專利名稱：用于高通量篩選細(xì)胞系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及制藥領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及就細(xì)胞系能夠在 工業(yè)M^莫上生產(chǎn)足夠數(shù)量和相當(dāng)性質(zhì)的蛋白質(zhì)的能力而言篩選細(xì)胞系的方 法。
背景技術(shù)：
高通量技術(shù)已成為制藥和生物技術(shù)研究中的重要工具。高通量分析方 法利用自動(dòng)化程序快速分析蛋白質(zhì)的活性、蛋白質(zhì)表達(dá)的水平、基因表達(dá) 和在生物系統(tǒng)中發(fā)生的眾多化學(xué)相互作用。通過這些方法和技術(shù)產(chǎn)生的數(shù) 據(jù)已被應(yīng)用于廣泛的領(lǐng)域例如癌癥研究、藥物開發(fā)和晶體學(xué)(參見，例如 Abramovitz爭(zhēng)人(2006) /Voteo附e 4(1): 5 [出版前電子公布(Epub ahead of print)])。
高通量分析依賴于從系統(tǒng)中發(fā)生的大量化學(xué)反應(yīng)中讀出特定化學(xué)相互 作用或化合物的能力。高通量技術(shù)已用于在短期內(nèi)探測(cè)數(shù)千種基因的特定 化學(xué)相互作用和表達(dá)水平。為了完成此艱巨的任務(wù)，開發(fā)了利用分子信號(hào) (例如，熒光團(tuán))和以極快的速度處理信息的自動(dòng)化分析手段的某些技術(shù) (參見，伊J:i口， Pinhasov ^1^^(2004) Cb附辦，C/re附.^ff/g/r T^/Y wg/r/7M《Scrcew, 7(2):133-40)。例如，微陣列技術(shù)已廣泛用于同時(shí)探測(cè)數(shù)千種基因的相互作 用，提供有關(guān)特定基因的有價(jià)值的信息(參見，例如，Mocellin和Rossi (2007) ￡"平祝o/. 593:19-30).在過去的數(shù)年中，自動(dòng)化和人工高通量蛋白質(zhì)表達(dá)和純化已成為易獲 得的快速篩選和產(chǎn)生可溶性蛋白質(zhì)用于結(jié)構(gòu)和功能性研究的方法(參見
Cabrita爭(zhēng)乂(2006) 5AfC祝ofec^朋/. 6: 12)。已將各種ii^，例如用于克 隆、表達(dá)和純化、連接不依賴性克隆(LIC)及蛋白質(zhì)表達(dá)的自誘導(dǎo)的基 于濾板(filterplate)的試驗(yàn)，與自動(dòng)化系統(tǒng)結(jié)合起來，以產(chǎn)生簡(jiǎn)單劃算的蛋 白質(zhì)并行生產(chǎn)技術(shù)(參見Cabrita爭(zhēng)入(2006) 5/otecAw0/. 6: 12;
Aslanidis爭(zhēng)入(l990) 7V"c/"'c爿"Vfei 仏18(20): 6069-6074)。這些方法為研 究者提供了在工業(yè)規(guī)^莫水平生產(chǎn)蛋白質(zhì)用于制藥和藥物開發(fā)的強(qiáng)大工具。
然而，從特定細(xì)胞中純化和表達(dá)蛋白質(zhì)存在特別的困難。在鑒定到目 的蛋白后，以純化的形式獲得顯著量的該蛋白質(zhì)相當(dāng)困難。因此，為了以 充足的數(shù)量生產(chǎn)蛋白質(zhì)用于工業(yè)開發(fā)，使用產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞系。
盡管細(xì)胞系可為研究者提供產(chǎn)生大量特定蛋白質(zhì)的機(jī)會(huì)，但它們并非 總是蛋白質(zhì)的有效生產(chǎn)者。某些細(xì)胞系克隆可能以次最佳的水平生產(chǎn)蛋白 質(zhì)。其他細(xì)胞系克隆可能產(chǎn)生最佳的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，但由于蛋白質(zhì)的結(jié) 構(gòu)畸形或不適當(dāng)?shù)姆g后修飾而不能產(chǎn)生完全功能的蛋白質(zhì)混合物。在生 物相關(guān)化合物的開發(fā)過程中這些問題將導(dǎo)致時(shí)間和資源的浪費(fèi)。因此，需 要能夠快速和可靠地提供有關(guān)特定細(xì)胞系中表達(dá)的蛋白質(zhì)的性質(zhì)和數(shù)量的 信息的高通量篩選方法。本發(fā)明涉及這些和其他重要目的。
發(fā)明概述
通過在開始目的蛋白的全面M^莫的生產(chǎn)之前分析細(xì)胞系中目的蛋白的 表達(dá)水平，將可以節(jié)約浪費(fèi)在不具有用于高通量蛋白質(zhì)表達(dá)的充足品質(zhì)的 細(xì)胞系上的大量時(shí)間和資源。本發(fā)明部分地基于如下發(fā)現(xiàn)，即，可以通過 實(shí)施高通量篩選方法和高通量純化方法以確定能夠產(chǎn)生足夠數(shù)量的目的蛋 白的細(xì)胞系。此外，這些方法可用于篩選候選細(xì)胞系以確定它們是否能夠 產(chǎn)生具有期望性質(zhì)，例如生物學(xué)活性的目的蛋白。因此這些高通量篩選和 高通量純化技術(shù)(在下文中統(tǒng)稱為"高通量篩選")是用于確定合適細(xì)胞系 以用于工業(yè)恥漠蛋白質(zhì)表達(dá)的有價(jià)值方法。該發(fā)現(xiàn)已用于提供允許使用高通量篩選方法鑒定可以用于工業(yè)類L^莫生產(chǎn)目的蛋白的細(xì)胞系的發(fā)明。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了高通量篩選用于蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞系的方 法。該方法包括高通量滴定篩選(high-throughput titer screening )細(xì)胞系 以確定各細(xì)胞系中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。選擇產(chǎn)生期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的 細(xì)胞系以用于隨后該蛋白質(zhì)的高通量純化。如果細(xì)胞系產(chǎn)生期望的蛋白質(zhì) 表達(dá)水平且其具有合適的性質(zhì)，則選擇該細(xì)胞系用于蛋白質(zhì)表達(dá)。
在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是抗體、配體、受體、蛋白質(zhì)的亞基、蛋 白質(zhì)的片段、融合蛋白、重組蛋白質(zhì)和它們的片段。在某些實(shí)施方案中， 蛋白質(zhì)是抗體、重組抗體或F(ab，)2片段。
在其他實(shí)施方案中，第一結(jié)合劑選自抗體、配體、受體、融合蛋白、 蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白質(zhì)和它們的片段。在特定的實(shí)施方案中，第一結(jié) 合劑是A蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。在其他實(shí)施方案中，可將結(jié)合劑附著 至固相支持物例如珠、板和微陣列芯片上。在許多實(shí)施方案中，固相支持 物包括纖維素、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、玻璃或聚苯乙烯。
在其他實(shí)施方案中，第二結(jié)合劑選自抗體、配體、受體、融合蛋白、 蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白質(zhì)和它們的片段。在特定的實(shí)施方案中，第二結(jié) 合劑是抗體或其片段。在更特定的實(shí)施方案中，抗體是F(ab，)2片段，甚 至更特別地是與抗體的Fc部分特異性結(jié)合的F(ab，)2片段。
在其他實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物是熒光團(tuán)、化學(xué)染料、放射性結(jié) 合劑、化學(xué)發(fā)光結(jié)合劑、電化學(xué)發(fā)光劑、磁性結(jié)合劑、順磁結(jié)合劑、親磁 (promagnetic )結(jié)合劑、產(chǎn)生有色產(chǎn)物的酶、產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物的酶、產(chǎn) 生磁性產(chǎn)物的酶。在非常特定的實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物是釕或多重 釕標(biāo)記(multiple ruthenium labels),
在一些實(shí)施方案中，試劑包括樹脂，所述樹脂在特定的實(shí)施方案中具 有附著至其的第三結(jié)合劑。在某些實(shí)施方案中，第三結(jié)合劑選自抗體、配 體、受體、融合蛋白、蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白質(zhì)和它們的片段。在特定 的實(shí)施方案中，第三結(jié)合劑是A蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。在一些實(shí)施方 案中，使用真空從試劑中洗脫蛋白質(zhì)。在其他實(shí)施方案中，通過離心洗脫蛋白質(zhì)。在其他實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)借助重力流通過樹脂而被洗脫。在許
多實(shí)施方案中，對(duì)孵育的細(xì)胞系的篩選j吏用自動(dòng)化工作站(automated workstation )進(jìn)行。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了高通量篩選用于蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞系的 方法。該方法包括步驟在培養(yǎng)基中孵育細(xì)胞系和將固相支持物與來自各 孵育的細(xì)胞系的樣品接觸。在該方面，所述固相支持物在其表面附著可以 結(jié)合各樣品中的蛋白質(zhì)的第一結(jié)合劑。將與第一結(jié)合劑結(jié)合的蛋白質(zhì)與能 夠結(jié)合該蛋白質(zhì)的第二結(jié)合劑接觸，所述第二結(jié)合劑與可檢測(cè)的標(biāo)記物有 效連接。通過檢測(cè)與結(jié)合蛋白質(zhì)的第二結(jié)合劑有效連接的標(biāo)記物來確定各 樣品中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。該方法還包括選擇具有期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平 的細(xì)胞系。在一些情況下，這可通過將各細(xì)胞系中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平與所 有細(xì)胞系中的平均蛋白質(zhì)表達(dá)水平比較來確定。例如，與所有細(xì)胞系中的 平均表達(dá)水平相比增加的蛋白質(zhì)表達(dá)水平可能是期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。 或者，降低的蛋白質(zhì)表達(dá)水平可能是期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，該表達(dá)水平
蛋白質(zhì)表達(dá)水平相比來確定。
本發(fā)明該方面的方法可以進(jìn)一步需要從選擇的細(xì)胞系分離上清液，將 各上清液分配至多孔板的小孔中。然后將上清液與結(jié)合蛋白質(zhì)的試劑接觸。 將蛋白質(zhì)從試劑中洗脫并且分析其是否具有合適的性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的該 方面，如果在步驟e)中選擇細(xì)胞系并且由該細(xì)胞系表達(dá)的蛋白質(zhì)具有合適 的性質(zhì)，則選擇該細(xì)胞系用于蛋白質(zhì)表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是 抗體、配體、受體、蛋白質(zhì)的亞基、蛋白質(zhì)的片段、融合蛋白、重組蛋白 質(zhì)和它們的片段。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是抗體、重組抗體或F(ab，)2 片段。
在其他實(shí)施方案中，第一結(jié)合劑選自抗體、配體、受體、融合蛋白、 蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白質(zhì)和其片段。在特定的實(shí)施方案中，第一結(jié)合劑 是A蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合劑可附著至固相 支持物例如珠、板和微陣列芯片上。在許多實(shí)施方案中，固相支持物包括纖維素、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、玻璃或聚苯乙烯。
在其他實(shí)施方案中，第二結(jié)合劑選自抗體、配體、受體、融合蛋白、 蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白質(zhì)和其片段。在特定的實(shí)施方案中，第二結(jié)合劑
是抗體和其片段。在更特別的實(shí)施方案中，抗體是F(ab，)2片段，甚至更 特別地是與抗體的Fc部分特異性結(jié)合的F(ab，)2片段。
在其他實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物是熒光團(tuán)、化學(xué)染料、放射性結(jié) 合劑、化學(xué)發(fā)光結(jié)合劑、電化學(xué)發(fā)光劑、磁性結(jié)合劑、順磁結(jié)合劑、親磁 結(jié)合劑、產(chǎn)生有色產(chǎn)物的酶、產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物的酶、產(chǎn)生磁性產(chǎn)物的酶。 在非常特定的實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物是釕或多重釕標(biāo)記。
在一些實(shí)施方案中，試劑包括樹脂，所述樹脂在特定的實(shí)施方案中具 有附著至其的第三結(jié)合劑。在某些實(shí)施方案中，第三結(jié)合劑選自抗體、配
體、受體、融合蛋白、蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白質(zhì)和其片段。在特定的實(shí) 施方案中，第三結(jié)合劑是A蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。在一些實(shí)施方案中， 使用真空從試劑中洗脫蛋白質(zhì)。在許多實(shí)施方案中，孵育的細(xì)胞系的篩選 使用自動(dòng)化工作站進(jìn)行。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了細(xì)胞培養(yǎng)工藝改進(jìn)的方法。該方法包括 在受試的不同^H牛下孵育各細(xì)胞系的步驟。然后將來自各不同條件的各細(xì) 胞系的細(xì)胞系樣品與固相支持物接觸。在該方面，固相支持物在其表面附 著能夠結(jié)合各樣品中的蛋白質(zhì)的第一結(jié)合劑。將與第一結(jié)合劑結(jié)合的蛋白 質(zhì)與能夠和該蛋白質(zhì)結(jié)合的第二結(jié)合劑接觸，所述第二結(jié)合劑與可檢測(cè)的 標(biāo)記物有效連接。通過檢測(cè)與結(jié)合蛋白質(zhì)的第二結(jié)合劑有效連接的標(biāo)記物 來確定各樣品中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。該方法還包括選擇具有期望的蛋白質(zhì) 表達(dá)水平的細(xì)胞系。在一些情況下，這可通過將各細(xì)胞系中的蛋白質(zhì)表達(dá) 水平與所有細(xì)胞系中的平均蛋白質(zhì)表達(dá)水平比較來確定。例如，與所有細(xì)
胞系中的平均表達(dá)水平相比增加的蛋白質(zhì)表達(dá)水平可能是期望的蛋白質(zhì)表 達(dá)水平?；蛘?，降低的蛋白質(zhì)表達(dá)水平可能是期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，該
水平也可通過將各卩爭(zhēng)逸的細(xì)肥，
均蛋白質(zhì)表達(dá)水平比較來確定，
12本發(fā)明該方面的方法可以進(jìn)一步需要從選擇的細(xì)胞系分離上清液，將 各上清液分配至多孑L板的小孔中。然后將上清液與結(jié)合蛋白質(zhì)的試劑接觸。 將蛋白質(zhì)從試劑中洗脫并且分析其是否具有合適的性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的該 方面，如果蛋白質(zhì)的數(shù)量和性質(zhì)與其他受試條件相比得到改善，則鑒定到 合適的細(xì)胞培養(yǎng)條件。
在其他實(shí)施方案中，第一結(jié)合劑選自抗體、配體、受體、融合蛋白、 蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白質(zhì)和其片段。在特定的實(shí)施方案中，第一結(jié)合劑
是A蛋白質(zhì)或鏈霉抗生物素蛋白。在其他實(shí)施方案中，可將結(jié)合劑附著至 固相支持物例如珠、板和孩l陣列芯片。在許多實(shí)施方案中，固相支持物包 括纖維素、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、玻璃或聚苯乙烯。
在其他實(shí)施方案中，第二結(jié)合劑選自抗體、配體、受體、融合蛋白、 蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白質(zhì)和其片段。在特定的實(shí)施方案中，第二結(jié)合劑 是抗體或其片段。在更特別的實(shí)施方案中，抗體是F(ab，)2片段，甚至更 特別地是特異性結(jié)合抗體的Fc部分的F(ab，)2片段。
在其他實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物是熒光團(tuán)、化學(xué)染料、放射性結(jié) 合劑、化學(xué)發(fā)光結(jié)合劑、電化學(xué)發(fā)光劑、磁性結(jié)合劑、順磁結(jié)合劑、親磁 結(jié)合劑、產(chǎn)生有色產(chǎn)物的酶、產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物的酶、產(chǎn)生磁性產(chǎn)物的酶。 在非常特定的實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物是釕或多重釕標(biāo)記。
在一些實(shí)施方案中，試劑包括樹脂，所述樹脂在特定的實(shí)施方案中具 有附著至其的第三結(jié)合劑。在某些實(shí)施方案中，第三結(jié)合劑選自抗體、配 體、受體、融合蛋白、蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白質(zhì)和其片段。在特定的實(shí) 施方案中，第三結(jié)合劑是A蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。在一些實(shí)施方案中， 使用真空從試劑中洗脫蛋白質(zhì)。在許多實(shí)施方案中，對(duì)孵育的細(xì)胞系的篩 選使用自動(dòng)化工作站進(jìn)行。
在某些實(shí)施方案中，受試條件是細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在其他實(shí)施方案中， 受試條件是溫度。在其他實(shí)施方案中，受試條件是濕度。在其它實(shí)施方案 中，受試M是壓力。在再其它實(shí)施方案中，受試條件是氧壓。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了高通量篩選用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞系的方法。該方法包括在培養(yǎng)基中孵育細(xì)胞系的第一步驟。將來自各細(xì)胞系的 樣品置于固相支持物上，即，使固體支持物與各樣品接觸。應(yīng)當(dāng)注意，固 相支持物在其表面附著可以與各樣品中的蛋白質(zhì)結(jié)合的第 一給合劑。第一 結(jié)合劑結(jié)合細(xì)胞樣品中的蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)與能夠和該蛋白質(zhì)結(jié)合的第二 結(jié)合劑接觸，所述第二結(jié)合劑與可檢測(cè)的標(biāo)記物有效連接。通過檢測(cè)與結(jié) 合蛋白質(zhì)的第二結(jié)合劑有效連接的標(biāo)記物來確定各樣品中的蛋白質(zhì)表達(dá)水
望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，而選擇用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞系。
在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是抗體、配體、受體、蛋白質(zhì)的亞基、蛋 白質(zhì)片段、融合蛋白、重組蛋白質(zhì)和它們的片段。在某些實(shí)施方案中，蛋
白質(zhì)是抗體、重組抗體或F(ab，)2片段。
在其他實(shí)施方案中，第一結(jié)合劑選自抗體、配體、受體、融合蛋白、 蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白質(zhì)和其片段。在特定的實(shí)施方案中，第一結(jié)合劑 是A蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。在其他實(shí)施方案中，可將結(jié)合劑附著至固 相支持物例如珠、板和微陣列芯片上。在許多實(shí)施方案中，固相支持物包 括纖維素、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、玻璃或聚苯乙烯
在其他實(shí)施方案中，第二結(jié)合劑選自抗體、配體、受體、融合蛋白、 蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白質(zhì)和其片段。在特定的實(shí)施方案中，第二結(jié)合劑 是抗體或其片段。在更特別的實(shí)施方案中，抗體是F(ab，)2片段，甚至更 特別地是與抗體的Fc部分特異性結(jié)合的F(ab，)2片段。
在其他實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物是熒光團(tuán)、化學(xué)染料、放射性結(jié) 合劑、化學(xué)發(fā)光結(jié)合劑、電化學(xué)發(fā)光劑、磁性結(jié)合劑、順磁結(jié)合劑、親磁 結(jié)合劑、產(chǎn)生有色產(chǎn)物的酶、產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物的酶、產(chǎn)生磁性產(chǎn)物的酶。 在非常特定的實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物是釕或多重釕標(biāo)記。在某些實(shí) 施方案中，該方法還包括唾液酸測(cè)定試驗(yàn)。
附圖簡(jiǎn)述
當(dāng)與附圖一起閱讀下列描述時(shí)，可更全面地理解本發(fā)明的上述和其他
14目的、其各種特征以及本發(fā)明本身，其中


圖1是高通量蛋白質(zhì)表達(dá)試驗(yàn)的圖示，顯示了在細(xì)胞樣品中檢測(cè)抗體。 圖2是高通量篩選試驗(yàn)的圖示，顯示了使用綴合至釕的不同F(xiàn)(ab，)2片
段的信號(hào)背景比。
圖3是高通量篩選試驗(yàn)的圖示，顯示了使用綴合至釕的不同F(xiàn)(ab，)2 片段的信號(hào)背景比。
圖4的曲線顯示檢測(cè)不同濃度的GPlba、 IL13受體和TNFR融合蛋 白的高通量篩選試驗(yàn)的靈敏度。
圖5的曲線顯示檢測(cè)不同濃度的抗GDF8、抗CD22和抗Lewis Y抗 體的高通量篩選試驗(yàn)的靈敏度。
圖6的曲線顯示進(jìn)行高通量滴定篩選試驗(yàn)和HPLC試驗(yàn)所需的試驗(yàn)時(shí)間。
圖7顯示就確定樣品中的TNFR融合蛋白水平而言在高通量篩選試驗(yàn) 和HPLC之間進(jìn)行的比較。
圖8顯示通過高通量滴定篩選試驗(yàn)確定的克隆中的表達(dá)水平。
圖9顯示就確定樣品中的抗Lewis Y抗體的水平而言在高通量篩選試 驗(yàn)和HPLC之間進(jìn)行的比較。
圖10顯示就確定樣品中的PSGL和GPlba的水平而言在高通量篩選 試驗(yàn)和HPLC之間進(jìn)行的比較。
圖11顯示就確定樣品中的抗Ap抗體的水平而言在高通量篩選試驗(yàn)和 HPLC之間進(jìn)行的比較。
圖12顯示在使用不同純化方法純化的樣品中發(fā)現(xiàn)的高分子量蛋白質(zhì) 的百分?jǐn)?shù)。
圖13顯示在使用不同純化方法純化的樣品中發(fā)現(xiàn)的高分子量蛋白質(zhì) 的百分?jǐn)?shù)。
圖14的柱形圖顯示在樣品中發(fā)現(xiàn)的高分子量蛋白質(zhì)的量，其中所述樣 品分離自生長(zhǎng)在不同務(wù)f牛下的不同細(xì)胞系。
15發(fā)明詳述
此處提及的專利和科學(xué)文獻(xiàn)確立了本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的知識(shí)。此 處引用的公開的美國(guó)專利、授權(quán)的申請(qǐng)、公布的外國(guó)專利和參考資料，包
括GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)序列，特此并入本文作為參考，其引用程度就如同將其 各自特別地且單獨(dú)地指出并入作為參考一樣。
1.1.概述
本發(fā)明的實(shí)施方案部分提供篩選具有生產(chǎn)目的蛋白的能力的細(xì)胞系的 方法。本發(fā)明還描述用于提高工業(yè)規(guī)^莫生產(chǎn)制藥和生物研究用蛋白質(zhì)的功 效的方法。特別地，本發(fā)明允許有效地生產(chǎn)可用于疾病例如癌癥、阿爾茨 海默氏病和糖尿病的藥物治療的蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了 用于高通量篩選細(xì)胞系以確定由細(xì)胞系生產(chǎn)的目的蛋白的數(shù)量和性質(zhì)的方 法。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了高通量篩選用于蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞系 的方法。該方法使用可以結(jié)合目的蛋白的第一結(jié)合劑和可以結(jié)合目的蛋白 的與可檢測(cè)的標(biāo)記物有效連接的第二結(jié)合劑。在一些實(shí)施方案中，將第一 結(jié)合劑附著至固相支持物例如珠、磁珠、板或微陣列芯片上。該方法還可 使用能結(jié)合目的蛋白、并允許從來源于細(xì)胞系的樣品純化該蛋白質(zhì)的試劑。 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，利用真空從試劑中抽吸洗脫的蛋白質(zhì)并通過 過濾器而從試劑中純化蛋白質(zhì)。在其他實(shí)施方案中，借助重力流，使溶液 流過試劑。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)"治療性蛋白"是對(duì)其所作用的身體區(qū)域或?qū)ζ?通過媒介物遠(yuǎn)程作用的身體區(qū)域具有生物學(xué)效應(yīng)的蛋白質(zhì)或肽。治療性蛋 白質(zhì)可以是例如分泌蛋白質(zhì)，例如抗體、抗體的抗原結(jié)合片段、可溶性受 體、受體融合物、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、酶或凝血因子，下文對(duì)此有更詳 細(xì)描述。上述蛋白質(zhì)在本質(zhì)上只是示例性的，并不意欲構(gòu)成限制。本領(lǐng)域 技術(shù)人員將理解任何蛋白質(zhì)均可以用于本發(fā)明，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 根據(jù)需要選擇待生產(chǎn)的特定蛋白質(zhì)。如本說明書中所使用的，術(shù)語(yǔ)多肽、蛋白質(zhì)和肽是同義的且可互換寸吏
用。因此，如此處所使用的，蛋白質(zhì)、肽或多肽的大小通常包含2個(gè)以上 氨基酸。例如，蛋白質(zhì)、肽或多肽可包含大約2至大約20個(gè)氨基酸、大約 20至40個(gè)氨基酸、大約40至大約100個(gè)氨基酸、大約100個(gè)氨基酸至大 約200個(gè)氨基酸、大約200個(gè)氛基酸至大約300個(gè)氨基酸等。
如此處所使用的，氨基酸是指本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何天然氨基酸、任何 氨基酸衍生物或任何氨基酸模擬物。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)或多肽的 殘基是連續(xù)的，沒有任何非氨基酸中斷氨基酸殘基序列。在其他實(shí)施方案 中，序列可包含一個(gè)或多個(gè)非氨基酸結(jié)構(gòu)部分。在特定的實(shí)施方案中，可 通過一個(gè)或多個(gè)非氨基酸結(jié)構(gòu)部分中斷蛋白質(zhì)或肽的殘基序列。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)"抗體"用于指具有抗原結(jié)合區(qū)的任何抗體樣分 子，包括抗體片段例如Fab'、 Fab、 F(ab，) 2、單域抗體(single domain antibody) (DABs)、 Fv、 scFv(單鏈Fv)等。用于制備和使用各種基于抗體 的構(gòu)建體和片段的技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。用于制備和表征抗體的方法 在本領(lǐng)域內(nèi)也是熟知的(參見，例如，Harlow和Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988;通過引用并 入本文)。例如，抗體可包括至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)全長(zhǎng)重鏈和至少一個(gè)，優(yōu) 選兩個(gè)輕鏈。此處使用的術(shù)語(yǔ)"抗體"包括抗體片段或變體分子例如抗原結(jié) 合片段(例如，F(xiàn)ab、 F(ab')2、 Fv、單鏈Fv片段、重鏈片段(例如，camelid VHH)和結(jié)合結(jié)構(gòu)域-免疫球蛋白融合物(例如，SMIPTM)?？贵w可以是單克 隆或單特異性抗體?？贵w還可以是人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、CDR 移植抗體或體外產(chǎn)生的抗體。在其他實(shí)施方案中，抗體具有選自例如IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4的重鏈恒定區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體具有選自 例如K和k的輕鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，改變，例如突變恒定區(qū)以改變抗 體的特性(例如，增加或減少下列之一或多個(gè)方面Fc受體結(jié)合、抗體糖 基化、半胱氨酸殘基的數(shù)目、效應(yīng)細(xì)胞功能或補(bǔ)體功能)。通常，抗體特異 性結(jié)合預(yù)先確定的抗原，例如與病癥例如神經(jīng)變性病、代謝病癥、炎癥、 自身免疫病癥和/或惡性腫瘤病癥相關(guān)的抗原。
17Small Modular ImmunoPharmaceuticals (SMIpTM)提供包含結(jié)合結(jié)構(gòu) 域多肽的變體分子的實(shí)例。SMIP及其用途和應(yīng)用公開于例如美國(guó)公開的 專利申請(qǐng)?zhí)?003/0118592、 2003/0133939、 2004/0058445、 2005/0136049、 2005/0175614、 2005/0180970、 2005/0186216、 2005/0202012、 2005/0202023、 2005/0202028、 2005/0202534和2005/0238646，和其相關(guān)專利家族成員， 它們?nèi)空w地并入本文作為參考。
單域抗體(single domain antibody)可包括其互補(bǔ)決定區(qū)是單結(jié)構(gòu)域多 肽的一部分的抗體。實(shí)例包括，但不限于，重鏈抗體、天然不含輕鏈的抗 體、源于常規(guī)4鏈抗體的單域抗體、工程化抗體和非源于抗體的單域構(gòu)架。
抗體可來源于任何物種，包括，但不限于小鼠、人、駱駝、美洲駝、山羊、 兔子、牛。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，此處所使用的單域抗體是稱為不含輕 鏈的重鏈抗體的天然單域抗體。此類單域抗體公開于例如WO 9404678。 為了清楚起見，來源于天然不含輕鏈的重鏈抗體的可變區(qū)此處稱為VHH 或納米抗體(nanobody ),以區(qū)別于四鏈免疫球蛋白的常規(guī)VH。此類VHH 分子可源于在駝科物種例如駱駝、美洲駝、單峰駝、羊駝和原駝(guanaco) 中產(chǎn)生的抗體。除駝科外的其他物種也可產(chǎn)生天然不含輕鏈的重鏈抗體； 此類VHH在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合片段"所涵蓋的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i) Fab片 段，由VL、 VH、 CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii) F(ab')2片段， 包含兩個(gè)在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由VH和 CHI結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的 Fv片段；(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段；(vi) camelid或camelized可 變區(qū)，例如VHH結(jié)構(gòu)域；(vii)單鏈Fv (scFv); (viii)雙特異性抗體；和(ix) 融合至Fc區(qū)的免疫球蛋白分子的一個(gè)或多個(gè)片段。此外，盡管Fv片段的 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH可以由分開的基因編碼，但可使用重組方法，通過 合成接頭將它們連接起來，以使它們形成其中VL和VH區(qū)配對(duì)形成單價(jià) 分子的單個(gè)蛋白質(zhì)鏈(稱為單鏈Fv (scFv);參見，例如，Bird等人(1988)Science 242:423-26; Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-83)。該單鏈抗體也旨在包括在術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合片段"內(nèi)?？?以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得抗體片段，并且可以以等同于 完整抗體的方式評(píng)估片段的功能。
除了"雙特異性"或"雙功能性"抗體外，抗體應(yīng)理解為其每一個(gè)結(jié)合位 點(diǎn)都是相同的。"雙特異性，，或"雙功能性抗體"是具有兩個(gè)不同的重鏈/輕鏈 對(duì)和兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)的人造雜交抗體?？赏ㄟ^多種方法，包括雜交瘤 的融合或Fab'片段的連接來產(chǎn)生雙特異性抗體。參見，例如，Songsivilai & Lachmann， Clin. Exp， Immunol. 79:315-321 (19卯)；Kostdny等人，J.
Immunol. 148， 1547-1553 (1992).
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞系"是指在培養(yǎng)中保持的并已獲得在離體 條件下生長(zhǎng)的能力的細(xì)胞?？墒辜?xì)胞系永生化或可將其短暫地建立為"原代 細(xì)胞系"。在某些實(shí)施方案中，可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)建立細(xì)胞系(參 見，例如，Kwak爭(zhēng)入(2006)爿w/附.所ofecA朋/. 17(1): 51-8)。在一些實(shí)施 方案中，細(xì)胞系是抗體生產(chǎn)性細(xì)胞系，可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)產(chǎn)生所 述細(xì)胞系(參見，例如，Dessain爭(zhēng)入(2004)丄/附附wwo/. AfW/^A. 291(1-2): 109-22.)。還可從商業(yè)來源例如ATCC細(xì)胞生物學(xué)保藏中心(American Type Culture Collections, Mannassas， VA)獲得細(xì)胞系。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)"結(jié)合劑"是指可通過共價(jià)鍵、氬鍵、離子鍵、 范德瓦爾斯力、倫敦力或所述力的任何組合與任何其他分子結(jié)合的分子。 結(jié)合劑包括，但不限于，蛋白質(zhì)和其片段、擬肽化合物(peptidomimetic compound)、抗體和其片段、核酸、毒素和小分子。
可通過本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法將結(jié)合劑置于經(jīng)衍生化的固相支持物上。 固相支持物包括，但不限于，珠、磁珠、孩1陣列芯片、硝酸纖維素膜、尼 龍膜、多孔板和PVDF膜。在一些實(shí)施方案中，固相支持物是板，其中電 極被置于板下以產(chǎn)生吸引結(jié)合磁性材料的結(jié)合劑的磁場(chǎng)。可以按照廠商的 方案使用板(參見Meso Scale Discovery, Gaithersburg， MD)。
固相支持物可以由玻璃、聚苯乙烯、塑料、磁性金屬例如鐵、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、纖維素或不影響結(jié)合劑結(jié)合蛋白質(zhì)的能力的任何惰性支持
物組成?？蓮睦鏏pplied Biosystems， (Foster City, CA)商購(gòu)獲得固相支持 物。
此外，在一些實(shí)施方案中，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施的方法，通 過稱為"印刷，，的方式(參見，例如，Schena等人，(1995) S"Vwce， 270(5235): 467-470),將結(jié)合劑置于固相支持物，例如微陣列芯片上。此處所使用的 術(shù)語(yǔ)"印刷"是指將點(diǎn)以非?？拷姆绞街糜诠滔嘀С治锷?，從而使得可以 在固相支持物上放置最大數(shù)目的點(diǎn)?？赏ㄟ^例如機(jī)器人印刷機(jī)(robotic printer)實(shí)施印刷方法。 <吏用Stealth Micro Spotting 4十(Telechem International, Inc， Sunnyvale, CA)的VersArray CHIP Writer Prosystem (BioRad Laboratories)是可用于產(chǎn)生用于該方面的聚焦微陣列(focused microarray )的芯片印刷裝置的非限定性實(shí)例。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)"合適的性質(zhì)"是指與目的蛋白尤其相關(guān)的性質(zhì)。 合適的性質(zhì)包括，但不限于，酶促反應(yīng)、抗體-表位相互作用和核酸-蛋白 質(zhì)相互作用。可通過分析目的蛋白的特定物理化學(xué)方面來測(cè)定合適的性質(zhì)。 例如，不旨在限制可使用的測(cè)定試驗(yàn)的類型，合適的性質(zhì)可以與蛋白質(zhì)的 大小、電荷、碳水化物含量、結(jié)合活性和酶活性相關(guān)?？墒褂梦锢斫Y(jié)構(gòu)分 析，例如NMR確定蛋白質(zhì)的總體三級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)。此外，基于凝集素的 測(cè)定試驗(yàn)和唾液酸測(cè)定試驗(yàn)(下面將更詳細(xì)地描述)可用于確定目的蛋白 的物理化學(xué)方面。換句話說，可以通過觀察目的蛋白的化學(xué)活性以及目的 蛋白的物理結(jié)構(gòu)來確定合適的性質(zhì)。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)"洗脫"是指通過使用溶劑從樹脂或結(jié)合劑中進(jìn) 行提取。從樹脂或結(jié)合劑上洗脫目的蛋白的方法可涉及包含能夠?qū)⒛康牡?白從結(jié)合劑上移走的分子的溶液。此外，溶劑可以具有改變樹脂或結(jié)合劑 的結(jié)合特性從而使目的蛋白不再與目的蛋白結(jié)合的pH。應(yīng)當(dāng)指出，任何溶 液均可在本發(fā)明中用于洗脫蛋白質(zhì)，只要該過程不影響目的蛋白的總體功 能或性質(zhì)。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)"樹脂"是指天然或合成來源的任何固體或半固
20體有機(jī)產(chǎn)物。樹脂包括可與允許從復(fù)雜混合物中純化分子的結(jié)構(gòu)部分綴合 的任何材料。用于本發(fā)明的結(jié)構(gòu)部分包括陽(yáng)離子分子、陰離子分子、金屬、 準(zhǔn)金屬、多糖、多肽、蛋白質(zhì)、核酸、肽、有機(jī)小分子和擬肽化合物。特 別地，樹脂本身可由任何惰性化合物，包括但不限于交聯(lián)葡聚糖、聚苯乙
烯、聚丙烯酰胺或中性多糖組成?？蓮睦鏑lontech Laboratories, Inc. (Mountain View， CA)商購(gòu)獲得樹脂。
此處所^f吏用的術(shù)語(yǔ)"高通量"是指允許以快速和筒單的方法確定細(xì)胞系 中存在期望的蛋白質(zhì)表達(dá)的手段。期望的蛋白質(zhì)表達(dá)既指通過高通量技術(shù) 篩選的細(xì)胞系表達(dá)的生物分子的數(shù)量也指其性質(zhì)。高通量方法還可包括用 于處理生物分子的自動(dòng)化系統(tǒng)和用于大^L4莫篩選的自動(dòng)化數(shù)據(jù)處理。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)"高通量滴定篩選"是指用于確定由細(xì)胞表達(dá)的 蛋白質(zhì)的數(shù)量的方法。高通量滴定篩選包括使用結(jié)合劑鑒定來源于細(xì)胞的 樣品中的目的蛋白。結(jié)合劑可以與可檢測(cè)的標(biāo)記物或固相支持物有效連接， 下面將對(duì)其全部進(jìn)行更詳細(xì)地描述。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)"高通量純化"是指同時(shí)或基本上同時(shí)地從多個(gè) 細(xì)胞樣品純化蛋白質(zhì)的方法。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞培養(yǎng)工藝改進(jìn)，，是指導(dǎo)致蛋白質(zhì)生產(chǎn)所需條 件得到優(yōu)化的過程，其中所述條件為在工業(yè)規(guī)^莫生產(chǎn)中或在小規(guī)模生產(chǎn)中 以足夠的數(shù)量和性質(zhì)生產(chǎn)蛋白質(zhì)所需的條件。可通過細(xì)胞培養(yǎng)工藝改進(jìn)方 法測(cè)試的條件包括，但不限于，鹽濃度、培養(yǎng)基內(nèi)容、生長(zhǎng)溫度、大氣壓、 大氣氧含量、培養(yǎng)物的攪拌和二氧化碳含量。細(xì)胞培養(yǎng)工藝改進(jìn)包括確定 蛋白質(zhì)的數(shù)量(高通量滴定篩選)和蛋白質(zhì)的性質(zhì)(高通量純化)的步驟。
為了細(xì)胞培養(yǎng)工藝改進(jìn)的目的，確定蛋白質(zhì)的性質(zhì)的方法包括但不限 于，結(jié)合測(cè)定試驗(yàn)、凝集素測(cè)定試驗(yàn)、唾液酸測(cè)定試驗(yàn)、NMR、圓二色性、 質(zhì)語(yǔ)、MALDI-TOF、酶測(cè)定法、比色測(cè)定法和氨基酸測(cè)序?？稍诩?xì)胞培 養(yǎng)工藝改進(jìn)方法的過程中于任何時(shí)間上使用這些測(cè)定試驗(yàn)。在某些實(shí)施方 案中，在完成目的蛋白的高通量純化后實(shí)施這些測(cè)定試驗(yàn)。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)"目的蛋白"是指為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)或制藥目的而生產(chǎn)的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣分子。例如，目的蛋白可以是治療性蛋白 質(zhì)。可從核酸序列(無論是染色體還是染色體外)產(chǎn)生目的蛋白，所述核
紗列包括但不限于前信使RNA、信使RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核內(nèi)異質(zhì)RNA ("HnRNA")、核糖體RNA、單鏈DNA和雙鏈RNA。核紗列的染色體 外來源可包括雙鏈DNA病毒基因組、單鏈DNA病毒基因組、雙鏈RNA 病毒基因組、單鏈RNA病毒基因組、細(xì)菌DNA 、線粒體基因組DNA 、 cDNA 或能夠產(chǎn)生目的蛋白的任何其他外來核酸來源。目的蛋白可以是任何結(jié)構(gòu) 或結(jié)構(gòu)的組合。例如，目的蛋白包括但不限于重組蛋白質(zhì)、包含四級(jí)結(jié)構(gòu) 的蛋白質(zhì)、糖基化蛋白、脂質(zhì)化蛋白、寡肽、肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì) 亞基、抗體或其片段和抗體樣分子。目的蛋白還包括例如融合蛋白。融合 蛋白通常具有引導(dǎo)肽的全部或?qū)嵸|(zhì)上部分，所述肽在N或C端連接第二多 肽或蛋白質(zhì)的全部或部分。例如，融合蛋白可使用來自其他物種的前導(dǎo)序 列，以允許蛋白質(zhì)在異源宿主中重組表達(dá)。另一種有用的融合包括加入免 疫學(xué)活性結(jié)構(gòu)域，例如抗體表位，以幫助融合蛋白的純化。融合蛋白可包 括靶向性結(jié)構(gòu)部分，例如可溶性受體片段或配體，和免疫球蛋白鏈、Fc片 段、各種同種型(包括IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgAl、 IgA2、 IgD和IgE)的重鏈恒定區(qū)。例如，融合蛋白可包含受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和 (例如融合至)人免疫球蛋白Fc鏈(例如，人IgG，例如，人IgGl或人IgG4， 或其突變形式)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在一個(gè)或多個(gè)^J^酸上，例如在野生 型序列的殘基254和257上突變?nèi)薋c序列以減少Fc受體的結(jié)合。融合蛋 白可額外地包括連接第一結(jié)構(gòu)部分和第二結(jié)構(gòu)部分例如免疫球蛋白片段的 接頭序列。例如，融合蛋白可包括肽接頭，例如長(zhǎng)度為大約4至20個(gè)，更 優(yōu)選5至10個(gè)氨基酸的肽接頭；肽接頭長(zhǎng)度可以為8個(gè)氨基酸。例如，融 合蛋白可包括具有式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y(其中y為1、 2、 3、 4、 5、 6、 7或8)的肽接頭。在其他實(shí)施方案中，可將額外的氨基酸殘基加至融合蛋 白的N或C末端，以促進(jìn)表達(dá)、空間柔性、檢測(cè)和/或分離或純化。
在融合接合處或附近包含切割位點(diǎn)可利于在純化后去除外來多肽。其 他有用的融合包括功能性結(jié)構(gòu)域例如來自酶的活性位點(diǎn)、糖基化結(jié)構(gòu)域、
22細(xì)胞靶向信號(hào)或跨膜區(qū)的連接?？刹⑷肴诤系鞍椎牡鞍踪|(zhì)或肽的實(shí)例包括 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制蛋白、殺細(xì)胞蛋白、促細(xì)胞凋亡劑、抗血管生成劑、激素、
細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、肽類藥物、抗體、Fab片段抗體、抗原、受體蛋白、 酶、凝激素、MHC蛋白、細(xì)胞粘附蛋白和結(jié)合蛋白。產(chǎn)生融合蛋白的方 法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。可以例如通過如下方式產(chǎn)生此類蛋 白質(zhì)使用雙官能交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)連接，從頭合成完整的融合蛋白、或?qū)?編碼引導(dǎo)肽的DNA序列與編碼第二肽或蛋白質(zhì)的DNA序列連接然后表達(dá) 完整的融合蛋白。
在某些實(shí)施方案中，融合蛋白是例如腫瘤壞死因子a和p受體 (TNFR-1; 1991年3月20日公布的EP 417,563;和TNFR-2， 1991年3月 20日公布的EP417，014，其各自通過以其全文引用合并入本文)形式的腫瘤 壞死因子抑制劑，可以按照本發(fā)明對(duì)其進(jìn)行分析(關(guān)于綜述，參見Naismith 和Sprang, J Inflamm. 47(1-2):1-7, 1995-96，通過以其全文引用合并入本 文)。根據(jù)一些實(shí)施方案，腫瘤壞死因子抑制劑包含可溶性TNF受體。在 某些實(shí)施方案中，肺瘤壞死因子抑制劑包含融合至免疫球蛋白的任何部分， 包括免疫球蛋白的Fc區(qū)的可溶性TNFR。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的 TNF抑制劑是TNFRI和TNFRII的可溶性形式。在某些實(shí)施方案中，本 發(fā)明的TNF抑制劑是可溶性TNF結(jié)合蛋白。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明 的TNF抑制劑是TNFR-Fc，例如，依那西普(etanercept )。如此處所使用 的，"依那西普"是指形式為兩個(gè)分子的p75TNF-a受體的細(xì)胞外部分的二 聚體(每個(gè)分子包含235個(gè)氨基酸的人IgGl的Fc部分)的TNFR-Fc 。 根據(jù)本發(fā)明，可以使用抗衰老化合物例如肌肽在TNFR-Fc的生產(chǎn)過程中 減少錯(cuò)折疊和/或聚集的蛋白質(zhì)的量。
可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)制備蛋白質(zhì)或肽，包括利用標(biāo) 準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽或肽、自天然來源分離蛋白質(zhì)或肽、 或化學(xué)合成蛋白質(zhì)或肽?？墒褂么颂幑_的技術(shù)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的 技術(shù)，擴(kuò)增和/或表達(dá)已知基因的編碼區(qū)(參見，例如，Kaleeba等人(2006) Science 311 (5769):1921-4)。可選擇地，蛋白質(zhì)、多肽和肽的各種商業(yè)制品對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。
此外，如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)"期望的表達(dá)水平，，是指取決于蛋白質(zhì)的 物理化學(xué)特征，為了允許蛋白質(zhì)的隨后純化所必需的蛋白質(zhì)的數(shù)量。目的 蛋白的期望表達(dá)水平取決于許多與待使用的生產(chǎn)方法相關(guān)的因素。例如， 特定細(xì)胞系中的表達(dá)水平將允許進(jìn)行蛋白質(zhì)的性質(zhì)和數(shù)量分析以及蛋白質(zhì) 的有效純化。因此可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)蛋白質(zhì)的特性和待用于該蛋 白質(zhì)的純化和分析測(cè)定方法，確定細(xì)胞系的期望蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
在某些實(shí)施方案中，基于對(duì)目的蛋白的特定要求，選擇期望的蛋白質(zhì) 表達(dá)水平。例如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平選擇為增加 的目的蛋白表達(dá)水平，以使產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量最大化。在其他實(shí)施方案中， 對(duì)于在生產(chǎn)其的細(xì)胞中具有高水平毒性的蛋白質(zhì)，例如毒素而言，可以將 減少的目的蛋白的表達(dá)水平選擇為期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。此外，在目的 蛋白以高濃度水平形成包涵體的情況下，也可以選擇減少的蛋白質(zhì)表達(dá)水 平。因此，由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇的蛋白質(zhì)表達(dá)水平取決于目的蛋白的特 征。
在確定細(xì)胞系產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的數(shù)量和性質(zhì)時(shí)，通常需要細(xì)胞系樣品用 于評(píng)估蛋白質(zhì)的表達(dá)和蛋白質(zhì)的性質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，可以使用本領(lǐng)
域已知的方法，例如細(xì)胞裂解和上清液分離法(參見，例如，Vara爭(zhēng)入(2005) 必/o附fl&Wtf/s 26(18): 3987-93; Iyer 爭(zhēng)乂 (1998) / C7^附. 273(5):2692-7),分離細(xì)胞系樣品?？蛇x擇地，可以從具有分泌蛋白例如抗 體、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白或血清蛋白的培養(yǎng)基中分離細(xì)胞系樣品。在這樣的實(shí) 施方案中，培養(yǎng)基是待就蛋白質(zhì)的數(shù)量和性質(zhì)接受檢測(cè)的樣品。在一個(gè)實(shí) 施方案中，如本文中進(jìn)一步描述的，在任何之前的純化步驟不存在的情況 下，將培養(yǎng)基樣品用于測(cè)定試驗(yàn)中檢測(cè)蛋白質(zhì)的數(shù)量。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了高通量篩選用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的細(xì)胞系的方 法。在該方法中，通過將固相支持物與包含蛋白質(zhì)的細(xì)胞系樣品接觸來確 定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞系樣品是細(xì)胞培養(yǎng)基。固 相支持物在其表面附著有能夠和蛋白質(zhì)結(jié)合的第一結(jié)合劑。該方法還包括可以和第一結(jié)合劑所結(jié)合并固定在固相支持物上的蛋白質(zhì)結(jié)合的第二結(jié)合 劑。第二結(jié)合劑與可檢測(cè)的標(biāo)記物有效連接?；诘鞍踪|(zhì)所需要的期望表 達(dá)水平選擇細(xì)胞系。
可通過"點(diǎn)印跡法，，(參見，例如，Heinicke爭(zhēng)乂(1992) /. /附附w朋/. AfW/ioA. 152(2): 227-36.)測(cè)量特定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，其中將第一結(jié)合劑 固定在膜例如硝酸纖維素、尼龍或PVDF膜上。還可使用蛋白質(zhì)微陣列技 術(shù)確定樣品中蛋白質(zhì)的表達(dá)?；蛘?，可以將樣品置于多孔板的包含第一結(jié) 合劑的小孔中。在這樣的實(shí)施方案中，類似的技術(shù)例如ELISA分析是本領(lǐng) 域常規(guī)的(參見，例如，Ausubel，爭(zhēng)乂(1996)C"/re"f尸rotoco/y/"Mo/ecw/fl尸 B脅^v，第1巻，pp. 4.2.1-4.2.9， John Wiley & Sons, Inc.)。
在一些實(shí)施方案中，使用自動(dòng)化工作站進(jìn)行細(xì)胞系樣品的高通量篩選 和/或純化。此外，可使用自動(dòng)化工作站進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)工藝改進(jìn)。通常在本 領(lǐng)域中使用自動(dòng)化工作站以在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行許多實(shí)驗(yàn)。自動(dòng)化工作站的實(shí) 例包括，但不限于，TECAN Genesis工作站(TECAN Schweiz AG, Mannedorf， CH)和Biomek FX工作站(Beckman Coulter, Fullerton， CA)?？蓮淖詣?dòng)化工作站的廠商獲得使用的方法，所述方法在本領(lǐng)域內(nèi)是 熟知的。
1.2.結(jié)合劑
本發(fā)明的方面使用結(jié)合目的蛋白的結(jié)合劑。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合 劑是抗體或其片段。當(dāng)特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合劑是抗體時(shí)，抗體可以是， 但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、遺傳工程 化抗體、雙特異性抗體(其中雙特異性抗體的特異性之一可以特異地結(jié)合 丙糖磷酸異構(gòu)酶蛋白質(zhì))、抗體片段(包括但不限于"Fv"、 "F(ab，)2"、 "F(ab)"和"Dab");和表現(xiàn)為是抗體的反應(yīng)性部分的單鏈("SC-MAb")。用 于制造抗體和其他結(jié)合劑的方法是熟知的(參見，例如，Coligan爭(zhēng)入(1991) 7V她o /s /" 7"附附wwo/og);， John Wiley和Sons, Inc.; Jones 爭(zhēng)入 (1986) yVW"" 321: 522-525; Marx (1985) 229: 455-456; Rodwell(1989) iVa,"" 342: 99-100; Clackson (1991) /.及/^M附ffto/. 3052: 36-39; Reichman爭(zhēng)入(1988) iVfl似"332: 323-327; Verhoeyen，爭(zhēng)入(1988) 239: 1534-1536)。
結(jié)合劑可以是能與抗體的Fc部分結(jié)合的抗體或其片段。在某些實(shí)施方 案中，結(jié)合劑允許檢測(cè)細(xì)胞系樣品中的抗體。在特定的實(shí)施方案中，使用 電化學(xué)發(fā)光可檢測(cè)標(biāo)記物，例如釕，可檢測(cè)地標(biāo)記作為第二結(jié)合劑的抗體。 此外，第二結(jié)合劑可以是使用電化學(xué)發(fā)光可檢測(cè)標(biāo)記物例如釕可檢測(cè)地標(biāo) 記的F(ab，)2片段。
圖1中顯示了使用F(ab，)2片段檢測(cè)目的蛋白。該F(ab，)2片段與可檢 測(cè)的標(biāo)記物例如Ori-Tag有效連接。在圖1中，F(xiàn)(ab，)2片段識(shí)別在該圖示 實(shí)例中作為目的蛋白的抗體的Fc部分。所述抗體已被固定在其上綴合有A 蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的珠上(圖1)。通過光的產(chǎn)生，觀察F(ab，)2片段 的結(jié)合(圖1)。
重要地應(yīng)注意，可將在本發(fā)明的方面中用作第 一結(jié)合劑的抗體偶聯(lián)至 固相支持物的表面。第一結(jié)合劑的偶聯(lián)可以提高反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度和產(chǎn)生改 善的結(jié)果。常用偶聯(lián)劑包括但不限于，使用(3-巰基丙基)三曱氧基硅烷 的硅烷化、瓊脂糖包衣和多聚-L-賴氨酸膜。此外，可對(duì)重組抗體進(jìn)行工程 改造以包含有助于偶聯(lián)支持物的標(biāo)簽(tag)。例如，可將具有組氨酸標(biāo)簽的 重組抗體偶聯(lián)至用鎳包被的支持物。
此外，化合物例如肽、擬肽化合物和小分子可用作結(jié)合劑?？蓮碾幕?其他生物分子，包括但不限于，糖、脂肪酸、固醇、類異戊二烯、噤呤、 嘧啶、上述物質(zhì)的衍生物或結(jié)構(gòu)類似物、或其組合等，合成結(jié)合劑。可使 用噬菌體展示文庫(kù)和化學(xué)重組文庫(kù)開發(fā)和選擇對(duì)于目的蛋白而言是可接受 的結(jié)合劑的合成化合物。本發(fā)明還考慮使用從如下物質(zhì)制備的潛在結(jié)合劑 擬肽(peptoid)、隨機(jī)生物寡聚物(美國(guó)專利號(hào)5，650，489)、苯并二氮雜卓類、 diversomer例如dydantoin、苯并二氮雜卓類和二肽、具有卩-D-葡萄糖骨 架的非肽擬肽物、寡聚氨基曱酸酯或肽基磷酸酯(peptidyl phosphonate )。
在某些實(shí)施方案中，結(jié)合劑可以是設(shè)計(jì)與蛋白質(zhì)特異性相互作用、結(jié)
26合或連接的肽。肽結(jié)合劑也可與任何其他蛋白質(zhì)的M酸序列相互作用、 連接或結(jié)合?？墒闺慕邮芏ㄏ蚧螂S機(jī)的化學(xué)修飾，例如?；?、烷基化、酯
化、酰胺化(amidification)等。
通過確定目的蛋白的結(jié)構(gòu)特征，例如使用X射線晶體學(xué)、中子衍射、 核磁共振光鐠和用于結(jié)構(gòu)確定的其他技術(shù)，可以進(jìn)一步幫助肽結(jié)合劑的鑒 定和篩選。計(jì)算機(jī)算法可進(jìn)一步幫助結(jié)合劑的鑒定?？梢允褂媚軌驋呙杈?有已知三維結(jié)構(gòu)的肽和小分子的數(shù)據(jù)庫(kù)從而鑒定在幾何形狀上適合靶蛋白 質(zhì)的位點(diǎn)的候選物的此類計(jì)算機(jī)算法(參見，例如，Chen和Kellogg (2005) 丄0 附/7"/1. AV/^/Afo/."仏19(2):69-82)。該類型的大多數(shù)算法提供了可以 用于發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)的結(jié)合口袋或結(jié)構(gòu)域區(qū)域形狀互補(bǔ)的類型廣泛的化學(xué)結(jié) 構(gòu)的方法?？蓪碜蕴囟〝?shù)據(jù)庫(kù)的一組肽中的每一個(gè)肽進(jìn)行比較，以確定 最有與目的蛋白相互作用的潛力的特定肽。
本發(fā)明的化合物還可以是擬肽化合物，該擬肽化合物可以至少部分地 是非天然的。擬肽化合物可以是具有任何期望的氨基酸序列的部分的小分 子模擬物。該化合物由于是才莫擬物從而可能具有增加的穩(wěn)定性、功效、效 力和生物利用度。此外，該化合物可具有減少的毒性。擬肽化合物可具有 增強(qiáng)的腸粘膜通透性。可通過合成制備該化合物。本發(fā)明的化合物可包括 L-、 D-或非天然氨基酸、a，a-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸(丙氨 酸的等電子類似物)?；衔锏碾闹麈溈删哂兄辽僖粋€(gè)用PSI-[CH-CH]替 代的鍵(Kempf爭(zhēng)入(1991) /w/L / /V/^. 7VW"w及"38(3): 237-41)?；衔?還可包括三氟酪氨酸、對(duì)-Cl-苯丙氨酸、對(duì)-Br-苯丙氨酸、聚-L-炔丙基甘 氨酸、聚-D，L-烯丙基甘氨酸或聚-L-烯丙基甘氨酸。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例是擬肽化合物，其中化合物具有被合適的模擬物替 代的鍵、肽主鏈或氨基酸組分。可以是合適的^酸模擬物的非天然M 酸的實(shí)例包括，但不限于P-丙氨酸、L-a-氨基丁酸、L個(gè)氨基丁酸、L-a-氨基異丁酸、L-s-氨基己酸、7-M庚酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、半胱氨 酸(乙酰^J^甲基)、N陽(yáng)s國(guó)Boc-N-a國(guó)CBZ畫L畫賴氨酸、N陽(yáng)s-Boc-N-a-Fmoc-L-賴 氨酸、L-曱硫氨酸砜、L-正亮氨酸、L-正纈氨酸、N-a-Boc-N-S-CBZ-L-鳥氨酸、N-3-Boc-N-a-CBZ-L-鳥氨酸、Boc-對(duì)-硝基-L-苯丙氨酸、Boc-羥脯 氨酸、Boc-L-硫代脯氨酸。(Blondelle，爭(zhēng)乂(1994)爿wri附/cro6. C&附W/^r. 38(10): 2280-6; Pinilla， 爭(zhēng)入(1995)必/o/;o(v附era. 37(3): 221-40)。
有時(shí)，結(jié)合劑可以是能與蛋白質(zhì)結(jié)合、相互作用或連接的小分子。這 樣的小分子可以是能夠穿透細(xì)胞的脂雙層的有機(jī)分子。小分子包括，但不 限于，毒素、螯合劑、金屬和準(zhǔn)金屬化合物?？蓪⑿》肿痈街粱蚓Y合至 靶向試劑，以便將小分子特異地引導(dǎo)至特定細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，結(jié)合劑是核酸序列，所述核,列可以是在生物 條件下能夠與蛋白質(zhì)例如轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的全長(zhǎng)序列、全長(zhǎng)序列的片段或合 成的寡核苷酸。"核酸"是指包含兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸的聚合物，其包括單 鏈、雙鏈和三鏈聚合物。"核苷酸，，是指天然和非天然化合物，其包含雜環(huán) 堿基、糖和連接基團(tuán)例如磷酸酯。例如，可將結(jié)構(gòu)基團(tuán)加至核苷酸的核糖 基或脫氧核糖基單位，例如2，-0位置上的甲基或烯丙基或替代2，-0基團(tuán) 的氟基?？梢岳缬脮趸⑺狨セ騉-甲基磷酸酯替代或修飾核酸的連接基 團(tuán)例如核酸的磷酸二酯。還可修飾堿基和糖，這在本領(lǐng)域中是已知的。為 了本公開內(nèi)容的目的，"核酸"還包括其中天然或修飾的核酸堿基附著至聚 酰胺主鏈上的"肽核酸"。
可將本發(fā)明的結(jié)合劑與可檢測(cè)的標(biāo)記物綴合。根據(jù)本發(fā)明，"可檢測(cè)的 標(biāo)記物"是可凈皮感知的結(jié)構(gòu)部分。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物與結(jié) 合劑有效連接。"有效連接"是指通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵(例如，離子鍵) 將可檢測(cè)的標(biāo)記物附著至結(jié)合劑上。用于產(chǎn)生共價(jià)鍵的方法是已知的(參見 例如 Wong, S. S. (1991) Ore附/s外 iVote/" C呵.wg"&Vm 0仍s-Z/"A:/fig， CRC Press; Burkhart爭(zhēng)入(1999) 77^ 0^附/對(duì)/j朋^ 々/7//cfl,/ow 6>/爿附/"< CWw57/wA;/wgor y4附/"o/i/"她，John Wiley & Sons Inc.中的一般方案)。
根據(jù)本發(fā)明，可檢測(cè)地標(biāo)記的結(jié)合劑包括與可檢測(cè)的結(jié)構(gòu)部分綴合的 結(jié)合劑。本發(fā)明的另一種可檢測(cè)地標(biāo)記的結(jié)合劑是融合蛋白，其中一個(gè)配
28偶體是結(jié)合劑，另一個(gè)配偶體是可檢測(cè)的標(biāo)記物。可檢測(cè)地標(biāo)記的結(jié)合劑 的再一非限定性實(shí)例是包含結(jié)合劑和對(duì)第二結(jié)構(gòu)部分具有高親和力的第一 結(jié)構(gòu)部分的第一融合蛋白和包含第二結(jié)構(gòu)部分和可檢測(cè)標(biāo)記物的第二融合 蛋白。例如，特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合劑可以與鏈霉抗生物素蛋白結(jié)構(gòu)部 分有效連接。向結(jié)合劑-鏈霉抗生物素蛋白融合蛋白中加入包含與熒光素結(jié) 構(gòu)部分有效連接的生物素結(jié)構(gòu)部分的第二融合蛋白，其中第二融合蛋白與 結(jié)合劑-鏈霉抗生物素蛋白融合蛋白的組合導(dǎo)致產(chǎn)生可檢測(cè)地標(biāo)記的結(jié)合 劑(即，與可檢測(cè)的標(biāo)記物有效連接的結(jié)合劑)。在特定的實(shí)施方案中，可
通過醫(yī)學(xué)成像裝置或系統(tǒng)檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)記物。例如，當(dāng)醫(yī)學(xué)成像系統(tǒng)是x
光機(jī)時(shí)，可通過X光機(jī)檢測(cè)的可檢測(cè)標(biāo)記物是放射性標(biāo)記物(例如，32P)。
注意，結(jié)合劑不必直接綴合可檢測(cè)結(jié)構(gòu)部分。例如，對(duì)于本身可以被第二
可檢測(cè)的結(jié)合劑(例如，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗小鼠第二抗體)特異性結(jié)合 的結(jié)合劑(例如，抗體)，其是與可檢測(cè)的結(jié)構(gòu)部分(即，F(xiàn)ITC結(jié)構(gòu)部分) 有效連接的。
可檢測(cè)標(biāo)記物可以是，但不限于，熒光團(tuán)(例如，熒光素(FITC)、藻 紅蛋白、羅丹明)、化學(xué)染料、或方文射性的、化學(xué)發(fā)光的、電化學(xué)發(fā)光的、 磁性的、順磁性的、親磁性的化合物、或產(chǎn)生可以是有色的、化學(xué)發(fā)光的 或磁性的產(chǎn)物的酶。可通過任何合適的手段，包括分光術(shù)、光化學(xué)、生物 化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)手段檢測(cè)信號(hào)。在某些情況下，可通 過兩種或更多種手段檢測(cè)信號(hào)。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)標(biāo)記物包括熒 光染料、^L射性標(biāo)記物、電化學(xué)發(fā)光和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。
例如，可將結(jié)合劑的氨基酸與Cy5/Cy3熒光染料綴合。這些染料常用 于本領(lǐng)域(參見，例如，Linder爭(zhēng)人(2002) E/e"n^/^ms/s. 23(5): 740-9)。 熒光標(biāo)記物可選自多種結(jié)構(gòu)類型，包括非限定性實(shí)例，例如l-和2-氨基萘、 p,p，-二氨基芪、芘、菲啶季銨鹽、9-氨基吖啶、p，p，-二氨基二苯甲酮亞胺、 蒽、氧雜羰花青、部花青(marocyanine )、 3-氨基馬萘雌酮、二萘嵌苯、 二苯并噁唑、二-對(duì)-噁唑基苯、1，2-苯并吩溱、視黃醇、二-3-氨基吡啶嗡鹽、 噢根普配基、四環(huán)素、sterophenol、苯并咪唑基苯胺、2-氧代-3-色烯(chromen)、吲哚、卩占噸、7-羥基香豆素、吩噁溱、7jC楊酸鹽、毒毛旋花 苷配基、卟啉、三芳基甲烷、黃素、卩占噸染料(例如，熒光素和羅丹明染料)、 花青染料、4，4-二氟-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-環(huán)戊二烯并茚(indacene )染料 和熒光蛋白(例如，綠色熒光蛋白、藻膽蛋白)。
其他有用的染料是化學(xué)發(fā)光染料，其可包括，但不限于，生物素綴合 的氨基酸。在特定的實(shí)施方案中，將電化學(xué)發(fā)光探針綴合至結(jié)合劑。如此 處所使用的，"電化學(xué)發(fā)光"是在電化學(xué)反應(yīng)后發(fā)生的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。電化 學(xué)發(fā)光探針包括，但不限于，魯米諾、二氫化吖啶酯、釕、釕螯合劑和三 聯(lián)吡咬釕、NHS酯。可從例如BioVeris Corp. (Gaithersburg, MD)商購(gòu)獲 得電化學(xué)發(fā)光探針。
1.3 分析測(cè)定試驗(yàn)
本發(fā)明的方面還使用蛋白質(zhì)性質(zhì)的測(cè)定試驗(yàn)?？稍谀康牡鞍椎母咄?滴定篩選過程中使用這些測(cè)定試驗(yàn)。還可在細(xì)胞培養(yǎng)工藝改進(jìn)期間確定蛋 白質(zhì)的性質(zhì)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作為蛋白質(zhì)性質(zhì)的一個(gè)部分，包括蛋白質(zhì)的一級(jí)、 二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)以及翻譯后修飾，例如糖基化、脂質(zhì)化和磷酸化。 此外，蛋白質(zhì)的大小、形狀和電荷也影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的物理結(jié) 構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)刊-使其正常功能的能力具有顯著影響。在酶反應(yīng)的情況下，蛋 白質(zhì)結(jié)構(gòu)實(shí)際上對(duì)于整個(gè)酶性質(zhì)是重要的。在抗體或其片段的情況下，抗 體的氨基酸的大小、形狀、表面電荷、糖基化和磷酸化對(duì)抗體的表位特異 性具有顯著的影響。
在一些實(shí)施方案中，使用NMR、基質(zhì)輔助激光解吸/飛行時(shí)間 ("MALDI-TOF")分析和圓二色性確定蛋白質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)(參見，例如，美 國(guó)專利號(hào)6,930,305、 7,005,272和7，029，872)。此類技術(shù)提供了對(duì)蛋白質(zhì)的 總體物理結(jié)構(gòu)的詳細(xì)分析。這些技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。
在特定的實(shí)施方案中，使用大小排阻層析確定目的蛋白的大小(參見， 例如，Brooks爭(zhēng)入(2000)7Va,/.f/5^. 97(13): 7064—7067)。 此外，可使用陽(yáng)離子交換層析確定蛋白質(zhì)的電荷(參見，例如，Zhang和 Glatz (1999)說WecA柳/.15(1): 12-18)?？捎糜阼b定目的蛋白的結(jié)構(gòu)的其他技術(shù)包括但不限于，反相HPLC、毛細(xì)管電泳SDS、毛細(xì)管區(qū)帶電泳 和高pH陰離子交換HPLC。可使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的程序?qū)嵤┻@些技術(shù)。
其他結(jié)構(gòu)測(cè)定試驗(yàn)包括唾液酸測(cè)定試驗(yàn)和凝集素測(cè)定試驗(yàn)。這些測(cè)定 試驗(yàn)鑒定蛋白質(zhì)表面上的糖基化水平，所M基化水平可以提供有關(guān)蛋白 質(zhì)性質(zhì)的信息。已使用唾液酸測(cè)定試驗(yàn)確定樣品中碳水化合物存在的程度， 這些技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的(參見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,807,553和 5，855，卯1)。基于凝集素的測(cè)定試驗(yàn)也檢測(cè)樣品中碳7jC化合物的存在，但通 過蛋白質(zhì)-碳水化合物相互作用的機(jī)制進(jìn)行(參見，例如，美國(guó)專利號(hào) 5,633,148)。凝集素測(cè)定試驗(yàn)已在本領(lǐng)域中廣泛用于碳7jC化合物的結(jié)合，并 在例如美國(guó)專利6,331,319中進(jìn)行了描述。
除了確定蛋白質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)，還可以測(cè)定蛋白質(zhì)行^使某些功能的能力 (參見，例如，美國(guó)專利號(hào)7,029,862)。此外，可在結(jié)合測(cè)定試驗(yàn)或結(jié)合抑 制測(cè)定試驗(yàn)中，使用例如包含受體的膜級(jí)分或表達(dá)受體的細(xì)胞，檢測(cè)蛋白 質(zhì)或多肽(例如，由雜交核酸編碼)的結(jié)合功能(參見，例如Van Riper爭(zhēng) 乂(1993) / ￡"jc/7. ATW.， 177: 851-856; Sledziewski等人，美國(guó)專利號(hào) 5,284,746)。由此，可估量編碼的蛋白質(zhì)或多肽結(jié)合配體、抑制劑和/或啟 動(dòng)子的能力。可使用結(jié)合蛋白質(zhì)的抗體通過免疫學(xué)方法，例如免疫印跡法、 免疫沉淀法和免疫測(cè)定法(例如，方文射免疫測(cè)定法、ELISA)，確定由本發(fā) 明的核酸編碼的蛋白質(zhì)或多肽的抗原特性。
可通過酶測(cè)定試騶r檢測(cè)蛋白質(zhì)或多肽(例如，由雜交核酸編碼)的信
號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能?？墒褂帽磉_(dá)蛋白質(zhì)或多肽的細(xì)胞，通過用于趨化性或介質(zhì)釋 放的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定試驗(yàn)(例如，監(jiān)測(cè)響應(yīng)配體或啟動(dòng)子的趨化性、胞吐作用(例 如，酶例如酯酶(例如絲氨酸酯酶)、穿孔蛋白、粒酶的脫粒)或介質(zhì)釋放(例 如，組胺、白細(xì)胞三烯)的測(cè)定試驗(yàn))(參見，例如，Taub爭(zhēng)人(1995) /. /附附wwo/" 155: 3877-3888; Baggliolini, M.和C. A. Dahinden (1994) /附附"膨/ogv 7iw/ay， 15: 127-133和此處引用的參考資料)，檢測(cè)蛋白質(zhì)或多 肽(例如，由雜交核酸編碼)的刺激功能。還可通過其他合適的方法估量 蛋白質(zhì)受體的功能特征。為例證本發(fā)明的方法，在各種細(xì)胞系上實(shí)施了上述篩選方法以鑒定產(chǎn) 生足夠數(shù)量的蛋白質(zhì)和足夠質(zhì)量的蛋白質(zhì)的那些細(xì)胞系。
實(shí)施例
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或只通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)即能夠確認(rèn)此處描述的具 體物質(zhì)和方法的大量等同方案。此類等同方案意欲包括在下列實(shí)施例之后 的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1
人Fc蛋白質(zhì)測(cè)定的高通量篩選
1. 抗AB標(biāo)準(zhǔn)品的制備
通過將20 ul的培養(yǎng)基R5CD1和24 ml測(cè)定緩沖液(PBS w/ 0.05 % Tween 20和1 %牛血清白蛋白)混合，在16塊測(cè)定板(Corning/Costar， Corning, NY)中預(yù)備標(biāo)準(zhǔn)曲線緩沖液(SCB )。使用6 ul 32.5 mg/ml參照標(biāo) 準(zhǔn)和644 ul SCB制備0.3 mg/ml中間標(biāo)準(zhǔn)(每次新鮮制備)。將1 ug/ml標(biāo)準(zhǔn) 置于2ml深孔板的稱為Al的小孔中和稱為HI的另外的小孔中。在16塊 測(cè)定板中,小孔Al包含6 ul 0.3 mg/ml中間標(biāo)準(zhǔn)和1794 ul SCB。對(duì)于小 孔H1，重復(fù)該過程。對(duì)于16塊測(cè)定板之每一塊，通過在孔中取卯Oul溶 液并加入900 ul SCB來制備系列稀釋物。以每標(biāo)準(zhǔn)孔50 ul分配稀釋物。
2. 對(duì)照的制備
制備對(duì)照以產(chǎn)生濃度為120 ug/ml的中間對(duì)照。簡(jiǎn)而言之，將6ul32.5 mg/ml參照標(biāo)準(zhǔn)與1619 ul培養(yǎng)基R5CD1混合。通過將5 ul 120ug/ml中間 對(duì)照和195 ul測(cè)定緩沖液混合，制備1:40的稀釋物；而通過將20 ul 1:40 稀釋的對(duì)照和180 ul測(cè)定緩沖液混合，制備1:400的稀釋物。通過取80 ul 1:400稀釋的對(duì)照并混合在160 ul測(cè)定緩沖液中，每?jī)蓧K測(cè)定板制備一份 1:1200稀釋的稀釋物。以每0.1對(duì)照孔50ul的量分配1:1200的稀釋物。此外，通過如下方式制備包含0.01 ng/ml對(duì)照的對(duì)照物將150 ul 120 ug/ml中間對(duì)照(如上所制備的)在l350 ul培養(yǎng)基中混合。通過將5 ul 12ug/ml中間對(duì)照在195 ul測(cè)定緩沖液中混合來制備1:40的稀釋物。通過 將20 ul l:40稀釋的對(duì)照混合在180 ul測(cè)定緩沖液中來制備1:400的稀釋 物，通過將80 ul 1:400稀釋的對(duì)照混合在160 ul測(cè)定緩沖液中，每2塊測(cè) 定板制備一份1:1200的稀釋物。以每0.01對(duì)照孔50 ul 1:1200稀釋的對(duì)照 等分試樣，分配對(duì)照。
2.帶ORI-標(biāo)簽的F(ab，^片段的制備
使用下列方案完成帶ORI-標(biāo)簽的抗Fc F(ab，)2片段的制備(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)。 簡(jiǎn)而言之，向1小 瓶ORITAGNHS酯(BioVeris，Gaithersburg，MD)中加入50plDMSO。以 最大的設(shè)置渦旋混合物直至小瓶底部的ORITAG溶解。然后，向50)nl溶 解的ORITAGNHS酯中加入1638 [il affiniPure F(ab，)2片段山羊抗人IgG 抗體至1638 ul。渦旋混合物，在黑色包裹中室溫孵育所述混合物60分鐘。 在孵育期間，在振蕩器上旋轉(zhuǎn)小瓶。
通過加入20 pi 2M甘氨酸來終止反應(yīng)，用箔紙包住試管，室溫孵育10 分鐘。在孵育期，用0.1% NaN3平衡兩個(gè)具有PBS的PD10 (Pharmacia, Piscataway, NJ)柱，并且按照廠商的方案進(jìn)行4吏用。將反應(yīng)試管離心5秒 以收集管中的所有體積。然后，向各PD10柱中加入854 ul反應(yīng)物。將樣 品加載至柱上，最終從每個(gè)柱子收集了 8管0.5 ml等分試樣。
通過BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒確定蛋白質(zhì)濃度。此外，來自第二步驟 的未標(biāo)記的剩余抗體用作確定蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)。在455 nm處測(cè)量蛋白 質(zhì)樣品的吸光度。
將具有合適的蛋白質(zhì)濃度和良好的ORI-TAG:蛋白質(zhì)比例的級(jí)分混 合。向最終的小瓶中加入牛血清白蛋白，從而制備P/。BSA溶液。將小瓶 在40 。C 5&存。
333. 細(xì)胞系樣品的制備和反應(yīng)
通過將5ul來自產(chǎn)生GPlba、 IL13R、抗CD22抗體、抗Lewis Y抗 體、抗Ap抗體或TNFR融合蛋白的細(xì)胞系的樣品與195 ul測(cè)定緩沖液混 合以制備1:40的稀釋物，通過將20 ul 1:40稀釋的樣品與180 ul測(cè)定緩沖 液混合以制備樣品的1:400稀釋物。最后，通過取出70 ul 1:400稀釋的樣 品并且將該樣品與140 ul測(cè)定緩沖液混合來制備1:1200稀釋物。以50 ul 將該終稀釋物分配至每一個(gè)樣品孔中。也將1:400稀釋物分配入另一塊測(cè) 定板的樣品孔中。
以5350 nl等分試樣(在5344 ul緩沖液中包含6 ul F(ab，)2片段)將帶 標(biāo)簽的F(ab，)2片段分配至每一塊測(cè)定板。每孔50 ul溶液。
從Dynal Biotech (Carlsbad, CA)獲得A蛋白珠。以每板5 ml測(cè)定緩 沖液中30 ul的量分配A蛋白珠。以每孔50 ul的體積分配此溶液。
如下將所有試劑和樣品分配至板中首先將加樣標(biāo)準(zhǔn)品(load
standard )、對(duì)照和樣品加入小孔中。然后加入抗Fc的帶ORI標(biāo)簽的F(ab，)2 片段。最后，加入A蛋白珠。
在混合的情況下，室溫孵育混合物2小時(shí)，使用方法"FcHumanl50" 在M8或M384分析4義上進(jìn)行讀數(shù)。
4. 數(shù)據(jù)分析
用于本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)的接受方針是10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中至少8個(gè)的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)復(fù)本之 間的讀數(shù)CV應(yīng)當(dāng)為大約20%。此外，對(duì)照的接受方針必須是80%至120 %之內(nèi)。此外，樣品的接受方針要求樣品復(fù)本之間的讀數(shù)CV為大約20%。 只有落在這些范圍內(nèi)的讀數(shù)才被考慮。
5. 魅
使用釕標(biāo)記的抗PSGL的F(ab，)2片段顯示出顯著更高的信噪比(圖2)。 將0.1 pg/ ml和0.4照/ ml F(ab，)2片段的數(shù)據(jù)相對(duì)于噪聲進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并且 將其制成柱形圖。當(dāng)用釕標(biāo)記時(shí)，Jackson 1、 Jackson 2、 Rockland l和Southern Biotech F(ab，)2片段具有增加的信噪比(圖2)。使用抗抗CD22的 F(ab，)2片段證實(shí)了這些實(shí)驗(yàn)(圖3)。
這些結(jié)果在使用抗Fc融合蛋白GPlba、 IL13受體和TNFR融合蛋白 的F(ab，)2片段的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步詳述(圖4)。曲線顯示當(dāng)靶融合蛋白的濃 度增加時(shí)，以F(ab，)2片段對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)增加(圖4)。使用抗GDF8、抗 CD22和抗Lewis Y抗體而非Fc融合蛋白作為靶，也獲得了相似的結(jié)果(圖 5)。
通過使用標(biāo)記的F(ab，)2片段鑒定樣品中蛋白質(zhì)的數(shù)量，相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)柱 方法例如HPLC，檢查了滴定篩選法。結(jié)果顯示對(duì)于確定蛋白質(zhì)的滴度， 滴定篩選法遠(yuǎn)比HPLC色i普法的速度快得多(圖6)。當(dāng)分析高達(dá)700多個(gè) 樣品時(shí)，HPLC與高通量滴定篩選相比，獲得蛋白質(zhì)數(shù)量讀數(shù)所需的時(shí)間 超過10倍以上(圖6)。
除了高通量篩選比標(biāo)準(zhǔn)柱方法更快外，其在確定蛋白質(zhì)的數(shù)量方面同 樣準(zhǔn)確(圖7、 9、 10和11)。當(dāng)比較HPLC和上述滴定篩選法時(shí)，對(duì)于抗 Lewis Y蛋白、PSGL、抗A(5和TNFR融合蛋白，鑒定到了幾乎相同的滴 度數(shù)量(圖7、 9、 lO和ll)。因此，此處描述的滴定篩選測(cè)定法在確定蛋白 質(zhì)的數(shù)量方面比標(biāo)準(zhǔn)柱技術(shù)快并且具有與標(biāo)準(zhǔn)柱技術(shù)相似的功效。
上面使用的高通量篩選能夠鑒定表達(dá)合適數(shù)量的抗體的細(xì)胞系(圖8)。 如圖8中所示，高通量滴定篩選法允許鑒定目的抗體的最高生產(chǎn)者(由每 克隆遞增的滴度0ig/ml)表明)。在這些實(shí)驗(yàn)中，最高滴度克隆編號(hào)為l， 第二高滴度克隆編號(hào)為2，以此類推。因此，通過該測(cè)定法快速地鑒定到 了最高克隆。
實(shí)施例2
高通量純化和鑒定合適的細(xì)胞培養(yǎng)條件 1.使用離心進(jìn)行的蛋白質(zhì)手工純化
可將實(shí)施例1的高通量滴定篩選法與下面詳述的高通量純化法結(jié)合起
35來以促進(jìn)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的潛在改進(jìn)。
薄層樹脂在20%乙醇中。加入另外的20。/。乙醇溶液以占終體積的 50%。將溶液充分混合并且以濾板(Whatman 7700-2804，長(zhǎng)滴注器(long drip ) ， 25 um， 96孑L x 800 uL， Whatman LabSciences, Orange, NJ)每孑L 200 uL等分試樣進(jìn)行分配。將濾板疊在空的微量培養(yǎng)板(Corning/Costar， Corning， NY)頂部，然后以700 rpm (大約等于104 G)離心(Sorvall Legend RT)3分鐘以除去20。/o的乙醇。然后，加入每孔200uL的RODI水，以空 微量滴定板在下方對(duì)這些板子離心3分鐘。重復(fù)該過程2次。
以每孔200 uL等分試樣加入清洗緩沖液。在將空的微量培養(yǎng)板置于下 面的情況下，對(duì)板離心3分鐘。再重復(fù)該過程兩次。當(dāng)所有樣品為至少170 ug/mL時(shí)，進(jìn)行最小稀釋以使相同組的樣品的滴度在大致相同的范圍(+/-20%)。將樣品稀釋至接近該最低濃度。對(duì)低于170ug/mL的任何樣品，加 樣一次以上。當(dāng)需要多次加樣時(shí)，僅為了確保加樣的蛋白質(zhì)總量在相同的 范圍(+/- 20%)內(nèi)而稀釋樣品。當(dāng)實(shí)施多次加樣時(shí)，首先加入所需的樣品， 并在空的小孔中加入200 uL清洗緩沖液。按需要對(duì)濾板進(jìn)行離心。
照例，將所有樣品與參照物spike (添加標(biāo)準(zhǔn)品)和培養(yǎng)基空白一起加 樣。以500 uL的加樣體積將樣品加載至A蛋白樹脂上(Protein A Mab Select, Amersham Biosciences),用接近整套受試樣品的濃度在培養(yǎng)基中制 備添加標(biāo)準(zhǔn)品(spiking standard)。以500ul/孔加樣添加標(biāo)準(zhǔn)品和培養(yǎng)基空 白。
通過用多通道移液器混合將樹脂與樣品一起重懸浮。將樹脂和樣品在 室溫孵育5至10分鐘。然后以700 rpm將混合物離心3分鐘，在深孔微量 培養(yǎng)板(Whatman 7710-5750， Whatman LabSciences, Orange, NJ)中收集 樣品流出物(flow-through )。然后，每孔加入200 uL清洗緩沖液(5 mM Tris， 20， 50或100 mM NaCl， pH 7.5),在將空的樣i量培養(yǎng)板置于下面的情況下， 離心混合物3分鐘。以每孔200uL加入清洗緩沖液。在將空的微量培養(yǎng)板 置于下面的情況下，離心樣品3分鐘。然后，在進(jìn)行洗脫前，為了中和， 在混合物中加入4uL Tris (2.0 M Tris， pH 8.5,或1.0 M Tris pH 8.5)至UV收集板(Corning/Costar， Corning, NY)。以每孔200 uL的體積向?yàn)V板中加 入洗脫緩沖液(50 mM甘氨酸，20或50或100 mM NaCl， pH 2.5或3.0)。用 多通道移液器混合樹脂和洗脫緩沖液。然后，在將收集板置于下面的情況 下，離心濾板3分鐘。在Spectra Max讀板器(Molecular Devices)上在A280 處讀板。
2. 使用柱層析進(jìn)行的蛋白質(zhì)性質(zhì)測(cè)定
對(duì)于CEX測(cè)定試驗(yàn)以50 uL等分試樣將洗脫物轉(zhuǎn)移入包含100 uL CEX流動(dòng)相A的Agilent板?；旌先芤?。使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行柱純化操作。
對(duì)于SEC測(cè)定試驗(yàn)以130 uL的體積將洗脫物轉(zhuǎn)移至Agilent板?；?合溶液。使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行柱純化操作。
對(duì)于HIC和唾液酸測(cè)定試驗(yàn)向UV板中加入4微升2M Tris，然后 直接洗脫入U(xiǎn)V板。混合溶液并且在Spectra Max讀板器上在A28t)進(jìn)行讀 數(shù)。.
3. 結(jié)果
使用上述技術(shù)進(jìn)行的樣品的高通量純化允許快速純化多達(dá)每板96個(gè) 樣品。該純化技術(shù)導(dǎo)致樣品的快速純化而不降低純化水平(圖12和13)。 如通過每個(gè)樣品中存在的高分子量蛋白的量所確定的，高通量純化技術(shù)和 其他技術(shù)一樣的好(圖12和13)。尤其是當(dāng)將高通量純化與標(biāo)準(zhǔn)的A蛋白 純化比較時(shí)(圖12和13)。
此外，使用高分子量蛋白的量可以確定由在不同細(xì)胞培養(yǎng)條件下生長(zhǎng) 的細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的性質(zhì)(圖14)。如圖14中所顯示的，不同的受試培養(yǎng) 基顯示出似乎取決于培養(yǎng)基的純化后不同數(shù)量的高分子量蛋白。特別地， 某些培養(yǎng)基條件顯示出與其他培養(yǎng)勤目比在高分子量蛋白的數(shù)量上有統(tǒng)計(jì) 學(xué)顯著的改善(圖14，大箭頭)。因此，以上使用的細(xì)胞培養(yǎng)工藝改進(jìn)方法 鑒定到了對(duì)于下游純化而言顯示出改進(jìn)的生長(zhǎng)特征的培養(yǎng)基。
等同方案
37本領(lǐng)域"^支術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到、或只使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即能夠確定此處描述的 具體組合物和方法的許多等同方案。此類等同方案被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍 內(nèi)，且被下列權(quán)利要求所涵蓋。
權(quán)利要求
1、高通量篩選用于蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞系的方法，該方法包括a)通過使從細(xì)胞系獲得的樣品與第一結(jié)合劑接觸，篩選樣品以確定各細(xì)胞系中目的蛋白的表達(dá)水平；b)使目的蛋白和有效連接了可檢測(cè)的標(biāo)記物的第二結(jié)合劑接觸；c)確定目的蛋白的表達(dá)水平；d)確定目的蛋白的合適性質(zhì)；e)選擇用于目的蛋白的高通量蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞系；其中如果細(xì)胞系產(chǎn)生期望表達(dá)水平和合適性質(zhì)的目的蛋白，則選擇該細(xì)胞系。
2、 權(quán)利要求l的方法，其中目的蛋白選自抗體、配體、受體、蛋白質(zhì) 的亞基、蛋白質(zhì)的片段、融合蛋白、重組蛋白、和它們的片段。
3、 權(quán)利要求2的方法，其中目的蛋白是抗體、重組抗體或F(ab，)2片段。
4、 權(quán)利要求l的方法，其中第一結(jié)合劑選自抗體、配體、受體、融合 蛋白、蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白、和它們的片段。
5、 權(quán)利要求4的方法，其中第一結(jié)合劑是A蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。
6、 權(quán)利要求4的方法，其中第一結(jié)合劑可附著至選自珠、板和微陣列 芯片的固相支持物上。
7、 權(quán)利要求6的方法，其中固相支持物包括纖維素、瓊脂糖、聚丙烯 酰胺、玻璃或聚苯乙烯。
8、 權(quán)利要求l的方法，其中目的蛋白的合適性質(zhì)選自電荷、大小、酶 活性、抗體-表位相互作用、核酸結(jié)合、碳7JC化物含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié) 構(gòu)和結(jié)合活性。
9、 權(quán)利要求l的方法，其中第二結(jié)合劑選自抗體、配體、受體、融合 蛋白、蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白、和它們的片段。
10、 權(quán)利要求9的方法，其中第二結(jié)合劑是抗體或其片段。
11、 權(quán)利要求10的方法，抗體是F(ab，)2片段。
12、 權(quán)利要求11的方法，其中F(ab，)2片段特異性結(jié)合抗體的Fc部分。
13、 權(quán)利要求1的方法，其中釕標(biāo)記的第二結(jié)合劑用第二可檢測(cè)的標(biāo) 記物標(biāo)記，所述第二可檢測(cè)的標(biāo)記物選自熒光團(tuán)、化學(xué)染料、放射性結(jié)合 劑、化學(xué)發(fā)光結(jié)合劑、電化學(xué)發(fā)光劑、磁性結(jié)合劑、順磁性結(jié)合劑、親磁 結(jié)合劑、產(chǎn)生有色產(chǎn)物的酶、產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物的酶和產(chǎn)生磁性產(chǎn)物的酶。
14、 權(quán)利要求12的方法，其中F(ab，)2片段與兩個(gè)或更多個(gè)釕標(biāo)記物 有效連接。
15、 權(quán)利要求l的方法，其中將樣品與附著至樹脂的第三結(jié)合劑接觸。
16、 權(quán)利要求15的方法，其中第三結(jié)合劑選自抗體、配體、受體、融 合蛋白、蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白、和它們的片段。
17、 權(quán)利要求16的方法，其中第三結(jié)合劑是A蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。
18、 權(quán)利要求17的方法，其中第三結(jié)合劑附著在固相支持物上。
19、 權(quán)利要求1的方法，其中從混合物中分離樹脂并且從第三結(jié)合劑 中洗脫表達(dá)的目的蛋白。
20、 權(quán)利要求19的方法，其中通過選自真空洗脫和重力流的方法洗脫 目的蛋白。
21、 權(quán)利要求l的方法，其中使用自動(dòng)化工作站篩選細(xì)胞系。
22、 高通量篩選用于表達(dá)和生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞系的方法，該方法包括:a) 將固相支持物與從細(xì)胞系分離的樣品接觸，該固相支持物在其表面 上附著有第一結(jié)合劑，該第一結(jié)合劑能夠結(jié)合目的蛋白；b) 將樣品與能結(jié)合目的蛋白的第二結(jié)合劑接觸，該第二結(jié)合劑與可檢 測(cè)的標(biāo)記物有效連接；c) 通過檢測(cè)與結(jié)合目的蛋白的第二結(jié)合劑有效連接的標(biāo)記物，確定目 的蛋白的表達(dá)水平；和d) 將各細(xì)胞系中的目的蛋白的表達(dá)水平與目的蛋白的平均表達(dá)水平 比較，并基于比較來選擇細(xì)胞系，其中如果細(xì)胞系中目的蛋白的表達(dá)水平比所有細(xì)胞系中的目的蛋白平 均表達(dá)水平高或低，則選擇該細(xì)胞系用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
23、 權(quán)利要求22的方法，還包括從選擇的細(xì)胞系分離上清液，然后將 上清液與能夠結(jié)合目的蛋白的試劑接觸。
24、 利要求23的方法，其中試劑附著在固相支持物上。
25、 權(quán)利要求24的方法，其中固相支持物是多孔板。
26、 權(quán)利要求23的方法，其中從試劑中洗脫結(jié)合的目的蛋白，并且分 析其是否具有合適的性質(zhì)。
27、 權(quán)利要求26的方法，其中如果在步驟e)中選擇細(xì)胞系并且所表達(dá) 的目的蛋白具有合適的性質(zhì)，則選擇該細(xì)胞系用于表達(dá)蛋白質(zhì)。
28、 權(quán)利要求22的方法，其中目的蛋白選自抗體、配體、受體、蛋白 質(zhì)的亞基、蛋白質(zhì)的片段、融合蛋白、重組蛋白、和它們的片段。
29、 4又利要求28的方法，其中目的蛋白是抗體、重組抗體或F(ab，)2 片段。
30、 權(quán)利要求22的方法，其中第一結(jié)合劑選自抗體、配體、受體、融 合蛋白、蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白、和它們的片段。
31、 權(quán)利要求30的方法，其中第一結(jié)合劑是A蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。
32、 權(quán)利要求22的方法，其中可將結(jié)合劑附著至選自珠、板和微陣列 芯片的固相支持物上。
33、 權(quán)利要求24的方法，其中固相支持物包括纖維素、瓊脂糖、聚丙 烯酰胺、玻璃或聚苯乙烯。
34、 權(quán)利要求22的方法，其中第二結(jié)合劑選自抗體、配體、受體、融 合蛋白、蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白、和它們的片段。
35、 權(quán)利要求34的方法，其中第二結(jié)合劑是抗體或其片段。
36、 權(quán)利要求35的方法，其中抗體是F(ab，)2片段。
37、 權(quán)利要求35的方法，其中抗體是與抗體的Fc部分特異性結(jié)合的 F(ab，)2片段。
38、 權(quán)利要求22的方法，其中可選擇標(biāo)記物選自熒光團(tuán)、化學(xué)染料、 放射性結(jié)合劑、化學(xué)發(fā)光結(jié)合劑、電化學(xué)發(fā)光劑、磁性結(jié)合劑、順磁性結(jié) 合劑、親磁結(jié)合劑、產(chǎn)生有色產(chǎn)物的酶、產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物的酶和產(chǎn)生磁 性產(chǎn)物的酶。
39、 權(quán)利要求38的方法，其中可檢測(cè)的標(biāo)記物是釕。
40、 權(quán)利要求22的方法，其中試劑包括附著有第三結(jié)合劑的樹脂，該 第三結(jié)合劑能夠結(jié)合目的蛋白。
41、 權(quán)利要求40的方法，其中第三結(jié)合劑選自抗體、配體、受體、融 合蛋白、蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白、和它們的片段。
42、 權(quán)利要求41的方法，其中第三結(jié)合劑是A蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。
43、 ^又利要求40的方法，其中分離樹脂，并從第三結(jié)合劑中洗脫目的 蛋白。
44、 權(quán)利要求43的方法，其中使用選自真空洗脫和重力流的方法從第 三結(jié)合劑洗脫目的蛋白。
45、 權(quán)利要求22的方法，其中對(duì)孵育的細(xì)胞系的篩選使用自動(dòng)化工作 站進(jìn)行。
46、 細(xì)胞培養(yǎng)工藝改進(jìn)的方法，該方法包括a) 在不同的細(xì)胞培養(yǎng)條件中孵育各細(xì)胞系；b) 將各細(xì)胞系樣品與附著至固相支持物的第一結(jié)合劑接觸，該第一結(jié) 合劑結(jié)合細(xì)胞系樣品中的目的蛋白；c) 使^L第一結(jié)合劑結(jié)合的目的蛋白與第二結(jié)合劑接觸，所述第二結(jié)合 劑與可檢測(cè)的標(biāo)記物有效連接；d) 通過檢測(cè)與結(jié)合目的蛋白的第二結(jié)合劑有效連接的標(biāo)記物，確定目 的蛋白的表達(dá)水平；和e) 基于檢測(cè)到的目的蛋白的表達(dá)水平選擇細(xì)胞系， 其中如果細(xì)胞系中目的蛋白的表達(dá)水平高于或低于所有細(xì)胞系中的目的蛋白平均表達(dá)水平，則選擇該細(xì)胞系。
47、 權(quán)利要求46的方法，還包括從選擇的細(xì)胞系分離上清液，和將上 清液與結(jié)合目的蛋白的試劑接觸。
48、 權(quán)利要求47的方法，其中試劑附著在固相支持物上。
49、 權(quán)利要求48的方法，其中固相支持物是多孔板。
50、 權(quán)利要求47的方法，其中從試劑中洗脫結(jié)合的目的蛋白，然后分 析其是否具有合適的性質(zhì)。
51、 權(quán)利要求50的方法，其中如果在步驟e)中選擇細(xì)胞系，且所表達(dá) 的目的蛋白具有合適的性質(zhì)，則選擇該細(xì)胞系用于表達(dá)蛋白質(zhì)。
52、 權(quán)利要求46的方法，其中目的蛋白選自抗體、配體、受體、蛋白 質(zhì)的亞基、蛋白質(zhì)的片段、融合蛋白、重組蛋白、和它們的片段。
53、 權(quán)利要求52的方法，其中目的蛋白是抗體、重組抗體或F(ab，)2 片段。
54、 權(quán)利要求46的方法，其中第一結(jié)合劑選自抗體、配體、受體、融 合蛋白、蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白、和它們的片段。
55、 權(quán)利要求54的方法，其中第一結(jié)合劑是A蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。
56、 權(quán)利要求46的方法，其中可將結(jié)合劑附著至選自珠、板和微陣列 芯片的固相支持物上。
57、 權(quán)利要求48的方法，其中固相支持物包括纖維素、瓊脂糖、聚丙 烯酰胺、玻璃或聚苯乙烯。
58、 權(quán)利要求46的方法，其中第二結(jié)合劑選自抗體、配體、受體、融 合蛋白、蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白、和它們的片段。
59、 權(quán)利要求58的方法，其中第二結(jié)合劑是抗體或其片段。
60、 權(quán)利要求59的方法，其中抗體是F(ab，)2片段。
61、 權(quán)利要求59的方法，其中抗體是與抗體的Fc部分特異性結(jié)合的 F(ab，)2片段。
62、 權(quán)利要求46的方法，其中可檢測(cè)的標(biāo)記物選自熒光團(tuán)、化學(xué)染料、 放射性結(jié)合劑、化學(xué)發(fā)光結(jié)合劑、電化學(xué)發(fā)光劑、磁性結(jié)合劑、順磁性結(jié)合劑、親磁結(jié)合劑、產(chǎn)生有色產(chǎn)物的酶、產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物的酶和產(chǎn)生磁 性產(chǎn)物的酶。
63、 權(quán)利要求62的方法，其中可檢測(cè)的標(biāo)記物是釕。
64、 權(quán)利要求46的方法，其中試劑包括附著有第三結(jié)合劑的樹脂，該 第三結(jié)合劑能夠結(jié)合目的蛋白。
65、 權(quán)利要求64的方法，其中第三結(jié)合劑選自抗體、配體、受體、融 合蛋白、蛋白質(zhì)的亞基、重組蛋白、和它們的片段。
66、 權(quán)利要求65的方法，其中第三結(jié)合劑是A蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。
67、 權(quán)利要求64的方法，其中分離樹脂，和從第三結(jié)合劑洗脫目的蛋白。
68、 權(quán)利要求67的方法，其中使用選自真空洗脫和重力流的方法從第 三結(jié)合劑洗脫目的蛋白。
69、 權(quán)利要求46的方法，其中對(duì)孵育的細(xì)胞系的篩選使用自動(dòng)化工作 站進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明公開了高通量篩選在某些制藥、藥物開發(fā)和生物技術(shù)方法中用于蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞系的方法，通過該方法可以依據(jù)細(xì)胞系產(chǎn)生期望蛋白質(zhì)表達(dá)水平和合適性質(zhì)的目的蛋白質(zhì)的能力，鑒定高產(chǎn)細(xì)胞系。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101472947SQ200780023091
公開日2009年7月1日 申請(qǐng)日期2007年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日
發(fā)明者J·H·周, N·巴倫, P·弗蘭基, S·科布 申請(qǐng)人:惠氏公司