 7.3hz， lh) 7.49 - 7.60 (m, 2h) 3.99 (s， 3h) 3.56 (d， /= 16.4hz, lh) 3.24 (d, 16.4hz, lh) 3.08 (s， 3h) 1.65 (s, 3h);mS (ES+)m/z 325 [M+l]+。
實(shí)施例22
2-氨基-6-{2-[3-(6-曱氧基吡啶-2-基)苯基]乙基}-3，6-二曱基-5，6-四氫嘧啶 -4(3//)-酉同鹽酸鹽
以2-氨基-6-[2-(3-溴苯基)乙基]-3,6-二曱基-5，6-四氫嘧啶-4(3//)-酮為起始反應(yīng)物進(jìn)行制備iHNMR (400mHz， DMSO-4) § 10.11 (s， lh) 8.54 (s, 2h) 7.88 - 7.98 (m, 2h) 7.72 - 7.81 (m, lh) 7.54 (d, /= 7.3hz， lh) 7,40 (t， /= 7.6hz, lh) 7.30 (d， /= 7.6hz, lh) 6.77 ((!， /= 8.3hz, lh) 3.95 (s, 3h) 3.16 (s, 3h) 2.91陽(yáng) 2.99 (m， lh) 2.70 - 2.82 (m, 3h) 1.82 - 1.94 (m， 2h) 1.32 (s, 3h);mS (ES+)m/z 353 [M+l]+。
實(shí)施例23
2-氨基-6-P-[3-(5-氯-2-氟吡啶-3-yl)苯基]乙基卜3，6-二甲基-S，6-四氫嘧啶 -4(3/7)-酮鹽酸鹽
以2-氨基-6-[2-(3-溴苯基乙基]-3，6-二曱基-5，6-四氫嘧啶-4(3//)-酮為起始 反應(yīng)物進(jìn)4亍制備1HNMR (400mHz, DMSO-^) 5 10.11 (s， lh) 8.54 (s， 2h) 8.31 (d, /= 1.3hz， lh) 8.27 (dd, /= 8.6, 2.5hz， lh) 7.53 (s， lh) 7.41 - 7.49 (m, 2h) 7.33 - 7.38 (m， lh) 3.16 (s， 3h) 2.88 - 2.96 (m， lh) 2.69 - 2.81 (m， 3h) 1.84 - 1.93 (m, 2h) 1.31 (s， 3h);mS (ES+)m/z (375) [M+l]+。
實(shí)施例24
(6-甲氧基吡啶-2-基)硼酸
H0\ /OH B
將2-溴-6-曱氧基吡啶(2g, 10.6mmol)和硼酸三異丙基酯(2.4g， 118mmo1) 混合在曱苯(15mL)中。將所得混合物冷卻至-78。C，歷時(shí)10min向所得混合物 中滴加正丁基鋰的己烷溶液(2.5m， 5.1mL, 12.76mmo1)。將所得混合物在-78。C 攪拌5h,然后使之升溫至-20。C，加入鹽酸水溶液(2m， 10mL)。分離有機(jī)層 和水層，用氫溴酸水溶液(48。/。)將水層的pH酸化至pH4。過濾得到標(biāo)題化合 物0.13g(收率8。/。)，該化合物沒有經(jīng)進(jìn)一步表征就直接用于下一步。
實(shí)施例25
(5-曱氧基吡啶-3-基)硼酸I
按照實(shí)施例24描述的方法、以3-溴-5-曱氧基吡啶為起始反應(yīng)物合成標(biāo)題 化合物，且該標(biāo)題化合物沒有經(jīng)進(jìn)一步表征就直接用于下一步。
測(cè)定
在下述至少 一個(gè)試-驗(yàn)中對(duì)化合物進(jìn)行測(cè)試 p-分泌酶
下面描述了用于裂解(Cleavage)-測(cè)定、熒光測(cè)定、TR-FRET-測(cè)定和 BiaCore測(cè)定的酶將人p-分泌酶(AA 1-AA460)的可溶部分克隆到 ASP2-Fc10-l-IRES-GFP-neoK真核表達(dá)載體上。將該基因融合到IgGl的Fc結(jié) 構(gòu)域(Fc domain)(親和標(biāo)記)中并穩(wěn)定克隆到HEK293細(xì)胞中。將純化的 sBACE-Fc存儲(chǔ)在Tris緩沖液中(pH9.2),純度為95 % 。
IGEN裂解測(cè)定
將酶以1:30稀釋在40mMmES pH 5.0中。將儲(chǔ)備底物在40mMmES pH 5.0 中稀釋至12|iM。將化合物在二曱亞砜中稀釋至所需的濃度(測(cè)定中二曱亞砜 的最終濃度為5%)。測(cè)定在^6孔PCR板(得自Greiner( !/650201))中進(jìn)行。將化 合物的二曱基曱砜溶液(3pL)力n至板中，然后添加酶(27pL),與化合物一起預(yù) 孵育5分鐘。用底物(30pL)來啟動(dòng)反應(yīng)。酶的最終稀釋度為1:60;底物的最終 濃度為6iaM。在室溫反應(yīng)20分鐘后，反應(yīng)通過以下方法來停止取出10^iL的 反應(yīng)混合物，然后將其以l:25稀釋在0.20MTrizmapH8.0中。將化合物稀釋 并通過Biomek FX加至板上或手動(dòng)地加至板上，然后所有剩余的液體操作都 在Biomek 2000儀器上進(jìn)行。
將所有抗體和鏈霉抗生物素蛋白涂覆的珠子稀釋在PBS(包含0.5。/。BSA 和0.5%吐溫20)中。產(chǎn)物通過以下方法來定量將50pL稀釋度為l:5000的新 生表位抗體(neoepitope antibody)力D至50pL稀釋度為1:25的反應(yīng)混合物中。然 后，添力口100pL的PBS(0.5o/oBSA， 0.5%吐溫20)，其含有0.2mg/mL IGEN珠子 (Dynabeadsm-280)和稀釋度為1:5000的釕標(biāo)記的山羊抗兔(Ru-GccR)抗體。新 生表位抗體的最終稀釋度為1:20000， Ru-GAR的最終稀釋度為1:10000，珠子 的最終濃度為0.1mg/mL。在室溫震搖孵育2小時(shí)后，混合物在IGEN儀器上(BioVeris)用Abbiochemial測(cè)定程序來讀取。 熒光測(cè)定
將酶以1:25稀釋在40mMmES pH 5.0中。將儲(chǔ)備底物在40mMmES pH 5.0 中稀釋至30nM。將酶和底物儲(chǔ)備溶液保持在冰上，直至將其置于儲(chǔ)備板中。 利用Biomek FX儀器來進(jìn)行所有液體操作。將酶(9iiL)與lpL化合物DMSO溶 液加至板中，預(yù)孵育5分鐘。當(dāng)測(cè)試化合物的劑量響應(yīng)曲線時(shí)，在潔凈的二 曱基亞砜中進(jìn)行稀釋。添加底物(10iiL)，然后反應(yīng)在室溫避光進(jìn)行25分鐘。 測(cè)定在Coming 384孔板(圓底、低容量、非結(jié)合性表面)(Coming #3676))中進(jìn) 行。酶的最終稀釋度為1:50;底物的最終濃度為15iuM(Km為25iuM)。產(chǎn)物的 焚光在VictorII板讀取器上利用針對(duì)標(biāo)記的Edans肽的方案來測(cè)量，激發(fā)波長(zhǎng) 為360nm,發(fā)射波長(zhǎng)為485nm。 二甲基亞石風(fēng)對(duì)照定義了 100%活性水平，不含 有酶時(shí)的活性定義為0。/?；钚?用40mMmES pH5.0緩沖液來代替)。
TR-FRET測(cè)定
在反應(yīng)緩沖液(乙酸鈉、chaps、氚核x-100、 EDTApHl》中將酶(截短型) 稀釋至6 lag/mL(原液(stock)為1,3mg/mL)和將底物(銪)CEVNLDAEFK(Qsy7) 稀釋至200nM(原液為60pM)。 Biomek FX用于所有液體操作，將酶和底物儲(chǔ) 備溶液保持在冰上，直至將其置于BiomekFX中。在板上加入酶(9 jil)然后加 入l pl化合物的二曱亞砜溶液，混合并預(yù)孵育10分鐘。然后加入底物(IO 混合，室溫下在暗處進(jìn)行反應(yīng)15分鐘。加入終止溶液(7pl，乙酸鈉pH9)使反 應(yīng)停止。在具有340 nm激發(fā)波長(zhǎng)和615 nm發(fā)射波長(zhǎng)的Victor II板標(biāo)儀上測(cè)量 產(chǎn)物的熒光。使用Corning 384孔板(圓底、低容量、非結(jié)合表面)(Coming #3676) 進(jìn)行試驗(yàn)。酶的最終濃度為0.3 nM、底物的最終濃度為IOO nM( 250nM的 Km) 。 二曱亞石風(fēng)對(duì)照組定義100 %活性水平和通過4又加入肽底物定義0 %活 性。對(duì)照抑制劑還可以用于劑量應(yīng)答測(cè)定中，其具有575 nM的IC50值。
P-分泌酶全細(xì)胞測(cè)定
根據(jù)制造商(Invitrogen)提供的方案，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(lipofectamine) 將編碼人全長(zhǎng)APP695的cDNA的pcDNA3.1質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞中。 用0.1-0.5mg/mL的抗菌素(zeocin)選擇克隆體。通過有限的稀釋克隆(limited dilution cloning)來產(chǎn)生均質(zhì)的細(xì)胞系?？寺±米孕虚_發(fā)的ELISA測(cè)定通過 APP表達(dá)的水平和條件培養(yǎng)基中所分泌的A|3的水平來表征。使穩(wěn)定表達(dá)人野玍聖Ai^的他K2 W翊肥(他K-FC」
生長(zhǎng)，所述DMEM包含4500g/L葡萄糖、GlutaMAX和丙酮酸鈉，并用10% FBS、 1 %非必需氨基酸和0.1mg/mL選擇抗體抗菌素補(bǔ)充。
。 #放試發(fā)
當(dāng)融合為80-90 %時(shí)收集細(xì)胞，并以0.2x106細(xì)胞/mL的濃度、100mL細(xì) 胞懸浮液/孔將細(xì)胞播種在黑色潔凈底部的96-孔多聚賴氨酸涂敷的板上。 37°C、 5。/。C02培養(yǎng)過夜后，用含有青霉素和鏈霉素(分別為IOO U/mL和100 嗎/mL)并含有測(cè)試化合物的細(xì)胞培養(yǎng)基替代細(xì)胞培養(yǎng)基，其中二曱基亞砜中 的最終濃度為1%。在37"、 5。/。C02條件下將細(xì)胞暴露在測(cè)試化合物中24小 時(shí)。為了使釋放的A卩定量，將IOO ^L細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至圓底聚丙烯96-孔板(測(cè) 定板)上。保存細(xì)胞培養(yǎng)板，用于在以下的ATP測(cè)定中進(jìn)行ATP測(cè)定。向測(cè)定 板的每個(gè)孔都添加50(iL的原始^r測(cè)溶液(包含0.5^ig/mL的兔抗-Ap40抗體和 0.5嗎/mL生物素化的單克隆鼠6E10抗體(在含有0.5。/。BSA和0.5。/。吐溫20的 DPBS中制備))，然后在4。C孵育過夜。然后，每個(gè)孔都添加50pL二級(jí)檢測(cè)溶 液，所述溶液包含0.5ixg/mL釕標(biāo)記的山羊抗兔抗體和0.2mg/mL鏈霉抗生物素 蛋白涂覆的Dyna珠子(Dynabead)。將板在室溫在板振蕩器上劇烈振蕩l-2小 時(shí)，然后板在IGENm8分析儀中測(cè)量電化學(xué)發(fā)光計(jì)數(shù) (electro-chemiluminescence)。 Ap標(biāo)準(zhǔn)曲線用以下方法得到使用在含有青霉 素和鏈霉素(分別為100U/mL、 100pg/mL)的細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度為20、 10、 2和0.2 ng A(3/mL的標(biāo)準(zhǔn)物獲得A(3標(biāo)準(zhǔn)曲線。
ATP測(cè)定
如以上所指出，在從細(xì)胞板轉(zhuǎn)移100pL培養(yǎng)基用于A卩40檢測(cè)后，將所述 細(xì)胞板用于細(xì)胞毒性測(cè)定，所述細(xì)胞毒性測(cè)定利用測(cè)量細(xì)胞總ATP的細(xì)胞增 生/細(xì)胞毒性試劑盒(ViaLightTM Plus)(Cambrex BioScience)來進(jìn)行。根據(jù)制造 商提供的方案來進(jìn)行。簡(jiǎn)要地，向板的每個(gè)孔都添加50pL細(xì)胞溶解試劑。將 板在室溫孵育1 O分鐘。添加1 OOjiL復(fù)溶的(reconstituted)ViaLightTM PlusATP試 齊寸，2分鐘后，發(fā)光度(luminescence)在LJL板讀取器或WallacTopcount中測(cè)量。
BACE Biacore方案
傳感芯片的制備
將肽過渡態(tài)等構(gòu)物(transition state isostere， TSI)或者亂序版本的肽TSI連接至Biacore CM5傳感芯片的表面，從而在Biacore 3000儀器上測(cè)定BACE。 CM5傳感芯片的表面具有可用于偶聯(lián)肽的4條不同通道。亂序的肽KFES-抑 制素-ETIAEVENV(KFES-statine-ETIAEVENV)與通道1偶聯(lián)，而TSI抑制劑 KTEEISEVN-抑制素-VAEF(KTEEISEVN-statine-VAEF)與同 一 芯片的通道2 偶聯(lián)。將這兩種肽以0.2mg/mL溶解在20mM乙酸鈉(pH為4.5)中，然后溶液以 14000rpm離心，從而除去所有顆粒。葡聚糖層上的羧基通過以下方法來活化 以5)aL/分鐘的速率注射0.5M N-乙基-N，-(3-二曱氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和 0.5MN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的1:1混合物，持續(xù)7分鐘。然后，將對(duì)照肽的 儲(chǔ)備溶液以5pL/分鐘的速率注射到通道l中，持續(xù)7分鐘，然后剩余的活化羧 基通過以下方法來阻斷以5(iL/分鐘的速率注射lM乙醇胺，持續(xù)7分鐘。 測(cè)定方案
將BACE在乙酸鈉緩沖液pH 4.5(電泳緩沖液減去二甲基亞砜)中稀釋至 0.5|liM,進(jìn)行BACE Biacore測(cè)定。將稀釋的BACE與二曱基亞砜或化合物的 二曱基亞砜稀釋液混合，二曱基亞砜的最終濃度為5%。將BACE/抑制劑混合 物在4。C孵育1小時(shí)，然后以20iaL/分鐘的速率注射到CM5 Biacore芯片的通道 l和2中。當(dāng)BACE與芯片結(jié)合時(shí)，信號(hào)以響應(yīng)單位(RU)來測(cè)量。與通道2上的 TSI抑制劑結(jié)合的BACE產(chǎn)生某種信號(hào)。BACE抑制劑的存在通過與BACE結(jié)
任何結(jié)合都是非特異性的，并且從通道2的響應(yīng)值減去。將二甲基亞石風(fēng)對(duì)照 定義為100%，并且將化合物的作用報(bào)道為相對(duì)于二曱基亞砜對(duì)照的抑制百 分比。
hERG測(cè)定
細(xì)胞培養(yǎng)
使(Persson， Carlsson, Duker， & Jacobson, 2005中記載的)表達(dá)hERG的中 國(guó)倉(cāng)鼠印巢Kl(CHO)細(xì)胞在F-12ham培養(yǎng)基中在37。C在加濕的環(huán)境(5%032) 中生長(zhǎng)至半數(shù)融合，所述F-12ham培養(yǎng)基含有L-谷氨酰胺、10。/。胎牛血清(FCS) 和0.6mg/ml潮霉素(都得自Sigma-Aldrich)。使用前，單層利用預(yù)溫?zé)?37。C) 的Versene 1:5000 (Invitrogen)的3ml等份液來洗滌。吸出此溶液后，將燒瓶在 孵育器中在37。C與另夕卜2ml的Versene l:5000—起孵育6分鐘。然后，細(xì)胞通 過輕輕敲擊而與燒瓶底分開，然后將1 Oml的Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(包含鈣 (0.9mM)和鎂(0.5mM))(PBS; Invitrogen)加至燒瓶，然后將其吸到15ml離心管
36中，之后離心(50g，4分鐘)。放棄所得到的上清液，然后將沉淀小心地重新懸
浮在3ml的PBS中。將細(xì)胞懸浮液的0.5ml等份液取出，然后在自動(dòng)化的讀取 器(Cedex; Innovatis)中確定活細(xì)胞的數(shù)目(基于錐蟲藍(lán)不相容法(trypan blue exclusion)),從而可用PBS調(diào)整細(xì)胞重新懸浮液的體積，以得到期望的最終細(xì) 胞濃度。當(dāng)涉及此參數(shù)時(shí)，引用測(cè)定中該點(diǎn)時(shí)的細(xì)胞濃度。用于在 IonWorksTMhT上調(diào)整電壓偏移(voltage offset)的CHO-Kvl.5細(xì)胞以相同的方 法來培養(yǎng)和制備，以供使用。 電生理學(xué)
此裝置的原理和操作記載在(Schroeder， Neagle, Trezise， & Worley, 2003) 中。簡(jiǎn)要地，所述技術(shù)以384孔板(PatchPlateTM)為基礎(chǔ)，其中利用抽吸來將 細(xì)胞定位在使兩個(gè)獨(dú)立流體腔室分開的小洞上，并且使細(xì)胞保持在其上，由 此在每個(gè)孔中試圖進(jìn)行記錄。 一旦進(jìn)行了封閉，就將PatchPlateTM底側(cè)上的溶 液變成一種包含兩性霉素B的溶液。此溶液可穿透在每個(gè)孔中覆蓋洞的細(xì)月包 膜片(patch of cellmembrane)，由此使穿孔全細(xì)胞膜片鉗記錄實(shí)際上得以進(jìn) 行。
使用卩-Test IonWorksTMhT(Essen Instrument)。此裝置不能對(duì)溶液進(jìn)行溫 熱，因此如以下那樣在室溫(約21。C)進(jìn)行操作。在"緩沖液，，位置的容器裝有 4ml的PBS,而在"細(xì)胞"位置的容器裝有以上所描述的CHO-hERG細(xì)胞懸浮 液。將包含待測(cè)試化合物(為其最終測(cè)試濃度的3倍)的96孔板(V形底,greiner Bio-one)置于"板r，位置，而將PatchPlateTM鉗夾到PatchPlateTM位置。將每塊 化合物板設(shè)計(jì)出12列，從而能構(gòu)建10條由8個(gè)點(diǎn)連成的濃度-作用曲線；板上 剩余的兩列用媒介物(二曱基亞砜的最終濃度為0.33%)和最大阻斷濃度之上 的西沙必利(最終濃度為10(iM)占據(jù)，媒介物用于定義測(cè)定基線，最大阻斷濃 度之上的西沙必利用于定義100。/。抑制水平。然后，IonWorksTMhT的射流頭(F 頭)將3.5pl的PBS加至PatchPlateTM的每個(gè)孔，并且其底側(cè)用"內(nèi)部，，溶液灌注， 所述"內(nèi)部，，溶液具有以下組分(單位為mM):葡萄糖酸鉀(K-Gluconate) 100、 KC1 40、 MgCl2 3.2、 EGTA3和HEPES 5(所有都為Sigma-Aldrich;利用10M KOH來將pH調(diào)整為7.25-7.30)。在啟動(dòng)和脫泡后，電子頭(E頭)圍繞 PatchPlateTM移動(dòng)，進(jìn)行鉆洞測(cè)試法(即施加電壓脈沖以確定在每個(gè)孔中的洞 是否開放)。然后，F(xiàn)頭將3.5ial的上述細(xì)胞懸浮液發(fā)送到PatchPlateTM的每個(gè)孔 中，并且細(xì)胞有200秒的時(shí)間來到達(dá)在每個(gè)孔中的洞，并且將洞封閉。此后，E頭圍繞PatchPlateTM移動(dòng)，以確定在每個(gè)孔中所得到的封閉電阻。接下來， 將PatchPlateTM的底側(cè)溶液變成"進(jìn)入"溶液，所述"進(jìn)入"溶液具有以下組分 (單位為mM): KC1 140、 EGTA 1、 MgCl2 1和HEPES 20(利用10M KOH來將 pH調(diào)整為7.25-7.30)連同100iig/ml的兩性霉素B(Sigma-Aldrich)。歷時(shí)9分鐘用 于膜片打孔后，E頭每次圍繞PatchPlateTM的48個(gè)孔移動(dòng)，以得到添加化合物 前的hERG電流測(cè)量值。然后，F(xiàn)頭將源于化合物板的每個(gè)孔的3.5pl溶液加至 PatchPlateTM的4個(gè)孔(二曱基亞砜在每個(gè)孔中的最終濃度為0.33%)。這通過以 下方法來實(shí)現(xiàn)從化合物板的最稀孔移動(dòng)到化合物板的最濃孔，以使任何化 合物遺留的影響最小化。孵育約3.5分鐘后，E頭圍繞PatchPlateTM的全部384 個(gè)孔移動(dòng)，以得到添加化合物后的hERG電流測(cè)量值。以這種方式可得到非 累積濃度-作用曲線，其中假如在足夠百分比的孔中達(dá)到驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)(參見以 下)，那么每種濃度的測(cè)試化合物的作用都有賴于對(duì)1至4個(gè)細(xì)胞的記錄。
添加化合物前和添加化合物后的hERG電流通過單一電壓脈沖來引起， 所述單 一 電壓脈沖的組成為在-70mV保持20秒，以160毫秒的步幅變?yōu)?-60mV(從而對(duì)泄漏進(jìn)行評(píng)價(jià))，以100毫秒的步幅變回為-70mV,以l秒的步 幅變?yōu)?40mV,以2秒的步幅變?yōu)?30mV，最后以500毫秒的步幅變?yōu)?70mV。 在添加化合物前和添加化合物后的電壓脈沖之間不對(duì)膜電勢(shì)進(jìn)行任何鉗夾。 從電流值扣除泄漏值，這有賴于對(duì)在電壓脈沖方案開始時(shí)在+10mV步驟所引 起的電流進(jìn)行評(píng)價(jià)。以兩種方式中的一種對(duì)IonWorksTMhT中的任何電壓偏移 進(jìn)行調(diào)整。當(dāng)確定化合物效力時(shí)，將去極化電壓偏斜(depolarising voltage ramp) 施加于CH0-Kvl.5細(xì)胞，并且注意到一個(gè)電壓，電流軌跡(current trace)在此 電壓出現(xiàn)拐點(diǎn)(即在此點(diǎn)觀察到通道由于偏斜方案而活化)。先前已經(jīng)利用相 同的電壓指令在常規(guī)的電生理學(xué)中確定了出現(xiàn)上述現(xiàn)象的電壓，并且發(fā)現(xiàn)其 為-15mV(數(shù)據(jù)未顯示)，因而可將偏移電勢(shì)(offset potential)錄入到 IonWorksTMhT軟件中，將此值用作參考點(diǎn)。當(dāng)確定hERG的基礎(chǔ)電生理性質(zhì) 時(shí)，任何偏移都通過以下方法來調(diào)整在IonWorksTMhT中確定hERG尾電流 反轉(zhuǎn)電勢(shì)(reversal potential),將其與在常規(guī)電生理學(xué)中所確定的值(-KmV，) 比較，然后在IonWorksTMhT軟件中進(jìn)行必要的偏移調(diào)整。電流信號(hào)以2.SkHz 的頻率來采集。
通過采用在-70mV初始保持時(shí)段的電流的40毫秒平均值(基線電流)，并 且從尾電流響應(yīng)的峰值扣除所述平均值，借助IonWorksTMhT軟件從扣除泄漏
38掃描后的hERG電流大小。在每個(gè)孔中所引起的 電流的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)為掃描前的封閉電阻^0MQ,掃描前的hERG尾電流幅度 >150pA，掃描后的封閉電阻〉60MQ。對(duì)hERG電流的抑制程度通過以下方法 來評(píng)價(jià)就每個(gè)孔而言，掃描后的hERG電流值除以各自掃描前的hERG電流值。
結(jié)果
本發(fā)明化合物的典型IC50值范圍在約1至約1 O，OOOnM。下面的表1中列出 了各實(shí)施例的生物學(xué)數(shù)據(jù)。
4l
實(shí)施例號(hào)TR-FRET測(cè)定中的IC50
實(shí)施例20114 nM
實(shí)施例21316nM
39
權(quán)利要求
1、游離堿形式的式I化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或鹽的溶劑化物其中P為吡啶環(huán)；Q為鍵或CH2CH2；R1獨(dú)立地選自氰基、鹵素、C1-6烷基和甲氧基；m為1或2；條件是不包括下述化合物；2-氨基-6-[3-(5-溴吡啶-3-基)苯基]-3，6-二甲基-5，6-二氫嘧啶-4(3H)-酮；2-氨基-6-[3-(2-氟吡啶-3-基)苯基]-3，6-二甲基-5，6-二氫嘧啶-4(3H)-酮；2-氨基-6-[3-(2-氯-3-氟吡啶-4-基)苯基]-3，6-二甲基-5，6-二氫嘧啶-4(3H)-酮。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的化合物，其中Cw烷基表示曱基。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中Q表示直接鍵。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)所述的化合物，其中，m為l，以及W為氰基、 曱氧基或者鹵素。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其中W為囟素，所述卣素為連接在吡 啶環(huán)2-位上的氯。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的化合物，其中m為2，以及W表示一個(gè)卣素 和一個(gè)曱基。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的化合物，其中卣素為連接到吡啶環(huán)6-位上的氟。
8、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的化合物，其中m為2，以及W表示兩個(gè)卣素原子。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物，其中所述兩個(gè)卣素原子表示下列卣素 組合中的任一種組合連接在吡咬環(huán)2-和3-位上的氯；連接在吡啶環(huán)2-位上 的氟和連接在吡啶環(huán)5-位上的溴；連接在吡啶環(huán)2-位上的氯和連接在吡啶環(huán) 5-位上的氟；連接在吡啶環(huán)2-位上的氟和連接在吡啶環(huán)5-位上的氯。
10、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中Q表示CH2-CH2。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的化合物，其中m為l,以及Ri選自卣素或者曱 氧基。
12、 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的化合物，其中所述卣素為連接在吡啶環(huán)2-位上的氯。
13、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的化合物，其中m為2，以及W表示兩個(gè)卣素原子。
14、 根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中所述兩個(gè)卣素原子表示連接在 吡啶環(huán)2-位上的氟和連接在吡啶環(huán)5-位上的氯。
15、 游離堿形式的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者鹽的 溶劑化物，所述化合物選自5-[3-(2-氨基-l，4-二曱基-6-氧代-l，4，5,6-四氫嘧啶-4-基)苯基]吡啶-3-曱腈鹽酸鹽；2-氨基-6-[3-(2,3-二氯吡啶-4-基)苯基]-3，6-二曱基-5,6-二氫嘧啶-4(3H)-酮乙酸鹽；2-氨基-6-[3-(5-溴-2-氟吡啶-3-基)苯基]-3，6-二曱基-5，6-二氫嘧啶-4(3印-酮乙酸鹽；2-氨基-6-[3-(2-氯-5-氟吡啶-4-基)苯基]-3，6-二曱基-5，6-二氫嘧啶-4(3印-酮三氟乙酸鹽；2-氨基-6-[3-(5-氯-2-氟吡啶-3-基)苯基]-3，6-二曱基-5，6-二氫嘧啶-4(3印-酮鹽酸鹽；2-氨基-6-[3-(6-氟-5-曱基吡啶-3-基)苯基]-3,6-二曱基-5,6-二氫嘧啶 -4(3 0-酮鹽酸鹽；2-氨基-6-[3-(2-氯吡啶-4-基)苯基]-3,6-二曱基-5,6-二氫嘧啶-4(3H)-酮鹽酸鹽；2-氨基-6-{2-[3-(2-氯吡啶-4-基)苯基]乙基}-3，6-二曱基-5，6-二氫嘧啶 -4(3H)-酮鹽酸鹽；2-氨基-6-[3-(5-曱氧基吡啶-3-基)苯基]-3,6-二甲基-5,6-二氫嘧啶-4(3H)-酮鹽酸鹽；2-氨基-6-{2-[3-(6-曱氧基吡啶-2-基)苯基]乙基}-3，6-二曱基-5，6-二氫嘧啶 -4(3H)-酮鹽酸鹽；和2-氨基-6-{2-[3-(5-氯-2-氟吡啶-3-基)苯基]乙基}-3，6-二曱基-5,6-二氫嘧 咬-4(3H)-酮鹽酸鹽。
16、 一種藥物組合物，所述組合物包括作為活性成分的、治療有效量的 根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)所述的化合物，以及包括藥學(xué)上可接受的賦型劑、 載體或稀釋劑。
17、 權(quán)利要求1 -15任一項(xiàng)所述的化合物作為藥物的用途。
18、 權(quán)利要求l-15任一項(xiàng)所述的化合物作為藥物用于治療或預(yù)防A(3-相關(guān)病理的用途。
19、 權(quán)利要求l-15任一項(xiàng)所述的化合物作為藥物用于治療或預(yù)防AP-相 關(guān)病理的用途，其中所述A(3-相關(guān)病理為唐氏綜合征、P-淀粉樣血管病、腦 淀粉樣血管病、遺傳性腦出血、與認(rèn)知缺損相關(guān)的障礙、MCI("輕度認(rèn)知缺 損")、阿爾茨海默病、記憶喪失、與阿爾茨海默病相關(guān)的注意力缺陷癥狀、 與阿爾茨海默病相關(guān)的神經(jīng)變性、混合型血管起源的癡呆、變性起源的癡呆、 早老性癡呆、老年性癡呆、與帕金森病相關(guān)的癡呆、進(jìn)行性核上麻痹或皮質(zhì) 基質(zhì)變性。
20、 權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)所述化合物在制備用于治療或預(yù)防Ap-相關(guān)病 理的藥物中的用途。
21、 權(quán)利要求l-15任一項(xiàng)所述化合物在制備用于治療AP-相關(guān)病理的藥 物中的用途，其中所述A(3-相關(guān)病理為唐氏綜合征、(3-淀粉樣血管病、腦淀 粉樣血管病、遺傳性腦出血、與認(rèn)知缺損相關(guān)的障礙、MCI("輕度認(rèn)知缺損")、 阿爾茨海默病、記憶喪失、與阿爾茨海默病相關(guān)的注意力缺陷癥狀、與阿爾 茨海默病相關(guān)的神經(jīng)變性、混合型血管起源的癡呆、變性起源的癡呆、早老 性癡呆、老年性癡呆、與帕金森病相關(guān)的癡呆、進(jìn)行性核上麻痹或皮質(zhì)基質(zhì) 變性。
22、 抑制BACE活性的方法，包括使BACE與權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)所述的化合物相接觸。
23、 治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的A(3-相關(guān)病理的方法，包括給予所述患者治療有效量的權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)所述的化合物。
24、 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述AP-相關(guān)病理為唐氏綜合征、 (3-淀粉樣血管病、腦淀粉樣血管病、遺傳性腦出血、與認(rèn)知缺損相關(guān)的障礙、 MCI("輕度認(rèn)知缺損，，)、阿爾茨海默病、記憶喪失、與阿爾茨海默病相關(guān)的 注意力缺陷癥狀、與阿爾茨海默病相關(guān)的神經(jīng)變性、混合型血管起源的癡呆、 變性起源的癡呆、早老性癡呆、老年性癡呆、與帕金森病相關(guān)的癡呆、進(jìn)行 性核上麻痹或皮質(zhì)基質(zhì)變性。
25、 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人類。
26、 治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的A(3-相關(guān)病理的方法，包括給予所述患者治 療有效量的權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)所述的化合物和至少一種認(rèn)知增強(qiáng)劑、記憶 增強(qiáng)劑或者乙酰膽i咸酯酶抑制劑。
27、 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述Ap-相關(guān)病理為唐氏綜合征、 卩-淀粉樣血管病、腦淀粉樣血管病、遺傳性腦出血、與認(rèn)知缺損相關(guān)的障礙、 MCI("輕度認(rèn)知缺損")、阿爾茨海默病、記憶喪失、與阿爾茨海默病相關(guān)的 注意力缺陷癥狀、與阿爾茨海默病相關(guān)的神經(jīng)變性、混合型血管起源的癡呆、 變性起源的癡呆、早老性癡呆、老年性癡呆、與帕金森病相關(guān)的癡呆、進(jìn)行 性核上麻痹或皮質(zhì)基質(zhì)變性。
28、 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人類。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有以下結(jié)構(gòu)式(I)的新型化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、組合物和用途。這些新型的化合物能治療或預(yù)防認(rèn)知缺損、阿爾茨海默病、神經(jīng)變性和癡呆。
文檔編號(hào)C07D401/10GK101460480SQ200780020948
公開日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2007年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月5日
發(fā)明者斯文·赫爾伯格, 斯蒂芬·伯格, 約翰·赫德斯特羅姆, 約翰·馬爾姆伯格 申請(qǐng)人:阿斯利康(瑞典)有限公司;阿斯特克斯醫(yī)療公司