專利名稱：：來自ch5D12抗體的去免疫拮抗性抗人CD40單克隆抗體的制作方法來自ch5D12抗體的去免疫拮抗性抗人CD40單克隆抗體本發(fā)明涉及免疫原性降低的人、人源化的和單克隆抗體，及其用途和制備方法。本發(fā)明尤其涉及拮抗性抗人CD40單克隆抗體。CD40分子是50kDa的I型膜糖蛋白，在B細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞(DC)和活化的內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)"6。在某些條件下，在成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞上也能發(fā)現(xiàn)CD407。CD40配體(CD40L，CD154)是32kDa的II型膜內(nèi)在糖蛋白，在活化的CD4+T細(xì)胞和小部分活化的CD8+T細(xì)胞上短暫表達(dá)8'9。此外，在活化后的許多其他細(xì)胞類型中也發(fā)現(xiàn)了CD40L，包括肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、DC和血小板w，11。小鼠模型中的研究清楚地顯示CD40L-CD40相互作用參與多種自身免疫性疾病的病理生理學(xué)(綜述參見參考文獻(xiàn)12)。來自CD40L轉(zhuǎn)基因小鼠(患有致死性炎癥性腸病)的證據(jù)第一次證明了CD40-CD40L相互作用還可能在炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)理中起作用"?？剐∈驝D40L單克隆抗體(Mab)在TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中通過固有層CD4+T細(xì)胞有效地預(yù)防粘膜炎癥和干擾素Y的產(chǎn)生14。在重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合癥(SCID)小鼠的炎癥性腸病模型中，已經(jīng)證明從T細(xì)胞重建當(dāng)天開始使用抗CD40L治療可以完全預(yù)防實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的臨床和組織學(xué)表現(xiàn)"。此外，在T細(xì)胞重建后5周的抗CD40L施用仍然可以阻止疾病的進(jìn)展，與對照動物相比，被治療的動物顯示病征和組織學(xué)的改善15。此外，用來自CD40L敲除小鼠的T細(xì)胞對SCID小鼠的重建還證明了表達(dá)CD40L的T細(xì)胞在疾病發(fā)展和白介素12生成中的重要作用16。利用抗CD40L或者CD40的單克隆抗體(Mab)可以拮抗CD40-CD40L相互作用。在用更高劑量水平的IgG,抗人CD40LMab治療患者期間，CD40L在活化血小板上的表達(dá)導(dǎo)致在血栓栓塞事件和這類Mab發(fā)展的終止17，19。因此拮抗CD40看來是一種更吸引人的方法。利用不同的載有CD40的細(xì)胞類型在多種體外研究中證明了Mab5D12(抗人CD40)的非刺激性拮抗活性2G，22，并且利用多種非人類靈長類動物疾病模型在體內(nèi)證實(shí)了嵌合105D12(ch5D12)的拮抗劑活性23，27。ch5D12是一種分子工程化的人IgG4抗體，其包含小鼠5D12重鏈和輕鏈的可變區(qū)，其被構(gòu)建用來降低在人類中使用時(shí)小鼠5D12的潛在免疫原性并延長其體內(nèi)半衰期?；加锌肆_恩病的患者受到胃腸道衰弱性炎性病癥的折磨，但其確切的病因?qū)W和發(fā)病機(jī)理還不清楚28，29。該疾病的特征在于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞流入患病粘膜"，31，炎癥可溶性介導(dǎo)物(mediator)的局部生成，以及相關(guān)組織損傷28，29。已經(jīng)證明粘膜CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以及細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-a和IL-12在起始克羅恩病的炎癥性循環(huán)(inflammatoryloop)中起著重要作用32'38。來自發(fā)炎粘膜的T細(xì)胞顯示更高的增殖能力28'29，并且分泌IFN-y和IL-2的量增加。在克羅恩病患者的粘膜活組織檢査中發(fā)現(xiàn)與T細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平增加33。我們研究了CD40/CD40L在克羅恩病損傷中的表達(dá)，表明CD40L對活化的CD4+T細(xì)胞的顯著作用39。CD40L能夠介導(dǎo)載有CD40細(xì)胞(主要是B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)的強(qiáng)活化，因此引起損傷處TNF-ct和IL-12的生成增加。利用免疫組織化學(xué)，在所有克羅恩病患者患病區(qū)域的樣品中均發(fā)現(xiàn)5D12染色相對于非患病區(qū)域增加。CD40和CD20(B細(xì)胞)或者CD68(巨噬細(xì)胞)的復(fù)染色法提示在克羅恩病患者的切片中，CD40+細(xì)胞主要是淋巴濾泡中的B細(xì)胞和固有層中的巨噬細(xì)胞。在共培養(yǎng)48小時(shí)后，來自克羅恩病患者發(fā)炎粘膜的固有層T細(xì)胞誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生大量IL-12和TNF-a。5D12的添加造成IL-12和TNF-a生成減少；該生成水平被降低到在IFN-y缺失和存在兩種條件下利用對照固有層T細(xì)胞觀察到的水平39。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供在體內(nèi)具有5D12的至少部分安全性和/或功效、不必需具有所述安全性和/或功效的量的替代分子?？贵w5D12或者至少其可變結(jié)構(gòu)域具有小鼠背景。本發(fā)明提供5D12的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的變體。為此本發(fā)明提供包括式(I)所示氨基酸序列的多肽1112131IIIIGFSX!SRYSVYWX2RQPPGKGX3EWX4GMMWGGGSTDYS415161IIITSLKSRLTISKDTSKSQVX5LKMNSLRTDDTAMYYC71VRTDGDY腫X,是G,A，V,L,I,P，F(xiàn)，M，W，C，N，Q,S,T,Y,D,E，K,R或者H;X2是G，A,V，L，I,P,F,M，W，C,N，Q，S，T，Y,D，E,K，R或者H;X3是G，A，V，L，I，P,F,M，W，C,N,Q,S，T，Y,D，E，K，R或者H;X4是GA,V，L，I,P,F,M，W,C，N，Q,S,T，Y,D，E,K，R或者H;禾口X5是G，A,V,L,I,P,F,M,W,C,N，Q,S,T,Y,D,E，K,R或者H。所述多肽與5D12抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域具有廣泛的序列相同性，但是將這種多肽或者包括所述多肽的抗體給人類個(gè)體施用時(shí)所述多肽的免疫原性更低。在指定的X,-Xs位可以存在指定的幾種氮基酸。包括本發(fā)明多肽的結(jié)合分子具有良好的CD40結(jié)合性質(zhì)。己經(jīng)注意到細(xì)胞中所述抗體的生成隨指定位置的氨基酸種類而稍有不同。這將在下文中詳細(xì)描述。本發(fā)明還提供包括下列氨基酸序列的本發(fā)明多肽111213141516171PGKGX3EWX4GMMWGGGSTDYSTSLKSRLTISKDTSK8191101111上述多肽基本上跨越小鼠5D12抗體重鏈的可變結(jié)構(gòu)域。與小鼠序列相比，所述氨基酸序列在數(shù)個(gè)位置發(fā)生改變。所述改變的多肽具有良好的結(jié)合性質(zhì)，并且同時(shí)被施用所述多肽的人良好耐受?？梢栽谥付ㄎ恢貌迦攵喾N氨基酸而與原始小鼠多肽相比不顯著降低和/或改變至少所述多肽的免12疫性質(zhì)。優(yōu)選本發(fā)明多肽在X,位包括GA,V，L，P，F(xiàn)，M，W，C，N，Q，S，T，Y,D，E,K,R或者H。采用這種方式，至少所述多肽在哺乳動物細(xì)胞中的生成性質(zhì)與原始小鼠或者嵌合多肽相比不會顯著降低和/或改變。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中X,是G,A,V,L,P，F(xiàn)或者M(jìn);X2是G,A,V,L,I,P,F或者M(jìn);X3是GA,V,L，I，P,F，M;X4是G，A，V，L,I，P，F(xiàn),M;禾口X5是GA，V,L，I，P,F,M，W,C，N，Q,S,T或者Y。這些多肽更適合于在哺乳動物細(xì)胞中高水平生成。尤其對于抗體來說。本發(fā)明還提供本發(fā)明的多肽，其中X!是GA,V，L或者M(jìn);X2是GA，V,L,I或者M(jìn);X3是GA，V，L，I，P，F(xiàn)，M;X4是GA,V，L，I或者M(jìn);禾口X5是P,F,W,N，Q,S，T或者Y。這些多肽更適合于高水平抗體生成，并且同時(shí)在人類中顯示良好的耐受性質(zhì)。本發(fā)明還提供式(I)所示的多肽，其中X,是L;X2是I;X3是P;X4是M;和/或X5是S。這種多肽是特別優(yōu)選的，因?yàn)槠鋵τ谀M抗體ch5D12的結(jié)合和藥理性質(zhì)的抗體來說具有優(yōu)良的生成性質(zhì)，而與小鼠或者ch5D12抗體相比，其在人類中的免疫性質(zhì)被提高，且其中與小鼠或者嵌合對應(yīng)物相比，至少所述多肽的生成沒有顯著降低。本發(fā)明還提供式(I)所示的多肽，其中X!是I;X2是V;X3是P;X4是M;和/或Xs是S。這種多肽是特別優(yōu)選的，因?yàn)槠鋵τ谀M抗體ch5D12的結(jié)合和藥理性質(zhì)的抗體來說具有優(yōu)良的生成性質(zhì)，而與小鼠或者ch5D12抗體相比，其在人類中的免疫性質(zhì)被提高，且其中與小鼠或者嵌合對應(yīng)物相比，至少所述多肽的生成沒有顯著降低。在X,-X5位中的至少一個(gè)位置與嵌合5D12相應(yīng)位置不同的抗體比嵌合5D12抗體在人類中具有更好的免疫性質(zhì)。在這種抗體的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明優(yōu)選提供本發(fā)明的多肽，其中Xi是I和X2是V;X,是I和X2是I;^是L和X2是I;或者X,是L和X2是V。所述多肽尤其優(yōu)選以下組合13X3是P;X4是M;和Xs是F或者S。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的多肽，其中X，是L;X2是V;Xs是L;X4是L和Xs是F。包括所述多肽的抗體的生成非常良好，并且與ch5D12相比其在人類中同時(shí)提供改良的免疫性質(zhì)。本發(fā)明還提供包括氨基酸序列GFSX,SRYSVYWX2R的多肽，其中X,是L和X2是I;或者X,是I和X2是V。該多肽包括5D12重鏈可變片段的修飾CDR1。與抗體5D12重鏈可變片段的CDR1相比，該CDR1包括至少一個(gè)不同的氨基酸。該氨基酸變化造成修飾的5D12或者ch5D12抗體的改良的免疫性質(zhì)，其中所述修飾包括至少用本發(fā)明的一種多肽替換5D12或者ch5D12中所述多肽的相應(yīng)序列，并且同時(shí)使所述抗體在哺乳動物細(xì)胞中有良好的生成。本發(fā)明還提供包括式(I)所示多肽的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。所述可變結(jié)構(gòu)域優(yōu)選包括90-130個(gè)、更優(yōu)選100-120個(gè)、更優(yōu)選105-115個(gè)、最優(yōu)選113個(gè)氨基酸?？梢酝ㄟ^合成或者通過細(xì)胞產(chǎn)生所述多肽。優(yōu)選通過細(xì)胞產(chǎn)生所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域。實(shí)際上存在至少5種重鏈類型y、5、a、|1和s，其中每種類型限定一類免疫球蛋白。本發(fā)明的多肽可以直接用作結(jié)合體或者被整合入抗體。當(dāng)被整合入抗體時(shí)，所述多肽優(yōu)選與抗體重鏈的恒定部分組合。為此本發(fā)明還提供包括式(I)所示多肽的抗體重鏈。本領(lǐng)域已知可變結(jié)構(gòu)域抗體的許多衍生物和類似物。但是，目前抗體的許多不同部分、衍生物和/或類似物正在使用。這類部分、衍生物和/或類似物的非限制性實(shí)例是單鏈Fv片段、單體(monobodies)、VHH、Fab片段、人工結(jié)合蛋白如avimers等等。這類特異性結(jié)合體的共同點(diǎn)是均存在重鏈可變結(jié)構(gòu)域。因此本發(fā)明還提供包括式(I)所示多肽的結(jié)合體。本發(fā)明優(yōu)選的結(jié)合體是抗體，因?yàn)榭贵w包括天然存在的結(jié)構(gòu)。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明提供包括本發(fā)明多肽的抗體。本發(fā)明的結(jié)合體優(yōu)選是被動物良好耐受的結(jié)合體。動物對多肽的耐受性取決于許多不同方面。免疫性(T細(xì)胞介導(dǎo)、B細(xì)胞介導(dǎo)或者其他)是動物對多肽的耐受性包括的變量之一。如上所述，5D12抗體具有小鼠背景。式(I)所示的多肽在人類中具有降低的免疫原性。因此它有時(shí)被稱為5D12重鏈可變結(jié)構(gòu)域的去免疫(deimmunized)變體。因此一方面本發(fā)明提供包含5D12抗體的表位特異性的抗體，其中所述抗體的重鏈?zhǔn)鞘?I)所示的多肽。本文使用的"去免疫"被定義為在動物中較原始抗體更低的免疫原性。通過14去除已知的人T細(xì)胞表位，式(I)所示的多肽與5D12重鏈相比是去免疫的。T細(xì)胞表位是蛋白質(zhì)內(nèi)具有結(jié)合MHCII型分子能力的氨基酸序列。通過去除T細(xì)胞表位，抗體的免疫原性降低。優(yōu)選本發(fā)明的可變結(jié)構(gòu)域被進(jìn)一步人源化，如鑲嵌(veneered)。通過利用鑲嵌技術(shù)，易與免疫系統(tǒng)接觸的外部殘基被選擇性地用人類殘基替換，以提供包含弱免疫原性或者基本上無免疫原性的鑲嵌表面的雜種分子。本發(fā)明使用的動物優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選靈長類動物，最優(yōu)選人。本發(fā)明抗體優(yōu)選包括人類抗體的恒定區(qū)。根據(jù)抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的差異，抗體被分成5種類型或者同種型IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。這些類型或者同種型包括至少一個(gè)以相應(yīng)希臘字母命名的所述重鏈。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的抗體，其中所述恒定區(qū)選自IgG、IgA、IgM、IgD和IgE恒定區(qū)，更優(yōu)選所述恒定區(qū)包括IgG恒定區(qū)，更優(yōu)選包括IgG,恒定區(qū)，優(yōu)選包括突變的IgG,恒定區(qū)，最優(yōu)選所述恒定區(qū)是IgG4恒定區(qū)。此外，所述IgG4恒定區(qū)優(yōu)選是人IgG4恒定區(qū)。優(yōu)選本發(fā)明的IgG4抗體包括如圖18所示的重鏈和輕鏈氨基酸序列的恒定區(qū)。優(yōu)選本發(fā)明的IgG4抗體包括如圖18所示的重鏈和輕鏈氨基酸序列。IgG4恒定區(qū)的一些變化是天然存在的和/或只要不改變所獲抗體的免疫性質(zhì)就是被允許的。通常恒定區(qū)允許大約l-5個(gè)氨基酸的取代。具有IgG4恒定區(qū)或者突變IgG,恒定區(qū)的抗體具有抗體的至少大部分藥理學(xué)性質(zhì)，但不結(jié)合補(bǔ)體，因此在體內(nèi)不會誘導(dǎo)其結(jié)合細(xì)胞的耗竭。優(yōu)選所述恒定區(qū)是人類抗體的恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明多肽和/或本發(fā)明結(jié)合體和/或本發(fā)明抗體的核酸。本發(fā)明使用的核酸通常但不唯一是核糖核酸(RNA)或者脫氧核糖核酸(DNA)。替代核酸也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，如肽核酸(PNA)。本發(fā)明的核酸例如包括在細(xì)胞中。當(dāng)所述核酸在所述細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，所述細(xì)胞產(chǎn)生本發(fā)明的多肽和/或結(jié)合體和/或抗體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明提供包括本發(fā)明多肽、本發(fā)明結(jié)合體、本發(fā)明抗體和/或本發(fā)明核酸的細(xì)胞。所述細(xì)胞優(yōu)選是動物細(xì)胞，更優(yōu)選是哺乳動物細(xì)胞，更優(yōu)選是靈長類動物細(xì)胞，最優(yōu)選是人類細(xì)胞。對于本發(fā)明的目的，合適的細(xì)胞是能夠包括并且優(yōu)選產(chǎn)生本發(fā)明多肽、本發(fā)明結(jié)合體、本發(fā)明抗體和/或本發(fā)明核酸的任何細(xì)胞。本發(fā)明還提供包括本發(fā)明抗體的細(xì)胞。優(yōu)選所述細(xì)胞產(chǎn)生所述抗體。15在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是雜交瘤細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、NS0細(xì)胞或者PER-C6TM細(xì)胞。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。本發(fā)明還提供包括本發(fā)明細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。各個(gè)機(jī)構(gòu)和公司已經(jīng)開發(fā)出用于大規(guī)模制備抗體如用于臨床使用的細(xì)胞系。這類細(xì)胞系的非限制性實(shí)例是CHO細(xì)胞、NS0細(xì)胞或者PER.C6TM細(xì)胞。這些細(xì)胞還可用于其他目的例如制備蛋白。被開發(fā)用于工業(yè)規(guī)模制備蛋白和抗體的細(xì)胞系在本文中還被稱為工業(yè)化細(xì)胞系。因此在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供被開發(fā)用來大規(guī)模制備蛋白和/或抗體的細(xì)胞系在制備本發(fā)明抗體中的用途。本發(fā)明還提供制備抗體的方法，包括培養(yǎng)本發(fā)明細(xì)胞并從所述培養(yǎng)物中收集所述抗體。優(yōu)選所述細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。優(yōu)選所述細(xì)胞適宜懸浮生長。此外還提供通過本發(fā)明制備抗體的方法獲得的抗體。優(yōu)選從培養(yǎng)物的培養(yǎng)基純化所述抗體。優(yōu)選親和純化所述抗體。本發(fā)明的細(xì)胞如雜交瘤細(xì)胞系、CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞或者其他已知適合于臨床目的的抗體制備的細(xì)胞類型。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人類細(xì)胞。優(yōu)選通過腺病毒E1區(qū)或者其功能等價(jià)物轉(zhuǎn)化細(xì)胞。這類細(xì)胞系的優(yōu)選實(shí)例是PER.C6TM細(xì)胞系或者其等價(jià)物。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞或者其變體。優(yōu)選所述變體利用谷氨酰胺合成酶(GS)載體系統(tǒng)表達(dá)抗體。已經(jīng)注意到所述XrX5位的一些氨基酸不適合于在抗體生成細(xì)胞中產(chǎn)生高水平的包括式(I)所示多肽的抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體中式(I)所示多肽包括XrX5，其中X！是G,A，V，L，I，P,F,M,W，C,N,Q,S,T，Y,D,E,K,R或者H。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，X,是QA,V，L，I,P，F(xiàn)或者M(jìn);X2是G,A，V,L，I,P,F或者M(jìn);X3是G,A，V，L,I，P,F,M;X4是QA,V，L，I,P,F，M;和X5是G,A,V，L,I，P，F(xiàn),M，W,C，N，Q,S,T或者Y。更優(yōu)選所述抗體包括式I所示的多肽，其中X!是QA，V,L,I或者M(jìn);X2是G,A,V,L，I或者M(jìn);X3是G，A，V，L,I，P,F,M;X4是G,A,V,L，I或者M(jìn);和X5是P,F,W,N,Q,S，T或者Y。更優(yōu)選X,是L;X2是I;X3是P;X4是M;和/或Xs是S。特別優(yōu)選&是I和X2是V;X,是I和X2是I;X,是L和X2是I;&是L和X2是L;X,是V和X2是I;X!是V和X2是V;Xi是L和Xs是L;X,是16V和乂2是L;或者X是L和乂2是V。后面的這些多肽特別優(yōu)選組合X3是P;X4是M;和Xs是F或者S，優(yōu)選S;在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明提供本發(fā)明的多肽，其中X"是L;X2是V;Xs是L;X4是L和Xs是F。包括所述多肽的抗體的生成非常良好，并且與ch5D12相比其在人類中同時(shí)提供改良的免疫性質(zhì)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的多肽，其中x,、x2、X3、X4或者Xs中至少一個(gè)與本發(fā)明所示序列相應(yīng)位置的氨基酸相同以產(chǎn)生特別良好的表達(dá)水平，并且其中X,、X2、X3、X4或者X5中還有至少一個(gè)與5D12氨基酸序列相應(yīng)位置的氨基酸相同。本發(fā)明多肽(其中X,、X2、X3、X4或者X5中至少一個(gè)與5D12氨基酸序列相應(yīng)位置的氨基酸相同)的優(yōu)點(diǎn)是，包括這種多肽的本發(fā)明結(jié)合體與本發(fā)明多肽(其中X"X2、X3、X4或者X5中沒有一個(gè)與5D12氨基酸序列相應(yīng)位置的氨基酸相同)相比具有的更好的表達(dá)水平。不受理論束縛，當(dāng)Xi,X2，X3,X4和/或X5位的氨基酸與5D12氨基酸序列相應(yīng)位置的氨基酸相同時(shí)，所述更好的表達(dá)水平被認(rèn)為是由于所述氨基酸有助于本發(fā)明結(jié)合體的正確組裝。包括式(I)所示多肽的抗體顯示非刺激性拮抗活性。因?yàn)镃D40L-CD40相互作用涉及多種炎性病癥如自身免疫性疾病和移植排斥的病理生理學(xué)，因此本發(fā)明的多肽尤其適合于改善炎性病癥的癥狀。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包括本發(fā)明的結(jié)合體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體。單克隆抗體技術(shù)允許制備大量基本上純的抗體，從而獲得可預(yù)測的產(chǎn)物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明提供包括本發(fā)明多肽的拮抗性抗人CD40單克隆抗體。本發(fā)明的結(jié)合體均更適合于該目的，因?yàn)樵谝粋€(gè)實(shí)施方案中它相對于小鼠5D12和/或嵌合5D12是去免疫的。因此，與小鼠5D12和/或嵌合5D12相比，本發(fā)明的結(jié)合體在人類中具有降低的免疫原性和延長的半衰期。因此，本發(fā)明的結(jié)合體具有抗多種炎性病癥的可持續(xù)藥物潛力。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的去免疫的拮抗性抗人CD40單克隆抗體。如前所述，本發(fā)明提供包括相對于5D12氨基酸序列發(fā)生氨基酸改變的5D12樣分子，其中所述改變至少在重鏈可變結(jié)構(gòu)域并且優(yōu)選還在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在這個(gè)方面本發(fā)明還提供包括式(II)所示氨基酸序列的本發(fā)明結(jié)合體1112131IIIIX6LGX7X8ASISCRSSQSLX9NSNGNTYLHWYLQRPGQS41516171IIIIPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDXI08191IIGVYXCSQSTHVPWT其中X6是GA，V，L，I,P,F,M,W,C,N，Q,S,T,Y,D,E，K,R或者H;X7是QA,V,L，I，P,F,M，W，C,N,Q,S,T，Y,D,E,K,R或者H;Xg是GA,V,L,I，P，F(xiàn)，M，W，C,N,Q，S,T，Y,D,E,K,R或者H;乂9是GA，V，L，I，P,F，M,W，C，N,Q，S，T,Y,D，E，K,R或者H;X10是GA，V，L，I,P，F(xiàn)，M,W，C，N，Q，S，T，Y,D，E，K,R或者H;和X是G，A,V,L,I，P，F(xiàn),M，W，C，N,Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H。所述結(jié)合體優(yōu)選是本發(fā)明的拮抗性抗人CD40單克隆抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，選自X6，X7,X8,X9,X,o或者X的X是選自類似在5D12氨基酸序列相應(yīng)位置的氨基酸和/或類似如本發(fā)明實(shí)施例2所示獲得良好表達(dá)水平的序列的相應(yīng)位置的氨基酸。因此，本發(fā)明的結(jié)合體優(yōu)選包括式(n)所示的氨基酸序列，其中X6是N,Q,S,T,Y，W或者C;X7是D,E,N，Q,S,T，Y,W或者C;Xs是N,Q，S,T，Y，GA，V，L，I,P，F(xiàn)，M,W或者C;X9是GA，V,L，I，P，F(xiàn)，M;Xu)是G,A,V，L,I,P，F(xiàn)，M;禾口Xu是N,Q，S,T,Y,G,A，V，L,I,P,F,M,W或者C。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的拮抗性抗人CD40單克隆抗體，所述抗體包括式(II)所示的包括下列氨基酸序列的多肽。18I112131IIIIELQLTQSPLSLPVX6LGX7X8ASISCRSSQSLX9NSNGNTYL鼎8191101111IIIISRVEAEDX10GVYXCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKR。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種本發(fā)明式(n)所示的多肽，其中X6是T或者S，X7是D或者Q，Xs是Q或者P，X9是V或者A，XI0是V或者L，以及Xu是F或者Y。更優(yōu)選的，其中X6是T，X7是Q，X8是P，乂9是A，Xw是V和X是Y。包括式(I)所示多肽以及優(yōu)選的式(II)所示多肽的5D12樣抗體結(jié)合了在產(chǎn)生細(xì)胞中的良好表達(dá)水平和在人類中的良好耐受性和藥物動力學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明的抗人CD40拮抗性抗體優(yōu)選包括式(I)所示的重鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列和式(II)所示的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列。這類抗體具有良好的特性。當(dāng)然可以通過修飾其中一或多個(gè)氨基酸產(chǎn)生這類原始抗體的變體。當(dāng)與所述原始抗體比較時(shí)，許多這類變體將表現(xiàn)或多或少的相似性。這類變體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。存在很多修飾本發(fā)明抗體的方式。這類修飾的一個(gè)非限制性實(shí)例是包括用焦谷氨酸而非谷氨酸的抗體。這種修飾的其他非限制性實(shí)例是與所述原始抗體相比，一或多個(gè)氨基酸的插入、缺失、倒位和/或取代。本發(fā)明提供產(chǎn)生這類變體的手段和方法。本發(fā)明還提供確定所述變體特性的試驗(yàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明原始抗體的變體，與所述原始抗體的氨基酸序列相比，所述變體包括大約1-10個(gè)氨基酸的插入、缺失、倒位和/或取代。優(yōu)選所述插入、缺失、倒位和/或取代不包括原始抗體的式(I)所示重鏈可變結(jié)構(gòu)域的X,位和X2位的氨基^在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種選擇抗人CD40拮抗性抗19體的方法，包括產(chǎn)生生成原始抗人CD40拮抗性抗體的第一細(xì)胞系，并確定所述第一細(xì)胞系生成的原始抗體的量，所述原始抗體包括重鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列1112131IIIIQVKLQESGPGLVKPSETLSITCTVSGFSX,SRYSVYWX2RQP41516171PGKGPE額GMMWGGGSTDYSTSLKSRLTISKDTSK8191101111SQVSLKMNSLRTDDTAMYYCVRTDGDYWGQGTTVTVSS其中X,和X2配對選自X「I和X^V;X「L和X,I;Xi二V和X2二V;X^L禾口X^L;或者X廣L和X,V，所述方法還包括產(chǎn)生至少一種生成所述原始抗體的變體的其他細(xì)胞系，其中所述變體抗體是修飾的原始抗體，與所述原始抗體相比，其包括大約1-5個(gè)氨基酸的插入、缺失、倒位和/或取代，其中所述修飾不包括X,和X2位氨基酸的修飾，和確定所述至少一種其他細(xì)胞系生成的變體抗體的量，所述方法還包括選擇生成量是原始抗體量至少50%的變體抗體。優(yōu)選所述原始抗體包括輕鏈氨基酸序列111213141516171YLQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI208191101111IIIISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKR。所述大約1-5個(gè)氨基酸的插入、缺失、倒位和/或取代可以位于非X,和X2位或者與其無關(guān)的抗體任何部分。優(yōu)選地，與所述原始抗體相應(yīng)鏈的氨基酸序列相比，所述大約1-5個(gè)氨基酸的插入、缺失、倒位和/或取代位于所述重鏈氨基酸序列或者所述輕鏈氨基酸序列。優(yōu)選地，與所述原始抗體的所述重鏈序列相比，所述大約1-5個(gè)氨基酸的插入、缺失、倒位和/或取代位于所述重鏈氨基酸序列。優(yōu)選所述方法還包括制備產(chǎn)生所述選擇抗體的抗體生產(chǎn)細(xì)胞系。該生產(chǎn)細(xì)胞系可以是所述其他細(xì)胞系，或者產(chǎn)生所述選擇抗體的另一細(xì)胞系。優(yōu)選所述方法還包括收集所述選擇抗體。本發(fā)明還提供通過本發(fā)明方法獲得的分離和/或重組抗人CD40拮抗性抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗人CD40拮抗性抗體包括重鏈氨基酸序列的修飾1112131IIIIQVKLQESGPGLVKPSETLSITCTVSGFSX!SRYSVYWX2RQP41516171IIIIPGKGPEWMGMMWGGGSTDYSTSLKSRLTISKDTSK8191101111其中X,和X2配對選自X「I和X2:V;X,-L和X2-I;X,:V和X2-V;X^L和X2-L;或者X^L禾卩X^V，與所述重鏈氨基酸序列相比，所述修飾包括大約1-5個(gè)氨基酸的插入、缺失、倒位和/或取代，并且其中所述修飾不包括Xi和X2位氨基酸的修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括本發(fā)明多肽、本發(fā)明結(jié)合體、本21發(fā)明抗體、本發(fā)明核酸和/或本發(fā)明細(xì)胞的藥物組合物。此外，本發(fā)明還提供本發(fā)明多肽、本發(fā)明結(jié)合體、本發(fā)明抗體、本發(fā)明核酸和/或本發(fā)明細(xì)胞作為藥物的用途。優(yōu)選用于改善自身免疫性疾病和/或炎性病癥的癥狀和/或減輕移植排斥和/或治療CD40陽性癌癥的藥物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述自身免疫性疾病和/或炎性病癥選自炎癥性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、牛皮癬、大皰性類天皰瘡和特應(yīng)性皮炎。因?yàn)楸景l(fā)明多肽的非刺激性CD40拮抗性，所以本發(fā)明多肽尤其適合于改善炎性病癥的癥狀，本發(fā)明多肽適合于改善數(shù)種病癥的癥狀。本發(fā)明使用的炎性病癥被定義為涉及炎性成分的任何疾病。對于本發(fā)明來說，炎性病癥特別包括自身免疫性疾病和/或移植排斥。CD40-CD40L相互作用在免疫應(yīng)答起始、放大和延長中的重要作用使本發(fā)明多肽特別適合于自身免疫性疾病的免疫調(diào)節(jié)。下文提供的關(guān)于CD40和CD40L的信息是為了說明CD40及其配體在炎性病癥中的作用。CD40分子是50kDa的I型膜糖蛋白，在B細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞(DQ上表達(dá)45—5D。此外，病理?xiàng)l件下可以在內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)CD4051。CD40配體(gp39、TBAM、TRAP、CD40L、CD154)是32kDa的II型膜內(nèi)在糖蛋白，在活化的CD4+T細(xì)胞和小部分活化的CD8+T細(xì)胞上短暫表達(dá)52'53。此外，在活化后的許多其他細(xì)胞類型中也發(fā)現(xiàn)了CD40L，包括肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、DC和血小板54，55。CD40被CD40L結(jié)合在B細(xì)胞中引發(fā)許多生物學(xué)事件，包括增殖，活化標(biāo)記的表達(dá)，免疫球蛋白(Ig)產(chǎn)生，同種型轉(zhuǎn)換，同型粘附和避免凋亡56，57。但是，如上所述，CD40分子的分布不像預(yù)先設(shè)想的那樣局限于B細(xì)胞。新分離的人單核細(xì)胞表達(dá)低水平的CD40分子，在IFN-y存在的條件下培養(yǎng)，其可被上調(diào)47—49，58。CD40與單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的結(jié)合誘導(dǎo)大量促炎介導(dǎo)物如IL-1、TNF-a和IL-12的分泌，這誘導(dǎo)炎性應(yīng)答和殺腫瘤活性4749'58，并使它們避免凋亡48。CD40結(jié)合還造成DC增強(qiáng)它們的分化和活化，增強(qiáng)共刺激分子如CD86、CD80和CD58的表達(dá)，增加細(xì)胞因子生成，并抑制凋亡5()'59。此外，當(dāng)在炎性條件下表達(dá)時(shí)，CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠誘導(dǎo)EC上細(xì)胞間粘附分子l(ICAM-l)、血管細(xì)胞粘附分子1(VCAM-1)和E-選擇蛋白的表達(dá)55。這些結(jié)果表明T細(xì)胞-EC相互作用期間通過CD40的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)22可能是調(diào)節(jié)EC活化和白細(xì)胞募集到非淋巴組織的重要步驟。體內(nèi)研究已經(jīng)表明CD40-CD40L相互作用在產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答6Q，61，抗原特異性T細(xì)胞的引發(fā)和活化62，巨噬細(xì)胞的短暫活化63，以及保護(hù)性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(通過T細(xì)胞介導(dǎo)的抗胞內(nèi)寄生蟲感染如肺囊蟲(Pneumocystis)、隱孢子蟲屬(Qyptosporidium)和利什曼原蟲屬(Leishmania)的巨噬細(xì)胞活化)64-66中的重要性。在小鼠自身免疫性疾病模型中證明了CD40及其配體的特異性作用。動物模型研究清楚顯示CD40L-CD40相互作用參與多種自身免疫性疾病的病理生理學(xué)。在這些研究中，利用患有自發(fā)性或者實(shí)驗(yàn)性自身免疫性疾病的小鼠，干擾CD40L-CD40相互作用具有明顯的有益作用。針對小鼠CD40L的Mab顯示預(yù)防或者減輕(SWRxNZB)Fl狼瘡小鼠和非肥胖糖尿病(NOD)小鼠(自發(fā)患有T細(xì)胞依賴性自身免疫性糖尿病)中膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE;MS的動物模型)的病征。證據(jù)表明CD40-CD40L相互作用還在炎癥性腸病(包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)的發(fā)病機(jī)理中起作用。具有高轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的CD40L轉(zhuǎn)基因小鼠顯示患有致死性炎癥性腸病，其特征在于CD40+細(xì)胞和CD40L+T細(xì)胞浸潤患病組織67。在用2,4,6-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的患有結(jié)腸炎的動物中，抗CD40LMab有效地預(yù)防粘膜炎癥和固有層CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-Y44。最近在SCID小鼠實(shí)驗(yàn)性炎癥性腸病模型中進(jìn)行了抗TNF-a治療和利用抗CD40LMab干擾CD40-CD40L途徑的直接比較。在該模型中，將同基因CD45RB鵬CD4+細(xì)胞注射入SCID小鼠，所述小鼠隨后患上腹瀉或者軟便并在T細(xì)胞重建后的開始3-5周顯示進(jìn)行性體重減輕，這是實(shí)驗(yàn)性炎癥性腸病的癥狀。在T細(xì)胞重建當(dāng)天利用抗TNF-a或者抗CD40L治療完全阻止了實(shí)驗(yàn)性炎癥性腸病的臨床和組織學(xué)表現(xiàn)。此外，在T細(xì)胞重建后5周的抗CD40L施用仍然可以阻止疾病的進(jìn)展，與對照動物相比，被治療的動物顯示疾病征狀和組織學(xué)的改善(未出版觀察)。最近的研究還證明千擾CD40-CD40L途徑在移植模型中是強(qiáng)烈免疫抑制的。利用同種異體小淋巴細(xì)胞或者T細(xì)胞耗盡的小淋巴細(xì)胞加上小鼠CD40L抗體的聯(lián)合治療使40例受體中的37例無限(indefmite)胰島同種異體移植存活，所述受體在主要和次要組織相容性基因座不同68。由這些實(shí)驗(yàn)可以總結(jié)得出CD40L-CD40相互作用的有效干擾很可能通過同種異體反應(yīng)性宿主T細(xì)胞阻止對靜止的小淋巴細(xì)胞的共刺激分子的誘導(dǎo)。在近來的另一項(xiàng)研究中，證明在首次用于實(shí)驗(yàn)的宿主和致敏宿主中，移植時(shí)施用小鼠CD40L的Mab均顯著延長完全不同的小鼠心臟同種異體移植物的存活。但是，當(dāng)抗CD40L治療被推遲到術(shù)后第5天時(shí)，抗CD40L未能延長移植物存活。從該研究可以總結(jié)得出抗CD40L治療主要通過干擾T細(xì)胞的輔助效應(yīng)功能來抑制同種異體移植排斥。還顯示同時(shí)干擾CD80/CD86-CD28和CD40-CD40L途徑有效阻止T細(xì)胞克隆的體外和體內(nèi)擴(kuò)增，促進(jìn)完全同種異體皮膚移植物的長期存活，和抑制原發(fā)血管化心臟同種異體移植物的慢性血管排斥的發(fā)展。此外，千擾CD40-CD40L途徑，任選與干擾CD80/CD86-CD28途徑聯(lián)用，在恒河猴腎同種異體移植模型中防止腎同種異體移植排斥69，7、要進(jìn)一步了解5D12對炎性病癥效果的信息，可以參見參考文獻(xiàn)71—81。多發(fā)性硬化是中樞(腦脊)神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病。在該病癥中，神經(jīng)纖維周圍的白質(zhì)發(fā)生硬化。術(shù)語多發(fā)性硬化(MS)字面意思是"許多疤痕"。神經(jīng)組織的硬化區(qū)域被稱為斑(plaques)。多發(fā)性硬化的癥狀、嚴(yán)重性和病程是高度可變的，這部分取決于斑的部位和白質(zhì)惡化(deterioration)程度。神經(jīng)系統(tǒng)的白質(zhì)惡化減緩神經(jīng)沖動，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)。常見狨猴(Callithrixjacchus)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是多發(fā)性硬化的有效臨床前模型(綜述參見86'87'1Q2，1Q4)。在該EAE模型的多種類型中發(fā)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)白質(zhì)損傷都具有MS的病理形態(tài)、放射性和免疫學(xué)特征95，98，1。1。因此，狨猴EAE模型可以連接人類和嚙齒類動物的較寬免疫差異，所述差異阻礙了在臨床前期的藥物開發(fā)渠道中選擇有希望的療法96'"'1()3。用rhMOG(表示人MOG胞外片段(氨基酸l-125)的重組蛋白)免疫的狨猴100。/。患上EAE，這歸因于每只猴的全部組成成分(repertoire)中單形MHCII型易感元件Caja-DRB*W1201的存在82'84'85'1Q7。該模型在治療開發(fā)中特別有用的方面在于腦白質(zhì)中發(fā)生的損傷是可見的并且可以用臨床相關(guān)磁共振成像技術(shù)試驗(yàn)性表征92，1()5。利用磁共振成像(MRI)對腦白質(zhì)損傷的縱向分析顯示大部分損傷中的體積漸進(jìn)增加和持久炎癥性活性。此外，利用MRI和先前描述的組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)1(H對CNS病理的表征顯示大部分損傷處于早期活性階段1%。己經(jīng)使用rhMOG誘導(dǎo)的EAE模型來檢測針對抗原遞呈細(xì)胞(APC)和T細(xì)胞的共刺激分子的抗體是否是MS的有效療法。CD40與其配體CD154的相互作用在EAE中進(jìn)行的多種免疫病理過程中扮演著重要角色，所述過程包括B細(xì)胞活化、抗原遞呈細(xì)胞(APC)活化、抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的啟動和巨噬細(xì)胞效應(yīng)功能的誘導(dǎo)9Q，93，97，7。1996年進(jìn)行的一項(xiàng)研究證實(shí)用抗CD154的抗體治療小鼠可以預(yù)防EAE88。但是，由于意料之外的副作用，MS患者的抗CD154抗體臨床試驗(yàn)被終止17，所述副作用在動物試驗(yàn)中沒有被觀察到。已經(jīng)制備了抗人CD40的小鼠單克隆抗體(Mab)5D12(mu5D12)。5D12抗體是CD40-CD40L介導(dǎo)的數(shù)種細(xì)胞類型活化的有效抑制劑，與其他大部分抗CD40Mab不同，5D12抗體不產(chǎn)生CD40刺激活性21，22，39。在狨猴EAE模型中，小鼠抗人CD40抗體mu5D12和該抗體的嵌合形式ch5D12均顯示對CNS白質(zhì)損傷進(jìn)展和神經(jīng)學(xué)缺陷的強(qiáng)抑制作用，并且沒有顯著的副作用23'24。同一研究顯示向患EAE的普通狨猴靜脈內(nèi)注射的抗CD40Mab能夠進(jìn)入腦白質(zhì)損傷，其中CD40分子主要在浸潤的巨噬細(xì)胞和活化的小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)M，如同早先在MS中發(fā)現(xiàn)的一樣s8。這就提出了問題，即ch5D12是否對已有損傷具有治療作用。'tHart等通過間隔2周的系列磁共振成像(MRI)監(jiān)測了7只rhMOG免疫猴的腦損傷進(jìn)展76。該研究的結(jié)果證明所有3只ch5D12治療猴中損傷性炎癥的抑制，而3只ch5D12治療猴中的2只損傷性腫大減輕。在病程早期預(yù)防CD40與其在活化T細(xì)胞上的配體CD154結(jié)合對嚙齒類動物ss敗w風(fēng)K)o和非人靈長類動物模型"'24中的臨床和神經(jīng)病理表達(dá)具有重要影響。CD40主要在MS患者以及患EAE的嚙齒類動物88和非人靈長類動物95的CNS白質(zhì)損傷內(nèi)表達(dá)。在骨髓嵌合小鼠中已經(jīng)清楚顯示CNS內(nèi)載有CD40的APC(如浸潤的巨噬細(xì)胞以及血管周圍和實(shí)質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)對EAE的發(fā)病機(jī)理非常重要83。'tHart等、Laman等和Boon等的結(jié)果76'79'81顯示CD40的抗體阻斷是MS的潛在有效治療方法。重要地是，ch5D12Mab在狨猴EAE模型或者其他靈長類物種中均沒有明顯的副作用,在狨猴兩種EAE模型(即用人髓磷脂79或者rhMOG81誘導(dǎo))的安慰劑對照實(shí)驗(yàn)中證明了抗CD40抗體的有益臨床效果。此外，'tHart等已經(jīng)證明了抗CD40抗體治療對己有損傷的抑制效果76。牛皮癬是折磨人口總數(shù)1-2%的炎癥性皮膚病。在該疾病中，損傷處的T細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞被活化并表達(dá)活化標(biāo)記物和共刺激分子。認(rèn)為角質(zhì)形成細(xì)胞和T細(xì)胞上表達(dá)的一些共刺激分子彼此相互作用，并且這類相互作用促進(jìn)疾病活性1G8"IQ。這樣一組分子可以是CD40(其在活化的角質(zhì)形成細(xì)胞上表達(dá))和CD154(CD40配體)(其在活化的CD4+T細(xì)胞上短暫表達(dá))。T細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞之間的CD40-CD154結(jié)合可以從這些細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，所述炎性介質(zhì)在牛皮癬損傷中豐度較高。CD40、CD154和CD40-CD154的相互作用最近被綜述111。培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞也表達(dá)CD40;IFN處理增強(qiáng)該表達(dá)。IFN-Y處理的角質(zhì)形成細(xì)胞(在本文自始至終被稱為0040++角質(zhì)形成細(xì)胞)上高表達(dá)的CD40與CD154的結(jié)合造成ICAM的上調(diào)和細(xì)胞因子生成增加112"14。到目前為止，只有一例涉及該結(jié)合在牛皮癬發(fā)病機(jī)理中的報(bào)道"3。在后續(xù)研究中沒有鑒定牛皮癬損傷中表達(dá)CD40的細(xì)胞類型，也沒有描述其發(fā)生和損傷狀況。也沒有研究牛皮癬損傷中CD154+T細(xì)胞的存在。因此，仍然不清楚CD154是否作為角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生在牛皮癬損傷中發(fā)現(xiàn)豐度較高115的趨化因子和補(bǔ)體的信號。通過10例牛皮癬患者損傷和非損傷皮膚的免疫組織化學(xué)，最近Pasch等證明了CD40+和CD154+細(xì)胞的存在和位置16。在角質(zhì)形成細(xì)胞簇中觀察到CD40的陽性增加，并且在正常、非損傷和損傷表皮的幾乎所有CDla+郎格罕氏細(xì)胞中均顯示CD40的高表達(dá)。此外，CD40的高表達(dá)存在于牛皮癬損傷中幾乎所有的CD83+細(xì)胞；而在非損傷和正常皮膚中很難觀察到它們"6。此外，在大部分患者中，只有CD40+細(xì)胞鄰位的小部分T細(xì)胞顯示CD154表達(dá)。這些結(jié)果使以下可能性增大，即€0154+1細(xì)胞可以與0040+角質(zhì)形成細(xì)胞、郎格罕氏細(xì)胞和CD83+樹突細(xì)胞結(jié)合，并且在損傷處從它們釋放介質(zhì)。此夕卜，他們還證明了CD40結(jié)合誘導(dǎo)趨化因子(IL-8、RANTES和MCP-1)的釋放116。在同一出版物中，Pasch等顯示拮抗性抗CD40抗體5D12抑制趨化因子IL-8、MCP-1與CD40有關(guān)的釋放，而RANTES釋放受抑制的程度較低116。這些數(shù)據(jù)表明拮抗性抗CD40mAb5D12至少可以部分影響牛皮癬損傷中觀察到的炎癥。US2003/0165499公開了SCID小鼠異種移植模型系統(tǒng)中5D12和其他拮抗性抗CD40抗體可測量的抗牛皮癬作用，所述模型系統(tǒng)被用作牛皮癬治療的模型，證明拮抗性抗CD40抗體可用于治療牛皮癬。在該體內(nèi)系統(tǒng)中證明了5D12的治療作用。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述自身免疫疾病和/或炎性病癥包括炎癥性腸病。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供本發(fā)明的用途，其中所述炎癥性腸病包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)或者克羅恩病(CD)。如上所述，本發(fā)明的多肽適合于治療多種炎性病癥，包括自身免疫性疾病和移植排斥。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明提供改善自身免疫性疾病和/或炎性病癥的癥狀和/或減輕移植排斥的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明多肽、本發(fā)明結(jié)合體、本發(fā)明抗體、本發(fā)明核酸和/或本發(fā)明細(xì)胞在制備用于改善自身免疫性疾病和/或炎性病癥的癥狀和/或減輕移植排斥的藥物中的用途。本發(fā)明使用的改善癥狀被定義為至少部分地改善疾病的至少一種癥狀。本發(fā)明尤其關(guān)注于目前還沒有有效療法的自身免疫性和/或炎性病癥。這類病癥的實(shí)例是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、牛皮癬、炎癥性腸病、大皰性類天皰瘡和特應(yīng)性皮炎。本發(fā)明的多肽(任選包含在本發(fā)明的結(jié)合體或者細(xì)胞中，和/或由本發(fā)明的核酸編碼)特別適合于改善自身免疫性疾病和/或炎性病癥的癥狀，因?yàn)楸景l(fā)明多肽的限定性質(zhì)允許以特異方式干擾CD40-CD40L途徑。此外，因?yàn)楸景l(fā)明的結(jié)合體優(yōu)選是去免疫的，所以本發(fā)明的結(jié)合體可以存在較長時(shí)間，因此可以在相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)在患者中顯示其拮抗活性。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明提供本發(fā)明多肽、本發(fā)明結(jié)合體、本發(fā)明抗體、本發(fā)明核酸和/或本發(fā)明細(xì)胞在制備改善自身免疫性疾病和/或炎性病癥的癥狀和/或減輕移植排斥的藥物中的用途，其中所述自身免疫性疾病和/或所述炎性病癥選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、牛皮癬、炎癥性腸病、大皰性類天皰瘡和特應(yīng)性皮炎。附圖簡述圖1.如符號指示的4個(gè)劑量水平在第0天單次施用后的ch5D12血清濃度。數(shù)值表示為嗎ch5D12/mL血清，這是按照參考文獻(xiàn)27的描述通過酶聯(lián)免疫吸附分析測定的。圖2.ch5D12輸注后28天期間克羅恩病活性指數(shù)(Crohn'sDisease27ActivityIndex,CDAI)評分的變化。陰影區(qū)域指示ch5D12水平超過10嗎/mL濃度(參見圖l)的時(shí)間段，在靈長類動物中發(fā)現(xiàn)所述10ng/mL濃度是功能性拮抗血清水平24—27。在0.3mg/kg的群組中，血清水平從沒有超過10嗎/mL水平。圖3.第0天和第28天的組織學(xué)疾病活性評分。最大活性評分是16，根據(jù)參考文獻(xiàn)40進(jìn)行活性評分。在第0天和第28天獲得9例受試者回腸的樣品(菱形)和11例受試者結(jié)腸的樣品(正方形)，結(jié)果表示為每劑量水平的ch5D12[(a)0.3mg/kg;(b)，1.0mg/kg;(c)，3.0mg/kg禾口(d)，10.0mg/kg]。圖4.患者012(3.0mg/kg)的結(jié)腸活檢和患者011(3.0mg/kg)的回腸活檢作為實(shí)例顯示炎性應(yīng)答的降低。在施用ch5D12前(a，c)和施用ch5D12后第28天(b,d)，利用識別所有T淋巴細(xì)胞(CD3)、B細(xì)胞(CD19)、巨噬細(xì)胞(CD68)和CD40(+)細(xì)胞的抗體對樣品染色。HE，蘇木精-曙紅。圖5.小鼠5D12VH和VL區(qū)的共有DNA和推導(dǎo)的氨基酸序列。圖6.小鼠V區(qū)與鑲嵌的和去免疫的5D12V區(qū)的氨基酸比較。圖7.去免疫5D12VH的12個(gè)被檢測氨基酸變體(Q5E,K13A，E16Q，T17S,I29L,137V，P45L,M48L,STS60NSA，T68S,S79F和T108S)與親代小鼠序列(ch5D12)和完全去免疫序列(DI5D12)的比對。圖8.利用JY細(xì)胞的FACS分析。48小時(shí)后收集瞬時(shí)表達(dá)5D12變體(Q5E,K13A，E16Q，T17S,I29L，137V，P45L，M48L，STS60NSA,T68S，S79F和T108S)的PER.C6細(xì)胞上清。作為對照還收集轉(zhuǎn)染ch5D12或者DI5D12轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清以及模擬(無質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清。利用JY細(xì)胞以及抗人FITC標(biāo)記的二抗(1/100稀釋)通過FACS檢測表達(dá)抗體的結(jié)合。作為FACS對照，JY細(xì)胞只與FITC標(biāo)記的二抗保溫。圖9.在去免疫5D12VH的29和37位的其他V-L-I變體(29I-37V，29V-37I,29I-37L，29V-37V，29L-37L，29V-37L,29L-37V)與親代嵌合序列(ch5D12)、完全去免疫序列(DI5D12;291-371)和PG102(29L-37I)的比對。圖10.生成PG102抗體的GS-CHO細(xì)胞系和"生長過度"24孔平板培養(yǎng)物的抗體生成分布。細(xì)胞系的數(shù)目繪于X軸，抗體濃度范圍繪于Y軸(抗體濃度范圍按照升序分布，起始于0-25嗎/ml)。圖ll.CDACFA補(bǔ)料分批搖瓶培養(yǎng)中細(xì)胞系A(chǔ))L107(DC1;上圖)，28B)L25(DC2;中間圖)和C)M95(DC3，下圖)的生長和抗體積聚譜。圖12.10)ig/mL的PG102(紅色)和ch5D12(PG100)(藍(lán)色)與3個(gè)不同水平的固定CD40結(jié)合的比較。圖13.通過抗獨(dú)特型mAb173-36-1抑制CD40mAb與表達(dá)人CD40的JY細(xì)胞的結(jié)合。在lpg/ml的濃度分析抗CD40mAb。數(shù)據(jù)是每種抗體4次單獨(dú)測定的平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。圖14.CD40-FcELISA。ch5D12(PG100)和PG102與人CD40-Fc濃度相關(guān)結(jié)合。板用250ng/ml人CD40-Fc包被過夜。同種型對照mAb，chFUN-l針對人CD86。數(shù)據(jù)表示為平均值士平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(所有n=3)。圖15.抗CD40mAb與JY細(xì)胞結(jié)合的FACS定量。ch5D12(PG100)和PG102顯示類似的半最大結(jié)合濃度(half-maximalbindingconcentration)。在這些實(shí)驗(yàn)中抗CD86mAb，chFUN-l也顯示結(jié)合JY細(xì)胞，這是由于人CD86被該細(xì)胞系表面表達(dá)。數(shù)據(jù)是每種抗體兩次測定的平均值。圖16.通過未標(biāo)記的ch5D12(PG100)和PG102抗體抑制ch5D12(PG100)-PE禾HPG102-PE與JY細(xì)胞的結(jié)合。在濃度增加的競爭性未標(biāo)記抗體存在的條件下，保溫ljug/ml標(biāo)記的ch5D12(PG100)(A)禾口PGl(^(B)。通過流式細(xì)胞術(shù)測定用平均熒光強(qiáng)度(MFI)表示的標(biāo)記抗體結(jié)合。ch5D12(PG100)PE和PG102PE結(jié)合的最大MFI分別是369熒光單位(A)和305熒光單位(B)。數(shù)據(jù)是4次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤。圖17.與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)后抑制THP-1細(xì)胞的IL-8釋放。在濃度增加的ch5D12(PG100)或者PG102存在條件下，用IFNy刺激的THP-1細(xì)胞與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)。通過ELISA測定THP-1細(xì)胞釋放的IL-8，所述釋放利用通過CD40-CD40L的Jurkat細(xì)胞與THP-1細(xì)胞的結(jié)合來誘導(dǎo)。數(shù)據(jù)是單次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖18.IgG4PG102重鏈和輕鏈的核酸和氨基酸序列。實(shí)施例實(shí)施例l#/，誠選擇臨床上被診斷為克羅恩病(通過放射性、內(nèi)窺鏡或者組織學(xué)證據(jù)確診)并且克羅恩病活性指數(shù)(CDAI)評分至少為220但不超過450(在施用研究29藥物前7天評分)的18例成年受試者(18-60歲)進(jìn)行研究。在所述研究前或者期間受試者可以接受下列治療:美沙拉對mesalamine)治療8周或者更長，其劑量在篩查前4周是穩(wěn)定的；每天最多30mg皮質(zhì)類固醇(或者每天9mg布地奈德(budesonide))，共8周或者更長，其劑量在篩查前2周是穩(wěn)定的；巰基嘌呤或者硫唑嘌呤4個(gè)月或者更長，其劑量在篩查前8周是穩(wěn)定的。受試者在篩查前3個(gè)月內(nèi)不能接受環(huán)孢菌素A或者氨甲蝶呤治療，也不允許在之前接受過Mab治療。所有登記受試者的平均年齡是35.8歲，其中7例是男性，ll例是女性。全部受試者都是白種人。在包括的不同群組的患者之間沒有觀察到明顯的差異(表l)，除了在較低劑量的3個(gè)組中大部分受試者是女性，而最高劑量組(10.0mg/kg)只包括男性受試者。就基線心電圖(ECG)、生命體征、身體檢查、克羅恩病體征和癥狀歷史以及基線實(shí)驗(yàn)室值來說，4個(gè)群組之間不存在顯著差異。4個(gè)劑量群組中關(guān)于基線特征也不存在顯著差異。但是最高劑量群組還顯示基線的最高CDAI評分。該研究得到下列單位的醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)UniversityHospitalsLeuven,Belgium,LeidenUniversityMedicalCenter,TheNetherlands,MedizinischeKlinik,Kiel,Germany,禾口HadassahMedicalCenter,Jerusalem,Israel。所有患者都簽署了該研究的知情同意書。微沒膝浙方,ch5D12是分子工程化的人IgG4抗體，其包含Mab5D12親代形式的重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域。己經(jīng)證明該Mab結(jié)合載有CD40的細(xì)胞并拮抗CD40介導(dǎo)的多種細(xì)胞的活化2^27。在一個(gè)開標(biāo)、單劑量、多中心試驗(yàn)中施用ch5D12，研究4個(gè)劑量水平。除了最后一個(gè)劑量群組(其中只登記了3例受試者)外，每個(gè)治療組有5例受試者。在靜脈內(nèi)完成劑量水平為0.3、1.0、3.0和10.0mg/kgch5D12的單次施用。在完成一個(gè)劑量組的招募后，只有當(dāng)確定現(xiàn)有劑量水平的安全性時(shí)才開始下一組的招募。前28天在每周一次的就診時(shí)評定臨床疾病活性，然后是第56天的最后一次就診。2例(3.0mg/kg劑量群組)在第28天評定后退出本研究，但評估時(shí)仍包括他們的數(shù)據(jù)。在研究過程中，受試者穩(wěn)定地采用他們當(dāng)前用藥的相同劑量。在研究期間不使用沒有得到許可的伴隨用藥。對ch5D12治療的應(yīng)答被定義為CDAI的降低2100點(diǎn)，臨床疾病緩解被定義為CDAK150(總分)并且CDAI降低至少100。對第28天篩查時(shí)接受內(nèi)窺鏡檢查的所有受試者(11=11)分析他們的克羅恩病內(nèi)窺鏡嚴(yán)重性指數(shù)(Crohn'sDiseaseEndoscopicIndexofSeverity,CDEIS)評分指數(shù)的降低。在施用ch5D12前以及施用ch5D12后第28天，從這11例患者采集活檢用于組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)。安全性評價(jià)包括身體檢査、生命體征、ECG和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(化學(xué)、血液學(xué)和尿檢)，所述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)包括抗dsDNA、pANCA和人抗嵌合抗體(HACA)評價(jià)。如參考文獻(xiàn)(27)所述通過酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)測定HACA。顏動力學(xué)按照先前的描述27通過ELISA測定ch5D12的血清濃度。為了測定注射的ch5D12對CD40的包被，將血液收集到肝素管，并用PBS兩倍稀釋。通過梯度離心(Lymphoprep,Nycomed，Roskilde,Denmark)分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，500000個(gè)細(xì)胞用FITC標(biāo)記的ch5D12和PerCP標(biāo)記的抗CD20(Becton-Dickinson,MountainView,CA,USA)染色，并在冰上保溫30分鐘。作為5D12-FITC結(jié)合的背景對照，單獨(dú)管的PBMC只用PerCP標(biāo)記的抗CD20抗體染色。洗滌掉未結(jié)合的抗體，然后利用流式細(xì)胞儀(FACSort;Becton-Dickinson)分析細(xì)胞。通過門控(gating)和獲取(acquiring)表達(dá)CD20的細(xì)胞總共5000個(gè)事件(events)來進(jìn)行事件的獲取。如果對于樣品組來說表達(dá)CD20的細(xì)胞的數(shù)目較低，在未染色和染色制品中小心獲取相同數(shù)目的事件。鄉(xiāng)學(xué)辦激靴學(xué)在治療前第0天和第28天的回腸結(jié)腸鏡檢查期間利用標(biāo)準(zhǔn)鑷獲得的回腸和結(jié)腸粘膜活檢固定于6%福爾馬林中用于常規(guī)分析。其他樣品立刻在液氮冷卻異戊烷中速凍于Tissue-Tek最佳切割溫度化合物(MilesLaboratoriesInc，Naperville，IL,USA)。樣品在-80。C保存直至進(jìn)一步使用。福爾馬林固定的樣品經(jīng)過常規(guī)石蠟處理。制備5微米厚的切片，并用蘇木精和曙紅染色。利用LeitzWetzlar顯微鏡(Wetzler,Germany)分析所述切片。每種樣品分析總共4個(gè)半連續(xù)切片。所述冷凍樣品用于免疫組織化學(xué)分析，該分析利用一組Mab分析淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞不同亞群的存在。所述組利用針對CD40和CD40L的Mab來實(shí)現(xiàn)。免疫組織化學(xué)染色在恒冷箱切片上進(jìn)行，室溫下干燥過夜，并在純丙酮中固定10分鐘。再水化的載玻片與下列31Mab保溫30分鐘CD3(克隆UCHTl,1/10稀釋)(Dako,Glostrup,Denmark),CD4(克隆MT310，1/10稀釋)(Dako)，CD8(克隆144B，1/20稀釋)(Dako)，CD19(克隆HD37,1/30稀釋)(Dako),CD40(克隆5D12,1/100稀釋)(PanGenetics,Amsterdam,TheNetherlands),CD68(克隆Kpl，1/50稀釋)(Dako)，CD154(克隆M90，1/10稀釋)(Serotec，Oxford,UK)。二抗Mab是生物素標(biāo)記的抗小鼠免疫球蛋白(1/400稀釋；Dako)，作用30分鐘。為了有效地封閉內(nèi)源性過氧化物酶，切片還在包含0.3%(v/v)H202的甲醇溶液中保溫20分鐘。在用PBS洗滌3次后，添加抗生物素蛋白/生物素過氧化物酶標(biāo)記的復(fù)合物(Dako)。在幾次保溫之間，所述切片用pH7的磷酸鹽緩沖液洗滌15分鐘。在包含0.05%3-氨基-9-乙基-咔唑(Janssen，Beerse,Bdgium)和0.01%H202的0.05m乙酸鹽緩沖液(pH4.9)中將切片保溫10分鐘使反應(yīng)產(chǎn)物顯色，產(chǎn)生亮紅色的免疫反應(yīng)性部位。然后，所述載玻片用Harris蘇木精進(jìn)行弱復(fù)染色，用蒸餾水洗滌，并用甘油封片。陰性對照包括，不含一抗或者二抗，只使用色原體，使用無關(guān)的同種型匹配小鼠IgG(波形蛋白；Dako)。用蘇木精和曙紅染色的石蠟切片均由相同的病理學(xué)家(K.G.)進(jìn)行分析，所述病理學(xué)家對樣品來源是不清楚的。利用組織學(xué)數(shù)字評分4()評估疾病活性，其中最大活性是16。同樣以不知情方式(blindedfashion)分析免疫組織化學(xué)染色的切片。對于15組切片，在高倍視野(放大率x40)下計(jì)算陽性染色細(xì)胞。根據(jù)基質(zhì)細(xì)胞的最高密度選擇所述視野。數(shù)目可以表示為基質(zhì)中單核細(xì)胞總數(shù)的百分比。這些計(jì)數(shù)用于組成評分系統(tǒng)，據(jù)此陽性染色細(xì)胞的強(qiáng)度可以被細(xì)分成4類-、+/-、+和++?；啬c和結(jié)腸的CD3+、CD4+、CD8+、CD19+和CD68+的正常值是+。CD40+禾nCD154+細(xì)胞的正常值是陰性(-)。免鼓全參教為了評估ch5D12的任何非特異性免疫抑制，評價(jià)了外周血T細(xì)胞增殖對植物凝集素絲裂原(PHA)的應(yīng)答。按照先前的報(bào)道41，對分離的PBMC進(jìn)行PHA刺激(l|ig/mL)。此外，測量循環(huán)CD3+、CD4+、CD8+和CD20+細(xì)胞的百分比以排除循環(huán)細(xì)胞的耗竭。對于流式細(xì)胞術(shù)，在指定時(shí)間將血液收集到肝素管，其中每個(gè)試管中的lOOpL全血如下染色(所有Mab均購32自Becton-Dickinson):抗CD3-FITC，抗CD19畫PE，抗CD45-PerCP，抗CD45-FITC，抗CD4-PE，抗CD8-PE和抗CD14-PE。然后在FACScan流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson)上分析染色的細(xì)胞。進(jìn)行該方案以計(jì)算CD4+相對CD8+細(xì)胞的比例并確定淋巴細(xì)胞群中B細(xì)胞的比例。報(bào)告的CD3和CD19的百分比是淋巴細(xì)胞群內(nèi)T細(xì)胞和B細(xì)胞的百分比，而CD4和CD8細(xì)胞報(bào)告為CD3細(xì)胞的百分比。只有CD14(單核細(xì)胞群)顯示的是總CD45群的百分比。越艦動力學(xué)單次i.v.注射后ch5D12的平均峰值水平是劑量依賴和劑量成比例的(圖1)。24小時(shí)后，在最高的3個(gè)劑量群組的血清中能夠檢測到大約50%被施用的ch5D12。對于0.3mg/kg群組，24小時(shí)后只有15%存在于血清中。對于非人靈長類動物研究，計(jì)算出tl/2p是8-10天27，這被現(xiàn)有的人類數(shù)據(jù)確認(rèn)。利用FITC標(biāo)記的ch5D12通過回體(exvivo)競爭分析確定(未顯示)0.3mg/kg的輸注沒有實(shí)現(xiàn)外周血B細(xì)胞上CD40的完全包被。對于1.0mg/kg組，可以觀察到循環(huán)B細(xì)胞上CD40包被大約1周，而在兩個(gè)最高劑量組中這個(gè)時(shí)間延長到2-3周。這提示在最低劑量組中，CD40的拮抗作用是不完全的，而在1.0mg/kg群組中實(shí)現(xiàn)l周的完全拮抗作用，并且在更高劑量組中甚至更長。游淑應(yīng)對CDAI進(jìn)展的分析顯示18例受試者中的13例(72%)在ch5D12輸注后具有良好反應(yīng)。類似地，18例受試者的4例(22%)在此期間經(jīng)歷了癥狀緩解。在第21天評價(jià)時(shí)，18例受試者中的IO例記錄了有利的反應(yīng)。群組2和4顯示CDAI最大的平均降低，并且沒有觀察到明顯的劑量-效果關(guān)系(圖2;表2)。之后重復(fù)測量anova顯示CDAI在56天觀察期間統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低(P〈0.001)。各個(gè)群組之間的差異統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。只在群組3和4中評價(jià)了CDEIS(因?yàn)槿航M1和2中只對3例受試者作了內(nèi)窺鏡檢查)。在群組3中，5例受試者中的2例CDEIS降低，而在群組4中，3例受試者中有2例降低。這兩組中的其余受試者沒有顯示變化(未顯示)。蘊(yùn)織學(xué),化對于被采集活檢的患者(11=11)，單個(gè)研究者評價(jià)他們組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)方面的變化。對活檢材料進(jìn)行的評估顯示治療對于疾病的顯微鏡下活性以及固有層單核細(xì)胞浸潤強(qiáng)度的顯著影響。從基線到第28天的組織病理學(xué)活性評分的變化顯示于圖3。提供有第0天9例患者的回腸樣品和11例患者的結(jié)腸樣品。4例患者的回腸在篩查時(shí)沒有患病，而5例患者患有活性回腸疾病。第0天那些患有活性疾病的患者的平均組織學(xué)評分是4.6(范圍3-7)。第28天所述5例患者的平均組織學(xué)評分降低到l.O(范圍0-3)。11例患者中4例的結(jié)腸在第0天沒有患病，來自這些患者的結(jié)腸樣品在第28天仍是正常的。7例患者的結(jié)腸顯然患病，其平均組織學(xué)分?jǐn)?shù)在第0天為4.5(范圍2-12)。第28天其降低到平均分?jǐn)?shù)為1.7(范圍0-7)。7例患者的5例中，第28天的分?jǐn)?shù)是O(提示是正?；顧z)或者l(提示只有結(jié)構(gòu)異常)。在最低劑量群組(a組)，l例受試者的結(jié)腸評分降低，但該組的其他結(jié)腸評分仍然較高，回腸評分甚至增加。在更高劑量群組(b-d組)，在ch5D12治療后第28天回腸或者結(jié)腸或者兩者的活性評分全部降低。最終，在81%(9/11)的受試者中觀察到陽性反應(yīng)[如參考文獻(xiàn)(41)所定義]。此外，在第0天患有活性疾病的7例受試者顯示中性粒細(xì)胞活性降低到在第28天活檢中不存在中性粒細(xì)胞。為了確定ch5D12治療靶向何種細(xì)胞，在現(xiàn)有活檢上對T細(xì)胞(CD3、CD4和CD8)和B細(xì)胞(CD19)標(biāo)記以及巨噬細(xì)胞標(biāo)記(CD68)就每個(gè)方案均進(jìn)行免疫組織化學(xué)評估。結(jié)果列于表3。在最低劑量群組中第28天未觀察到降低，而在所有其他群組中觀察到浸潤減少。在處于基線的回腸樣品中，9例患者中的6例CD3+T細(xì)胞數(shù)增加。在結(jié)腸中，11例患者中的4例存在CD3+T細(xì)胞數(shù)增加，在常規(guī)組織學(xué)檢查中他們均患有活性疾病。第28天，除了1例患者外所有患者的CD3+T細(xì)胞數(shù)被歸一化。該患者(患者001;最低劑量組；0.3mg/kg)的回腸和結(jié)腸中存在持續(xù)的CD3+細(xì)胞增加，這與常規(guī)組織學(xué)的持續(xù)炎性活性和肉芽腫性炎癥一致。CD4+和CD8+細(xì)胞顯示與CD3+相似的模式。CD19+B細(xì)胞的模式與從T細(xì)胞觀察到的模式相當(dāng)。第O天，9例患者(提供其回腸活檢)中的6例和11例結(jié)腸樣品中的4例存在B細(xì)胞的升高。第28天，除了低劑量組的1例患者外所有患者的B細(xì)胞量被歸一化。第28天在CD68+單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上觀察到相似的降低。第0天，9例患者(提供其回腸活檢)中的5例和11例結(jié)腸樣品中的4例存在CD68十單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的量增加。除了1例低劑量群組的患者以外，第28天所有的增加都被再次歸一化，所述患者的結(jié)腸樣品中仍保持較高的CD68+單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，甚至在回腸活檢中也有增加，表明該患者在第28天仍患有活性疾病。圖4顯示施用ch5D12前和施用ch5D12后第28天，患者011(活性評分7)的回腸活檢和患者012(活性評分12)的結(jié)腸活檢中所有3種主要細(xì)胞類型(T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞)降低的代表性實(shí)例。安全絲沒有受試者因?yàn)椴涣际录?AE)而退出研究，這些AE的大部分是輕度至中度嚴(yán)重性。對發(fā)生25°/。AE總數(shù)的AE的評估顯示最常見的AE是發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛、肌痛和頭痛。關(guān)節(jié)痛，經(jīng)常發(fā)生在基線和隨訪期間，其頻率隨著隨訪進(jìn)程而降低。4例受試者出現(xiàn)了流感樣癥狀和癢疹，其中只有1例受試者是在施用研究藥物(3.0mg/kg)后不久開始出現(xiàn)中度皮疹?？偟膩碚f，對于任何單個(gè)AE來說沒有明顯的劑量反應(yīng)，可能例外的是頭痛/偏頭痛。在6例受試者中觀察到6起嚴(yán)重不良事件(SAE);0.3mg/kg群組中沒有發(fā)生事件，1.0mg/kg群組中3起事件，3.0mg/kg群組中2起事件，以及10.0mg/kg群組中1起事件。6起SAE中的5起被認(rèn)為可能與研究藥物有關(guān)，1起事件被認(rèn)為是無關(guān)的。除了1起事件以外的其他所有事件都是胃腸事件(2例不完全腸梗阻(sub-ileus)均在l.Omg/kg;2例加重的克羅恩病，1.0和3.0mg/kg受試者；和l例加重的腹痛，3.0mg/kg受試者)。但是這些事件中的兩起發(fā)生在不可能與所述研究藥物有因果關(guān)系的時(shí)間點(diǎn)(1例受試者在輸注當(dāng)天，另1例受試者在施用研究藥物后29天經(jīng)過內(nèi)窺鏡檢查后)。觀察到的異常顯示與研究藥物或者劑量無關(guān)。，淑全參教因?yàn)閏h5D12在體外抑制B細(xì)胞活化，所以測定總免疫球蛋白水平，發(fā)現(xiàn)其在隨訪期間是穩(wěn)定的。為了排除ch5D12能夠從循環(huán)中耗竭B細(xì)胞的可能性，我們在研究過程中進(jìn)行PBMC的亞型分析。CD3、CD4、CD8和CD14陽性細(xì)胞的百分比和絕對數(shù)不受施用ch5D12的影響。在施用ch5D12后不久循環(huán)CD19+B細(xì)胞的絕對數(shù)短暫降低，在ch5D12從循環(huán)中被清除后又恢復(fù)到它們的初始值(未顯示)。為了研究ch5D12治療是否會造成常規(guī)免疫抑制作用，用多克隆T細(xì)胞激活物PHA刺激在治療前后不同時(shí)間點(diǎn)分離的PBMC。令人遺憾地是，10.0mg/kg劑量群組的細(xì)胞被不正確的冷凍，因此不會對PHA應(yīng)答，包括施用ch5D12前獲得的細(xì)胞。利用與PHA保溫誘導(dǎo)的剌激指數(shù)變化劇烈，但是沒有檢測到ch5D12治療后的降低趨勢(數(shù)據(jù)未顯示)。2個(gè)更低劑量的群組在整個(gè)研究過程中都沒有可檢測的抗ch5D12抗體。在3.0mg/kg群組，發(fā)現(xiàn)l例受試者產(chǎn)生抗ch5D12應(yīng)答，盡管該信號非常低并且只能在該患者未被稀釋的第28天樣品中檢測到。在最高劑量組，另1例受試者在研究的第28天和第56天具有抗ch5D12抗體。這些在1:64稀釋后能檢測到。因此，只有2例受試者對施用ch5D12可能有免疫應(yīng)答。//論在這種開標(biāo)、多中心試驗(yàn)中，給患有中度至嚴(yán)重克羅恩病的受試者施用4個(gè)劑量水平的ch5D12。登記了18例受試者，除了最后一個(gè)劑量群組(其中只登記了3例受試者)外，每個(gè)治療組有5例受試者。在食蟹猴中觀察到的ch5D12血清水平劑量依賴的增加和長血清半衰期27在人類中得到確認(rèn)。本研究證明了利用ch5D12拮抗CD40介導(dǎo)的細(xì)胞活化的可行性，并且沒有明顯的副作用。CDAI分析顯示研究期間72%的受試者具有臨床應(yīng)答，22%具有癥狀緩解。這些結(jié)果是很有希望的；但是開標(biāo)設(shè)計(jì)和對照組的缺失不可能明確的將觀察到的變化歸因于所述研究藥物的施用。但是，我們有幾個(gè)論據(jù)支持ch5D12的抗炎作用。首先，在兩個(gè)最高劑量群組受試者中觀察到的CDEIS降低證明治療效果。其次，活檢的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示ch5D12降低結(jié)腸或者回腸中的炎性活性。在低劑量群組沒有觀察到明顯的作用。10.0mg/kg群組的受試者在第0天具有最低的組織學(xué)活性評分，因此該群組活性評分的降低是有限的。在1.0mg/kg和3.0mg/kg組發(fā)現(xiàn)基線的最高評分，第28天在這些患者中組織學(xué)評分存在明顯的降低。盡管在本研究中鑒定出2例患者具有抗ch5D12抗體，但HACA抗體36的水平仍然非常低，只能在很低的血清稀釋度下被檢測到。仍然需要確認(rèn)抗ch5D12應(yīng)答是否能夠在后續(xù)研究中被檢測到。該試驗(yàn)通常代表第一次施用抗CD40Mab，特別是給人施用ch5D12。但是，先前已經(jīng)在狨猴的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)中體內(nèi)獲得了Mab5D12生物活性的證據(jù)。疾病誘導(dǎo)后2-4周開始的5D12施用具有顯著的有益效果23。這種觀點(diǎn)的體內(nèi)證據(jù)促使了5D12的重組人源化和進(jìn)一步發(fā)展。還在狨猴EAE模型中評價(jià)了ch5D12的生物活性。在MOG免疫后第50天，安慰劑組的發(fā)病率是100%(50。/。的動物因?yàn)槠銭AE的嚴(yán)重性而被處死)，而在ch5D12治療組中沒有觀察到疾病跡象24。此外，在恒河猴腎移植模型25以及當(dāng)被用于免疫抑制策略以阻止抗腺病毒顆粒及其產(chǎn)物的免疫應(yīng)答吋26，ch5D12均顯示功能活性。對人和食蟹猴組織的組織交叉反應(yīng)研究顯示ch5D12與淋巴器官中B細(xì)胞和DC的細(xì)胞表面結(jié)合。在人或者食蟹猴組織中沒有觀察到意料之外的交叉反應(yīng)性。在食蟹猴中評價(jià)了ch5D12的安全性和耐受性，其中每周施用ch5D12共4周在全部猴中都顯示是安全的，沒有任何副作用。在本研究中，獲得功能性證據(jù)證明ch5D12能夠阻止B細(xì)胞活化和增殖27?？偟膩碚f，這些研究顯示拮抗性抗人CD40Mabch5D12沒有意料之外的交叉反應(yīng)性，是安全的，限制了食蟹猴的免疫反應(yīng)性，并且在狨猴中抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的典型慢性炎性疾病。因此，臨床前評估支持其進(jìn)一步發(fā)展以用于患者。已經(jīng)在動物模型中證實(shí)CD40-CD154(CD40L)共刺激途徑是治療自身免疫性疾病和移植排斥的有希望的臨床靶位15。有可能通過靶向CD40或者CD154來抑制CD40-CD154的相互作用。之前的所有研究都集中于拮抗CD154，CD154在活化的T細(xì)胞和血小板上選擇性表達(dá)"1。因?yàn)檠ㄋㄈ允录航?jīng)停止了利用抗人CD154Mab的人類臨床研究12"4。因?yàn)樵摽笴D154Mab被構(gòu)建為人源化的IgG,，其與Fc受體結(jié)合極其緊密，所以抗CD154Mab可以將CD154交聯(lián)至Fc受體，造成血塊形成。最近，CD40據(jù)報(bào)道在血小板上組成性表達(dá)，被認(rèn)為對利用可溶性CD154刺激血小板活化是功能上重要的。通過添加抗CD154或者抗CD40Mab可以終止這些造成血小板活化的刺激效應(yīng)42。我們還在人血小板實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了ch5D12的非刺激性特征，因?yàn)橄蚶脕喿罴褲舛鹊腁DP或者膠原預(yù)刺激的血小板中添加ch5D12對血小板的活化狀態(tài)沒有任何效果(M.F.Hoylaerts，未公開的觀37察，Leuven，Belgium)。此外，與IgG,骨架相比，ch5D12Mab骨架的IgG4Fc部分與血小板上表達(dá)的Fc受體的結(jié)合能力降低。所述兩種方法的另一區(qū)別還在于ch5D12耙向B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和DC，而抗CD154Mab主要靶向活化的T細(xì)胞，導(dǎo)致臨床策略顯著不同。在本研究接受治療的任何患者中都未觀察到血栓栓塞癥狀。ch5D12作用主要基于干擾CD40介導(dǎo)的細(xì)胞活化。CD40引發(fā)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和DC的細(xì)胞因子和趨化因子分泌，并增強(qiáng)DC的抗原遞呈能力。因?yàn)閏h5D12拮抗CD40受體，而TNF-a產(chǎn)生是通過CD40受體誘導(dǎo)的39，所以它還可以拮抗TNF-a分泌，而TNF-a無疑是克羅恩病中的一個(gè)重要細(xì)胞因子43。但是，許多其他炎性細(xì)胞因子如IL-8和IL-12"也通過CD40引發(fā)來誘導(dǎo)，因此除了阻止TNF-a產(chǎn)生外，ch5D12還具有抗炎性質(zhì)。不論觀察到的效果是否主要取決于減弱的T細(xì)胞活化或者細(xì)胞因子和趨化因子的釋放減少，都需要進(jìn)一步的研究。本ch5D12首次用于人類的研究顯示了有希望的臨床益處，并且沒有嚴(yán)重的副作用。為了確定ch5D12在維持癥狀緩解和安全監(jiān)測多次輸注中的作用及最佳給藥方案，還需要進(jìn)一步的臨床研究。顯然，拮抗CD40的治療益處不會僅限于克羅恩病，還可以潛在延伸至許多其他炎性病癥。實(shí)施例2材料和方法廣合腐游產(chǎn)生從5D12雜交瘤細(xì)胞系克隆小鼠5D12的可變區(qū)。簡單來說，利用Qiagen從裂解的細(xì)胞分離總RNA。通過RT-PCR利用寡核苷酸5'CAGGTSMARCTSSAGSAGTCWGG3'和5'GCATGTACTAGTAATTTTTVTTGTCCACYTTGGTGCT3'擴(kuò)增mu5D12的VH區(qū)，并利用寡核苷酸5'CGATACGASMTYCAGCTGACCCAGTCTCCA3'和5'GACTCATCTAGATACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG3'擴(kuò)增mu5D12的VL區(qū)。序列分析后確定V區(qū)的共有序列。隨后V區(qū)與編碼人IgG4和人kappa的基因組序列被再克隆到pcDNA3002(Marissenetal,J.ofVirol,2005:79:4672-4678)以構(gòu)建嵌合IgG4免疫球蛋白表達(dá)質(zhì)粒。5D"去棘腐游產(chǎn)生38與Biovation合作，利用他們擁有的Delmmunisation技術(shù)鑒定V區(qū)內(nèi)可能的T細(xì)胞表位。輔助T細(xì)胞表位包括蛋白內(nèi)具有結(jié)合MHCII型分子能力的短氨基酸序列。3k過移除T細(xì)胞表位，抗體將不再引發(fā)T細(xì)胞輔助以及針對所述抗體的后續(xù)免疫原性。利用PeptideThreading完成鑒定。PeptideThreading方法是一種基于計(jì)算機(jī)的方法，其基于X-射線結(jié)晶學(xué)獲得的已知結(jié)構(gòu)來預(yù)測肽(小氨基酸序列)與18種不同的人MHCII型分子的結(jié)合。此外進(jìn)行分析從V區(qū)尋找來自數(shù)據(jù)庫〖www,wehil.wehi.edu.au)的已知人T細(xì)胞結(jié)合肽的存在。根據(jù)一級鼠V區(qū)氨基酸序列，設(shè)計(jì)表面人源化(鑲嵌)的V區(qū)。在這些鑲嵌的VH序列內(nèi)鑒定出8個(gè)可能的T細(xì)胞表位，在鑲嵌的VL區(qū)內(nèi)鑒定出4個(gè)T細(xì)胞表位。通過氨基酸取代去除鑒定的T細(xì)胞表位。根據(jù)這個(gè)分析，合成編碼去免疫的VH和VL區(qū)的DNA序列并將其再克隆到pcDNA3002-hIgG4-kappa表達(dá)質(zhì)粒。敘誘變?yōu)榱嘶謴?fù)去免疫pcDNA3002表達(dá)質(zhì)粒VH區(qū)內(nèi)的鼠序列，按照制造商的方案使用Stratagene的QuickChangeSite-DirectedMutagenesisi式齊U盒。表4列出了使用的寡核苷酸。簡單來說，變性所述質(zhì)粒，然后退火包含所需突變的有義和反義引物。利用BiometmT梯度PCR儀循環(huán)(95。C30秒；55°C30秒；68°C600秒)16次，摻入誘變序列。利用只切割甲基化DNA的Dpnl消化未突變的親代質(zhì)粒。然后將包含突變質(zhì)粒的PCR混合物轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞。挑取菌落并通過DNA序列分析正確的質(zhì)粒。第二組實(shí)驗(yàn)集中于產(chǎn)生29和37位的其他變體，通過對結(jié)構(gòu)相關(guān)的V或者L特異取代I。按照上文描述的相似方式，利用表6所示的寡核苷酸產(chǎn)生質(zhì)粒。需要兩輪誘變產(chǎn)生雙突變(表7)。用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化XLl-blue感受態(tài)細(xì)胞。PER.C6頓表這各種形式的5D12只在PERX6TM(Cmcell)中瞬時(shí)表達(dá)。簡單來說，轉(zhuǎn)染前一天PER.C6TM被胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)。將細(xì)胞以每孔4xl()S細(xì)胞的密度鋪板于T24孔板的DMEM中，所述DMEM添加有10%FCS。第二天培養(yǎng)基被替換為0.5ml新鮮培養(yǎng)基。對于每孔將l嗎質(zhì)粒DNA稀釋到50jalOPTI-MEMI中，然后將其與包含3^1LipoFectAMINE2000(LF2000)試劑(Invitrogen)的等體積OPTI-MEMI混合。將混合物在室溫保溫20分鐘以便形成DNA-LF2000試劑復(fù)合物。隨后將DNA-LF2000試劑復(fù)合物(100pl)直接添加到各孔。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在37'C的C02培養(yǎng)箱中保溫。48h后分析上清的抗體表達(dá)。通過夾心ELISA測量表達(dá)抗體的量。簡單來說，96LEIA/RJA板(Coming3590)在4。C用多克隆抗體抗人IgG(Jackson109-005-088)包被o/n，所述抗體用PBS1/1000稀釋(100|111/孔)。用包含0.05%Tween和1%BSA的PBS圭寸閉后，板用PBS-0.05MTween洗滌3次。作為標(biāo)準(zhǔn)品，隨后滴定使用純化的嵌合5D12，從400ng/ml開始直至零，一式三孔。樣品(瞬時(shí)上清)同樣也用于滴定。所有稀釋均使用PBS-0.05%Tween。板在37"C保溫1小時(shí)。洗滌3次后，每孔添加1/5000稀釋的檢測抗體(抗人kappa堿性磷酸酶標(biāo)記的(SouthernBiotechAssociates2060-04))。板在37。C保溫1小時(shí)。除去保溫液后，將板洗滌5次。利用PNP底物(SigmaN-2765)(lmgPNP/ml底物緩沖液-100mMTris/HCl，100mMNaCl，5mMMgCl2.6H20pH9.5-)完成染色。利用655nm作為參照，在BioRad550Titertek上測量OD405nm。通過FACS分析對表達(dá)抗體的抗原特異性進(jìn)行分析。JY細(xì)胞是EBV轉(zhuǎn)化的人B細(xì)胞，其表達(dá)CD40。簡單來說，100000個(gè)JY細(xì)胞與100^1來自瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)的上清在4。C保溫20分鐘。為了去除未結(jié)合的抗體，用包含0.05%NaAzide和1%BSA的PBS洗滌細(xì)胞。使用1/100稀釋的FITC標(biāo)記的抗人IgG(Jackson109-095-127)作為二抗。在4'C保溫20分鐘后，洗滌細(xì)胞。最終在FACScan(BD)上測量細(xì)胞樣品。錢在分析數(shù)個(gè)克隆后，確定了鼠5D12的V區(qū)的共有序列(圖5)。通過人表面化(humansurfacing)重新設(shè)計(jì)V區(qū)，保留關(guān)鍵的鼠氨基酸。通過PeptideThreading方法和數(shù)據(jù)庫搜索確定這些重新設(shè)計(jì)的序列內(nèi)可能的40T細(xì)胞表位。在VH區(qū)內(nèi)鑒定出8個(gè)(可能表位的第一個(gè)堿基27、30、43、46、57、61、77和83位)可能的表位，在VL區(qū)內(nèi)鑒定出4個(gè)(7、13、28和86位)可能的表位。根據(jù)T細(xì)胞表位作圖和鑲嵌方法確定最佳的去免疫VH和VL氨基酸序列(圖6)。為了去除VH區(qū)61位的T細(xì)胞表位，需要特別注意不能引入潛在的N糖基化位點(diǎn)(N-X-T/S):NSA被STS取代。在這種最終設(shè)計(jì)中VH區(qū)的12個(gè)位置被改變(計(jì)數(shù)60-62位作為l個(gè)變化)。對于VL區(qū)來說，8個(gè)位置被改變。通過對完全去免疫5D12(DI5D12)和ch5D12(重命名為PG100)的表達(dá)水平進(jìn)行比較的初步實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)由于引入的突變，DI5D12的表達(dá)水平低于其親代序列(數(shù)據(jù)未顯示)。理論上每種取代均能影響表達(dá)抗體的特征。因此為了研究VH區(qū)各個(gè)位置變化對抗體特征的影響，設(shè)計(jì)了其他12個(gè)變體(圖7)。在每個(gè)變體中，第1位被恢復(fù)到初始的鼠氨基酸序列。為了檢測不同形式的表達(dá)水平和功能性，構(gòu)建14種pcDNA3002表達(dá)質(zhì)粒。每種質(zhì)粒包含人IgG4骨架(VH區(qū)與其連接)和人kappa區(qū)(VL區(qū)與其連接)。一種質(zhì)粒編碼ch5D12，其中使用鼠V區(qū)。其他13種質(zhì)粒是去免疫形式，其中去免疫VL區(qū)與去免疫VH區(qū)或者圖7所示的12種VH變體之一聯(lián)用。隨后利用LipoFectamine2000用所述14種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PER.C6細(xì)胞。還包括陰性模擬轉(zhuǎn)染(無質(zhì)粒)。48小時(shí)后收集各個(gè)轉(zhuǎn)染的瞬時(shí)上清，并分析抗體表達(dá)。圖8顯示FACS數(shù)據(jù)。顯然所有被檢測的構(gòu)建體均結(jié)合JY細(xì)胞，表明5D12的CD40結(jié)合特異性被保留。此外FACS數(shù)據(jù)表明生成的抗體水平是不同的。DI5D12和ch5D12(PG100)的表達(dá)水平顯然存在差異。變體Q5E,K13A，E16Q，T17S，STS60NSA和T68S顯示與DI5D12相同的表達(dá)特征。其他變體看起來增加了表達(dá)水平。為了精確確定不同的表達(dá)水平，通過測量抗體水平的定量ELISA來分析全部上清。如表5所示，可以將被檢測的變體分成3組表達(dá)水平?jīng)]有或者提高較低(Q5E、K13A、E16Q、T17S和STS60NSA)，與ch5D12(PG100)相比變體P45L、M48L、S79F和T108S恢復(fù)到至多40%的表達(dá)水平，而I29L和I37V變體恢復(fù)到超過50。/。的水平。尤其是第29位的取代(I到L)看起來對表達(dá)水平有較大的影響。I29L變體隨后被重新命名為PG102抗體。以下觀察結(jié)果(即29位(I到L)和37位(I到V)的取代均對表達(dá)水平有較大影響)是出乎意料的，因?yàn)榘被酙、L和V在結(jié)構(gòu)上密切相關(guān)，并且這3種氨基酸共同組成一組支鏈氨基酸。在后續(xù)研究中還進(jìn)一步確認(rèn)了用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸V或者L對29和37位氨基酸I的組合取代的效果。圖9顯示參照ch5D12(PGIOO)、DI5D12和PG102(I29L變體)設(shè)計(jì)的V-L-I變體。為了檢測V-L-I變體的表達(dá)水平和功能性，如上所述構(gòu)建其他pcDNA3002表達(dá)質(zhì)粒，其包含人IgG4骨架(所述變體之一的VH區(qū)與其連接)和人kappa區(qū)(VL區(qū)與其連接)。隨后利用LipoFectamine2000用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染？￡11(6，細(xì)胞。48小時(shí)后收集各個(gè)轉(zhuǎn)染的瞬時(shí)上清并分析抗體表達(dá)。為了精確確定不同的表達(dá)水平，通過測量抗體水平的定量ELISA來分析全部上清。如表8所示，第29和37位上V、L或者I的不同組合與變化的生成水平有關(guān)。這進(jìn)一步證明最終不僅僅是全部的V、L和I取代導(dǎo)致更高的生成水平。,y論通過降低治療抗體的免疫原性可以改變其特征。該研究證明去免疫設(shè)計(jì)使抗體仍具有與其抗原結(jié)合的能力，但是抗體只能以低水平產(chǎn)生。表達(dá)時(shí)最有可能存在的問題就是去免疫VH和VL區(qū)的組裝。通過將每個(gè)取代位置改回到VH區(qū)內(nèi)的初始鼠序列，顯示一些位置對于抗體的正確表達(dá)是必需的。尤其是基于peptidethreading方法的位點(diǎn)對表達(dá)水平有很大的影響。所有基于鑲嵌引入的N端變化幾乎沒有影響。值得注意的是29位的L取代I具有最大影響，這是出乎意料的，因?yàn)檫@兩種氨基酸結(jié)構(gòu)上密切相關(guān)。I29L變體隨后被重新命名為PG102抗體。后續(xù)研究顯示29和37位上V、L或者I的不同組合導(dǎo)致生成水平的變化，證明盡管這3種支鏈氨基酸V、L和I結(jié)構(gòu)上密切相關(guān)，但對29和37位上這些氨基酸任一種的取代對完整抗體的生成水平均有影響。實(shí)施例3材料和方法Mf產(chǎn)生尸G川2(72處變沐J游GS-OfO潘應(yīng)系游溝建、廢透,生長。LonzaBiologies(Lonza)在PanGeneticsBV的要求下完成GS-CHO細(xì)胞系的構(gòu)建、選擇和評估，所述細(xì)胞系表達(dá)人重組IgG4/kappa抗體PG102(U9L變體)。利用Lonza的谷氨酰胺合成酶(GS)基因表達(dá)系統(tǒng)(WO2003054172)通過用產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)染CHOK1SV宿主細(xì)胞來構(gòu)建細(xì)胞系。基因序列由PanGenetics提供。細(xì)胞系CH0K1SV是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系CH0K1的懸浮變體，其適應(yīng)化學(xué)限定的、無動物成分的(CDACF)培養(yǎng)基(Bebbingtonetal(1192)Biotechnology10:169-75;delaCmzEdmondsMCetal(2006)Mol.Biotechnol.34:179-90)。所有試劑、培養(yǎng)基組分和材料均購自鑒定合格的供應(yīng)商。補(bǔ)料SF40和SF41制劑，培養(yǎng)基CM42和培養(yǎng)基補(bǔ)充劑SPE購自Lonza。使用培養(yǎng)基CD-CHO(Invitrogen)時(shí)還添加選擇劑L-甲硫氨酸砜亞胺(MSX)用于CDACF適應(yīng)細(xì)胞系的常規(guī)亞培養(yǎng)以及添加酚紅用于轉(zhuǎn)染。選擇劑MSX由Sigma提供。這些培養(yǎng)基和補(bǔ)料不含抗生素。還在Lonza構(gòu)建了編碼PG102基因的GS表達(dá)載體。從Lonza低溫保存的工作細(xì)胞庫269-W的小瓶獲得CHOK1SV宿主細(xì)胞。潘應(yīng)線濃度,赫絲通過快速升溫至37。C并稀釋到大約50mL的生長培養(yǎng)基從低溫保存的儲存液小瓶中復(fù)蘇細(xì)胞。通過離心細(xì)胞去除冷凍保護(hù)劑，丟棄上清，將細(xì)胞重懸浮于新鮮的生長培養(yǎng)基。對于靜止培養(yǎng)，細(xì)胞在T25燒瓶中生長，培養(yǎng)體積為5-15mL。將這些靜止培養(yǎng)物置于35.5-37.(TC的培養(yǎng)箱中，所述培養(yǎng)箱含10%v/vC02的空氣。對于懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)物在合適體積的生長培養(yǎng)基中擴(kuò)增，每4天亞培養(yǎng)以便在CDACF培養(yǎng)基中生長。使用的容器是125mL搖瓶(10-30mL的培養(yǎng)體積)，250mL搖瓶(30-50mL的培養(yǎng)體積)，500mL搖瓶(50-100mL的培養(yǎng)體積)，1L滾瓶(100-200mL的培養(yǎng)體積)，或者2L滾瓶(200-400mL的培養(yǎng)體積)。每個(gè)培養(yǎng)物的頂部空間充有5n/。v/vC02的空氣，密封燒瓶。然后將培養(yǎng)物在35.5-37.(TC的振動平臺上按照140士5rpm旋轉(zhuǎn)保溫。43通過無菌提取培養(yǎng)樣品，用臺盼藍(lán)染色非活細(xì)胞并用改進(jìn)的Fuchs-Rosenthal血球計(jì)顯微鏡檢查，獲得總細(xì)胞濃度和活細(xì)胞濃度。當(dāng)適當(dāng)時(shí)，計(jì)數(shù)前先稀釋樣品。此外，利用CASY-1顆粒計(jì)數(shù)器或者Vi-CELLXR自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器測量總細(xì)胞濃度和活細(xì)胞濃度。對于CASY-1計(jì)數(shù)器，從每個(gè)燒瓶無菌提取培養(yǎng)樣品，用Casyton緩沖液稀釋，測定活細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)。通過大小區(qū)分活細(xì)胞和非活細(xì)胞。將活細(xì)胞對總細(xì)胞的比例乘以100計(jì)算出百分比存活性。對于Vi-CELLXR計(jì)數(shù)器，無菌提取0.7mL細(xì)胞培養(yǎng)物，并進(jìn)行自動化的臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)。利用一系列相片和計(jì)算機(jī)分析算法鑒定和計(jì)數(shù)活細(xì)胞和非活細(xì)胞。對于所有的計(jì)數(shù)法，將活細(xì)胞對總細(xì)胞的比例乘以100計(jì)算出百分比存活性。駐潘扁絲在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，離心收集在非選擇性培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞，并將其以1.43xl(^個(gè)活細(xì)胞/mL的濃度重懸。對于每次轉(zhuǎn)染，向電穿孔杯中添加大約0.7mL細(xì)胞懸液和4(Vg質(zhì)粒DNA。然后將電穿孔杯放入電穿孔裝置，輸送300V、900pF的單脈沖。電穿孔后，禾l」用培養(yǎng)基CD-CHO/酚紅將杯中的細(xì)胞按照大約每孔5000個(gè)宿主細(xì)胞分配到96孔板。將所述板在35.5-37.0。C置于10%v/v032的空氣中保溫。轉(zhuǎn)染次日，每孔添加150pL選擇性培養(yǎng)基CD-CHO/酚紅/66.6pMMSX。每孔MSX的終濃度是50pM。對板進(jìn)行監(jiān)控以確定何時(shí)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡，只留下轉(zhuǎn)染細(xì)胞的聚集。在轉(zhuǎn)染后大約3-4周轉(zhuǎn)染細(xì)胞的聚集變得明顯。所有被檢測和處理的轉(zhuǎn)染子進(jìn)一步來自于通過目測確定只包含單個(gè)集落的孔。靜i/:靜德應(yīng)殿成鮮定轉(zhuǎn)染后將96孔板保溫大約3-4周以允許集落形成。在顯微鏡下檢測集落以證實(shí)它們具有合適的大小(覆蓋孔底部超過60%)，并且每孔中只存在一個(gè)集落。然后利用Lonza對于組裝抗體的ELISA分析按照"組裝ELISA"的描述分析培養(yǎng)上清的抗體生成。在取樣時(shí)測定孔的百分比鋪滿率(confluence)。禾擁分析結(jié)果除以百分比鋪滿率得到的值對細(xì)胞系排序。將高級別細(xì)胞系的培養(yǎng)物在24孔板的培養(yǎng)基CD-CHO/酚紅/25)iMMSX中擴(kuò)增，讓其達(dá)到鋪滿。達(dá)到鋪滿時(shí)，將該培養(yǎng)物接種于T25燒瓶中的培養(yǎng)基CD-CHO/酚紅/25pMMSX，而向剩余培養(yǎng)物中再補(bǔ)料新鮮的CD-CHO/酚紅/25(iMMSX，并繼續(xù)保溫14天。在該時(shí)間點(diǎn)，從24孔板收集培養(yǎng)上清，并利用Lonza的用于組裝抗體的ELISA分析測定抗體濃度。選擇最高產(chǎn)的細(xì)胞系。當(dāng)在T25燒瓶中達(dá)到鋪滿時(shí)，允許選擇的細(xì)胞系生長到多層，然后再補(bǔ)料CD-CHO/25pMMSX。在補(bǔ)料后，將培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱再放置4-7天，直到培養(yǎng)基再次變成橙色/黃色，從燒瓶移取細(xì)胞。謝應(yīng)系f譜為CA4CF,懸浮錄養(yǎng)激從鋪滿的T25燒瓶培養(yǎng)物開始懸浮培養(yǎng)。按照0.05-0.2xl(^個(gè)活細(xì)胞/mL的濃度將懸浮培養(yǎng)物接種到包含CD-CHO/25MSX培養(yǎng)基的125mL搖瓶中。最多14天之后如果T25燒瓶中的活細(xì)胞濃度仍達(dá)不到0.05xl(^個(gè)活細(xì)胞/mL，則自動將15mL各培養(yǎng)物加入125mL搖瓶中的15mLCD-CHO/25pMMSX中。然后按照0.2xl()s個(gè)活細(xì)胞/mL的接種濃度，以4天亞培養(yǎng)方式，將所述細(xì)胞系在新鮮的CD-CHO/25|liMMSX培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)亞培養(yǎng)，直到獲得可接受和可重復(fù)的生長特征。著浮潛蕎^潘應(yīng)系f長,主產(chǎn)力游伊定補(bǔ)料分批搖瓶培養(yǎng)利用CM42/4xSPE培養(yǎng)基，在500mL搖瓶中用100mL細(xì)胞懸液制備每個(gè)被選細(xì)胞系的單一培養(yǎng)物。按照0.2x106個(gè)活細(xì)胞/mL的濃度接種培養(yǎng)物，各培養(yǎng)物的頂部空間用5%v/vC02的空氣平衡。將培養(yǎng)物在35.5-37.CTC140士5rpm轉(zhuǎn)動的振動平臺上保溫，直到后峰活細(xì)胞濃度小于或等于0.6x106個(gè)活細(xì)胞/mL或者達(dá)到15天('生長過度')。在該時(shí)間點(diǎn)收集培養(yǎng)物。每日用Vi-CELL自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定細(xì)胞濃度。在細(xì)胞濃度為1.4-2.2><106個(gè)活細(xì)胞/mL時(shí)，一次性加入營養(yǎng)補(bǔ)料SF40。在初次添加后大約24、48和72小時(shí)繼續(xù)進(jìn)行一次性添加。一旦細(xì)胞濃度大于4.0xl(^個(gè)活細(xì)胞/mL時(shí)，使用第二補(bǔ)料(SF41)。按照合適間隔提取培養(yǎng)物樣品，離心，將上清保存于-20土5。C直到通過A蛋白HPLC分析抗體濃度。在-20士5。C保存從各生長過度的培養(yǎng)物收集的上清。還評估了IO個(gè)抗體濃度最高的生長過度培養(yǎng)物產(chǎn)45生的抗體量。在A蛋白純化以及通過還原和非還原性十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的抗體特征鑒定和等電聚焦(正F)分析以及基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDITOF-MS)寡糖分析前利用凝膠滲透高效液相層析(GP-HPLC)方法評價(jià)了樣品的聚集水平。爍溫保存在整個(gè)工作計(jì)劃中在關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)低溫保存細(xì)胞。通過離心回收生長培養(yǎng)物中的細(xì)胞并重懸于低溫保存混合物中。所述混合物包括合適的生長培養(yǎng)基(92.5%v/v)和二甲基亞砜(7.5。/。v/v)。然后將等份細(xì)胞分裝到標(biāo)記的小瓶，每等份包含大約1.5mL低溫保存培養(yǎng)基和大約0.5-1.5xl(f個(gè)活細(xì)胞。然后小瓶在自動可編程細(xì)胞冷凍機(jī)中冷凍，隨后轉(zhuǎn)移到液氮冷藏庫。對于每個(gè)被選細(xì)胞系，在培養(yǎng)物傳代到懸浮液的時(shí)候細(xì)胞的世代數(shù)被定義為零。隨后利用來自下列等式的步驟計(jì)算每次亞培養(yǎng)的世代數(shù)(向下舍入最接近的0.5代)。其中Ny-在時(shí)間/的世代數(shù)Nf=在時(shí)間Z的世代數(shù)X/=在時(shí)間/的活細(xì)胞濃度(細(xì)胞/mL)X/=在時(shí)間/的活細(xì)胞濃度(細(xì)胞/mL)并且/>z'微分橋根據(jù)相鄰細(xì)胞濃度值之間區(qū)域(近似直角梯形)的面積總和來計(jì)算生長曲線下區(qū)域的時(shí)間積分(活細(xì)胞濃度的時(shí)間積分(IVC);109細(xì)胞.11/10。通過將兩種活細(xì)胞濃度的平均值(細(xì)胞/mL)乘以兩次測定之間的經(jīng)過時(shí)間(h)計(jì)算該區(qū)域。該方法基于Renard等(1988)在BiotechnologyLetters10(2)91-96頁的描述。趁微46當(dāng)合適的時(shí)候，通過抗體濃度(mg/L)對活細(xì)胞濃度時(shí)間積分的線性回歸分析計(jì)算總的特異性生成速率(總qp:mg/10S細(xì)胞/h)。該線的斜率等于總qP。用收獲抗體濃度除以收獲時(shí)IVC值計(jì)算收獲特異性生成速率(收獲qP)。利用測量組裝人IgG的ELISA測定上清樣品的抗體濃度。這涉及在包被山羊抗人IgGFc的96孔板上捕獲樣品中的組裝抗體和標(biāo)準(zhǔn)品。利用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗人輕鏈和顯色底物四甲基聯(lián)苯胺顯示結(jié)合的抗體。顯色程度與樣品中存在的抗體質(zhì)量成正比。利用IgG標(biāo)準(zhǔn)品(批號L07387/5/2)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定濃度。利用Agilent1100HPLC上的A蛋白高效液相層析(HPLC)定量產(chǎn)物濃度。抗體選擇性結(jié)合POROSA蛋白免疫檢測柱。從柱上洗脫未結(jié)合的材料并通過降低溶劑pH釋放殘留的結(jié)合抗體。利用多波長檢測器通過2S0nm的吸光度監(jiān)控洗脫。根據(jù)抗體標(biāo)準(zhǔn)品(LotL07385/4/10)定量抗體(利用Chemstation軟件)并利用^!1=1.52的消光系數(shù)校正。^節(jié)襲辦靴帝lj備GravityfedrmpProteinASepharose柱(5mL)。柱在使用前用6M鹽酸胍洗滌并用50mM甘氨酸/甘氨酸鹽-250mMNaCl緩沖液pH8.0平衡。在添加到柱之前，將柱負(fù)載材料的pH調(diào)節(jié)為pH8.0i0.1。rmpA蛋白親和柱用平衡緩沖液洗滌，用0.1M甘氨酸緩沖液pH3.5洗脫。柱洗脫液用的2MTrisBase中和至大約pH7.0，并在Dulbecco's磷酸鹽緩沖液中透析以用于IEF和SDSPAGE分析。^蒼力菜,錄眾宛銀游5Z^i^(^分析通過A蛋白純化制備用于分析的細(xì)胞培養(yǎng)樣品。利用4-20%的預(yù)制Novex聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。對于還原性SDSPAGE,樣品用2-巰基乙醇還原并用pH8.0的SDS變性。在樣品上樣到凝膠(每條泳道IO昭)前，將樣品加熱2.0士0.5分鐘。利用相同的凝膠和Novex非還原性樣品緩沖液(不47添加2-巰基乙醇)進(jìn)行非還原性SDSPAGE。在樣品上樣到凝膠(每條泳道4昭)前，將樣品加熱1.0士0.5分鐘的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間。電泳后，用考馬斯亮藍(lán)R250染色75分鐘并用甲醇/乙酸脫色來顯影蛋白?！煌?^親浙錄眾貧體游/EF分析通過A蛋白純化制備用于分析的細(xì)胞培養(yǎng)樣品。禾擁預(yù)制瓊脂糖IEF凝膠,pH3-pH10進(jìn)行IEF分析。按照每條泳道大約10叱蛋白樣品上樣凝膠，然后預(yù)聚焦70Vh。在去除樣品添加條后，電泳繼續(xù)1500Vh(每;t央凝膠1500V，20mA，25W)。在三氯乙酸磺基水楊酸甲醇溶液中固定IEF凝膠，然后用考馬斯亮藍(lán)R250(考馬斯藍(lán)批號染色003/L11905/118和003/Ll1905/131)。然后脫色并干燥凝膠(脫色液批號003/L11905/117禾d003/L11905/121)。GP-HPLC方法根據(jù)蛋白組分的大小迸行分離。大的組分如蛋白聚集物因?yàn)樘蟛荒芤匀魏纬潭葷B入基質(zhì)顆粒，所以在更小的組分如蛋白單體前從柱被洗脫。更小的組分如片段更容易滲入基質(zhì)，所以在單體后被洗脫。因此使用該技術(shù)從聚集物和片段分離抗體單體。通過相對于校準(zhǔn)標(biāo)記的特征性保留時(shí)間和位置鑒定單體組分。注射未稀釋的樣品以上樣50-250叱，其中產(chǎn)物濃度是1-5mg/mL(Lonza分析的確認(rèn)荷載范圍)。GF-250柱的分子量范圍是4-400kDa。在280nm檢測樣品組分，并利用AgilentChemstation軟件分析色譜峰。利用聚集物的垂線法和片段的切線斜滑(tangentskim)進(jìn)行積分。通過計(jì)算相對于總積分峰面積的各組分的峰面積確定樣品組分的比例。利用組合了延時(shí)引出(delayedextraction)的MicromassMALDI-LR通過MALDITOF-MS對各細(xì)胞系產(chǎn)生的PG102抗體進(jìn)行寡糖分析。用陽離子模式在反射式配置(reflectronconfiguration)中進(jìn)行MALDITOF-MS。利用混合的N-聚糖標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)設(shè)備。利用POROSA蛋白柱從收獲上清純化抗體。收集純化級分，利用二硫蘇糖醇還原二硫鍵，然后利用碘醋酸鹽垸基化還原的硫醇。利用N-聚糖酶(PNGaseF)釋放寡糖，然后將其置于耙板上兩層超二羥基苯甲酸(super-dihydroxybenzoicadd,super-DHB)基質(zhì)之間用于MALDITOF-MS分析。碧菜C7/(9超F(xiàn)敘智應(yīng)游絲PG102基因序列被Lonza用來構(gòu)建雙基因載體pPG102/DGV(未顯示)，該載體用于通過電穿孔轉(zhuǎn)染CHOKlSV宿主細(xì)胞系。利用載體pPG102/DGV進(jìn)行6組轉(zhuǎn)染，在96孔板中通過組裝ELISA篩選255個(gè)轉(zhuǎn)染子上清的抗體生成。99.6%被篩選的轉(zhuǎn)染子產(chǎn)生可檢測的抗體水平。選擇43個(gè)高等級轉(zhuǎn)染子在24孔板中進(jìn)一步評估。艦線激,微著凝應(yīng)首先在24孔板上擴(kuò)增選擇的GS-CHO細(xì)胞系培養(yǎng)物，然后將其在T25靜止燒瓶中擴(kuò)增。24孔板中剩余的細(xì)胞被飼喂新鮮培養(yǎng)基并在評價(jià)抗體生產(chǎn)力前"生長過度"。選擇的細(xì)胞系顯示抗體濃度范圍為8.3-120mg/L(圖10)。通過組裝ELISA確定的產(chǎn)物濃度最高的23個(gè)細(xì)胞系培養(yǎng)物被選擇用于進(jìn)一歩評估。將選擇的培養(yǎng)物加入CDACF培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。所有細(xì)胞系都成功地適應(yīng)懸浮培養(yǎng)并選擇用于在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中進(jìn)一步評估。遂雍游潘應(yīng)系^^辨分欲潔嚴(yán)潛泰^主長浙生產(chǎn)力錄C^伊仿在補(bǔ)料分批搖瓶培養(yǎng)中評估23個(gè)被選細(xì)胞系的生長和生產(chǎn)力特征。準(zhǔn)備每個(gè)細(xì)胞系的單一培養(yǎng)物。當(dāng)活細(xì)胞濃度符合補(bǔ)料標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，向培養(yǎng)物中添加兩種補(bǔ)料SF40和SF41。用于補(bǔ)料方式的方案在技術(shù)上盡可能模仿Lonza的通用GS-CHO發(fā)酵方法。23個(gè)被選細(xì)胞系的生長和生產(chǎn)力數(shù)據(jù)示于表9。補(bǔ)料分批搖瓶培養(yǎng)物的收獲上清的A蛋白HPLC分析顯示4種細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體濃度大于1000mg/L。細(xì)胞系L107產(chǎn)生最高的抗體濃度，1674mg/L。49凝遂師一微鄉(xiāng)辦粉浙微赫激箱微貧鄉(xiāng)救在分析前，利用rmpA蛋白瓊脂糖凝膠層析純化具有最高抗體濃度的10個(gè)細(xì)胞系的收獲樣品。然后利用SDSPAGE和IEF分析A蛋白純化抗體。非還原性條件下通過SDSPAGE對A蛋白純化樣品的目視分析顯示所有樣品都是彼此相似的，在大約200kDa處顯示完整的抗體條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。還觀察到其他少量條帶，盡管它們不全都在凝膠圖像上可見。還觀察到分子量在U6-200kDa之間的3個(gè)條帶，分子量在66-97kDa之間的1個(gè)條帶，分子量在37-55kDa之間的1個(gè)條帶和分子量在22-31kDa之間的兩個(gè)條帶。觀察到的66-97kDa之間的額外條帶是非還原條件下IgG4抗體典型的半抗體。IgG4批間分析對照(interassaycontrol,IAC)中也觀察到相同的半抗體。還原條件下通過SDSPAGE分析的A蛋白純化樣品顯示也都是彼此相似的，在大約50kDa處顯示重鏈條帶，在大約25kDa處顯示輕鏈條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。IEF分析顯示來自被選細(xì)胞系的A蛋白純化抗體樣品的完整性顯示類似的譜，除了L97、M92和M59以外的所有細(xì)胞系在pi范圍8.15-9.30均具有6個(gè)一級條帶(3個(gè)主要和3個(gè)次要條帶)。這三個(gè)細(xì)胞系顯示3個(gè)主要和2個(gè)次要條帶。在樣品J3和J4觀察到其他條帶，盡管這些不是在所有凝膠圖像上都可見。貧沐游寡粉橋通過MALDITOF-MS對選擇用于在補(bǔ)料分批搖瓶培養(yǎng)中進(jìn)一步評估的10個(gè)細(xì)胞系中各個(gè)產(chǎn)生的抗體進(jìn)行寡糖分析。從10個(gè)細(xì)胞系獲得的抗體的主要寡糖結(jié)構(gòu)是G0F和G1F，這是在抗體上觀察到的典型的N-聯(lián)寡糖結(jié)構(gòu)。在來自細(xì)胞系L52的抗體測得總聚糖的最高水平6.7。/。，而檢測到相對低水平的寡甘露糖結(jié)構(gòu)。在總聚糖范圍1.1-4.6%的所有樣品中均觀察到寡甘露糖-5(man-5)結(jié)構(gòu)。全部被分析的樣品都包含類似水平的寡糖和相對低濃度的man-5(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)通過GP-HPLC分析被選擇用于進(jìn)一步評估的10個(gè)細(xì)胞系中各個(gè)產(chǎn)生的抗體時(shí)，更低分子量組分(LMWC)是最不重要的，但優(yōu)選水平在25%以下。除顯示水平為27.1%的L52夕卜，所有樣品均顯示低于25%的水平(表10)。通常不會使用聚集比例的兩種不同計(jì)算，但當(dāng)樣品間LMWC水平變化很大時(shí)則認(rèn)為這是必需的。對數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析，排除LMWC而只關(guān)注于單體和較大的峰，顯示所有樣品的聚集峰面積小于2.2%(表ll)。低于5%的水平被認(rèn)為是可接受的。激應(yīng)系雌獰選擇3個(gè)細(xì)胞系用于制備接種前原種(pre-seedstock，PSS)。使用的選擇標(biāo)準(zhǔn)是組合高收獲抗體濃度、可接受生長特征以及可接受產(chǎn)物質(zhì)量特征。選擇細(xì)胞系L107作為前導(dǎo)細(xì)胞系，因?yàn)樗谠u估的23個(gè)細(xì)胞系中顯示最高的收獲抗體濃度，以及可接受生長和產(chǎn)物質(zhì)量特征(圖11A)。細(xì)胞系L25在評估的23個(gè)細(xì)胞系中顯示第二高的收獲抗體濃度，以及可接受生長和產(chǎn)物質(zhì)量特征(圖11B)。因此細(xì)胞系L25被選為第一備用細(xì)胞系。細(xì)胞系M95在評估的23個(gè)細(xì)胞系中顯示第三高的收獲抗體濃度，并具有可接受生長和產(chǎn)物質(zhì)量特征(圖11B)。因此細(xì)胞系M95被選為第二備用細(xì)胞系。辭M嚴(yán)柳爍溫保存對于3種被選細(xì)胞系的每一種都低溫保存接種前原種(每個(gè)原禾中20小瓶)。這些原種保存于氣相液氮冷藏庫中。細(xì)胞系L107、L25和M95分別被重命名為DC1、DC2和DC3。微LonzaBiologies(Lonza)被要求完成表達(dá)人重組IgG4/kappa抗體PG102的GS-CHO細(xì)胞系的構(gòu)建、選擇和評估。所述基因序列由PanGenetics提供，并利用Lonza谷氨酰胺合成酶(GS)基因表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生載體。通過電穿孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞系CHOKISV，其是已經(jīng)適51應(yīng)于化學(xué)限定的、無動物成分培養(yǎng)基的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系CHO-Kl的懸浮變體。通過CHOK1SV轉(zhuǎn)染獲得254個(gè)分泌抗體的細(xì)胞系。在24孔板中評估了43個(gè)細(xì)胞系的生長和生產(chǎn)力。獲得的抗體濃度高至120嗎/mL。在單一補(bǔ)料分批搖瓶培養(yǎng)物中評估23個(gè)細(xì)胞系。獲得的收獲抗體濃度范圍是121-1674(xg/mL。4個(gè)細(xì)胞系實(shí)現(xiàn)收獲抗體濃度超過1000mg/L。選擇抗體濃度最高的IO個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行產(chǎn)物質(zhì)量分析。通過還原和非還原十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦分析顯示來自各個(gè)被選細(xì)胞系的純化抗體的產(chǎn)物質(zhì)量是彼此相當(dāng)?shù)?。對來自IO個(gè)被選細(xì)胞系中各個(gè)的純化抗體的寡糖分析顯示相對低(<4.6%)水平的寡甘露糖-5。GP-HPLC分析顯示前3個(gè)細(xì)胞系的聚集物水平都低于1%。選擇3個(gè)細(xì)胞系(U07、L25和M95)根據(jù)生長、生產(chǎn)力和產(chǎn)物質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步評估。每個(gè)細(xì)胞系低溫保存20小瓶的接種前原種。這3個(gè)細(xì)胞系分別被重命名為DC1、DC2和DC3。實(shí)施例4遭過表^^庸^^嚴(yán)(S&cor^^/定c/^Z)"(G7W尸G702(72處變鄰與乂CDW-Fc舒^游動力學(xué)材料和方法利用Biacore3000設(shè)備，在25.0。C恒溫下通過表面等離子共振比較ch5D12(PG100)和PG102(I29L變體)與人CD40結(jié)合的動力學(xué)。在這些實(shí)驗(yàn)中與IgGl-Fc結(jié)構(gòu)域(huCD40-Fc;R&DSystems目錄號149-CD-50)融合的重組人CD40胞外結(jié)構(gòu)域被用作靶抗原。HuCD40-Fc(l|Lig/mL于10mM乙酸鹽緩沖液，pH5.0)通過Lys殘基的胺基與碳二亞胺活化的BiacoreCM5芯片偶聯(lián)，產(chǎn)生127.4RU的抗原固定水平。為了動力學(xué)分析，在BiacoreRunningBuffer(包含EDTA和表面活性劑的HEPES緩沖鹽水；HBS-EP)中制備系列稀釋的ch5D12(PG100)和PG102(10.0昭/mL-0.313呢/mL)。以30pL/分鐘的流速進(jìn)行動力學(xué)分析。樣品以相同流速結(jié)合4分鐘，解離5分鐘。然后利用30mMNaOH再生芯片表面30秒，在注射下一樣品前在HBS-EP中重建基準(zhǔn)2.5分鐘。交替注射PG102和ch5D12(PG100)的樣品，52對第一組重復(fù)試驗(yàn)在每個(gè)稀釋度增加濃度，然后對第二組重復(fù)試驗(yàn)降低濃度。使用BIAcore控制軟件(Version3.2)收集數(shù)據(jù)，使用BIAevaluation軟件(Version4.1)分析動力學(xué)數(shù)據(jù)。利用兩種不同的分子相互作用模型二價(jià)分析物模型和朗繆爾1:1結(jié)合模型計(jì)算結(jié)合參數(shù)。鄉(xiāng)觀察到的結(jié)合ch5D12(PG100)和PG102抗體的最高水平分別是152.5RU和140.2RU。對于這兩種抗體來說，根據(jù)朗繆爾和二價(jià)結(jié)合模型計(jì)算出的動力學(xué)速率常數(shù)(分別是ka和kd，或者kal和kdl)稍有不同。盡管這兩種抗體的總親和力(KD)在模型內(nèi)差異不大，但PG102比ch5D12(PG100)顯示更快的結(jié)合和離解速率(圖12)。來自這些實(shí)驗(yàn)的動力學(xué)參數(shù)概述如下朗繆爾(l:l)模型ch5D12(PG100)ka1.88xlo6;ivrV1kd5,07xl(xV1PG1022,51x106MV5.96xIO陽VKD2.71xlO"。M2.37x1(T10M二價(jià)結(jié)合(1:2)模型ch5D12(PG100)kal6.41xl()5]VrV1kdl1.60xl(rV1ka21.21xl(T3RUs-1kd22.55xl(T3s-1PG1027.82x1oS]yrV12.47xif)-3s"1.31xl(T3RUs"2.24x10-3s陽1KD5.29xlO'9M■41xio.9M對這兩種方法的擬合優(yōu)度分析表明二價(jià)結(jié)合模型描述的數(shù)據(jù)更好。這兩種抗體變體在兩種模型中計(jì)算出的親和力不同，但是各個(gè)抗體利用相同模型獲得的解離常數(shù)(KD)的估算值是相當(dāng)?shù)睦美士姞柲Ｐ蚦h5D12(PG100)和PG102分別是2.71xl(T1DM和2.37x10"°M;利用二價(jià)分析物模型分別是5.25xl0—9M和5.41xl0—9M。實(shí)施例5教帝貧教獰M貧體,劍c/z5D〃(PG7(9"浙戶G7W錄合JT潘應(yīng)為了證明PG102(I29L變體)和其親代分子ch5D12(PG100)結(jié)合相同的CD40表位，使用抗獨(dú)特型抗體抑制PG102或者ch5D12與表達(dá)CD40的JY細(xì)胞的結(jié)合，通過FACS測量。材料和方法室溫下用5%人血清封閉表達(dá)人CD40的JY細(xì)胞30分鐘。將不同濃度(0-10嗎/mL)的鼠mAb5D12(克隆173-36-1)的抗獨(dú)特型抗體與ch5D12(PG100)(l)ag/mL)、PG102(lng/mL)或者陰性對照嵌合抗huCD86抗體(chFUN-l;l嗎/mL)在50jiL/管的總體積中預(yù)保溫，并保溫15分鐘。用FACS緩沖液(lxPBS，1%BSA和0.05%疊氮化鈉)洗滌JY細(xì)胞，丟棄上清。將JY細(xì)胞以2xl(^個(gè)細(xì)胞/mL的濃度重懸于FACS緩沖液。向預(yù)保溫抗體混合物中添加50pL的JY細(xì)胞懸液，得到100pL/管的終體積。細(xì)胞在4"C保溫30分鐘，然后用4mlFACS緩沖液/管洗滌，丟棄上清。將細(xì)胞沉淀重懸于用FACS緩沖液(1:100)稀釋的IOOiliL山羊抗人IgG-FITC(JacksonImmimoresearchLabs.Cat.No.109-095-127)，并在4。C保溫30分鐘。然后用4mlFACS緩沖液洗滌細(xì)胞，丟棄上清。將沉淀重懸于200pLFACS緩沖液，利用FACScan流式細(xì)胞儀(BectonDickinson)測量結(jié)合的抗體。錢抗獨(dú)特型mAb173-36-1以濃度依賴方式抑制PG102和ch5D12(PG100)結(jié)合JY細(xì)胞上表達(dá)的huCD40(圖13)。chFUN-1與也在JY細(xì)胞上表達(dá)的CD86的結(jié)合不受mAb173-36-1的影響。抗獨(dú)特型mAb173-36-1對CD40特異性抗體與JY細(xì)胞上CD40結(jié)合的封閉作用不存在顯著差異。例如，計(jì)算出的mAb173-3-1介導(dǎo)的ch5D12(PG100)(第1批)和PG102(第2批)的抑制的logIC50值分別是-5.74±0.14和-5.76±0.1l(p>0.05;n=4)。這些值對應(yīng)于大約1.8pg/mL(12nM)的抗獨(dú)特型濃度。表12顯示計(jì)算出的抗獨(dú)特54型介導(dǎo)的ch5D12(PG100)和PG102結(jié)合JY細(xì)胞的抑制的-loglC50值的總結(jié)。實(shí)施例6遞過五ZZS^,/定c/z5Z)/2(^G7W」/〃PG7W與CD-WFc游禁合材料和方法用100)iL/孔的huCD40-muIg(Ance11，目錄號504-020)包被ELISA板(CostarEIA/RIA板，Coming目錄號3590)并在4°C的潮濕環(huán)境中保溫過夜，其中huCD40-mulg用PBS稀釋到250ng/mL。用200pL/孔的洗滌緩沖液(0.05%Tween-20于PBS)將板洗滌3次。隨后，用200^!7孔的封閉緩沖液(5%BSAFractionV[Roche，目錄號735094]于洗滌緩沖液)封閉板，在37°C(潮濕環(huán)境)保溫1小時(shí)。用洗滌緩沖液洗板3次。用封閉緩沖液將檢測抗體(ch5D12(PGIOO)，PG102和陰性對照嵌合抗huCD86抗體chFUN-l)稀釋到0-1200ng/mL，并將其轉(zhuǎn)移到分析板，終體積為100nL/L，然后在37°C(潮濕環(huán)境)保溫l小時(shí)。用洗滌緩沖液洗板3次，然后添加100^1/孔的山羊抗人kappa-AP檢測抗體(SouthernBiotechAssociates目錄號2060-0)，所述抗體用封閉緩沖液1:1000稀釋。將板在37'C的潮濕環(huán)境保溫1小時(shí)，然后用洗滌緩沖液洗滌3次，再用PBS洗滌一次。向15mLPNP底物緩沖液(12.1gTris,5,84gNaCl,1.02gMgCl2.6H20于1LH20(用HC1調(diào)節(jié)至pH9.6))中添加1片對硝基苯基磷酸鹽片劑(Sigma，目錄號N-2765)制備PNP底物。按照100nL/孔向分析板添加PNP底物。在添加3MNaOH終止反應(yīng)前，將板在37。C保溫?cái)?shù)分鐘(最多30分鐘)以便顯色。利用微板讀數(shù)器(Biorad，model550)在405nm測定顏色強(qiáng)度。錢在大量獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)系列稀釋的ch5D12(PG100)和PG102(I29L變體)與固定的CD40-Fc同等地結(jié)合(圖14)，而抗CD86對照抗體不顯示與CD40-Fc可檢測的結(jié)合。所有實(shí)驗(yàn)計(jì)算出的半最大結(jié)合濃度概述于表13。對于評估的任何抗CD40抗體批次沒有觀察到半最大結(jié)合濃度的顯著差異。實(shí)施例755遞過i^GS,/定c/75D72(PG700」教戶G7W與JT潘應(yīng)表這游/zwCDW游茲合材料和方法利用FACS緩沖液(lxPBS，1%BSA和0.05%疊氮化鈉)洗滌表達(dá)CD40的JY細(xì)胞。丟棄上清，按照2xl()S個(gè)細(xì)胞/mL的濃度將JY細(xì)胞重懸于FACS緩沖液。然后，將50pLJY細(xì)胞懸液添加到50pL各種檢測抗體(ch5D12(PGIOO)，PG102和陰性對照嵌合抗huCD86抗體chFUN-l)，所述抗體被配制為0-900ng/mL的濃度范圍，并在4。C保溫30分鐘。然后用4mlFACS緩沖液/管洗滌細(xì)胞，丟棄上清。將細(xì)胞沉淀重懸于用FACS緩沖液1:100稀釋的100|iL山羊抗人IgG-FITC(JacksonImmunoresearchLabs.目錄號109-095-127)，并在4。C保溫30分鐘。然后用4mlFACS緩沖液洗滌細(xì)胞，丟棄上清。將沉淀重懸于200nLFACS緩沖液，利用FACScan流式細(xì)胞儀(BectonDickinson)測量結(jié)合的抗體。錢所有被檢測批次的ch5D12(PG100)和PG102都顯示與JY細(xì)胞表達(dá)的CD40類似的結(jié)合特征(圖15)，它們的半最大抗體結(jié)合濃度相當(dāng)(表14)。chFUN-l也結(jié)合JY細(xì)胞，雖然其平均熒光強(qiáng)度(MFI)低于ch5D12(PG100)和PG102。這是因?yàn)镴Y細(xì)胞也表達(dá)人CD86。巡利用體外細(xì)胞和基于ELISA的分析，已經(jīng)測定了不同PG102(I29L變體)和ch5D12(PG100)的CD40結(jié)合特征。通過抗獨(dú)特型mAb173-36-1以相同效力抑制PG102和ch5D12(PG100)與表達(dá)CD40的JY細(xì)胞的結(jié)合。因此，計(jì)算出的PG102和CH5D12(PG100)批次的平均-logIC50值的范圍分別是5.51-6.11(11=8)和5.43-6.04(n-10)(pX).05)?？贵w173-36-1針對ch5D12(PG100)前體即鼠mAb5D12的可變區(qū)，不抑制抗CD86同種型對照抗體的結(jié)合。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，利用結(jié)合人CD40-Fc的抗體的ELISA分析以及結(jié)合JY細(xì)胞的FACS分析測定了PG102和ch5D12(PG100)的半最大結(jié)合濃度。在ELISA分析中，任意被檢測批次的PG102和ch5D12(PG100)的半最大結(jié)合濃度間都不存在顯著差異。例如，計(jì)算出的PG102和ch5D12(PG100)批次的平均-log半最大結(jié)合濃度分別是7.47±0.04和7.54±0.03(P>0.05，n=4)，56對應(yīng)于大約30ng/ml。在PG102和ch5D12(PG100)結(jié)合JY細(xì)胞表達(dá)的CD40的FACS實(shí)驗(yàn)中觀察到類似的半最大結(jié)合濃度。這些結(jié)果表明PG102和ch5D12(PG100)具有相同的CD40結(jié)合互補(bǔ)位，如抑制PG102和ch5D12(PG100)結(jié)合CD40的抗獨(dú)特型抗體的相似效力特征所證明。此外，這兩種抗體在ELISA和基于細(xì)胞的分析中對于結(jié)合人CD40均顯示類似的體外效力?？傊@里的數(shù)據(jù)表明PG102和ch5D12(PG100)與人CD40的結(jié)合性質(zhì)是相同的。實(shí)施例8，^^未標(biāo)a^貧0^0拔銀競爭,i^劍cMD72fK^"-i^浙？G/"-戶五與表^^ACDW游J7潘應(yīng)游茲合材料和方法在37匸含5%C02的空氣潮濕環(huán)境中，JY細(xì)胞(Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)化的人B類淋巴母細(xì)胞系)在Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium(IMDM)中生長，所述培養(yǎng)基包含10。/。熱滅活的胎牛血清(FCS)、2mML-谷氨酰胺和5(Hig/mL慶大霉素。在流式細(xì)胞術(shù)測量當(dāng)天收獲細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)使用未標(biāo)記的ch5D12(PG100)(第4批)和PG102(第2批)抗體。還使用這兩種抗體PE標(biāo)記的形式，以便通過流式細(xì)胞術(shù)直接測定與JY細(xì)胞的結(jié)合。利用AbDSerotec(Oxford,UK)的PE定制標(biāo)記抗體。對于每個(gè)FACS分析，使用下列方案。從細(xì)胞培養(yǎng)物收獲JY細(xì)胞并計(jì)數(shù)。隨后在不同濃度(0-1Ojig/mL)未標(biāo)記競爭性ch5D12(PG100)或者PG102存在的條件下，將lxl()5個(gè)表達(dá)CD40的JY細(xì)胞/200(iL保溫緩沖液(PBS，1%BSA，0.05%疊氮化鈉)與l叱/mL標(biāo)記的ch5D12(PG100)或者PG102抗體在4-8。C保溫30分鐘。洗滌細(xì)胞，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，利用FACScan流式細(xì)胞儀(Becton&Dickinson)測定每個(gè)濃度的MFI。利用CellQuest⑥軟件(Becton&Dickinson)測量和分析5000個(gè)事件/樣品。翁菜在這些分析中未標(biāo)記的ch5D12(PG100)和PG102顯示類似的抑制特征(圖16)。未標(biāo)記的ch5D12(PG100)和PG102對lpg/mLch5D12(PG100)結(jié)合的抑制的平均-logICso值分別是7.50±0.03和7.63±0.03(n=4)，而未標(biāo)記的ch5D12(PG100)和PG102對l(ig/mlPG102結(jié)合的抑制的平均-logICso值分別是7.54±0.01和7.65±0.02(n=4)。這些-logIC50值對應(yīng)于大約20-30ng/mL(即130-200pM)的PG102和ch5D12(PG100)濃度。實(shí)施例9鄉(xiāng)請應(yīng)微/丄-<9材料和方法利用基于細(xì)胞的功能性生物分析測量PG102的功能性。簡單來說，第1天，在添加10。/。胎牛血清(Gibco，ref10270-106)和50pg/mL慶大霉素(Invitrogen，目錄號15750-045)的Iscove,sModifiedDulbecco，sMedium(IMDM,BioWhittaker，目錄號BE12-722F)中培養(yǎng)THP-1禾卩Jurkat39.8/50人類細(xì)胞。用1000單位/mL細(xì)胞培養(yǎng)物的rhuIFNi刺激THP-1。在第3天的生物分析中，需要4xl()S個(gè)細(xì)胞/mL濃度的THP-1和Jurkat39.8/50細(xì)胞。計(jì)數(shù)THP-1和J39.8/50細(xì)胞并測定它們的存活性。然后將細(xì)胞稀釋到大約lxl(^個(gè)細(xì)胞/mL的濃度，按照1:1混合細(xì)胞懸液并在37。C潮濕的5%C02環(huán)境中保溫48小時(shí)。在第3天如下洗滌THP-1和J39.8/50細(xì)胞(對THP-1細(xì)胞來說洗滌步驟是去除IFN-y):將5mLIFN-y刺激的THP-1禾bJ39.8/50細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50mLfalcon管。添加40mLHank's平衡鹽溶液(HBSS)，將細(xì)胞在1500rpm(利用正C離心機(jī))離心6分鐘。丟棄上清。在添加10%FCS的預(yù)溫IMDM中重懸細(xì)胞沉淀。將THP-1細(xì)胞和J39.8/50細(xì)胞調(diào)節(jié)到濃度為4xl(^個(gè)細(xì)胞/mL。對于抑制分析，用添加10%胎牛血清的溫IMDM培養(yǎng)基將試驗(yàn)樣品ch5D12(PG100)或者PG102(I29L變體)系列稀釋，獲得范圍在0-160ng/mL的最終分析濃度。按照下列順序?qū)HP-1、J39.8/50和試驗(yàn)樣品一式三份添加到圓底細(xì)胞培養(yǎng)板(NimclonTM):50pLTHP-l細(xì)胞(相當(dāng)于每孔2><104個(gè)細(xì)胞)，50laL試驗(yàn)樣品和50ixLJ39.8/50細(xì)胞?？傮w積是每孔150^1。用多孔食品薄膜覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)板并在37。C潮濕的5%C02環(huán)境中保溫48小時(shí)。第5天，培養(yǎng)48小時(shí)后，吸出70pL細(xì)胞培養(yǎng)上清并轉(zhuǎn)移到圓底微量滴定板。按照制造商說明書，利用商品化ELISA(Biosource,HumanIL-8cytoset，目錄號CHC1304)分析收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清的IL-8含量。58錢PG102(I29L變體)和ch5D12(PG100)對于激活THP-1釋放IL-8顯示類似的抑制效果(圖17)。計(jì)算出的這兩種抗體的-loglC5o值分別是8.42和8.28。這些值對應(yīng)于大約30pM的ICso濃度。實(shí)施例IO先前對人和食蟹猴組織的組織交叉反應(yīng)研究顯示ch5D12(PG100)與淋巴器官中B細(xì)胞和DC的細(xì)胞表面結(jié)合。在人或者食蟹猴組織中沒有觀察到意料之外的交叉反應(yīng)。對于PG102重復(fù)該研究并獲得類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)，表明ch5D12(PG100)和PG102以類似方式結(jié)合各種組織切片。先前還在食蟹猴中評價(jià)了ch5D12的安全性和耐受性，其中每周施用ch5D12共4周在全部猴中都顯示是安全的，沒有任何副作用。在本研究中，獲得功能性證據(jù)證明ch5D12能夠阻止B細(xì)胞活化和增殖27。利用一個(gè)時(shí)間更長的方案對PG102重復(fù)了安全性研究。簡單來說，設(shè)計(jì)了一個(gè)在食蟹猴中13周的靜脈內(nèi)毒性研究，恢復(fù)期為14周，利用3個(gè)劑量水平(O、25和100mg/kgi.v.)和26只猴(每個(gè)治療組6只猴(3M，3F)，另外每個(gè)積極治療組加4只猴(2M，2F)作為恢復(fù)組)。完成下列檢測TK，抗PG102應(yīng)答，流式細(xì)胞術(shù)(包括PBMC的CD40包被)，淋巴結(jié)活檢和標(biāo)準(zhǔn)毒理學(xué)評價(jià)如血液學(xué)和免疫組織化學(xué)。該研究結(jié)果顯示對于被測的任何劑量水平都沒有觀察到毒性。PG102是安全的并被良好耐受?？偟膩碚f，這些研究證明拮抗性抗人CD40MabPG102與其親代抗體ch5D12(PG100)—樣沒有出乎意料的交叉反應(yīng)，在體內(nèi)是安全的并被良好耐受。表1.各組基本統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>BMI，體重指數(shù)；CDAI，克羅恩病活性指數(shù)；CDEIS，克羅恩病內(nèi)窺鏡嚴(yán)重性指數(shù)表2.ch5D12治療后克羅恩病活性指數(shù)評分的降低受試者篩查時(shí)的第28天最大最大癥狀減輕癥狀減輕CDAICDAI的CDAI降CDAI降(是/否,的天數(shù)降低低3低的天數(shù)ach5D12輸注后的28天觀察期間CDAI的最大降低b癥狀減輕被定義為總CDAI評分S150并且降低>100。e所有受試者都顯示CDAI評分的降低，除了受試者010(l.Omg/kg群組)。該受試者篩查評分為241.4，而CDAI評分從沒有低于篩查時(shí)得到的值。CDAI，克羅恩病活性指數(shù)。群組1:0.3mg/kgch5D12001253-30002274570033208600439258005265117平均301584110712966149987211471412,6群組2:lmg/kgch5D12006232-4300722813300839414400928856010e241-42平均2775069175172123無降低108721212114群組3:3mg/kgch5D1201129927012308194013280106014327-84015249103平均2936927194106147103115282828142825.2群組4:10mg/kgch5D12016357-6501735830201828020平均3328610930110217121282123.:4184否否否否是否是否否否否是否否否否是否61表3.免疫組織化學(xué)評分CD3CD4CD8CD19CD68受試者ID群組(mg/kg)樣品來源0280280280280280010.3回腸+++++++++++++++++++結(jié)腸++++++++++++++++++++0050.3回腸NSNSNSNSNSNSNSNSNSNS結(jié)腸+++++++++++++++0091.0回腸++++++++++++++結(jié)腸++++++++++Oil3.0回腸+++++++++++++++結(jié)腸+++++++++十0123.0回腸+++++++++++++++結(jié)腸+++++++++++++++0133.0回腸+++++++++++++++結(jié)腸+++++++++0143.0回腸+++++++++++++++結(jié)腸++++++++++0153.0回腸NSNSNSNSNSNSNSNSNSNS結(jié)腸++++++++++01610回腸++++++++++結(jié)腸++++++++++01710回腸++++++++++結(jié)腸++++++++++01810回腸++++++++++結(jié)腸+++++++++++++++淋巴細(xì)胞結(jié)果0=篩查時(shí)，28=第28天。NS.無樣品a用識別所有T淋巴細(xì)胞(CD3)、T輔助細(xì)胞(CD4)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8)、B細(xì)胞(CD19)和巨噬細(xì)胞(CD68)的抗體染色所有提供的活檢。來自非炎癥組織的回腸和結(jié)腸的CD3+、CD4+、CD8+、CD19+和CD68+的值是單陽性的(+)。62表4引物序列5'-3'Q5EctcccaggttaagcttgaggagtctggacctggQ5ErevccaggtccagactcctcaagcttaacctgggagK13Agacctggcctggtggcaccctc3gag3cccK13ArevgggtctctgagggtgccaccaggccaggtcE16QCCtggtg幼3CCCtC3C3g3CCCtgtCCatC3CE16Qrevgtgatggac鄉(xiāng)gtctgtgagggtttcaccaggT17SgtgaaaccctcagagagcctgtccatcacatgcT17SrevgcatgtgatggacaggctctctgagggtttcacI29Lgcactgtctctgggttctcactctccagatatagtgtatac129Lrevgtatacactatatctggagagtgagaacccagagacagtgc137Vgatatagtgtatactgggttcgccagcctccagg137VrevcctggaggctggcgaacccagtatacactatatcP45LcctccaggaaagggtctggagtggatgggaatgP45LrevcattcccatccactccagaccctttcctggaggM48LgggtccggagtggctgggaatgatgtgM48LrevC3catcattccc3gccactccgg3cccSTS60NSAgtggtggttccacagactataattcagctctcaaatccagactgaccSTS60NSArevggtcagtctggatttgagagctgaattatagtctgtggaaccaccacT68SctcaaatccagactgagcatcagcaaggacaccT68SrevggtgtccttgctgatgctcagtctggatttgagS79FcacctcgaagagccaggtcttcttaaaaatgaacagtctgcS79FrevgcagactgttcatttttaagaagacctggctcttcgaggtgT108SgggtcaaggaacctcggtcaccgtctcT108Srevgagacggtgaccgaggttccttgaccc誘變寡核苷酸。用于在第5，13，16，17，29，37，45，48，60，68，79和108位氨基酸引入突變的寡核苷酸。對于每個(gè)位置，有義和反義("rev")寡核苷酸是必需的。63表5FACSELISA比例變體MFIng/mlQ5E3944420K13A3126712E16Q3942019T17S3348222I29L137V1089613311175》6154P45L8256626M48L8052524STS60NSA6230814T68S3529513S79F9686940T108S9964830CH5D121032187100:DI5D125039218模擬11n.d.空白10n.d.通過FACS和定量ELISA測得的表達(dá)數(shù)據(jù)概述。對于每個(gè)5D12變體(Q5E，K13A,E16Q,T17S，I29L,I37V,P45L,M48L，STS60NSA,T68S,S79F和T108S)以及ch5D12和DI5D12，顯示MFI值(通過FACS測定)和收獲上清中的抗體濃度(通過ELISA測定)。還顯示模擬轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)基對照的MFI值。通過ELISA數(shù)據(jù)與ch5D12值(定為100%)的比較計(jì)算比例。表6:誘變寡核苷酸。用于在第29和37位氨基酸引入突變的寡核苷酸。列出有義和反義(rev)寡核苷酸。___引物序列5'-3'I29Vgcactgtctctgggttctcagtctctagatatagtgtatac129VrevgtatacactatatctagagactgagaacccagagacagtgcI29Lgcactgtctctgggttctcactctccagatatagtgtatac129Lrevgtatacactatatctggagagtgagaacccagagacagtgc137Lgatatagtgtatactggctgcgccagcctccagg137Lrevcctggaggctggcgcagccagtatacactatatc137Vgatatagtgtatactgggttcgccagcctccagg137Vrevcctgg3ggctggcg^cccagtatac3ctatatc表7:雙重突變體的產(chǎn)生需要2輪誘變。下面列出用于產(chǎn)生其他DI5D12變體的歩驟1和步驟中分別使用的引物組。突變體步驟1步驟2PG102[29L-371(LI)]I29L+I29Lrevn.a.29I-37V(IV)137V+I37Vrevn.a.29V-37I(VI)129V+I29Vrevn.a.29I-37L(IL)I37L+I37Lrevn.a.29V-37V(W)129V+I29Vrev137V+I37Vrev29L-37L(LL)129L+I29Lrev137L+I37Lrev29V-37L(VL)129V+I29Vrev137L+B7Lrev29L-37V(LV)129L+I29Lrev137V+I37Vrev65表8.通過定量ELISA測得的表達(dá)數(shù)據(jù)。對于每個(gè)其他5D12變體(29I-37V，29V-371，29I-37L,29V-37V,29L-37L,29V-37L禾卩29L-37V)以及ch5D12(PG100)、DI5D12和PG102(I29L變體)，顯示收獲上清中的抗體濃度。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>表9:在CDACF補(bǔ)料分批搖瓶培養(yǎng)中CHO細(xì)胞系的生長&生產(chǎn)力數(shù)據(jù)的概述培養(yǎng)物ID最大活細(xì)胞濃度106細(xì)胞/mL活細(xì)胞濃度的時(shí)間積分109細(xì)胞.h/L收獲時(shí)的產(chǎn)物濃度mg/L比生成率(收獲qP)mg/l()9細(xì)胞/h比生成率(總q。mg/l()9細(xì)胞/hU07(DC1)9.66220116740.760.78L25(DC2)11.06261012580.480.48M95(DC3)9.58214611730.550.58L5213.452989畫0.330.34L735.9513259360.710.77L4510.4820969150.440.45J39,2020128880.440.48J411.0220378710.430.45L977.5518218190.450.53M927.8216658070.480.53M594.6532707920.240.24L1026.2012827330.570,60M58'8.7819706620.340.39G205.7313916580.470.52L653.748786510.740.90L568.5217285460.320.30M6310.7924654440,180.18G79.8720583760.180.20Gil5.0411453100.270.30LI5.7811632630.230.21M1511.2326541210.050.04M549.9522782760.120.15M5611.562347270.010.0167表10:GP-HPLC分析(包括LMWC)<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>抗CD40mAb(批次)-logIC50nch5D12(PG100)(第1批)5.74±0.144ch5D12(PG100)(第2批)5.64±0.012ch5D12(PG100)(第3批)5.55±0.062ch5D12(PG100)(第4批)5.63±0.022PG102(第1批)5.85±0.124PG102(第2批)5.76±0.114表12:計(jì)算出的對ch5D12(PG100)和PG102結(jié)合JY細(xì)胞的抗獨(dú)特型介導(dǎo)的抑制的-loglC50的概述。數(shù)據(jù)表示n次測定的平均值i平均值標(biāo)準(zhǔn)誤。用任意測試抗體批次的抗獨(dú)特型的抑制效力不存在顯著差異(pX).05，ANOVA繼之以多重比較的Tukey's檢驗(yàn))?？笴D40mAb(批次)-log半最大結(jié)合濃度nch5D12(PG100)(第1批)7.54±0.034ch5D12(PG100)(第2批)7.53±0.022ch5D12(PG100)(第3批)7.48±0.102ch5D12(PG100)(第4批)7.37±0,102PG102(第1批)7.45±0.044PG102(第2批)7,47±0.044表13.計(jì)算出的ch5D12(PG100)和PG102結(jié)合人CD40-Fc的-log半最大結(jié)合濃度值的概述，通過ELISA測定。數(shù)據(jù)表示n次測定的平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤。被檢測的任意抗體批次的結(jié)合不存在顯著差異(pX).05，ANOVA繼之以多重比較的Tukey's檢驗(yàn))。作為參考，7.45的-log半最大結(jié)合濃度對應(yīng)于大約35ng/ml(200pmol)的濃度。69抗CD40mAb(批次)-log半最大結(jié)合濃度nch5D12(PG100)(第1批)7.262ch5D12(PG100)(第2批)7.342ch5D12(PG100)(第3批)7.492ch5D12(PG100)(第4批)7.592PG102(第1批)7.442PG102(第2批)7.482表14:計(jì)算出的ch5D12(PG100)和PG102結(jié)合表達(dá)人CD40的JY細(xì)胞的-log半最大結(jié)合濃度值的概述，通過ELISA測定。數(shù)據(jù)是兩次測定的平均值。作為參考，7.45的-log半最大結(jié)合濃度對應(yīng)于大約35ng/ml(200pmo1)的濃度。70參考文獻(xiàn)1RanheimEA,KippsTJ.ActivatedTcellsinduceexpressionofB7/BB1onnormalorleukemicBcellsthroughaCD40-dependentsignal.JExpMed(1993);177:925-35.2HasboldJ，Johnson-LegerC，AtkinsCJ，ClarkEA,KlausGGB.PropertiesofmouseCD40:celulardistributionofCD40andBcellactivationbymonoclonalanti-mouseCD40antibodies.EurJImmunol(1994);24:1835-42.3AldersonMR，ArmitageRJ,ToughTW，StrockbineL,FanslowWC,SpriggsMK.CD40expressionbymonocytes:regulationbycytokinesandactivationofmonocytesbytheligandforCD40.JExpMed(1993);178:669-74.4KienerPA，Moran-DavisP,RankinBM，WahlAF，AruffoA，HollenbaughD.StimulationofCD40withpurifiedsolublegp39inducesproinflammatoryresponsesinhumanmonocytes.JImmunol(1995);155:4917-25.5ShuU，KiniwaM,WuCY，etal.ActivatedTcellsinduceinterleukin-12productionbymonocytesviaCD40-CD40ligandinteraction.EurJImmunol(1995);25:1125-8,6CellaM，ScheideggerD，Palmer-LehmannK,LaneP,LanzavecchiaA,AlberG.LigationofCD40ondendriticcellstriggersproductionofhighlevelsofinterleukin-12andenhancesTcellstimulatorycapacity:T-ThelpviaAPCactivation.JExpMed(1996);184:747-52.7vanKootenC,Banchereau丄FunctionsofCD40onBcells,dendriticcellsandothercells.CurrOpinImmunol(1997》9:330-7.8CayabyabM，PhillipsJH，LanierLL.CD40preferentiallycostimulatesactivationofCD4+Tlymphocytes.JImmunol(1994);152:1523-31.9HermannP,Van-KootenC,GaillardC,BanchereauJ,BlanchardD.CD40ligand-positiveCD8+TcellclonesallowBcellgrowthanddifferentiation.EurJImmunol(1995》25:2972-7.10GrewalIS,FlavellRA.CD40andCD154incell-mediatedimmunity.71A薩RevImmunol(1998);16:111-35.11HennV,SlupskyJR,GrafeM,etal.CD40ligandonactivatedplateletstriggersaninflammatoryreactionofendothelialcells.Nature(1998);391:591-4.12vanKootenC,BanchereauJ.CD40-CD40ligand.JLeukocBiol(2000);67:2-17.13CleggCH,RulffesJT,HaugenHS，etal.Thymusdysfunctionandchronicinflammatorydiseaseingp39transgenicmice.IntImmunol(1997);9:1111-22.14SttiberE,StroberW,NeurathM.BlockingtheCD40L-CD40interactioninvivospecificallypreventstheprimingofThelper1cellsthroughtheinhibitionofinterleukin12secretion.JExpMed(1996);183:693-8.15LiuZ,GeboesK，ColpaertS,etal.PreventionofexperimentalcolitisinSCIDmicereconstitutedwithCD45RBhighCD4+TcellsbyblockingtheCD40-CD154interactions.JImmunol(2000);164:6005-14.16DeJongYP,ComiskeyM，KalledSL，etal.ChronicmurinecolitisisdependentontheCD154/CD40pathwayandcanbeattenuatedbyanti-CD154administration.Gastroenterology(2000);119:715-23.17KawaiT,AndrewsD，ColvinRB,SachsDH,CosimiAB.ThromboemboliccomplicationsaftertreatmentwithmonoclonalantibodyagainstCD40ligand.NatMed(2000);6:114.18BuhlerL，AlwaynIP,AppelJZIII，RobsonSC，CooperDK.Anti-CD154monoclonalantibodyandthromboembolism.Transplantation(2001);71:491.19KnosallaC,GollacknerB,CooperDK.Anti-CD154monoclonalantibodyandthromboembolismrevisited.Transplantation(2002》74:416-17.20deBoerM，ConroyJ,MinHY,KwekkeboomJ.Generationofmonoclonalantibodiestohumanlymphocytecellsurfaceantigensusinginsectcellsexpressingrecombinantproteins.JImmunolMeth(1992》152:15-23.21KwekkeboomJ,deBoerM,TagerJM,deGrootC.CD40playsanessentialroleintheactivationofhumanBcellsbymurineEL4B5cells.Immunology(1993);79:439-44.22KwekkeboomJ，deRijkD,KasranA，BarcyS,deGrootC,deBoerM.HelpereffectorfunctionofhumanTcellsstimulatedbyanti-CD3Mabcanbeenhancedbyco-stimulatorysignalsandispartiallydependentonCD40-CD40ligandinteraction.EurJImmunol(1994);24:508-17.23LamanJD,'tHartBA,Brok,HPM，etal.ProtectionofmarmosetmonkeysagainstEAEbytreatmentwithamurineantibodyblockingCD40—5D12).EurJImmunol(2002);32:2218-28.24BoonL,BrokHPM,BauerJ，etal.Preventionofexperimentalautoimmuneencephalomyelitisinthecommonmarmoset(Callithrixjacchus)usingachimericantagonistMabagainsthumanCD40isassociatedwithalteredB-cellresponses.JImmunol(2001》167:2942-9.25HaanstraKG,RingersJ，SickEA，etal.Preventionofkidneyallograftrejectionusinganti-CD40andanti-CD86inprimates.Transplantation(2003);75:637-43.26Haegel-KronenbergerH，HaanstraK,Ziller-RemyC,etal.Inhibitionofcostimulationallowsforrepeatedsystemicadministrationofadenoviralvectorinrhesusmonkeys.GeneTh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ulateTlymphocyteproliferationbyaCD40-dependentmechanism.EurJImmunol(1996);26:1371-1377.115PaschMC，BosJD，AsgharSS.Activationofcomplementfrompsoriasis.ClinExpDermatol(1998);23:189-190.116PaschMC,Timar，K，vanMeusM，HeyendaalVMR,BosJD,LamanJD，AshgarSS.InsitudemonstrationofCD40-andCD154-positivecellsinpsoriaticlesionsandkeratinocyteproductionofchemokinesbyCD40ligationinvitro.J.Pathol(2004);203:839-848.8權(quán)利要求1.一種多肽，包括氨基酸序列1112131||||GFSX1SRYSVYWX2RQPPGKGX3EWX4GMMWGGGSTDYS415161|||TSLKSRLTISKDTSKSQVX5LKMNSLRTDDTAMYYC71|VRTDGDY其中X1是G，A，V，L，I，P，F(xiàn)，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H；X2是G，A，V，L，I，P，F(xiàn)，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H；X3是G，A，V，L，I，P，F(xiàn)，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H；X4是G，A，V，L，I，P，F(xiàn)，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H；和X5是G，A，V，L，I，P，F(xiàn)，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H。2.如權(quán)利要求1所述的多肽，包括氨基酸序列111213141516171PGKGX3EWX4GMMWGGGSTDYSTSLKSRLTISKDTSK3.如權(quán)利要求1或者2所述的多肽，其中X,是G,A,V，L，P，F(xiàn),M,W，C，N,Q，S,T，Y,D，E，K,R或者H'4.如權(quán)利要求1-3中任一所述的多肽，其中X,是G，A，V,L，P，F(xiàn)或者M(jìn);X2是G，A,V，L，I，P,F或者M(jìn);X3是G，A，V,L,I,P，F(xiàn)，M;X4是G，A,V,L，I,P，F(xiàn)，M;禾口X5是GA,V,L，I，P，F(xiàn),M，W，C,N,Q，S,T或者Y。5.如權(quán)利要求1-4中任一所述的多肽，其中:Xj是G,A，V,L或者M(jìn);X2是G,A，V,L，I或者M(jìn);X3是GA，V,L,I，P,F,M;X4是G，A，V,L,I或者M(jìn);和X5是P，F(xiàn)，W，N,Q，S，T或者Y。6.如權(quán)利要求5所述的多肽，其中:X!是L;X2是I;X3是P;X4是M;或者Xs是S。7.如權(quán)利要求1或者2所述的多肽，其中:Xi是I和X2是V;X!是L和X2是I;3X,是V和X2是V;Xj是L和X2是L;或者X,是L和X2是V。8.如權(quán)利要求7所述的多肽，其中X3是P;X4是M;和Xs是F或者X5是S，優(yōu)選是S。9.如權(quán)利要求1-7中任一所述的多肽，其中X,是L;X2是V;X3是L;X4是L和X5是F。10.—種多肽，包括氨基酸序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中X!是L和X2是I;或者X,是I和X2是V。11.一種結(jié)合體，包括權(quán)利要求1-10中任一所述的多肽。12.—種抗體，包括權(quán)利要求1-10中任一所述的多肽。13.如權(quán)利要求12所述的抗體，包括人類抗體的恒定區(qū)，優(yōu)選IgG恒定區(qū)。14.如權(quán)利要求12或者13所述的抗體，其中所述恒定區(qū)是補(bǔ)體激活缺陷的區(qū)域，優(yōu)選人IgG4恒定區(qū)或者突變的人IgGl恒定區(qū)。15.—種核酸，其編碼權(quán)利要求1-10中任一所述的多肽、和/或權(quán)利要求11所述的結(jié)合體、和/或權(quán)利要求12-14中任一所述的抗體。16.—種細(xì)胞，其包括權(quán)利要求1-10中任一所述的多肽、和/或權(quán)利要求11所述的結(jié)合體、和/或權(quán)利要求12-14中任一所述的抗體和/或權(quán)利要求15所述的核酸。17.—種拮抗性抗人CD40單克隆抗體，其包括權(quán)利要求1-10中任一所述的多肽。18.—種去免疫的如權(quán)利要求17所述的拮抗性抗人CD40單克隆抗體。19.如權(quán)利要求17或者18所述的拮抗性抗人CD40單克隆抗體，包括<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>其中Xe是N，Q,S，T，Y，W或者C;X是D,E,N,Q，S，T，Y,W或者C;X8是N，Q，S，T，Y，G，A，V,L,I，P,F,M,W或者C;X9是GA,V,L，I，P,F，M;X'o是G，A,V,L,I，P,F,M;和Xu是N,Q,S，T,Y，GA，V，L，I，P，F(xiàn)，M，W或者C。20.如權(quán)利要求19所述的拮抗性抗人CD40單克隆抗體，包括氨基酸序列I112131IIiIELQLTQSPLSLPVX6LGX7X8ASISCRSSQSLX9NSNGNTYLHW415161718191101111IIIISRVEAEDX10GVYXuCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKR。21.如權(quán)利要求19或者20所述的抗體，其中X6是T或者S,X7是D或者Q,Xs是Q或者P,X9是V或者A,X^是V或者L和Xn是F或者Y。22.如權(quán)利要求19-21中任一所述的抗體，其中X6是T,乂7是Q，X8是P，X9是A,X!o是V和Xu是Y。23.—種細(xì)胞，包括權(quán)利要求19-22中任一所述的抗體。24.如權(quán)利要求23所述的細(xì)胞，其產(chǎn)生所述抗體。25.如權(quán)利要求16、23或者24所述的細(xì)胞，其是雜交瘤細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞、NS0細(xì)胞或者PER-C6TM細(xì)胞。26.如權(quán)利要求25所述的細(xì)胞，在—保藏單位保藏，編號為_27.—種細(xì)胞培養(yǎng)物，包括權(quán)利要求23-26中任一所述的細(xì)胞。28.—種制備抗體的方法，包括培養(yǎng)如權(quán)利要求16、23-26中任一所述的細(xì)胞并從所述培養(yǎng)物中收集所述抗體。29.—種通過權(quán)利要求28所述方法獲得的抗體。30.如權(quán)利要求29所述的抗體，其是純化的。31.—種藥物組合物，包括權(quán)利要求1-10中任一所述的多肽、權(quán)利要求ll所述的結(jié)合體、權(quán)利要求12-14、17-22、29或者30中任一所述的抗體、權(quán)利要求15所述的核酸和/或權(quán)利要求16、23-26所述的細(xì)胞。32.用作藥物的權(quán)利要求1-10中任一所述的多肽、權(quán)利要求11所述的結(jié)合體、權(quán)利要求12-14、17-22、29或者30中任一所述的抗體、權(quán)利要求15所述的核酸和/或權(quán)利要求16、23-26所述的細(xì)胞。33.權(quán)利要求1-10中任一所述的多肽、權(quán)利要求11所述的結(jié)合體、權(quán)利要求12-14、17-22、29或者30中任一所述的抗體、權(quán)利要求15所述的核酸和/或權(quán)利要求16、23-26所述的細(xì)胞在制備藥物中的用途，所述藥物用于改善自身免疫性疾病和/或炎性病癥的癥狀和/或減輕移植排斥和/或治療CD40陽性癌癥。34.如權(quán)利要求33所述的用途，其中所述自身免疫性疾病和/或炎性病癥選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、牛皮癬、大皰性類天皰瘡和特應(yīng)性皮炎。35.如權(quán)利要求33所述的用途，其中所述自身免疫性疾病和/或炎性病癥包括炎癥性腸病。36.如權(quán)利要求35所述的用途，其中所述炎癥性腸病包括漬瘍性結(jié)腸炎(UC)或者克羅恩病(CD)。37.—種給個(gè)體提供抗體的方法，包括給所述個(gè)體提供如權(quán)利要求12-14、17-22、29或者30中任一所述的抗體。38.—種選擇抗人CD40拮抗性抗體的方法，包括產(chǎn)生生成初始抗人CD40拮抗性抗體的第一細(xì)胞系并確定所述第一細(xì)胞系生成的初始抗體的量，所述初始抗體包括重鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中X,和X2配對選自X,=I和X2=V;X！=L和X2=I;X！=V和X2=V;X'=L禾口X2=L;或者X,=L禾口X2=V，所述方法還包括產(chǎn)生至少一種生成所述初始抗體變體的其他細(xì)胞系和確定所述至少一種其他細(xì)胞系生成的變體抗體的量，其中與所述初始抗體相比，所述變體抗體是包括大約1-5個(gè)氨基酸的插入、缺失、倒位和/或取代的修飾的初始抗體，其中所述修飾不包括X,和X2位氨基酸的修飾，所述方法還包括選擇生成的量是初始抗體量至少50%的變體抗體。39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述初始抗體包括輕鏈氨基酸序列YLQRPGQSPRIXIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI8191101111SRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRC40.如權(quán)利要求38或者39所述的方法，其中與所述初始抗體相應(yīng)鏈的氨基酸序列相比，所述1-5個(gè)氨基酸的插入、缺失、倒位和/或取代位于所述重鏈氨基酸序列或者所述輕鏈氨基酸序列中。41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中與所述初始抗體的所述重鏈序列相比，所述1-5個(gè)氨基酸的插入、缺失、倒位和/或取代位于所述重鏈氨基酸序列中。42.如權(quán)利要求38-41中任一所述的方法，還包括產(chǎn)生一種抗體生產(chǎn)細(xì)胞系，所述細(xì)胞系生成所述選擇的抗體。43.如權(quán)利要求42所述的方法，還包括收集所述選擇的抗體。44.一種通過權(quán)利要求43所述的方法獲得的抗人CD40拮抗性抗體。全文摘要本發(fā)明提供新的拮抗性抗人CD40單克隆抗體，制備它們的方法及其用途。文檔編號C07K16/28GK101490086SQ200780025878公開日2009年7月22日申請日期2007年5月9日優(yōu)先權(quán)日2006年5月9日發(fā)明者K·S·約翰遜,M·T·登哈爾托赫,R·D·卡松,R·J·J·范內(nèi)爾芬申請人:潘詹奈蒂克斯有限公司