識(shí)別具有降低免疫原性的抗體的方法
【專利說(shuō)明】識(shí)別具有降低免疫原性的抗體的方法
[0001] 巧關(guān)申請(qǐng)案簾叉參考
[0002] 本申請(qǐng)案根據(jù)35U.S.C. § 119(e)主張優(yōu)先權(quán)主張對(duì)2012年9月19日提出申請(qǐng) 的臨時(shí)申請(qǐng)案系列第61/703, 170號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容的全文W引用方式并入本文中。
[0003] 序列表
[0004] 本申請(qǐng)案含有已WASCn格式通過(guò)EFS-Web提交且由此全文W引用方式并入本文 中的序列表。在2013年9月17日創(chuàng)建的所述ASCII副本名為381493-721W0(118133)_ 化.txt且大小為6, 980字節(jié)。
【背景技術(shù)】
[0005] B細(xì)胞表位是由免疫系統(tǒng)的抗體鑒別的分子位點(diǎn)。治療蛋白中B細(xì)胞表位的識(shí)別 可用于設(shè)計(jì)在投與患者時(shí)不會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)的變體。
[0006]B細(xì)胞表位可通過(guò)通常利用丙氨酸（丙氨酸掃描）使蛋白質(zhì)的氨基酸個(gè)別突變并 測(cè)定各突變對(duì)抗體結(jié)合的效應(yīng)來(lái)識(shí)別（翁達(dá)的nda)等人，2011，國(guó)家科學(xué)院院刊（Proc. 化tl.Acad.Sci.) 108(14) : 5742-7)。誘變后破壞蛋白質(zhì)-抗體結(jié)合指示突變殘基是由抗 體鑒別的B細(xì)胞表位的一部分。已發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞表位中的單一突變甚至可消除與一組針 對(duì)蛋白質(zhì)的抗體的結(jié)合，并且可通過(guò)在B細(xì)胞表位中引入突變來(lái)降低蛋白質(zhì)的免疫原性 (永田（^gata)和派斯坦（Pastan), 2009,高級(jí)藥物遞送綜述（AdvancedDrugDelivery Reviews)61:977-985)。然而，此方法還耗時(shí)且勞動(dòng)密集。此外，丙氨酸掃描不一定會(huì)識(shí)別 可最大降低免疫原性的突變。
[0007] 因此，需要容許識(shí)別并消除B細(xì)胞表位的簡(jiǎn)單的非勞動(dòng)密集但全面的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供允許對(duì)要闡明的參考抗體中所關(guān)注區(qū)域內(nèi)的每一氨基酸的免疫原性 貢獻(xiàn)的系統(tǒng)。本發(fā)明提供，參考抗體的任何、一些或所有位置處的氨基酸殘基可突變成其它 19個(gè)氨基酸中的一些或全部且評(píng)估所述突變對(duì)抗體免疫原性的效應(yīng)。還可評(píng)估突變對(duì)抗體 的表達(dá)水平和/或與祀分子的結(jié)合的效應(yīng)，從而容許識(shí)別其中消除或減少免疫原性區(qū)但其 保留有利性質(zhì)（例如，適宜表達(dá)水平、與祀分子的結(jié)合）的抗體變體。因此，本發(fā)明提供降 低抗體免疫原性的方法。所述方法是基于篩選并識(shí)別與抗個(gè)體基因型抗體的結(jié)合降低的抗 體變體。與抗個(gè)體基因型抗體的結(jié)合的降低與降低的活體內(nèi)免疫原性相關(guān)（例如，參見永 田和派斯坦，2009,高級(jí)藥物遞送綜述61:977-985)。
[0009] 本發(fā)明的方法通常包含W下步驟：(a)使宿主細(xì)胞庫(kù)與特異性結(jié)合到參考抗體的 抗個(gè)體基因型抗體接觸，所述參考抗體是結(jié)合到祀分子的單克隆抗體，所述宿主細(xì)胞庫(kù)包 含各自在細(xì)胞表面上表達(dá)與參考抗體相差單一氨基酸點(diǎn)突變的抗體變體的哺乳動(dòng)物宿主 細(xì)胞；化）識(shí)別所述宿主細(xì)胞庫(kù)中表達(dá)抗體變體的細(xì)胞群體，所述抗體變體展示相對(duì)于參 考抗體降低的與抗個(gè)體基因型抗體的結(jié)合；和（C)識(shí)別在所述群體中富集的抗體變體，由 此識(shí)別具有降低免疫原性的參考抗體變體。在某些方面中，所述方法需要對(duì)宿主細(xì)胞庫(kù)進(jìn) 行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法和使用（例如）英光活化細(xì)胞分選（FAC巧從宿主細(xì)胞庫(kù)分選所述群體。
[0010] 在某些方面中，所述方法進(jìn)一步包含W下步驟：測(cè)定具有降低免疫原性的抗體變 體是否W實(shí)質(zhì)上等于或優(yōu)于參考抗體的水平結(jié)合到祀分子和/或W實(shí)質(zhì)上等于或優(yōu)于參 考抗體表達(dá)水平的水平表達(dá)。在具體實(shí)施例中，結(jié)合和表達(dá)是通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法、磁性珠 粒分選、BIAcore、FACS、ELISA、AlphaLisa或Ki址xA測(cè)定，并且是在識(shí)別具有降低免疫原性 的抗體變體之前、同時(shí)或之后測(cè)定。
[0011] 本文所述方法已適用于抗TNF-a抗體D2E7 (還稱作阿達(dá)木單抗（Adalimum油)）。 識(shí)別與1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)不同抗個(gè)體基因型抗體的結(jié)合降低的D2E7變體。本發(fā)明提供具有 與D2E7的CDR序列相關(guān)的CDR序列的抗TNF-a抗體，但其具有至少一個(gè)降低與抗Id抗體 的結(jié)合的取代。所述變體在本文中有時(shí)稱作"降低免疫原性"變體。
[0012] 本發(fā)明的抗TNF-a抗體包含6個(gè)氨基酸序列對(duì)應(yīng)于W下序列的CDR;SEQID N0:5(CDR-Hl)、WQIDN0:6(CDR-ffi)、WQIDN0:7(CDIM13)、WQIDN0:8(CDR-Ll)、WQ IDN0:9(CDR-L2)和SEQIDN0:10(CDR-冊(cè)），并且具有至少一個(gè)選自W下的取代；CDR-Ll 中的G5F、CDR-L1 中的G5I、CDR-L1 中的G5V、CDR-L1 中的G5W、CDR-L1 中的G5Y、CDR-L1 中 的R7I、CDR-L1 中的R7T、CDR-L1 中的R7V、CDR-L1 中的N8A、CDR-L1 中的N8D、CDR-L1 中 的N8E、CDR-L1 中的N8G、CDR-L1 中的N8L、CDR-L1 中的N8M、CDR-L1 中的N8Q、CDR-L1 中 的N8R、CDR-L1 中的N8T、CDR-L2 中的All、CDR-L2 中的A1T、CDR-L2 中的A1V、CDR-L2 中 的T4D、CDR-L3 中的R2G、CDR-L3 中的MF、CDR-L3 中的N4M、CDR-L3 中的N4W、CDR-L3 中 的MY、CDR-L3中的貼L、CDR-L3中的貼N、CDR-L3中的貼W、CDR-L3中的貼Y、CDR-L3中 的T9Y、CDR-H1 中的D1S、CDR-H1 中的Y2A、CDR-H1 中的Y2C、CDR-H1 中的Y2K、CDR-H1 中 的Y2M、CDR-H1 中的Y2R、CDR-H1 中的Y2S、CDR-H1 中的Y2V、CDR-H1 中的冊(cè)C、CDR-H1 中 的冊(cè)D、CDR-H1中的冊(cè)E、CDR-H1中的冊(cè)S、CDR-H1中的冊(cè)T、CDR-肥中的T3A、CDR-肥中 的T3G、CDR-肥中的T3N、CDR-肥中的W4A、CDR-肥中的W4F、CDR-肥中的W4H、CDR-肥中 的W4L、CDR-肥中的W4M、CDR-肥中的W4V、CDR-肥中的N5G、CDR-肥中的S6D、CDR-肥中的 S化、CDR-肥中的I9K、CDR-肥中的D10L、CDR-肥中的Y11A、CDR-肥中的Y11C、CDR-肥中 的Y11EXDR-肥中的Y11FXDR-肥中的Y11GXDR-肥中的Y11HXDR-肥中的Y11IXDR-肥 中的YUK、CDR-H2 中的Y11L、CDR-H2 中的Y11M、CDR-H2 中的Y11N、CDR-H2 中的Y11Q、 CDR-H2 中的Y11R、CDR-H2 中的Y11S、CDR-H2 中的Y11V、CDR-H2 中的Y11W、CDR-H2 中的 A12YXDR-H2 中的D13NXDR-H2 中的V15DXDR-H2 中的V15UCDR-H2 中的V15MXDR-H2 中 的V15QXDR-肥中的V15TXDR-肥中的E16FXDR-肥中的E16HXDR-肥中的E16KXDR-肥 中的E16R、CDR-H2 中的E16T、CDR-H2 中的E16W、CDR-H2 中的G17A、CDR-H2 中的G17C、 CDR-H2 中的G17E、CDR-H2 中的G17H、CDR-H2 中的G17I、CDR-H2 中的G17K、CDR-H2 中的 G17UCDR-H2 中的G17MXDR-H2 中的G17NXDR-H2 中的G17PXDR-H2 中的G17QXDR-H2 中 的G17R、CDR-肥中的G17S、CDR-肥中的G17T、CDR-肥中的G17Y、CDR-冊(cè)中的V1G、CDR-冊(cè) 中的V1R、CDR-H3 中的V1W、CDR-H3 中的L4T、CDR-H3 中的L4V、CDR-H3 中的T6V、CDR-H3 中 的S9KXDR-冊(cè)中的S9WXDR-冊(cè)中的S9Y和CDR-冊(cè)中的D11V。與阿達(dá)木單抗的CDR序列 相比，6個(gè)CDR總共可具有至多8個(gè)、至多7個(gè)、至多6個(gè)、至多5個(gè)或至多4個(gè)氨基酸取代。 在某些方面中，與阿達(dá)木單抗的CDR相比，各CDR可具有至多4個(gè)、至多3個(gè)或至多2個(gè)取 代。在具體實(shí)施例中，本發(fā)明的抗TNF-a抗體具有氨基酸取代的一或多個(gè)組合，其中重鏈 取代（如果存在）包含W下中的至少一者；(a)CDR-Hl中的Y2K;(b)CDR-Hl中的Y2M;(c)CDR-H1中的Y2K和CDR-冊(cè)中的T6V; (d)CDR-H1中的Y2KXDR-冊(cè)中的V1G和CDR-冊(cè)中的 T6V;(e)CDR-冊(cè)中的V1W;和（f)CDR-冊(cè)中的V1G和CDR-冊(cè)中的T6V，并且其中輕鏈取代 (如果存在）包含W下中的至少一者；（a)CDR-L1中的G5S和CDR-L1中的A11S;化)CDR-L1 中的R7I; (C)CDR-L1 中的G5S、CDR-L1 中的R7T和CDR-L1 中的Alls;和（d)CDR-L1 中的 G5SXDR-L1中的R7I和CDR-L1中的Alls。在具體實(shí)施例中，本發(fā)明抗體包含選自圖22中 所述氨基酸取代的氨基酸取代的組合。
[0013] 本發(fā)明的抗TNF-a抗體優(yōu)選與阿達(dá)木單抗抗個(gè)體基因型抗體5A1、10F8、7A11、 mil、6All和10B7中的一者、二者、H者、四者、五者或所有六者的結(jié)合降低。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼本發(fā)明的抗TNF-a抗體的核酸分子和包含其的宿主細(xì) 胞。
[0015] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含本發(fā)明的抗TNF-a抗體的醫(yī)藥組合物和通過(guò)投與抗 TNF-a抗體或含有其的醫(yī)藥組合物治療患有免疫病癥的人類患者的方法。在某些方面中， 所治療免疫病癥是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)(包括成人的中度到嚴(yán)重RA)、青少年型特發(fā)性關(guān) 節(jié)炎（JIA)(包括4歲和更大年齡患者的中度到嚴(yán)重多關(guān)節(jié)JIA)、銀屑病關(guān)節(jié)炎（PsA)(包 括成人的PsA)、關(guān)節(jié)粘連性脊椎炎（A巧（包括成人的AS)、克羅恩氏病把rohn'sdisease) (CD)(包括成人的中等或嚴(yán)重CD)、慢性斑塊狀銀屑?。≒s)(包括成人的中度到嚴(yán)重慢性斑 塊狀銀屑?。┗蜉S也型脊椎關(guān)節(jié)炎（axSpA)(包括無(wú)結(jié)構(gòu)損害的X射線證據(jù)的成人患者的 嚴(yán)重axSpA)。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1A-1C;圖1A提供合成D2E7 (阿達(dá)木單抗，HUMIRA)可變重鏈（Vh)和可變輕鏈 (V^片段的翻譯氨基酸序列。圖1B提供0267￥?和V^片段的CDR氨基酸序列。圖1C提供 D2E7Vh和D2E7Vl片段的核巧酸序列（分別為SEQIDN0:1和SEQIDN0:3)。
[0017] 圖2 ;提供D2E7-Vl中引起與TNF-a的中性結(jié)合和與抗Id5Al(a)、10F8(b)或 7All(c)的降低結(jié)合的有益突變列表。給出在個(gè)別CDR和在卡己特化abat)編號(hào)兩種情況 下的氨基酸位置。圖2按出現(xiàn)順序分別掲示SEQIDNO. :8-10。
[001引 圖3A-3B;圖3A提供D2E7-VhCDR-H1和CDR-肥中將引起與TNF-a的中性 結(jié)合和與抗IdlHll(d)、6All(e)或10B7(f)的降低結(jié)合的有益突變列表。圖3B提供 D2E7-VhCDR-H3中引起與TNF-a的中性結(jié)合和與抗IdlHll(d)、6All(e)或10B7訊的降 低結(jié)合的有益突變列表。給出在個(gè)別CDR和在卡己特編號(hào)兩種情況下的氨基酸位置。圖3A 按出現(xiàn)順序分別掲示SEQIDNO. :5-6。圖3B掲示SEQIDN0:7。
[0019] 圖4提供載體pYA206和pCWeOO中的D2E7的結(jié)構(gòu)。
[0020] 圖5提供人類TNF-a對(duì)細(xì)胞表面表達(dá)的WTD2E7F油的滴定曲線。
[0021] 圖6提供結(jié)合到細(xì)胞表面表達(dá)的WT-D2E7F油的抗個(gè)體基因型（抗Id)的滴定曲 線。
[0022] 圖7A-7B;圖7A提供經(jīng)TNF-a染色的野生型D2E7的FACS分選概況。圖7B提供 經(jīng)TNF-a染色的Vh點(diǎn)突變庫(kù)的FACS分選概況。
[002引圖8A-8B提供經(jīng)1H11染色的野生型D2E7和Vh點(diǎn)突變庫(kù)的FACS分選概況。
[0024] 圖9提供沉默密碼子突變D2E7富集比（W位置計(jì)）。給出在個(gè)別CDR情況下的氨 基酸位置。
[0025] 圖10提供D2E7子庫(kù)的板圖。給出在個(gè)別CDR和在卡己特編號(hào)兩種情況下的氨基 酸位置。圖10按出現(xiàn)順序從頂部到底部，從左到右分別掲示SEQIDNO. :8-10和5-7。
[0026] 圖11提供D2E7突變體子庫(kù)和野生型對(duì)照的FACS概況。
[0027] 圖12提供D2E7突變體子庫(kù)和野生型對(duì)照的FACS概況。
[002引圖13A-13D提供D2E7重鏈可變區(qū)的空間填充模型。圖A、B和C分別W灰色顯示 輕鏈CDR1、2和3。圖DW灰色顯示抗Id抗Id1H11的表位。如下文所繪示Vh序列（SEQ IDN0:2)顯示加下劃線的CDR和W粗體雙下劃線文本表示的對(duì)于與抗Id1H11的結(jié)合重要 的位置。H個(gè)CDR中的各者都向所述表位貢獻(xiàn)一或多個(gè)氨基酸。
[0029] EVQLVESGGGLVQPGR化化SCAASGFT抑ax:晝旦'WVRQAPGKGLEWVSAIT巡NSGHIDYADS 哩^RFTIS畑NAKNSLYLQMN化RAEDTAVYYCAK里進(jìn) ^STASSLDYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO: 2)
[0030] 圖14A-14D提供D2E7輕鏈可變區(qū)的空間填充模型。圖A、B和C分別W灰色顯示 輕鏈CDR1、2和3。圖DW灰色顯示抗Id5A1和10F8的表位。如下文所繪示列（SEQ IDN0:4)顯示加下劃線的CDR和W粗體雙下劃線文本表示的對(duì)于與抗Id5A1和10F8的結(jié) 合重要的位置。H個(gè)CDR中的各者都向所述表位貢獻(xiàn)一或多個(gè)氨基酸。
[0031] DIQMTQSPS化SASVGDRVTITCRASQGIRNYI,AWYQQKPGKAPKU,TYAASIIQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTIS化QP邸VATYYC皿I狂RAPYTFGQGTKVEIK(SEQIDNO:4)
[003引 圖15提供D2E7-VhCDRl-2突變體的單點(diǎn)FACS分析。
[0033] 圖16提供D2E7代表性位置分析。
[0034] 圖17提供平均1H11富集比（W位置計(jì)）。
[0035] 圖18提供平均5A1富集比（W位置計(jì)）。
[0036] 圖19提供平均10F8富集比（W位置計(jì)）。
[0037] 圖20A-20B顯示抗TNF-a抗體突變對(duì)與四個(gè)市售供體的血清試樣中的抗阿達(dá)木 單抗抗體的結(jié)合的影響。氨基酸位置是W卡己特編號(hào)給出。VkSS是指CDR-L1中具有取代 G28S和A34S(卡己特編號(hào)）的化，其對(duì)應(yīng)于CDR-L1中的G5S+A11S組合。
[0038] 圖21A-21B顯示與抗阿達(dá)木單抗抗體的結(jié)合的降低最大的抗TNF-a變體抗體。 VkSS是指CDR-L1中具有取代G28S和A34S(卡己特編號(hào)）的化，其對(duì)應(yīng)于CDR-L1中的 G5S+A11S組合。
[0039] 圖22顯示具有多個(gè)氨基酸取代的變體的結(jié)合數(shù)據(jù)。VkSS是指CDR-L1中具有取 代G28S和A34S(卡己特編號(hào)）的化，其對(duì)應(yīng)于CDR-L1中的G5S+A11S組合。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 識(shí)別具有陳化免疫原巧的杭體的方法
[0041] 本發(fā)明進(jìn)一步提供允許對(duì)要闡明的所關(guān)注抗體（參考抗體）內(nèi)所關(guān)注區(qū)域中的每 一氨基酸的免疫原性貢獻(xiàn)的系統(tǒng)。所述方法需要對(duì)參考抗體在一或多個(gè)區(qū)（例如，CDR-L1、 CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-肥、CDR-冊(cè)、FR-L1、FR-L2、FR-L3、FR-H1、FR-肥、FR-冊(cè)和 FR-H4中的一或多者）進(jìn)行全面誘變和評(píng)估突變對(duì)與抗個(gè)體基因型抗體（"抗Id")的結(jié)合 的效應(yīng)。本文所述方法可識(shí)別上述具有降低免疫原性的抗TNF-a抗體變體。
[0042]庫(kù)設(shè)計(jì)和構(gòu)筑:設(shè)計(jì)抗體庫(kù)，其在參考抗體的所需區(qū)或結(jié)構(gòu)域中的每一可能位置 處含有每一可能單一氨基酸取代，用于識(shí)別突變對(duì)與抗Id抗體的結(jié)合的效應(yīng)（良好、差或 中性）。隨后使用（例如）"隨機(jī)化NNK密碼子"構(gòu)筑抗體變體庫(kù)W產(chǎn)生單一氨基酸變體， 其中"N"是指任何堿基（例如，A、C、G或T)且"K"是指G或T。NNK隨機(jī)化方案可編碼覆 蓋所有20種天然氨基酸的32個(gè)不同密碼子。抗體的各位置處的氨基酸殘基可突變?yōu)榕c 相同位置處的野生型氨基酸不同的19種氨基酸中的任一者，從而在抗體中產(chǎn)生單一氨基 酸點(diǎn)突變。最終結(jié)果是抗體變體庫(kù)，其涵蓋有一個(gè)殘基在庫(kù)中成員之間各有不同的多種抗 體的群組。基于祀向突變的氨基酸數(shù)目，庫(kù)的總體復(fù)雜性可介于約50-10, 000個(gè)成員之間 (例如，50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、 7000、7500、8000、8500、9000、9500 或 10, 000 個(gè)成員），介于約 1000-5000 個(gè)成員之間，或?yàn)?約1000個(gè)成員。與庫(kù)的大小和復(fù)雜性無(wú)關(guān)，本文所述方法容許同時(shí)篩選庫(kù)的所有成員并同 時(shí)對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。
[0043] 作為非限制性實(shí)例，為識(shí)別與參考抗體相比具有降低免疫原性的特定抗體變體， 互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)中的氨基酸殘基是潛在突變祀。B細(xì)胞表位的消除或減少可產(chǎn)生具有降 低免疫原性的抗體。通常，可考慮并識(shí)別約50到60個(gè)CDR氨基酸位置用于突變?？稍O(shè)計(jì) 并構(gòu)筑合成DNA片段組，其編碼野生型親代Vh或V許日所有可能的單一氨基酸抗體變體?？?使用上述隨機(jī)化NNK密碼子產(chǎn)生單一氨基酸抗體變體。因此，CDR內(nèi)各位置處的氨基酸殘 基可突變，從而沿所選CDR區(qū)產(chǎn)生單一氨基酸點(diǎn)突變。最終結(jié)果是抗體變體庫(kù)，其是有一個(gè) 殘基在庫(kù)中成員之間各有不同的多種抗體的群組。在此實(shí)例中，庫(kù)具有約1000-1300個(gè)成 員，其中所選區(qū)中的50到60或65個(gè)CDR氨基酸位置中的各者經(jīng)19種天然氨基酸中的一 者取代，在任何給定位置處總共20種不同氨基酸（即，50X20 = 1000 ;60X20 = 1200 ;或 65X20 = 1300)。
[0044]抗體變體的表達(dá);在庫(kù)構(gòu)筑后，第二步驟是表達(dá)抗體變體庫(kù)用于通過(guò)細(xì)胞表面展 示來(lái)分選?？墒褂没谡故镜姆椒ǎɡ缯熬w展示、酵母展示、細(xì)菌展示和核糖體展示） 表達(dá)變體庫(kù)，并且優(yōu)選地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)W確保所表達(dá)變體進(jìn)行適當(dāng)折疊和翻譯后 修飾。
[0045] 對(duì)于哺乳動(dòng)物表達(dá)來(lái)說(shuō)，用于在細(xì)胞表面上系留并展示四聚體免疫球蛋白分子的 跨膜結(jié)構(gòu)域可為能夠經(jīng)由酶、化學(xué)或光解裂解移除的任何跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中， 跨膜結(jié)構(gòu)域側(cè)接由裂解酶鑒別并裂解的裂解位點(diǎn)。舉例來(lái)說(shuō)，裂解酶可為脂肪酶、醋酶、磯 酸酶、糖巧酶或駿膚酶。在一些實(shí)施例中，跨膜結(jié)構(gòu)域包含具有核酸酶（例如核糖核酸酶 (RNase)或脫氧核糖核酸酶值化se))鑒別并裂解的序列的寡核巧酸或寡核巧酸類似物。在 一些實(shí)施例中，跨膜結(jié)構(gòu)域包含蛋白酶鑒別并裂解的膚或膚類似物。
[0046] 在一些實(shí)施例中，可使用mRNA剪接產(chǎn)生具有或無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白（例 女口，參見美國(guó)專利第7, 947, 495號(hào)，其全部?jī)?nèi)容都W引用方式并入本文中）。
[0047] 在其它實(shí)施例中，跨膜結(jié)構(gòu)域側(cè)接由重組酶鑒別的重組酶鑒別位點(diǎn)。重組酶鑒 別位點(diǎn)的實(shí)例包括（但不限于）lox位點(diǎn)、att位點(diǎn)、dif位點(diǎn)和化t位點(diǎn)。關(guān)于重組酶的 綜述參見（例如）索爾（Sauer) ,1994,生物技術(shù)新見（Qirr.Opin.Biotech.) 5:521-527; 蘭迪（Landy)，1993,生物技術(shù)新見 3:699-707 ;薩多夫斯基（Sadowski)，1993,FASEB 7:760-767 ;和美國(guó)專利公開案第20040115814號(hào)。
[0048] 用于本文所述組合物和方法中的跨膜結(jié)構(gòu)域可源自I型、II型和III型 膜蛋白（例如，參見切斯納特（Chesnut)等人，1996,免疫學(xué)方法雜志（J.Imm. Methods)，193:17-27 ;瓦爾貝里（W址化erg)等人，1997,細(xì)胞生物學(xué)雜志（J.Cell Biol. )，137:555-562;廖（Liao) ,2001，生物技術(shù)與生物工程炬iotech.and Bioeng. )，73:313-323 ;和美國(guó)專利第5, 264,