專利名稱：：新型多價免疫球蛋白的制作方法新型多價免疫球蛋白本發(fā)明提供與一個細胞的至少2個細胞表面分子特異性結合的多價免疫球蛋白或其部分、它們的用途和制備它們的方法，在所述免疫球蛋白的至少一個結構環(huán)區(qū)中至少一個修飾決定其與所述細胞表面分子的表位結合，其中未經修飾的免疫球蛋白不顯著結合所述表位。在很多治療性、診斷性和分析應用中業(yè)已發(fā)現(xiàn)單克隆抗體的用途?；镜目贵w結構在本文用完整的IgGl免疫球蛋白作為例子予以闡明。兩條同樣的重鏈(H)和兩條同樣的輕鏈(L)結合形成Y形抗體分子。每一條重鏈都有四個結構域。氨基端可變區(qū)(VH)位于Y的頂部。跟隨著的是三個恒定區(qū)CH1、CH2和羧基端CH3，CH3位于Y主干的底部。一段短的區(qū)段，即轉換區(qū)，將重鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)連接起來。鉸鏈將CH2和CH3(Fc片段)與抗體其余部分(Fab片段)連接起來。完整的抗體分子通過蛋白酶在鉸鏈處切割可產生一個Fc片段和兩個同樣的Fab片段。輕鏈由可變區(qū)(VL)和恒定區(qū)(CL)這兩個結構域構成，VL和CL通過轉換區(qū)分隔開。鉸鏈區(qū)內的二硫鍵連接著兩條重鏈。輕鏈通過另外的二硫鍵與重鏈偶聯(lián)。Asn-連接的碳水化合物部分視免疫球蛋白類別連接在恒定區(qū)的不同位置。對于IgGl,在Cys235和Cys238對之間的4交鏈區(qū)內的兩個二硫鍵連接兩條重鏈。輕鏈由位于CH1結構域的Cys229s和CL結構域的Cys214s之間的另外的兩個二硫鍵與重鏈偶聯(lián)。碳水化合物部分連接到每個CH2的Asn306，在Y主干形成明顯的突出部分。這些特征具有意義深遠的功能結果。重鏈和輕鏈兩個的可變區(qū)(VH)和(VL)都位于Y的"頂部"，它們在那兒與抗原反應。分子的這一頂部是氨基酸序列N端所位于的一側。Y主干以有效介導效應子功能的方式突出，例如補體活化和與Fc受體相互作用、或ADCC和ADCP。其CH2和CH3結構域突出以促進與效應蛋白的相互作用。氨基酸序列的C端位于頂部的相反一側，可將其稱為Y的"底部"。在抗體中發(fā)現(xiàn)命名為X(lambda)和k(kappa)的兩種類型的輕鏈。特定免疫球蛋白具有k鏈或人鏈，從來不會一樣一條。在具有X或k輕鏈的抗體之間還沒有發(fā)現(xiàn)功能上的差別?？贵w分子中的每個結構域都有一個相似的結構兩個|3片層在擠壓式反向平行P桶中彼此緊密堆疊在一起。這種保守結構稱為免疫球蛋白折疊。免疫球蛋白恒定區(qū)折疊含有4股片層和3股片層，其中4股片層針對3股片層堆疊在一起。通過在各個片層p鏈之間的氫鍵結合、通過內部相對片層殘基之間的疏水鍵結合和通過各片層之間的二硫鍵來穩(wěn)定所述折疊。3股片層包含C、F和G鏈，4股片層有A、B、E和D鏈。字母A到G表示沿著免疫球蛋白折疊的氨基酸序列的卩鏈的次序位置?？勺儏^(qū)折疊具有9個(3鏈(betastrand),排列在4股和5股的兩個片層內。5股片層在結構上與恒定區(qū)的3股片層同源，但含有額外的C'和C"鏈。其余的鏈(A、B、C、D、E、F、G)在恒定區(qū)免疫球蛋白折疊中，與其配對物在拓樸學上相同，在結構上相似。二好u鍵將在相對片層中的B鏈和F鏈連接起來，如同在恒定區(qū)一樣。免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區(qū)都含有三個高變環(huán)，即互補決定區(qū)(CDR)。V區(qū)的三個CDR(CDR1、CDR2、CDR3)在卩桶的一端串在一起。CDR為連接免疫球蛋白折疊的(3鏈B-C、C'-C"和F-G的環(huán)。不同免疫球蛋白分子的CDR中的殘基有變化，使得每種抗體對抗原具有特異性?？贵w分子頂部的VL和VH結構域緊密堆疊在一起，使得6個CDR(每一結構域有3個)協(xié)作構建抗原特異性結合表面(或空穴)。因此，抗體的天然抗原結合位點由連接輕鏈可變區(qū)的B-C、C'-C"和F-G鏈和重鏈可變區(qū)的B-C、C'-C"和F-G鏈的環(huán)組成。在天然免疫球蛋白中不是CDR環(huán)的環(huán)，或并非由CDR環(huán)決定的抗原結合口袋部分的環(huán)，不具有抗原結合或表位結合特異性，但有助于整個免疫球蛋白分子和/或其效應物的正確折疊或其它功能，因此稱為結構環(huán)，供本發(fā)明目的用。現(xiàn)有技術文獻表明，為了改造現(xiàn)有抗原結合位點并藉此引入新的結合特性的目的，迄今一直采用免疫球蛋白樣支架結構。然而，迄今為止，為了抗原結合只有CDR區(qū)業(yè)已進行工程改造，換言之，在免疫球蛋白折疊情況下，為了改變其結合親和力或特異性，只對天然抗原結合位點進行了修飾。有大量的文獻記載了這種改造免疫球蛋白的不同形式，它們經常以在噬菌體顆粒表面展示或在各種原核或真核表達系統(tǒng)中可溶性表達的單鏈Fv片段(scFv)或Fab片段的形式來表達。PCT/EP2006/050059描述了工程改造免疫球蛋白的方法，包括在結構環(huán)區(qū)(structuralloopregion)內進行修飾以獲得新的抗原結合位點。該方法廣泛應用于免疫球蛋白，并可用于產生一系列靶向多種抗原的免疫球蛋白。但是，未明確描述細胞表面耙的多價結合物(binder)。US2005/266000A1描述了包含變異重鏈可變構架區(qū)(variableframeworkdomain,VFR)的多肽。VFR為可與抗原接觸的抗原結合口袋或溝(groove)部分。VFR為CDR環(huán)區(qū)部分，位于CDR環(huán)一側的可變區(qū)以經由CDR環(huán)區(qū)支持抗原結合。除VFR以外的構架環(huán)尚不能發(fā)生突變以用于工程改造抗原結合位點的目的。與人類癌癥有關的細胞表面蛋白可能是單克隆治療的有效靶標。抗體可通過調節(jié)細胞活化或通過補充免疫系統(tǒng)引起抗腫瘤反應。某些mAb通過交聯(lián)靶標來實現(xiàn)其部分作用效果，這可以將靶標聚起來并導致活化、抑制或放大細胞信號，最后以細胞靶標的細胞停滯和/或凋亡為結果。業(yè)已證明，某些Mab(抗CD19、抗CD20、抗CD21和抗CD22)對淋巴瘤細胞系很少或沒有先天抗生長活性，通過用它們作為四價同型二聚體而轉化成為有效的抗腫瘤藥。這些活性可通過募集效應細胞和/或補體在體內得到提高。用于治療性mAb的另一策略是將細胞毒性藥物與所述mAb偶聯(lián)。這樣的免疫毒素可結合細胞表面靶，接著內化，釋放藥物殺死該靶細胞?？赡苄枰獙袠舜丶鳛閮然南葲Q條件。為了提高mAb通過靶標分子簇集而發(fā)揮其作用的功效，已經設計了多種形式的多價Ab。業(yè)已發(fā)明了形成四價Ab的共價連接的全長IgG，以及經由使用其分泌尾端而模擬聚合IgM和IgA的天然存在的IgM和IgGAb。通過在全長IgG的每一H鏈的C端加上Fab設計出了另一種四價形式。為了讓腫瘤滲透得到改進，將使用單鏈Fv(scFv)2片段(每一Fv由通過肽接頭連接的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)組成)的較小的構建體連接在一起形成多價復合體。這樣的構建體半衰期可能相當短(與全長mAb半衰期比較)，因此，這一問題已經通過將這些scFv多聚體與IgGFc片l殳連接而解決了。4艮難控制用scFv和相似形式形成精確的聚合度，即二聚體、三聚體、四聚體，視基礎構建體和表達方法可以不同比率形成較大的復合體。產生多價免疫球蛋白的任何已知形式在免疫原性、體內半衰期或生產問題等方面都具有某些缺點。本發(fā)明的目的是提供模件系統(tǒng)(modularsystem),該系統(tǒng)可根據(jù)各種需要設計靶向細胞的多價免疫球蛋白，從而解決了現(xiàn)有技術的這些問題。發(fā)明簡述本發(fā)明提供經由經修飾的結構環(huán)提供與細胞表面分子的另外結合由此與細胞表面受體交聯(lián)來結合細胞表面蛋白的免疫球蛋白結構域。根據(jù)本發(fā)明，提供與一個細胞的至少2個細胞表面分子特異性結合的多價免疫球蛋白或其結合部分，在所述免疫球蛋白的至少一個結構環(huán)區(qū)中至少一個修飾決定其與所述細胞表面分子的表位(包括位于一個細胞上的或在同源細胞群內可得到的抗原特性結構)結合，其中未經修飾的免疫球蛋白不顯著結合所述表位。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的多價免疫球蛋白可進一步與一種或多種經修飾的免疫球蛋白或其部分或者與未經修飾的免疫球蛋白或其部分組合，以獲得組合免疫球蛋白。優(yōu)選地，在核苷酸序列或氨基酸序列內結構環(huán)結構域的修飾為缺失、取代、插入或其組合。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的免疫球蛋白或其部分的核酸，和用于工程改造本發(fā)明多價免疫球蛋白的方法，該方法包括以下步驟-提供編碼包含至少一個結構環(huán)區(qū)(structuralloopregion)的免疫球蛋白的核酸，-修飾所述結構環(huán)區(qū)的至少一個核苷酸殘基，-將所述經修飾的核酸轉移至表達系統(tǒng)，-表達所述多價免疫球蛋白，-使表達的多價免疫球蛋白接觸表位，和-測定所述多價免疫球蛋白是否結合所述表位。另外，提供本發(fā)明多價免疫球蛋白在制備用于治療用途例如用于腫瘤細胞治療和感染病原體的細胞的藥物中的用途。發(fā)明詳述本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白結構域可就其本身使用，或可摻入各種已知的抗體形式例如完全抗體、Fab、單鏈Fvs、Fab2、微抗體等等以提供另外的對細胞表面表位或受體的結合位點。具體地說，本發(fā)明涉及用于工程改造特異性結合抗原表位的免疫球蛋白的方法。通過在結構環(huán)區(qū)進行修飾，可對免疫球蛋白進行工程改造以結合表位。在一個優(yōu)選的實施方案中，免疫球蛋白特異性結合來源于或模擬同一抗原或不同抗原的至少兩個#1此不同的表位。例如，本發(fā)明方法涉及工程改造特異性結合至少一個第一表位的免疫球蛋白，并在所述免疫球蛋白的至少一個結構環(huán)區(qū)內包含至少一個修飾；然后測定所述至少一個環(huán)區(qū)與至少一個第二表位的特異性結合，其中未經修飾的結構環(huán)區(qū)(非CDR區(qū))不能特異性結合所述至少一個第二表位，該方法包括下列步驟-提供編碼與至少一個第一表位特異性結合并包含至少一個結構環(huán)區(qū)的免疫球蛋白的核酸，-修飾由所述核酸編碼的至少一個所述環(huán)區(qū)的至少一個核苷酸殘基，-將所述經修飾的核酸轉移至表達系統(tǒng)，-表達所述經修飾的免疫球蛋白，-使表達的經修飾免疫球蛋白接觸所述至少一個第二表位，和-測定所述經修飾的免疫球蛋白是否特異性結合第二表位。本發(fā)明方法優(yōu)選涉及在所述免疫球蛋白的至少一個結構環(huán)區(qū)里的至少一個+務飾，和測定所述至少一個環(huán)區(qū)與至少一個選自細J包表面抗原的分子的特異性結合，其中含有未經修飾的結構環(huán)區(qū)的免疫球蛋白不能特異性結合所述至少一個分子。本文所用術語"免疫球蛋白"包括免疫球蛋白或免疫球蛋白的部分或片段或衍生物。因此，該術語包括根據(jù)本發(fā)明待修飾的"免疫球蛋白結構域肽"(本文所用術語免疫球蛋白和抗體可互換)，以及含有結構環(huán)或這類結構域(例如微結構域(minidomain))的結構環(huán)的免疫球蛋白結構域或其部分。免疫球蛋白可作為分離的肽或作為與其它肽的組合分子使用。在某些情況下，優(yōu)選用所定義的經〗奮飾的結構環(huán)或結構環(huán)區(qū)或其部分作為分離的分子用于結合或組合目的。本文所定義的"免疫球蛋白結構域"含有經修飾和工程改造后可具有特異性結合特征的免疫球蛋白結構域肽或多肽。該肽與免疫球蛋白結構域序列同源，優(yōu)選長度為至少5個氨基酸，更優(yōu)選長度為至少IO或甚至至少50或100個氨基酸，構成至少部分結構環(huán)或結構環(huán)區(qū)或結構域的非CDR環(huán)區(qū)。優(yōu)選地，該肽排除那些被認為是非功能氨基酸、雜合或嵌合CDR區(qū)或CDR樣區(qū)和/或CDR區(qū)的正則結構的插入。結合特征是指特異性表位結合、親和力(affinity)和親合力(avidity)。本發(fā)明免疫球蛋白的衍生物是一種或多種本發(fā)明免疫球蛋白和/或其中可在一種或多種其它蛋白質(例如其它免疫球蛋白、配體、支架蛋白、酶、毒素等等)的任何位置與本發(fā)明免疫球蛋白的任何結構域或微結構域融合的融合蛋白的任意組合。本發(fā)明免疫球蛋白的衍生物還可通過重組技術或通過各種化學技術(例如共價偶聯(lián)、靜電作用、二硫鍵等)結合其它物質而獲得。結合到免疫球蛋白的其它物質可為脂類、糖類、核酸、有機和無機分子或其任意組合(例如PEG、前藥或藥物)。衍生物還可為具有相同氨基酸序列但完全或部分從非天然或經化學修飾的氨基酸制備的免疫球蛋白。本發(fā)明的工程分子將作為獨立蛋白(stand-aloneprotein)以及融合蛋白或衍生物使用，最典型的融合方式是作為較大抗體結構或完全抗體分子或其部分(例如Fab片段、Fc片段、Fv片段等)的組成部分。使用工程蛋白來產生同時為雙特異性、三特異性并且或許甚至同時具有更多特異性的分子是可行的，同時根據(jù)計劃使用這樣的分子的需求來同時控制和預選擇結合效價也是可行的。本發(fā)明另一方面涉及具有至少一個環(huán)區(qū)的免疫球蛋白，其特征在于所述至少一個環(huán)區(qū)包含形成至少一個經修飾的環(huán)區(qū)的至少一個氨基酸修飾，其中所述至少一個經修飾的環(huán)區(qū)特異性結合抗原的至少一個表位。優(yōu)選在分子水平上結合至少一個經修飾的抗體結構域，該抗體結構域經由非可變序列或結構環(huán)結合具有至少一個其它結合分子的特異性配偶體，該其它結合分子可以是抗體、抗體片4殳、可溶性受體、配體或另外的^f奮飾抗體結構域。作為由本發(fā)明免疫球蛋白特異性識別的結合對部分起作用的分子優(yōu)選選自蛋白質分子、核酸和糖類。經修飾的免疫球蛋白的環(huán)區(qū)可特異性結合任何種類的結合分子或結構，特別是抗原、蛋白質分子、蛋白質、肽、多肽、核酸、多聚糖、碳水化合物、脂類、有機小分子、無機分子或其組合或融合物。當然，經修飾的免疫球蛋白可包含至少兩個環(huán)或環(huán)區(qū)，由此每一個環(huán)或環(huán)區(qū)可特異性結合不同的分子或表位。根據(jù)本發(fā)明，可將結合抗原或所有種類的細胞表面抗原的抗原結合位點的區(qū)域引入特定抗體結構的結構環(huán)內。本發(fā)明術語"抗原"應指已知與或能夠與免疫球蛋白的CDR環(huán)區(qū)相互作用的分子或結構。現(xiàn)有技術提及的天然抗體的結構環(huán)區(qū)不與抗原相互作用，但對整體結構有幫助和/或有助于結合效應分子。只有按照本發(fā)明進行工程改造后，結構環(huán)才可以形成抗原結合口袋而不涉及CDR環(huán)或CDR區(qū)。本發(fā)明術語"細胞表面抗原"包括細胞表面上所有能夠被抗體結構識別的抗原和這樣的分子的片段。優(yōu)選"細胞表面抗原"是已經被證明是抗原或能夠在免疫學上或治療上有關的那些抗原，尤其是那些已經測定其臨床前或臨床功效的抗原。這些細胞表面分子明確地和本發(fā)明目的有關，并介導殺細胞活性。一旦本發(fā)明免疫球蛋白與這些細胞表面分子中的至少兩個結合后，免疫系統(tǒng)就提供細胞溶解或細胞死亡，由此提供攻擊人體細胞的有效手段。優(yōu)選地，抗原選自細胞表面抗原，包括受體，特別是選自erbB受體酪氨酸激酶(例如EGFR、HER2、HER3和HER4,但不限于這些)、TNF-受體超家族分子(例如Apo-l受體、TNFR1、TNFR2)、神經生長因子受體NGFR、CD40、T-細胞表面分子、T-細胞受體、T-細胞抗原0X40、TACI-受體、BCMA、Apo-3、DR4、DR5、DR6、誘餅受體(例如DcRl、DcR2)、CAR1、HVEM、GITR、ZTNFR畫5、NTR-1、TNFL1,但不限于這些分子；B-細胞表面抗原，例如CDIO、CD19、CD20、CD21、CD22、實體瘤或血癌細胞抗原或標記、淋巴瘤或白血病細胞、包括血小板在內的其它血液細胞，但不限于這些分子。根據(jù)另一個優(yōu)選實施方案，結合經修飾的結構環(huán)區(qū)的抗原或分子選自腫瘤相關抗原(特別是EpCAM)、腫瘤相關糖蛋白-72(TAG-72)、腫瘤相關抗原CA125、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、高分子量黑素瘤相關抗原(HMW-MAA)、表達與LewisY有關的糖類的腫瘤相關抗原、癌胚抗原(CEA)、CEACAM5、HMFGPEM、粘蛋白MUC1、MUC18和細胞角蛋白腫瘤相關抗原、細菌抗原、病毒抗原、過敏原、變態(tài)反應相關分子IgE、cKIT和Fc-s-受體I、IRp60、IL-5受體、CCR3、紅細胞受體(CR1)、人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、新生兒Fc-y-受體FcRn、Fc-y-受體Fc-yRI、Fc-y-RII、Fc-yRIII、Fc-a-受體、Fc-e-受體、熒光素、溶菌酶、toll樣受體9、促紅細胞生成素、CD2、CD3、CD3E、CD4、CDll、CDlla、CD14、CD16、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33(p67蛋白)、CD38、CD40、CD40L、CD52、CD54、CD56、CD64、CD80、CD147、GD3、IL畫1、IL-1R、IL-2、IL國2R、IL畫4、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL畫12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、LIF、OSM、干擾素a、干擾素卩、干擾素y;TNF-a、TNF卩2、TNFa、TNFa卩、TNF-R1、TNF畫RII、FasL、CD27L、CD30L、4-lBBL、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、LIGHT、VEG1、OX40L、TRAIL受體-1、Al腺苷受體、淋巴毒素卩受體、TACI、BAFF-R、EPO;LFA-3、ICAM-1、ICAM-3、整聯(lián)蛋白卩l(xiāng)、整聯(lián)蛋白卩2、整聯(lián)蛋白a4/p7、整聯(lián)蛋白a2、整聯(lián)蛋白a3、整聯(lián)蛋白a4、整聯(lián)蛋白a5、整聯(lián)蛋白a6、整聯(lián)蛋白av、aV卩3整聯(lián)蛋白、FGFR-3、角質形成細胞生長因子、GM-CSF、M-CSF、RANKL、VLA-1、VLA-4、L-選擇蛋白、抗Id、E-選擇蛋白、HLA、HLA-DR、CTLA-4、T細胞受體、B7-l、B7-2、VNR整聯(lián)蛋白、TGF卩1、TGF卩2、嗜伊紅粒細胞趨化蛋白1(eotaxinl)、BLyS(B-淋巴細胞刺激因子)、補體C5、IgE、IgA、IgD、IgM、IgG、因子VII、CBL、NCA90、EGFR(ErbB-l)、Her2/neu(ErbB誦2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB4)、組織因子、VEGF、VEGFR、內皮素受體、VLA-4、糖類(例如血型抗原和有關糖類)、糖基化Galili、胃泌激素、胃泌激素受體、腫瘤相關糖類、半抗原NP-cap或NIP-cap、T細胞受體a/(3、E-選擇蛋白、P-糖蛋白、MRP3、MRP5、谷胱甘肽-S-轉移酶pi(多重抗藥性蛋白)、a-顆粒膜蛋白(GMP)MO、地高辛、胎盤堿性磷酸酶(PLAP)和睪丸PLAP樣堿性磷酸酶、轉鐵蛋白受體、乙酰肝素酶I、人心肌肌球蛋白、糖蛋白nb/IIIa(GPnb/IIIa)、人巨細胞病毒(HCMV)gH包膜糖蛋白、HIVgpl20、HCMV、呼吸道合胞病毒RSVF、RSVFFgp、VNR整聯(lián)蛋白、HepBgpl20、CMV、gpllbllla、HIVIIIBgpl20V3環(huán)、呼吸道合胞病毒(RSV)Fgp、單純皰滲病毒(HSV)gD糖蛋白、HSVgB糖蛋白、HCMVgB包膜糖蛋白、產氣莢膜梭菌毒素及其片段。只要抗原亞結構在免疫學上相關，即也被天然抗體或單克隆抗體識別，則通常將其稱為"表位"(例如B-細胞表位、T-細胞表位)。本發(fā)明術語"表位"應指可完全構成本發(fā)明結合結構域或免疫球蛋白的特異性結合配偶體或作為特異性結合配偶體部分的分子結構。表位在化學上可由糖類、肽、脂肪酸、無機物質或其衍生物及其任何組合組成。若表位為肽或多肽，則通常肽內將包括有至少3個氨基酸，優(yōu)選8-50個氨基酸，更優(yōu)選約10-20個氨基酸。肽的長度沒有臨界上限，可包含幾乎全長的多肽序列。表位可為線性表位或構象表位。線性表位由多肽鏈的一級序列單區(qū)段組成。線性表位可連續(xù)或重疊。構象表位由通過多肽折疊形成四級結構聚到一起的氨基酸組成，這些氨基酸在線性序列中不必彼此相鄰。表位明確地為診斷有關的分子的至少一部分，即在樣品中沒有或存在表位與疾病或與健康狀況或與制備中的過程狀態(tài)或與環(huán)境和食物狀況在性質上或數(shù)量上相關聯(lián)。表位還可為治療有關的分子的至少一部分，即該分子可由改變該疾病病程的特異性結合結構域靶向。優(yōu)選地，通過在免疫球蛋白序列(特別是核苷酸序列)中取代、缺失和/或插入一個或多個元件而在結構環(huán)中引入新的抗原結合位點。根據(jù)本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案，修飾至少一個核苷酸導致由所述核酸編碼的免疫球蛋白的氨基酸序列的取代、缺失和/或插入。修飾至少一個環(huán)區(qū)可導致取代、缺失和/或插入一個或多個核苷酸或氨基酸(優(yōu)選點突變)或甚至交換整個環(huán)，更優(yōu)選交換至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15直至30個氨基酸。因此，經修飾的序列包含在結構環(huán)的保守區(qū)中未包括的氨基酸，新引入的天然存在的但對修飾位點為外源的氨基酸，或天然存在氨基酸的取代物。當外源氨基酸選自一組特定氨基酸時，例如具有特定極性或疏水性的氨基酸，依照本發(fā)明可獲得在隨機位置富含該組特定氨基酸的文庫(library)。這樣的庫也稱作"融合"文庫。經隨機修飾的核酸分子可包含本文鑒定的重復單位，這些重復單位編碼所有的已知天然存在的氨基酸或其子集。將那些含有經修飾的序列(其中特殊的氨基酸子集用作修飾目的)的文庫稱作"融合"文庫。這樣的文庫成員提高了這樣子集的氨基酸在修飾位置的概率，比平常提高到至少2倍，優(yōu)選到至少3倍或甚至高至少4倍。這樣的文庫也有文庫成員數(shù)目限制或下限，以便實際的文庫成員數(shù)目達到理論文庫成員數(shù)目。在某些情況下，融合文庫的文庫成員數(shù)目不少于理論數(shù)目的103倍，優(yōu)選不少于102倍，最優(yōu)選不少于10倍。本發(fā)明文庫可設計為含有至少50%、優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90Q/o的特殊^t式的專一的文庫，或主要由特異性抗體模式組成的文庫。優(yōu)選特異性抗體模式，以便本發(fā)明優(yōu)選文庫選自VH文庫、VHH文庫、VK文庫、VX文庫、Fab文庫、CH1/CL文庫和CH3文庫。特別優(yōu)選其特征在于含有一個以上抗體結構域的復合分子內容的文庫，例如IgG文庫或Fc文庫。其它優(yōu)選文庫為含有T-細胞受體、形成T-細胞受體的文庫。另外的優(yōu)選文庫為表位文庫，其中融合蛋白包含具有表位變體的分子，還使得能選擇具有相似結合作用但功能性不同的竟爭性分子。實例為TNFa文庫，其中TNFa融合蛋白的三聚體由單遺傳包裝展示。然而，插入免疫球蛋白環(huán)區(qū)的氨基酸的最大數(shù)目可優(yōu)選最多不超過30、優(yōu)選25、更優(yōu)選20個氨基酸。通過本領域已知方法，用所有可能的氨基酸或選擇優(yōu)選用于隨機化目的的氨基酸，優(yōu)選隨機或半隨機發(fā)生氨基酸取代和插入，其如本專利申請所公開的。修飾位點可處于特殊單結構環(huán)或結構環(huán)區(qū)。環(huán)區(qū)通常由彼此不相鄰的至少2個、優(yōu)選至少3個或至少4個環(huán)組成，這樣可有助于通過形成抗原結合位點或抗原結合口袋來結合抗原。優(yōu)選一個或多個修飾位點位于10個氨基酸范圍內，更優(yōu)選在20、30、40、50、60、70、80、90直至IOO個氨基酸內，特別是在結構區(qū)內，以形成表面或口袋，在此處抗原可在空間上4姿近環(huán)區(qū)。優(yōu)選通過隨機、半隨機或特別地通過定點隨機誘變方法(尤其是缺失、交換或將隨機產生的插入引入到結構環(huán)內)，使至少一個環(huán)區(qū)優(yōu)選地突變或修飾產生文庫。或者，優(yōu)選應用組合方法。可采用任何已知的誘變方法，其中之一是盒誘變。這些方法可用于在本發(fā)明免疫球蛋白的所需位置產生氨基酸修飾。在某些情況下，例如用任何可能的氨基酸或選擇的優(yōu)選氨基酸隨機選擇位置，以使環(huán)序列隨機化，或者用簡單的規(guī)則進行氨基酸改變。例如，可優(yōu)選使所有的殘基突變?yōu)樘囟ò被崂绫彼?，稱為氨基酸掃描或丙氨酸掃描。可將這樣的方法與更加復雜的工程方法結合起來，后者采用了選擇方法篩選出較高水平的序列多樣性。本發(fā)明優(yōu)選方法涉及編碼免疫球蛋白、免疫球蛋白結構域或其部分的經隨機修飾的核酸分子，這樣的核酸分子在具有5'-NNS-3'、5'-NNN-3'、5'-NNB-3'或5'-NNK-3'序列的結構環(huán)編碼區(qū)內包含至少一個核苷酸重復單位。在某些實施方案中，經修飾的核酸包含選自以下的核苷酸密碼子TMT、WMT、BMT、RMC、RMG、MRT、SRC、KMT、RST、YMT、MKC、RSA、RRC、NNK、NNN、麗S或其任意組合(編碼遵照IUPAC)?？赏ㄟ^將合成寡核苷酸引入到較大的核酸區(qū)段，或通過全程合成完全核酸分子來實施核酸分子修飾。若欲編碼氨基酸子集，可用會減少無義序列組合數(shù)目的三核苷酸結構單元實施核酸合成(例如Yanez等，NucleicAcidsRes.(2004)32:el58;Virnekas等，NucleicAcidsRes.(1994)22:5600-5607)。經隨機修飾的核酸分子可包含編碼所有已知天然存在的氨基酸的上述經鑒別的重復單位。如本領域所熟知，有多種用于鑒別和分離具有某些結合特征和親和力的蛋白的可供選擇的技術，包括例如展示技術，例如噬菌體展示、核糖體展示、細胞表面展示等等，其如下所述。用于生產和篩選抗體變體的一般方法為本領域所熟知。用于抗體分子生物學、表達、純化和篩選的方法描述于AntibodyEngineering(抗體工程學)，由Duebel和Konterma皿編輯，Springer-Verlag，Heidelberg,2001;和Hayhurst和Georgiou，2001,CurrOpinChemBiol5:683-689;Maynard和Georgiou，2000,A腿RevBiomedEng2:339-76。用以下方式理解本發(fā)明"結構環(huán)"或"非CDR環(huán)"由具有所謂免疫球蛋白折疊的結構域構成的免疫球蛋白。大體上，通過環(huán)連接反向P片層以形成緊壓的反平行P桶。在可變區(qū)內，某些結構域的環(huán)本質上決定抗體特異性，即通過抗體的天然結合位點結合抗原。這些環(huán)被稱作CDR環(huán)。CDR環(huán)位于CDR環(huán)區(qū)內，在某些情況下也可位于與CDR環(huán)相鄰的可變構架區(qū)(稱為"VFR")。已知VFR可幫助形成通常主要由CDR環(huán)決定的抗體的抗原結合口袋。因此，認為VFR為CDR環(huán)區(qū)的部分，并且不適合用于本發(fā)明目的。與CDR環(huán)區(qū)內的或位于最接近CDR環(huán)的VFR形成對照，可變區(qū)的其它VFR將特別適用于本發(fā)明。那些VFR是位于CDR環(huán)區(qū)對面的或在可變免疫球蛋白結構域C端一側的VFR結構環(huán)?？贵w結構域的所有其它環(huán)對所述分子結構和/或效應功能相當有幫助。這些環(huán)在本文中定義為"結構環(huán)"或非CDR環(huán)，其還應排除在CDR環(huán)區(qū)內的任何VFR?？蓪⒕幋a經修飾的免疫球蛋白(在以下整個說明書中免疫球蛋白總是包括免疫球蛋白片段或衍生物)的核酸分子克隆到宿主細胞，進行表達并分析其結合特異性。用熟知的方法和在以下書籍中描述的可用于本發(fā)明的多種方法實施這些實踐MolecularCloning-ALaboratoryManual(分子克隆實驗手冊)，3.sup.rdEd.(Maniatis,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,200l)和CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物學通用方案)(JohnWiley&Sons)。為了表達所述免疫球蛋白，可將編碼本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白的核酸摻入到表達載體。表達載體通常包含位于含操縱或調控序列、選擇標記、任何融合配偶體和/或另外的元件的功能關系(functionalrelationship)中的可操作連接的免疫球蛋白。可通過在誘導或引起經修飾的免疫球蛋白表達的合適的條件下，培養(yǎng)用核酸(優(yōu)選含有編碼經修飾的免疫球蛋白的核酸的表達載體)轉化的宿主細胞來產生本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白。將外源核酸分子？1入宿主的方法為本領域所熟知，并將視所用宿主而變化。當然，還可采用非細胞或無細胞表達系統(tǒng)來表達經修飾的免疫球蛋白。本文所用術語"表達系統(tǒng)"指含有可操作連接的所需編碼序列和調控序列的核酸分子，由此用這些序列轉化或轉染的宿主能夠產生所編碼的蛋白質。為了有效轉化，載體上可包括表達系統(tǒng)；然而，除此外有關DNA也可整合到宿主染色體上。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施方案，表達系統(tǒng)包含載體。本領域所知的任何表達載體如合適可用于該目的。經修飾的免疫球蛋白優(yōu)選在宿主中表達，優(yōu)選在細菌、酵母、植物細胞、在動物細胞或在植物或動物中表達。多種合適的宿主細胞可用于表達經修飾的免疫球蛋白，包括但不限于哺乳動物細胞(動物細胞)或/和植物細胞、細菌(例如枯草芽孢桿菌(Bac/〃wssw^7/力、大腸桿菌(Esc/zer/cWaco//))、昆蟲細胞和酵母(例如巴其斤德、畢赤酵母CP/c/z/a;aston》、酉良酒酵母OSacc/zarawyc&sce^v/w'ae))。例如，可用于本發(fā)明的多種細胞系參見ATCC細胞系目錄，可得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。此外，植物和動物也可用作表達本發(fā)明免疫球蛋白的宿主?？筛鶕?jù)所用宿主選擇表達載體或表達盒以及轉染載體或轉染盒。當然，還可使用非細胞或無細胞蛋白質表達系統(tǒng)。產生足量蛋白質的體外轉錄/翻譯蛋白質表達平臺提供無細胞蛋白質表達的多個優(yōu)點，排除了對通常與基于細胞的表達系統(tǒng)有關的費力的上游和下游步驟(例如宿主細胞轉化，培養(yǎng)或裂解)的需要。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，經修飾的免疫球蛋白在表達后進行純化或分離?？梢远喾N本領域技術人員已知的方法分離或純化經修飾的免疫球蛋白。標準純化方法包括色譜技術(包括親和色譜法、離子交換或疏水色i普法)、電泳技術、免疫技術、沉淀技術、透析技術、過濾技術、濃縮技術和色譜聚焦技術。通常通過特定融合配偶體實現(xiàn)純化。例如，若釆用GST融合，可用谷胱甘肽樹脂純化抗體；若采用His-標簽，則用Ni+2親和色譜法純化；或若用flag-標簽，則用固定化抗flag抗體純化。對于合適純化技術的一般指導方針，參見AntibodyPurification:PrinciplesandPractice(抗體純化原理與實踐),3.sup.rdEd.,Scopes,Springer-Verlag，NY,1994。當然，還可能在宿主表面表達本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白，特別是在細菌、昆蟲或酵母細胞表面或在嗟菌體或病毒表面?？捎枚喾N方法篩選經修飾的免疫球蛋白，這些方法包括但不限于在體外測定、體內和基于細胞的測定中使用的方法和選擇技術。在篩選程序中可使用自動化和高通量篩選技術。篩選可采用融合配偶體或標記應用，例如酶、免疫標記、同位素標記或小分子標記，例如熒光染料或比色染料或發(fā)光分子。在一個優(yōu)選實施方案中，在體外測定中篩選免疫球蛋白的功能特性和/或生物物理學特性。在一個優(yōu)選實施方案中，篩選抗體的功能，例如其催化反應的能力或其對其靶標的結合親和力。測定可采用多種檢測方法，包括但不限于發(fā)色標記、熒光標記、發(fā)光標記或同位素標記。如本領域所知，篩選方法子集為那些用于選擇有利文庫成員的方法。本文中將這些方法稱為"選擇方法，，，這些方法用于本發(fā)明篩選經修飾的免疫球蛋白。當用選擇方法篩選免疫球蛋白庫時，只增殖、分離和/或觀測滿足某些選擇標準的有利的文庫成員。如所理解的一樣，因為僅觀測最合適的變體，所以這樣的方法能夠篩選比通過個別地測定文庫成員的適當性的方法可篩選的文庫更大的文庫。能夠通過任何方法、技術或共價或非共價連接的融合配偶體、相應基因型的免疫球蛋白表型(其為具有編碼該表型的核酸的抗體的功能)進行選擇。例如，通過將文庫成員與基因III蛋白融合，能夠用噬菌體展示作為選擇方法。在這種方法中，選擇或分離滿足某些標準(例如對免疫球蛋白的耙標的結合親和力)的經修飾的免疫球蛋白，也選擇或分離編碼它們的核酸。一旦分離，然后就可擴增編碼經修飾的免疫球蛋白的一種或多種基因?？芍貜头Q為淘選(panning)的分離和擴增的這一過程，以使有利的抗體變體富集在文庫中。對連接的核酸的核酸序列測定最終使得可鑒定基因?？稍诒景l(fā)明中使用的用于篩選免疫球蛋白文庫的多種選擇方法為本領域已知。這些包括但不限于噬菌體展示(Phagedisplayofpeptidesandantibodies:alaboratorymanual(肽和4元體喧菌體展示實驗手冊)，Kay等，1996,AcademicPress,SanDiego,Calif"1996;Low-man等，1991,Biochemistry30:10832-10838;Smith,1985，Science228:1315-1317)及其衍生技術，例如選擇性噬菌體感染(Malmborg等，1997，JMolBiol273:544-551)、選擇性感染噬菌體(Krebber等，1997，JMolBiol268:619-630)和延時感染性淘選(delayedinfectivitypanning)(Benhar等，2000，JMolBiol301:893-904);細胞表面展示(Witrrup,2001，CurrOpinBiotechnol,12:395-399)，例如在細菌中展示(Georgiou等，1997,NatBiotechnol15:29-34;Georgiou等，1993,TrendsBiotechnol11:6-10;Lee等，2000，NatBiotechnol18:645-648;Jun等,1998，NatBiotechnol16:576-80)、酵母中展示(Boder和Wittrup,2000，MethodsEnzymol328:430-44;Boder和Wittrup，1997,NatBiotechnol15:553-557)和哺乳動物細胞中展示(Whitehorn等，1995，Bio/technology13:1215-1219);以及體外展示技術(Amstutz等，2001,CurrOpinBiotechnol12:400-405),例如多核糖體展示(Mattheakis等,1994,ProcNatlAcadSciUSA91:9022-9026)、核糖體展示(Hanes等，1997，ProcNatlAcadSciUSA94:4937-4942)、mRNA展示(Roberts和Szostak,1997,ProcNatlAcadSciUSA94:12297-12302;Nemoto等，1997,FEBSLett414:405-408)和核糖體失活展示系統(tǒng)(Zhou等，2002，JAmChemSoc124,538-543)?？捎糜诒景l(fā)明的其它選擇方法包括不依賴展示的方法，例如體內方法，包括但不限于周質表達和細胞計量篩選(cytometricscreening)(Chen等，2001,NatBiotechnol19:537-542)、抗體片段補體測定(Johnsson和Varshavsky,1994，ProcNatlAcadSciUSA91:10340-10344;Pelletier等，1998,ProcNatlAcadSciUSA95:12141-12146)和在選擇模式(Visintin等，1999,ProcNatlAcadSciUSA96:11723-11728)中使用的酵母雙雜交篩選(Fields和Song,1989，Nature340:245-246)。在備選實施方案中，通過以下融合配偶體能夠進行選擇結合表達載體上的特定序列的融合配偶體，由此使該融合配偶體和相關的Fc變體文庫成員(具有編碼它們的核酸)共價或非共價連接。在備選實施方案中，若抗體表達給予細胞某些生長、繁殖或存活優(yōu)勢，則可進行體內選擇。稱作"定向進化"方法的選擇方法子集為包括那些在選擇期間雜交或交配有利序列并有時摻入新的突變的方法。如本領域技術人員所理解，定向進化方法可促進對文庫中最有利序列的鑒別，可增加篩選的序列的多樣性?？捎糜诒景l(fā)明篩選抗體變體的多種定向進化方法為本領域已知，包括但不限于DNA改組(PCTWO00/42561A3;PCTWO01/70947A3)、外顯子改組(美國專利第6，365，377號；Kolkman和Stemmer,2001，NatBiotechnol19:423-428)、家族改組(Crameri等，1998:Nature391:288-291;美國專利第6,376,246號)、RACfflTT.TM.(Coco等，2001，NatBio畫technol19:354-359;PCTWO02/06469)、STEP和隨機引發(fā)體外重組(Zhao等，1998，NatBiotechnol16:258-261;Shao等,1998,NucleicAcidsRes26:681-683)、核酸外切酶介導的基因拼裝(美國專利第6,352,842號；美國專利第6,361,974號)、基因位點飽和誘變.TM.(美國專利第6,358,709號)、基因重新拼裝.TM.(美國專利第6,358,709號)、SCRATCHY(Lutz等，2001，ProcNatlAcadSciUSA98:11248-11253)、DNA片段化方法(Kikuchi等，Gene236:159-167)、單鏈DNA改組(Kikuchi等，2000,Gene243:133-137)和AME系統(tǒng).TM.定向進化抗體工程技術(AppliedMolecularEvolution)(美國專利第5，824，514號;美國專利第5，817，483號；美國專利第5,814,476號；美國專利第5,763,192號;美國專利第5,723,323號)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施方案，通過選自以下的結合測定確定經修飾的免疫球蛋白與分子的特異性結合免疫測定，優(yōu)選酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、表面等離子體共振測定、飽和轉移差語核磁共振波譜分析、轉移NOE(trNOE)核磁共振波譜分析、竟爭性測定、組織結合測定、活細胞結合測定和細胞提取物測定。用多種本領域已知方法可進行結合測定，這些方法包括但不限于FRET(熒光共振能量轉移)和基于BRET(生物發(fā)光共振能量轉移)的測定、AlphascreenTM(放大發(fā)光親近均相測定)、閃爍親近測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、SPR(表面等離子體共振，也稱為BIACORETM)、等溫滴定量熱法、差示掃描量熱法、凝膠電泳和包括凝膠過濾在內的色譜法。這些方法和其它方法均可利用某些融合配偶體或標記。經修飾的免疫球蛋白優(yōu)選與標記或報告分子綴合，標記或報告分子選自有才幾分子、酶標記、》欠射性標記、顏色標記、熒光標記、發(fā)色標記、發(fā)光標記、半抗原、地高辛配基、生物素、金屬絡合物、金屬、膠體金及其混合物。綴合標記或報告分子的經修飾的免疫球蛋白可用于例如診斷方法中。經修飾的免疫球蛋白可綴合使得可在例如結合測定(例如ELISA)和結合研究中簡單檢測所述綴合物的其它分子。在一個優(yōu)選實施方案中，用一種或多種基于細胞的測定或體內測定篩選抗體變體。對于這樣的^r測，通常外源地加入純化或未純化的經修飾的免疫球蛋白，以使細胞與屬于文庫(libmry)的各個免疫球蛋白或免疫球蛋白庫(pool)接觸。這些測定法通常但并不總是基于免疫球蛋白的功能；這些功能也就是抗體結合其靶標和介導某些生物化學事件(例如效應功能、配體/受體結合抑制、細胞凋亡等等)的能力。這樣的測定法通常涉及監(jiān)測細胞對抗體的應答，例如細胞存活、細胞死亡、細胞形態(tài)變化或轉錄活化(例如天然基因或報告基因的細胞表達)。例如，這樣的檢測可測量抗體變體引發(fā)ADCC、ADCP或CDC的能力。對于某些檢測，可能需要加入另外的細胞或組分，也就是除靶細胞之外的細胞或組分，例如血清補體或效應細胞，例如外周血單核細胞(PBMC)、NK細胞、巨噬細胞等等。這樣的另外的細胞可來自生物體，優(yōu)選人類、小鼠、大鼠、兔和猴。免疫球蛋白可引起某些表達靶標的細胞系的細胞凋亡，或它們可通過已經加入到該檢測中的免疫細胞介導攻擊靶細胞。用于監(jiān)測細胞死亡或生存能力的方法為本領域已知，包括應用染料、免疫化學、細胞化學和放射性試劑。例如，半胱天冬蛋白酶(caspase)染色檢測可測量細胞凋亡，吸收或釋放放射性底物或熒光染料例如阿爾瑪藍可監(jiān)測細胞生長或活化。在一個優(yōu)選實施方案中，可使用基于DELFIARTEuTDA的細胞毒性檢測(PerkinElmer，MA)?；蛘?，可通過測量釋放的一種或多種天然細胞內組分例如乳酸脫氫酶，來監(jiān)測死亡的或損傷的靶細胞。在基于細胞的測定中轉錄活化也可用作測定功能的方法。在這種情況下，可通過測定可被上調的天然基因或免疫球蛋白，例如釋放某些可被測量的白介素，或作為選擇可經由報告構建體讀出，來監(jiān)測響應?；诩毎臏y定還可涉及測量作為存在經修飾的免疫球蛋白響應的細胞的形態(tài)學變化。用于這樣的檢測的細胞類型可為本領域已知，可采用的真核的或原核的和多種細胞系?；蛘?，用已經用編碼變體的核酸轉化或轉染的細胞實施基于細胞的篩選。更確切地說，不向細胞中外源地加入抗體變體。例如，在一個實施方案中，基于細胞的篩選利用細胞表面展示?？刹捎媚軌蛟诩毎砻嬲故窘浶揎椀拿庖咔虻鞍椎娜诤吓渑俭w(Witrrup,2001,CurrOpinBiotechnol,12:395-399)。在一個優(yōu)選實施方案中，可用一種或多種基于細胞的測定經過實驗測定經修飾的免疫球蛋白的免疫原性。在一個優(yōu)選實施方案中，離體T-細胞活化檢測用于經過實驗定量免疫原性。在該方法中，抗原呈遞細胞和來自匹配供者的幼稚T細胞一次或多次受到目標肽或全抗體的刺激。然后，可用多種方法檢測T細胞活化，例如通過監(jiān)測細胞因子的產生或測量攝取的含氚胸苷。在最優(yōu)選實施方案中，用Elispot測定來監(jiān)測干擾素y的產生(Schmittel等，2000，J.Immunol.Meth.，24:17-24)。在細胞、組織和全生物體實驗中，可離體表征本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白的生物學特性。如本領域所知，為了測量藥物用于治療疾病或疾病模型的功效，或為了測量藥物的藥代動力學、藥效學、毒性和其它性質，經常在動物體內測試藥物，這些動物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、貓、豬和猴?？蓪游镒鳛榧膊∧Ｐ?。經常在小鼠中測試治療藥，小鼠包括但不限于棵鼠、SCID小鼠、異種移植物小鼠和轉基因小鼠(包括敲入小鼠和敲除小鼠)。這樣的實驗可提供有意義的數(shù)據(jù)，用于確定抗體用作具有合適半衰期、效應功能、細胞凋亡活性、細胞毒性或溶細胞性活性的治療劑的潛力。任何生物體(優(yōu)選哺乳動物)可用于測試。例如，因為靈長類猴和人類的遺傳相似性而可作為合適的治療模型，所以可用靈長類猴測試本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白的功效、毒性、藥代動力學、藥效學、半衰期或其它特性。物質在人體內測試最終需要正式批準為藥物，因此當然要提供這些實驗。因此，可在人體內測試本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白以確定其治療功效、毒性、免疫原性、藥代動力學和/或其它臨床特性。尤其是那些通過至少兩個表面抗原結合單個細胞(優(yōu)選結合至少三個結構交聯(lián)靶細胞)的本發(fā)明多價免疫球蛋白，將被認為是凋亡前的情況，并對靶向和交聯(lián)細胞發(fā)揮細胞凋亡活性。多價結合為結合配偶體提供了相當大的聯(lián)合，也被稱為交聯(lián)，它是細胞凋亡的必要條件?？梢远喾N抗體制品來使用本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白。在一個實施方案中，將本發(fā)明抗體變體例如作為主動或被動免疫療法用于治療或預防，作為診斷試劑、商用化合物或研究試劑、優(yōu)選治療劑用于制備性、商業(yè)或分析應用。在單克隆或多克隆抗體組合物中可使用經修飾的免疫球蛋白或抗體變體。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白用于捕獲或殺死帶有目標抗原的目標細胞，例如癌細胞。在備選實施方案中，本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白用于例如通過拮抗細胞因子或細胞因子受體來封閉、拮抗或刺激目標抗原。在備選優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白用于封閉、拮抗或刺激生長因子或生長因子受體，藉此介導殺死帶有或需要目標抗原的目標細^^。在備選優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白用于封閉、拮抗或刺激酶和酶底物。本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白可用于各種治療目的，優(yōu)選用于主動或^皮動免疫療法。具體地說，本發(fā)明免疫球蛋白或通過本發(fā)明方法可獲得的免疫球蛋白可用于制備供主動免疫用的疫苗。據(jù)此免疫球蛋白用作抗原性藥物物質以調配疫苗，或在疫苗制劑中使用用于在離體或體內釣取或捕獲抗原結構。在一個優(yōu)選實施方案中，將包含經修飾的免疫球蛋白的抗體給予患者以治療特定疾病。用于本發(fā)明目的的"患者"既包括人類又包括其它動物，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人類。本文"特定疾病"是指可通過給予包含本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白的藥用組合物改善的疾病。在一個實施方案中，本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白是給予患者的唯一的治療藥物?；蛘?，本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白與一種或多種其它治療藥物聯(lián)合給予，這些包括但不限于細胞毒性藥物、化療藥、細胞因子、生長抑制劑、抗激素藥物、激酶抑制劑、抗血管生成藥、保心藥或其它治療藥物?？砂殡S一種或多種其它治療方案給予經修飾的免疫球蛋白。例如，可將本發(fā)明抗體變體連同化學治療、放射治療或化學治療和放射治療二者給予患者。在一個實施方案中，可聯(lián)合一個的免疫球蛋白。依照本發(fā)明的另一個實施方案，采用本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白和一種或多種其它抗癌治療來離體治療癌癥細胞。預期這樣的離體治療可用于骨髓移植，特別是自體骨髓移植。當然，預期可采用本發(fā)明抗體與外科手術等其它治療技術合用。多種其它治療藥物可用于與本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白一起給予。在一個實施方案中，經修飾的免疫球蛋白與抗血管生成藥一起給予，后者為阻斷或某種程度上干擾血管發(fā)育的化合物?？寡苌梢蜃涌衫鐬樾》肿踊虻鞍踪|，例如抗體、Fc融合分子或細胞因子，它們結合與促進血管生成有關的生長因子或生長因子受體。本文優(yōu)選抗血管生成因子為結合血管內皮生長因子(VEGF)的抗體。在備選實施方案中，經修飾的免疫球蛋白與誘導或加強獲得性免疫應答的治療藥物(例如把向CTLA-4的抗體)一起給予。在備選實施方案中，經修飾的免疫球蛋白與酪氨酸激酶抑制劑一起給予，后者是在某種程度上抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子。在備選實施方案中，本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白與細胞因子一起給予。本文所用"細胞因子"是指由一個細胞群釋放的可作為細胞間介質(包括趨化因子)對另一細胞起作用的蛋白質的通稱。涵蓋其中本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白與一種或多種治療活性劑調配在一起的藥用組合物。通過將具有所需純度的所述免疫球蛋白與4壬選藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington'sPharmaceuticalSciences(雷明頓藥物科學),第16版,Osol,A.編輯,1980)混合，來制備呈凍干制劑或水性溶液劑形式的合適的本發(fā)明抗體變體的儲存制劑。用于體內給藥的制劑優(yōu)選無菌。這一點易于通過經無菌過濾膜過濾或其它方法來完成。本文公開的經修飾免疫球蛋白和其它治療活性劑還可調配為免疫脂質體和/或包裹在孩"交嚢中?？捎枚喾N方法給予包含本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白的藥用組合物，優(yōu)選藥用組合物呈無菌水性溶液劑的形式，給予方法包括但不限于經口、皮下、靜脈內、鼻內、耳內、透皮、黏膜、局部(例如凝膠劑、藥膏、洗劑、霜劑等)、腹膜內、肌內、肺內(例如可購自Aradigm的AERxTM可吸入技術或購自InhaleTherapeutics的InhanceTM肺遞送系統(tǒng))、陰道內、胃腸外、直腸或眼內。本文所用術語"特異性結合，，指在不同類的分子群中確定目標關聯(lián)配體的結合反應。因此，在指定的條件(例如在免疫球蛋白情況下免疫測定條件)下，具體的抗體結合其特定"目標"，并不以顯著量結合存在于樣品中的其它分子。經修飾的結構環(huán)區(qū)可類比抗體CDR,為結合抗原-、結構-或分子的蛋白質部分，而其本身不是抗原。本發(fā)明另一方面涉及用于制備在所述免疫球蛋白的結構環(huán)區(qū)中包含至少一個修飾的免疫球蛋白或其藥用制品并測定所述免疫球蛋白與抗原表位結合的方法，其中未經修飾的免疫球蛋白不顯著結合所述表位，該方法包括下列步驟-提供編碼包含至少一個環(huán)區(qū)的免疫球蛋白的核酸，-修飾至少一個所述環(huán)區(qū)的至少一個核苷酸殘基，-將所述經修飾的核酸轉移至表達系統(tǒng)，-表達所述經修飾的免疫球蛋白，-讓表達的經修飾免疫球蛋白與表位接觸，-測定所述經修飾的免疫球蛋白是否與所述表位結合，和-提供結合所述表位的經修飾免疫球蛋白和任選地將其制成藥用制品。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明免疫球蛋白為雙特異性抗體或雙特異性單鏈抗體。進一步優(yōu)選免疫球蛋白包含雙特異性結構域或其部分，包括微結構域。具體地說，本發(fā)明涉及用于以下方面的方法制備與至少一個第一分子特異性結合的多特異性免疫球蛋白或其藥用制品，在所述免疫球蛋白至少一個結構環(huán)區(qū)包含至少一個修飾；并測定所述至少一個環(huán)區(qū)與至少一個第二分子的特異性結合，所述第二分子為抗原，例如選自過^:原、腫瘤相關抗原、自體抗原、酶、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原和病毒抗原，其中含有未經修飾的結構環(huán)區(qū)的免疫球蛋白不能特異性結合所述至少一個第二分子，該方法包括下列步驟-提供編碼包含至少一個結構環(huán)區(qū)、特異性結合至少一個第一分子的免疫球蛋白的核酸，-修飾由所述核酸編碼的至少一個所述環(huán)區(qū)的至少一個核苷酸殘基，-將所述經修飾的核酸轉移至表達系統(tǒng)，-表達所述經修飾的免疫球蛋白，-讓該表達的經修飾免疫球蛋白與所述至少一個第二分子接觸，和-測定所述經修飾的免疫球蛋白是否特異性結合第二分子，和-提供與所述至少一個第二分子特異性結合的經修飾免疫球蛋白和任選地將其制成藥用制品。優(yōu)選將不止一種特異性工程改造為特異性結合對成員(Kufer等(2004)TrendsinBiotechnology,第22巻，第238-244頁)。為了產生多特異性(例如雙特異性、單克隆抗體或抗體片段)已經進行了無數(shù)嘗試。在產生由兩條不同的多肽鏈(重鏈和輕鏈)構成的雙特異性抗體中的一個問題，是需要在一個細胞中表達四條不同的鏈(兩條重鏈和兩條輕鏈)，導致多種不同的分子組合，不得不在混合物中將其與所需的雙特異性分子分開。由于它們的相似性，這些分子的分離很困難并花費多。已經采用了多種技術來使這種不想要的配對偶的出現(xiàn)最小化(Carter(2001)JournalofImmunologicalMethods,第248巻，第7-15頁)。對該問題的一個解決方法是制備具有兩種特異性的一條多肽鏈，象例如彼此連接的兩條scFv，或制備所謂的雙抗體。這樣的分子經證明遠離天然分子折疊，非常難產生(Le-Gall等(2004)ProteinEngineering,Design&Selection,第17巻，第357-366頁)。目前設計雙特異性抗體的另一個問題是這樣一個事實即使雙親抗體二價結合其各自的結合配偶體(例如lgG)，得到的雙特異性抗體對各自結合配偶體的每一個也是單價的。優(yōu)選本發(fā)明多特異性分子解決了這些問題將雙特異性分子表達為一條多肽鏈成為可能(經修飾的Ig結構域具有兩個結合特異性，參見實施例部分)，這比表達兩條抗體多肽鏈更容易完成(Cabilly等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3273-3277(1984))。由于第二種特異性位于分子的非可變部分，不必有兩條不同的重鏈或不同的輕鏈這一事實，其也可制備為象分子的抗體(即由兩條多肽鏈構成，為同型二聚體或異型二聚體)。因此，不可能有兩條鏈錯誤配對。本發(fā)明抗體可由重鏈和輕鏈組成，它們一起形成通過第一種特異性來結合特異性結合配偶體的可變區(qū)?？赏ㄟ^重鏈或輕鏈任一種的任何結構環(huán)的經修飾的環(huán)形成第二種特異性。通過不止一個結構上相鄰的非CDR環(huán)(在重鏈或在輕鏈上或在兩種鏈上)也可形成結合位點。經修飾的抗體或衍生物可為完全抗體或抗體片段(例如Fab、CH1-CH2、CH2-CH3、Fc，有或沒有鉸鏈區(qū))?？蓡蝺r或多價結合相同或不同的結合配偶體，或甚至視設計而定對于不同的結合配偶體具有不同效價。因為存在多種不同的環(huán)用于選擇和設計在重鏈及輕鏈的非CDR區(qū)的特異性結合位點，所以設計具有甚至超過兩種特異性而沒有上述問題的抗體衍生物成為可能?？捎没虿挥秒慕宇^來連接在一條多肽鏈內的特異性結合結構域。所述發(fā)明的免疫球蛋白的經修飾的結構環(huán)區(qū)可在所述免疫球蛋白的恒定區(qū)和/或可變區(qū)內。萬一經修飾的結構環(huán)在恒定區(qū)內，優(yōu)選在CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C或其部分內。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，免疫球蛋白為人源或鼠源。既然經修飾免疫球蛋白可用于各種目的，特別是用于藥用組合物，那么免疫球蛋白優(yōu)選為人源或鼠源。當然，經修飾的免疫球蛋白還可為人源化或嵌合免疫球蛋白。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，人免疫球蛋白選自IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4和IgM。鼠免疫球蛋白優(yōu)選選自IgA、IgD、IgE、IgGl、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3和IgM。經修飾的免疫球蛋白可源自上述經鑒別的免疫球蛋白類別之一并此后在結構上加以改變。免疫球蛋白優(yōu)選包含免疫球蛋白或其部分的重鏈和/或輕鏈。對于本發(fā)明目的，可優(yōu)選提供異型二聚體或同型二聚體分子以及單體免疫球蛋白。經修飾的免疫球蛋白可包含重鏈和/或輕鏈和至少一個可變區(qū)和/或恒定區(qū)。本發(fā)明免疫球蛋白優(yōu)選包含免疫球蛋白或其部分(包括微結構域)的至少一個恒定區(qū)和/或至少一個可變區(qū)。恒定區(qū)為免疫球蛋白分子的不變部分的免疫球蛋白折疊單位，也稱為恒定區(qū)結構域(例如CH1、CH2、CH3、CH4、Ck、Cl)?？勺儏^(qū)為免疫球蛋白的可變部分的免疫球蛋白折疊單位，也稱為可變區(qū)結構域(例如Vh、Vk、VI、Vd)。優(yōu)選本發(fā)明免疫球蛋白由選自CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C或其部分或組合的恒定區(qū)組成，恒定區(qū)包括微結構域，具有至少一個環(huán)區(qū)，該免疫球蛋白的特征為所述至少一個環(huán)區(qū)包含形成至少一個經修飾的環(huán)區(qū)的至少一個氨基酸修飾，其中所述至少一個經修飾的環(huán)區(qū)特異性結合抗原的至少一個表位。本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白可包含一個或多個恒定區(qū)(例如至少2個、3個、4個、5個、6個、IO個結構域)。如果在經修飾的免疫球蛋白中存在不止一個結構域，則這些結構域可為相同類型或不同類型(例如CH1-CH1-CH2、CH3-CH3、Fc區(qū)、(CH2)2-(CH3)2)。當然，單個結構域的順序也可為任何種類(例如CH1-CH3-CH2、CH4-CH1-CH3-CH2)。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，經修飾的環(huán)區(qū)CH1、CH2、CH3和CH4包含第7-21位氨基酸、第25-39位氨基酸、第41-81位氨基酸、第83-85位氨基酸、第89-103位氨基酸和第106-117位氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，CH3的第15-17位、第29-34位、第85.4-85.3位、第92畫94位、第97-98位和/或第108-110位的氨基酸殘基經過修飾。人源Igk-C和Igl-C的環(huán)區(qū)優(yōu)選包含第8-18位氨基酸、第27-35位氨基酸、第42-78位氨基酸、第83-85位氨基酸、第92-100位氨基酸、第108-117位氨基酸和第123-126位氨基酸。鼠源Igk-C和Igl-C的環(huán)區(qū)優(yōu)選包含第8-20位氨基酸、第26-36位氨基酸、第43-79位氨基酸、第83-85位氨基酸、第90-101位氨基酸、第108-116位氨基酸和第122-125位氨基酸。根據(jù)特定實施方案，本發(fā)明免疫球蛋白可在選自VH、Vk、Vi、VHH及其組合的可變區(qū)內含有修飾。更明確地，它們在第7-21位氨基酸、第25-39位氨基酸、第41-81位氨基酸、第83-85位氨基酸、第89-103位氨基酸或第106-117位氨基酸內包含至少一個修飾，其中在所述結構域內所述氨基酸位置的編號方式為IMGT編號。本發(fā)明另一優(yōu)選免疫球蛋白由重鏈或輕鏈或其部分(包括微結構域)的可變區(qū)與至少一個環(huán)區(qū)、優(yōu)選結構環(huán)區(qū)組成，其特征在于所述至少一個環(huán)區(qū)包含形成至少一個經修飾的環(huán)區(qū)的至少一個氨基酸修飾，其中所述至少一個經修飾的環(huán)區(qū)特異性結合抗原的至少一個表位。在備選實施方案中，本發(fā)明免疫球蛋白的特征為人源VH或Vk或VX環(huán)區(qū)在第8-20位氨基酸、第44-50位氨基酸、第67-76位氨基酸和第89-101位氨基酸、最優(yōu)選第12-17位氨基酸、第45-50位氨基酸、第69-75位氨基酸和第93-98位氨基酸內包含至少一個修飾，其中在所述結構域內所述氨基酸位置的編號方式為IMGT編號。如有可能，選擇用于本發(fā)明修飾目的的人源免疫球蛋白可變區(qū)結構環(huán)區(qū)優(yōu)選包含第8-20位氨基酸、第44-50位氨基酸、第67-76位氨基酸和第89-101位氨基酸。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施方案，如有可能，選擇用于本發(fā)明修飾目的的鼠源免疫球蛋白可變區(qū)結構環(huán)區(qū)包含第6-20位氨基酸、第44-52位氨基酸、第67-76位氨基酸和第92-101位氨基酸。本發(fā)明免疫球蛋白還優(yōu)選為駱駝源。駱駝抗體僅包含一條重鏈，具有與由輕鏈和重鏈組成的正?？贵w相同的抗原親合力。因此，駱駝抗體比例如人抗體更小一些，這使得它們可滲透到致密組織到達抗原，而較大的蛋白質不能到達這里。此外，與常用抗體比較起來，簡單、高親合力和特異性和達到及與活性部位反應的潛力，駱駝重鏈抗體在設計、制備和應用臨床上有價值的化合物等方面都表現(xiàn)出優(yōu)勢。駱駝或駱駝源的免疫球蛋白優(yōu)選包含至少選自CH1、CH2和CH3的一個恒定區(qū)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施方案，駱駝免疫球蛋白CH1、CH2和CH3的環(huán)區(qū)包含第8-20位氨基酸、第24-39位氨基酸、第42-78位氨基酸、第82-85位氨基酸、第91-103位氨基酸和第108-117位氨基酸。甚至更特別地，鼠源免疫球蛋白VH環(huán)區(qū)在第6-20位氨基酸、第44-52位氨基酸、第67-76位氨基酸和第92-101位氨基酸內包含至少一個修飾，其中在所述結構域內所述氨基酸位置的編號方式為IMGT編號。駱駝源VHH經修飾的環(huán)區(qū)優(yōu)選在第7-18位氨基酸、第43-55位氨基酸、第68-75位氨基酸和第91-101位氨基酸內包含至少一個修飾，其中在所述結構域內所述氨基酸位置的編號方式為IMGT編號。上述各個免疫球蛋白的經鑒別的氨基酸區(qū)為特定適于本發(fā)明修飾目的的環(huán)區(qū)。本發(fā)明再一方面涉及用于特異性結合和/或檢測分子的方法，該方法包括下列步驟(a)讓本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白或通過本發(fā)明方法可獲得的經修飾的免疫球蛋白與懷疑含有所述分子的試驗樣品接觸，和(b)檢測潛在的特異性免疫球蛋白/分子復合物的形成。本發(fā)明另一方面涉及用于特異性分離分子的方法，該方法包括下列步驟(a)讓本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白或通過本發(fā)明方法可獲得的經修飾的免疫球蛋白與含有所述分子的樣品接觸，(b)分離所形成的特異性免疫球蛋白/分子復合物，和(c)任選地從所述復合物分離分子。本發(fā)明免疫球蛋白可用于從樣品特異性地分離分子。若使用多特異性免疫球蛋白，則從樣品可分離不止一個分子。在這樣的方法中用經修飾的免疫球蛋白尤其有利，因為其使得例如可產生具有固定在其上的限定量結合配偶體(即經修飾的免疫球蛋白)均質表面的介質，結合配偶體能夠結合待分離的分子。與此相反，若用單特異性結合配偶體，不產生均質介質，因為單一結合配偶體不能以同樣的效率結合介質。本發(fā)明另一方面涉及用于讓化合物靶向目標的方法，該方法包括下列步驟(a)讓本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白或通過本發(fā)明方法可獲得的經修飾的免疫球蛋白與能夠特異性結合所述化合物接觸，(b)將免疫球蛋白/化合物復合物遞送到目標。本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白可用于將結合到CDR和/或經修飾的環(huán)區(qū)的至少一種化合物遞送到目標。這樣的免疫球蛋白可在疾病治療過程中用于將治療物質遞送到優(yōu)選作用位點。本發(fā)明另一方面涉及本發(fā)明免疫球蛋白或通過本發(fā)明方法可獲得的免疫球蛋白在制備免疫球蛋白的蛋白質文庫中的用途。另外，本發(fā)明的文庫不僅僅含有多種蛋白質或融合蛋白、遺傳包裝物，而且含有蛋白質前體、核酸、核糖體、細胞、病毒、噬菌體和表達編碼蛋白質的信息和/或這樣的蛋白質的其它展示系統(tǒng)。本發(fā)明另一方面涉及包含本發(fā)明免疫球蛋白或通過本發(fā)明方法可獲得的免疫球蛋白的蛋白質文庫。在上面和實施例中可發(fā)現(xiàn)用于構建所述文庫的優(yōu)選方法。本發(fā)明文庫可用于鑒別結合獨特分子的免疫球蛋白。具體地說，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明免疫球蛋白或通過本發(fā)明方法可獲得的免疫球蛋白的蛋白質文庫在設計免疫球蛋白衍生物中的用途?？赏ㄟ^用以下蛋白質文庫改變現(xiàn)有的免疫球蛋白以將抗原結合位點51入到任何結構域或微結構域相應結構域的蛋白質文庫具有至少10個、優(yōu)選勵個、更優(yōu)選勵0個、更優(yōu)選畫00個、更優(yōu)選100000個、最優(yōu)選超過1000000個變體結構域或微結構域，且具有至少一個經修飾的環(huán)，特別地為一個或多個結構環(huán)。文庫成員的數(shù)目甚至可更高一些，在大部分情況下高達10el2,且某些展示系統(tǒng)例如核糖體展示，該數(shù)目可甚至更高。然后篩選結合特定抗原的文庫。在鑒別了分子所需的特性后，通過基因工程技術將所選擇的結構域或微結構域克隆到最初的免疫球蛋白，以使其置換野生型區(qū)?；蛘撸挥芯幋a環(huán)或編碼突變氨基酸的DNA可被交換以獲得具有特定抗原的另外的結合位點的免疫球蛋白。突變的抗原特異性結構環(huán)位點的選擇視最初免疫球蛋白結構和另外的結合位點目的而定。例如，若最初分子為必須插入另外抗原結合位點而不干擾效應功能的完全免疫球蛋白，則待修飾的環(huán)將選自遠離為Fc效應分子的天然結合配偶體的CH2和CH3的結構域。若最初免疫球蛋白為Fab片段，則在輕鏈或重鏈恒定區(qū)或各自的可變區(qū)內修飾環(huán)是可能的。為了產生文庫，人們可制備突變原始分子(在一個或多個結構域的一個或多個結構環(huán)上具有突變)文庫。選擇完全突變的原始分子可具有某些優(yōu)勢，因為選擇與經修飾的結構環(huán)結合的抗原將傳遞空間有利的修飾，若還對其它特性進行測定，則突變免疫球蛋白將顯示出來。特別地優(yōu)選Fc文庫，例如在C端環(huán)區(qū)具有結合位點的文庫。突變結構域或微結構域或結構域融合分子的蛋白質文庫的大小要求(即變體蛋白質數(shù)目)視任務而定。一般而言，重新產生抗原結合位點的文庫需要比用于進一步修飾已經存在的由經修飾的結構環(huán)(例如用于提高對抗原的親和力或改變微妙的特異性)構成的工程抗原結合位點的文庫更大。本發(fā)明還涉及免疫球蛋白文庫或核酸文庫，它們包含許多免疫球蛋白，例如恒定區(qū)或可變區(qū)、微結構域和/或包含在微結構域中的至少一個結構環(huán)區(qū)，或編碼這一切的核酸分子。所述文庫含有具有不同修飾的成員，其中多數(shù)由在至少一個結構環(huán)區(qū)的修飾來界定。核酸文庫優(yōu)選包括至少10個具有核苷酸序列差別以獲得至少一個不同的氨基酸(導致一個氨基酸交換)的不同的成員，更優(yōu)選包括至少100、更優(yōu)選1000或10000個不同的成員(例如通過隨才幾化策略或組合4支術設計)。甚至還優(yōu)選更多樣性的單獨成員數(shù)目，例如至少1000000或至少10000000個。為了產生多特異性免疫球蛋白，本發(fā)明另一方面為選自至少2個本發(fā)明文庫的2個不同的免疫球蛋白、結構域或微結構域的組合。這些經選擇的特異性免疫球蛋白可彼此組合和與結構單元類似的其它分子組合，設計結構域或微結構域的最佳排列以獲得所需要的性質。例如，具有抗原結合性質并基于Fc的分子可如此使用作為用于其它結合模體的載體或作為構建具有恒定區(qū)或可變區(qū)的免疫球蛋白的結構單元，或另外僅與恒定區(qū)組合，例如多聚體Fc分子，優(yōu)選具有2、3或4個抗原結合位點。此外，可將一個或多個本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白引入到蛋白質的各種和所有不同的位點，而不破壞該蛋白質的結構。所創(chuàng)造的這樣的"結構域改組"技術新文庫可再次用于選擇所需要的性質。優(yōu)選地，本發(fā)明免疫球蛋白由至少兩個免疫球蛋白結構域或其部分(包括微結構域)組成，每一個結構域都含有至少一個抗原結合位點。也優(yōu)選包含免疫球蛋白或其部分(包括微結構域)的至少恒定區(qū)的一個結構域和/或至少可變區(qū)的一個結構域的本發(fā)明免疫球蛋白。因此，例如在C端區(qū)修飾的可變區(qū)，或連接經修飾的CH1區(qū)(例如經修飾的CH1微結構域)的可變區(qū)，為優(yōu)選實施方案之一。優(yōu)選文庫含有選自免疫球蛋白結構域、微結構域或其衍生物的本發(fā)明免疫球蛋白。本發(fā)明優(yōu)選實施方案為用于抗原結合的分子(抗原結合分子)，其包含按照本發(fā)明修飾的至少一個免疫球蛋白結構域和結構環(huán)區(qū)以結合該抗原，其中所述結合分子不包含抗體可變區(qū)。它可包含對抗體活性有用的其它部分(例如天然的或經修飾的效應區(qū)(序列))；然而，在其天然存在的位置其缺乏抗體的"天然"結合區(qū)，即可變區(qū)或CDR環(huán)，包括CDR區(qū)內的VFR環(huán)。本發(fā)明的這些抗原結合分子具有上面對本發(fā)明分子所描述的優(yōu)點，但沒有由CDR環(huán)介導的抗體特異性結合活性；然而，在結構環(huán)區(qū)具有新近引入的特異性結合活性。優(yōu)選地，本發(fā)明這些抗原結合分子包含CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C及其組合；所述組合包含至少2個、優(yōu)選至少4個、尤其至少6個恒定區(qū)和至少一個按照本發(fā)明修飾的結構環(huán)或環(huán)區(qū)。優(yōu)選這些結構環(huán)區(qū)經由根據(jù)本發(fā)明修飾的結構環(huán)區(qū)或在這樣兩個恒定區(qū)之間天然存在的結構環(huán)連接。本發(fā)明這些抗原結合分子的實施方案由根據(jù)本發(fā)明在結構環(huán)中具有至少一個修飾的抗體Fc區(qū)組成。用于本發(fā)明的抗原結合分子也優(yōu)選結構環(huán)中新的抗原結合位點通過隨機技術引入，即通過隨機技術交換環(huán)的一個或多個氨基酸殘基，或通過隨機產生的引入插入到這樣的結構環(huán)中?？晒┻x擇的優(yōu)選是使用組合方法。優(yōu)選在經修飾的結構環(huán)中抗原結合位點選自合適文庫。本發(fā)明其它方面涉及具有抗原結合位點的經修飾的免疫球蛋白，以提供與未經修飾的免疫球蛋白無關的特異性并摻入到一個或多個結構環(huán)中。本文所用術語"無關"是指抗原不能由特異性CDR結合區(qū)或免疫球蛋白的其它天然或內在結合區(qū)所識別。免疫球蛋白的外源結合配偶體但并非天然結合配偶體由此可通過新近形成的結構環(huán)的抗原結合位點結合。這意味著不認為天然結合配偶體(例如Fc-受體或免疫系統(tǒng)效應器)通過不適合于未經修飾的免疫球蛋白的抗原結合位點來結合。優(yōu)選本發(fā)明免疫球蛋白包含至少2個抗原結合位點，第一位點結合第一表位，第二位點結合第二表位。根據(jù)優(yōu)選實施方案，本發(fā)明免疫球蛋白包含至少2個環(huán)區(qū)，第一環(huán)區(qū)結合第一表位，第二環(huán)區(qū)結合第二表位。至少第一或至少第二環(huán)區(qū)或二者都可含有結構環(huán)。本發(fā)明免疫球蛋白包括本領域已知的其含有本發(fā)明必需要素的功能性片段根據(jù)本發(fā)明修飾的結構環(huán)或環(huán)區(qū)。優(yōu)選本發(fā)明免疫球蛋白包含具有與未經修飾的結構域至少50%同源性的結構域。術語"同源性，，表示多肽在其一級、二級或三級結構的相應位置具有相同或保守的殘基。該術語還延伸到編碼同源多肽的2個或更多個核苷酸序列。"同源免疫球蛋白結構域"，是指就全長天然序列免疫球蛋白結構域序列或本文公開的全長免疫球蛋白結構域序列的任何其它片段而論，具有至少約50%氨基酸序列同一性的本發(fā)明免疫球蛋白結構域。優(yōu)選地，同源免疫球蛋白結構域將具有與天然免疫球蛋白結構域序列或本文公開的全長免疫球蛋白結構域序列的任何其它明確限定的片段至少約50%氨基酸序列同一性，優(yōu)選至少約55%氨基#列同一性，更優(yōu)選至少約60%氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約65%氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約70%氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約75%氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約80%氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約85%氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約90%氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約95%氨基酸序列同一性。就本文所鑒定的免疫球蛋白結構域序列的"氨基酸序列同一性百分比(°/。)"而言，定義為在比對序列和必要時引入空位(gap)以達到最大序列同一性百分比并且不考慮任何作為序列同一性部分的保守取代后，候選系列中的氨基酸殘基與特定免疫球蛋白結構域序列中的氨基酸殘基相同的百分比?？捎帽绢I域技術內的各種方法完成用于測定氨基酸序列同一性百分比目的的比對，例如用公眾可獲得的計算機軟件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可確定用于測量比對的合適參數(shù)，包括完成貫穿待比較的序列的全長的最高比對所需要的任何算法。通過用WU-BLAST-2計算機程序(Altschul等，MethodsinEnzymology266:460-480(1996))，可如下所述獲得氨基酸序列同一性百分比(。/。)值。將大部分WU-BLAST-2檢索參數(shù)設為默認值。將那些不設定為默認值的(即可調參數(shù))設定為以下值重疊跨距(overlapspan)=1,重疊分數(shù)=0.125,字串閾值(wordthreshold)(T)=11,打分矩陣=BLOSUM62。當采用WU-BLAST-2時，用(a)除以(b)來求出氨基S^列同一性％值(a)在具有源自天然免疫球蛋白結構域序列的目標免疫球蛋白結構域的氨基酸序列和由WU-BLAST-2決定的比較目標氨基酸序列(即目標免疫球蛋白結構域與其比較的序列，其可能是未經修飾的免疫球蛋白結構域)之間匹配相同的氨基酸殘基數(shù)目；(b)目標免疫球蛋白結構域的非隨機部分的氨基酸殘基總數(shù)目。例如，在"包含具有與氨基酸序列B至少80%氨基酸序列同一性的氨基,列A的多肽"表述中，氨基酸序列A是比較目標氨基酸序列，氨基酸序列B是目標免疫球蛋白結構域的氨基酸序列。本發(fā)明另一方面涉及含有以下成分的結合配偶體試劑盒(a)具有與摻入一個或多個結構環(huán)的免疫球蛋白無關的抗原結合位點的經修飾的免疫球蛋白，和(b)含有所述抗原表位的結合分子。根據(jù)本發(fā)明，該試劑盒的這樣的結合分子可作為捕獲劑用于鑒別本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白的結合特異性。通過使用本發(fā)明該試劑盒的結合分子，可測定本發(fā)明經修飾的免疫球蛋白的功效。本文所定義的功效是經修飾的分子對其抗原的結合特性?？稍谔禺愋院?或親和力和/或親合力方面定量和/或定性測定結合，其用于質量控制目的。修飾后所獲得的本發(fā)明分子的結合特性可進一步通過標準技術例如親和力成熟來達到要求。藉此為調整結合特性進一步交換在抗原結合位點內或其周圍的核苷酸序列。此外，本發(fā)明試劑盒的結合分子可用于在由至少10、優(yōu)選至少100、更優(yōu)選至少1000、更優(yōu)選至少10000、尤其是至少100000個在結構環(huán)中具有不同經修飾的免疫球蛋白組成的文庫中選擇具有本發(fā)明適當功效的經修飾的免疫球蛋白。實施例表明主要特征之一是工程改造那些通常不涉及所需的抗體固有功能例如抗原結合的免疫球蛋白結構域或區(qū)域。因此，除抗體CDR區(qū)之外的區(qū)域(包括鄰近CDR環(huán)的環(huán))的修飾將保持其抗原結合功能。觀察到免疫球蛋白結構域的特定折疊使得在結構上與CDR相似但位置和序列不同的區(qū)域內可引入隨機突變。通過本發(fā)明鑒定的區(qū)域有例如CDR、連接免疫球蛋白P鏈折疊的環(huán)區(qū)。更特別地，本文描述了通過引入突變，例如在連接人IgGlCH3結構域的A-B和E-F(3鏈的環(huán)中的隨機突變，選擇特異性結合Toll樣受體9-肽(TLR-9)或雞蛋溶菌酶的突變的CH3結構域，Toll樣受體9-肽(TLR-9)或雞蛋溶菌酶分別是通常不能被人IgGl的CH3結構域識別和結合的肽和蛋白質。我們所引入的突變包括在野生型序列中選擇的氨基酸殘基被隨機選擇的殘基取代的突變，它們也包括在上述環(huán)中插入額外的氨基酸殘基。用類推的方法，來自任何類別的免疫球蛋白和來自任何物種的免疫球蛋白的免疫球蛋白結構域都適合這種類型的工程改造。此外，不僅可操作本發(fā)明目標中的特定環(huán)，而且可以同樣方式操作在免疫球蛋白結構域中連接P鏈的任何環(huán)。根據(jù)本發(fā)明，可制備來自任何生物體和來自任何免疫球蛋白類別的工程免疫球蛋白結構域，它們可保留原樣(作為單一結構域)或作為較大分子的組成部分。例如，它們可作為完整免疫球蛋白的組成部分，因此，具有由6個CDR形成的其"正常"抗原結合區(qū)和新的工程抗原結合區(qū)。同樣如此，可產生多特異性(例如雙特異性)免疫球蛋白。工程免疫球蛋白結構域還可為任何融合蛋白的組成部分。這些工程免疫球蛋白結構域的用途都落入免疫球蛋白用途的通用領域內。除非另有說明，否則免疫球蛋白所有的氨基酸序列編號都遵照IMGT編號方案(IMGT，theinternationalImMunoGeneTicsinformationsystem@imgt.cines.fr;http:〃imgt.cines.fr;Lefranc等,1999，NucleicAcidsRes.27:209-212;Ruiz等，2000NucleicAcidsRes.28:219-221;Lefranc等，2001，NucleicAcidsRes.29:207-209;Lefranc等，2003，NucleicAcidsRes.31:307-310;Lefranc等，2005,DevCompImmunol29:185-203)。SEQIDNO,IPREPQVYTIiPPSRDEI/TKNQVSI/TCljVKGJ1YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKI/TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEMiHNHYTQKSIiS!jSPGKAAASEQIDNo.2ccatggccccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgtgacgagctcrmsnnsnnscaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagcttaccgtgnnsrmsnnsaggtggrmsnnsgggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacasccactacscacsgsagsgcctctccctgtctccgggt3a3gcggccgca〃SEQIDNo.3MAPREPQVYTLPPSRDEIiXXXQVSLTCLVKGFYPSD工AVEWESNGGPENNYKTTPPV!iDSDGSFET1YSKI1TVXXXRWXXGNVFSCSVMHEAIj冊HYTQKSIjSIiSPGKAAASEQIDNo,4cttgcc3tggccccccgagaaccacsggtgtacSEQIDNo.5agtcgagctcgtcacgggatgggggcagggSEQ工DNo.6gtacgagctcnnsnnsnnscaagtcagcctgacctgcctggSEQIDNo.7tgccaagcttgctgtagaggaagaaggagcegSEQIDNo.8tgecaagettaccgtgnnsnnsrmsaggtggnnsnnsgggaaegtcttetcatgctccgSEQIDNo.9agttgcggccgctttacccggagacagggagagSEQIDNo,10MAPREPQVYTIiPPSRDEMXXQVSIiTCLVKGFYPSD工AVEWES卿PE賺KTTPPVLDSDGSFFIjYSKLTVXXXXXXRWXXGNVFSCSVMHEAMNHYTQKSLSLSPGKAAASEQIDNo.UccatggccccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgtgacgagctennsnnsnnscaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggsctccgacggctccttcttcctctacagcaagcttaccgtgnnsnnsniisrmsrmsnnsaggtggnnsnrisgggaacgicttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcscaaccactacacscagssgagcctctccctgtctccgggtaaagcggccgcaSEQIDNo,12tgccaagcttaccgtgnnsnnsnnsnnsrmsrmsaggtggnnsiinsgggaacgtcttctcatgctccgSEQIDNo，13MAPREPQVYTLPPSRDELXXXQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKl/rVXXXXXXXXRWXXGNVFSCSVMHEAIiHNHYTQKSIiSLSPGKAAASEQIDNO,14ccatggccccccgagaaccacaggtgtacacagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccggagaacaactacaagaccscgcctcccttaccgtgnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsngcatgaggctctgcacaaccactacacacsccctgcccccstcccgtgactcccagcgacatcgccgtgggtgctggactccgscggctcnsaggtggnnsrmsgggaacgaagagcctctccctgtctcgagctcnnsnnsmiscaagtagtgggagagcaatgggcagcttcttcctctacagcasgcgtcttctcstgctccgtgstcgggtaaagcggccgcaSEQIDNO.15tgccaagcttaccgtgnnsnnsnnsnnsnnsnnsrmsnnsaggtggrmsnnsgggaacgtcttctcatgctccg實施例1:CH3文庫的構建和噬菌體表面展示利用BrookhavenDatabaseasentrylOQO.pdb中公布的IgGlFc片段的晶體結構輔助設計突變型CH3結構域。SEQIDNo.1中給出用作構建CH3文庫基礎的序歹ll。在該序列中，第一個氨基酸對應于Brookhavendatabaseentryloqo.pdb中A鏈的第343位脯氨酸。loqo.pdb中含有的最后一個殘基是SEQIDNo.1中的第102位絲氨酸。在詳細分析loqo.pdb的結構并通過肉目M企查形成連接卩鏈的環(huán)的殘基后，決定使第17、18和19位殘基(其為連接A-B卩鏈的環(huán)的組成部分)以及第71、72、73、76和77位殘基(其為連接SEQIDNo.1中的E-F(3鏈的環(huán)的組成部分)隨機化。通過一系列PCR反應接著連接得到的PCR產物產生工程基因。為了促進連接，修飾編碼SEQIDNo.1的核苷酸序列某些密碼子以產生限制酶切位點而不改變氨基酸序列(沉默突變)。為了插入到具有pe舊分泌信號讀框的克隆載體pHENl(NucleicAcidsRes.1991Aug11;19(15):4133-7.Multi-subunitproteinsonthesurfaceoffilamentousphage:methodologiesfordisplayingantibody(Fab)heavyandlightchains(絲狀嗟菌體表面的多亞基蛋白展示抗體(Fab)重鏈和輕鏈的方法).HoogenboomHR,GriffithsAD,JohnsonKS,ChiswellDJ，HudsonP,WinterG.)內，將編碼Met-Ala的額外的核苷酸殘基連接到序列的5'端以創(chuàng)造Nco1限制酶切位點。對于隨機化的殘基，選擇編碼所有20種天然存在的氨基酸的密碼子NNS(IUPAC密碼，此處S表示C或G),但避免3個終止密碼子中的2個。工程序列作為核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，作為氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。SEQIDNo.3中的字母X表示隨機化的氨基酸殘基。用于裝配突變CH3結構域的PCR引物序列如SEQIDNo.4到9所示。將人單克隆抗體3D6重鏈cDNA(FelgenhauerM，KohlJ,RtikerF.NucleotidesequencesofthecDNAsencodingtheV-regionsofH-andL-chainsofahumanmono-lonalantibodyspecifictoHlV畫l-gp41(》扁石馬對HIV-l-gp41特異性的人單克隆抗體H鏈和L鏈V區(qū)的cDNA核苷酸序列).NucleicAcidsRes.1990Aug25;18(16):4927.)用作PCR反應模板。用SacI和/或HindIII分別消化三個PCR產物并連接在一起。用Ncol和Notl進一步消化連接產物，并連接到先前已用Ncol和Notl消化的表面展示噬菌粒(phagemid)載體pHenl上。通過限制酶分析和通過DNA測序來支配大量被選擇的克隆，發(fā)現(xiàn)含有計劃中的插入，包括正確地插入的隨機化序列。對于以下噬菌體制備步驟，采用標準方案。簡而言之，通過電穿孔將連接混合物轉化到大腸桿菌TGI細胞。隨后，用輔助噬菌體M13-K07從大腸桿菌TGI細胞拯救噬菌體顆粒。然后以2步用PEG/NaCl從培養(yǎng)物上清液沉淀出噬菌體顆粒，溶解于水，用于通過淘選進行選擇，或者，儲存在-80'C。實施例2:CH3+3文庫的構建本文庫按照與CH3文庫同樣的方式構建和克隆。構建體的氨基酸序列如SEQIDNo.lO所示，相應的核苷酸序列如SEQIDNo.ll所示，用于構建的引物為SEQIDNo.4-7、SEQIDNo.9和SEQIDNo.12。實施例3:CH3+5文庫的構建本文庫按照與CH3文庫同樣的方式構建和克隆。構建體的氨基酸序列如SEQIDNo.13所示，相應的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示，用于構建的引物為SEQIDNo.4-7、SEQIDNo.9和SEQIDNo.15。實施例4:CH1文庫的構建在人IgGlCHI文庫中，使Ser93、Ser94、Ser95、Gly98、Thr99和Gln100隨機化，用定點隨機誘變另外插入3個隨機殘基。Leu96不突變。在另一個人IgGlCH1文庫中，使Pro92、Ser93、Ser94、Ser95、Leu96、Thrl01、Gly98、Thr99和Gln100隨機化,用定點隨機誘變另外插入3個隨才幾殘基。用噬菌粒載體pHENl的限制酶切位點Ncol和Notl,將編碼文庫的基因克隆到在N端具有pdB引導區(qū)的讀框中和在C端具有來自fd噬菌體的蛋白III的讀框中。用標準方法實施噬菌體顆粒的制備、特異性結合克隆的淘選和選擇。文庫序列第一個CH1文庫的核苷酸序列1GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCC101CCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCW3201CGTGGTGACCGTGCCCNNSNNSNWSTTGMN3鵬NNSNNS鵬NNSACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACMSAAA301GTTGAGCCCAAATCTGCGGCCGCA第一個CH1文庫的氨基酸序列跳PKSAM第二個CH1文庫的核苷酸序列1GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT咖GGCACW3CAGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCC101CCGMCCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAG201CGTGGTGACCGTG卵S卵SN卵卵S咖NNSNNS卿MHSU卿NSNNSTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAA301GTTGAGCCCAAATCTGCGGCCGCT第二個cm文庫的氨基酸序列實施例4:CL文庫的構建在人IgGlCL文庫中，使Ser92、Lys93、Ala94、Asp95、Glu97、Lys98和His99隨機化，并用定點隨機誘變在Serl6和Glyl7之間另外插入3個隨機殘基。用噬菌粒載體pHENl的限制酶切位點Ncol和Notl，將編碼文庫的基因克隆到在N端具有pelB引導區(qū)的讀框中和在C端具有來自fd噬菌體的蛋白III的讀框中。用標準方法實施噬菌體顆粒的制備、特異性結合克隆的淘選和選擇。CL文庫的核苷酸序列1GTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT仰S卵SN卿GAACTGCCTCTGTT6TGTGCCTGCTGAATAACTTCT101ATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATMCGCCCTCCAMCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTA201CAGCCTCAGGTCGACCCTGACGCTG仰SimS訓S卵STAC卵SNNS柳SAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACA301AAGAGCTTCAACAGGGGAGAGCL文庫的氨基酸序列實施例5:在Rpl0-L肽上淘選CH3-噬菌體文庫實施3輪淘選。用代表B-細胞分子標記CD20的模擬表位的合成肽RplO-L包被馬來酰亞胺活化板(Pierce)(Perosa等，AnnNYAcadSci.(2005)51:672-83)。其推斷的氨基酸序列如下ITPWPHWLERSS。每孔加入200pl以下溶液PBS,pH=7.2，含有以下濃度的溶解的肽-第1輪淘選100pg/ml-第2輪淘選100pg/ml畫第3輪淘選50嗎/ml。在4。C孵育過夜，接著用10嗎/ml半胱氨酸-HCl的PBS溶液室溫封閉2小時(每孔200|il)。然后，使含有來自文庫CH3、CH3+3、CH3+5和CH3+7的同樣濃度的噬菌體的表面展示噬菌體文庫與結合肽反應，即通過加入噬菌體懸液和2%BSA-PBS到200接著在室溫下震蕩孵育45分鐘，不震蕩孵育90分鐘。未結合的噬菌體顆粒如下洗掉-第1輪淘選后:15x200plT畫PBS,5x200(ilT國PBS-第l輪淘選后15x200plT-PBS，10x200plT-PBS畫第l輪淘選后20x200plT-PBS,20x200|ilT-PBS。通過每孔加入200pl的0.1M甘氨酸(pl^2.2)并在室溫震蕩孵育30分鐘，實施結合顆粒的洗脫。隨后，通過加入60pl2MTris^咸中和噬菌體懸液，接著通過讓10ml指數(shù)生長期的培養(yǎng)物與0.5ml洗脫的噬菌體混合并在37。C孵育30分鐘，來感染大腸桿菌TG1細胞。最后，將感染的細菌接種到含有1%葡萄糖和100嗎/ml氨千青霉素的TYE培養(yǎng)基并在30'C培養(yǎng)過夜。CH3噬菌體文庫在RplO-L肽上的淘選結果<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>實施例6:所選用于可溶性表達的克隆的克隆化用PCR分批擴增洗脫的噬菌體顆粒中含有的已改變的編碼CH3結構域的序列。在用Ncol和Notl限制酶切后，將它們插入到pNOTBAD(Invitrogen載體pBAD,含有后來插入的Notl位點)。在轉化到大腸桿菌E104后，于30。C在含有1%葡萄糖和100嗎/ml氨千青霉素的TYE培養(yǎng)基上選擇細胞。所選克隆的可溶性表達和篩選將4x96個氨千青霉素抗性菌落在200^含有氨千青霉素的2xYT培養(yǎng)基(在微量滴定板上)中在搖床上于30。C培養(yǎng)過夜。然后用加到終濃度為0.1°/。的L-阿拉伯糖誘導它們。在再次過夜孵育后，在室溫下，通過2000rpm離心15分鐘收集細胞，通過重新懸浮于100jil硼酸鈉緩沖液(160mM硼酸鈉、200mMNaCl，pH-8.0)并孵育至少6小時釋放出周質蛋白質。為了篩選，用50pg/ml肽RplO-L溶解于PBS(pH二7.2)的100pg/ml溶液將4塊馬來酰亞胺板于4。C包被過夜。然后，各塊板用10(ig/ml半胱氨酸-HCl的PBS溶液在室溫下封閉2小時(每孔200pl)。然后，通過加入50pl裂解物(lysate)和50pi2%BSA-PBS，接著在室溫下過夜孵育，使釋放的周質蛋白質與結合肽反應。帶有his標簽的蛋白的結合如下顯示與每孔100pl抗四組氨酸(tetra-his)抗體(QIAgen)溶液(用1%BSA-PBS按1:1000稀釋)孵育90分鐘，并與每孔100pl用HRP標記的山羊抗小鼠抗體(Sigma)的溶液(用1%BSA-PBS按1:1000稀釋)孵育90分鐘。在加入底物OPD(3mg/ml)的檸檬酸鈉/磷酸鹽緩沖液(pHN4.5)和0.4pl/ml&02后，觀察到信號。通過加入100^1.25MH2S04來終止反應。在每一克隆單孔中RplO-L結合的篩選結果<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>將顯示陽性信號的克隆在20ml含有氨千青霉素的2xYT中于30。C培養(yǎng)過夜。然后將它們按1:20接種到新鮮培養(yǎng)基中，30。C3小時后，用終濃度為0.1%的L-阿拉伯糖進行誘導，使其在16。C過夜表達重組CH3-結構域。然后表達細胞的周質在1ml硼酸鈉緩沖液(pH-8.0)中最少裂解6小時。使周質提取物與RplO-L肽反應，如上所述準確顯示了結合。Rpl0-L結合的篩選結果<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>所選在pET27b中可溶性表達的克隆的克隆化用PCR擴增在結合RplO-L時產生顯著信號的克隆中含有的已改變的編碼CH3結構域的序列。在用NcoI和NotI限制酶切后，將它們插入到pET27b(Novagen)。在轉化到大腸桿菌BL21(DE3)后，于30°C在含有1°/。葡萄糖和50(ig/ml卡那霉素(kanamycin)的TYE培養(yǎng)基上選擇轉化的細胞。將顯示陽性信號的克隆在20ml含有2%葡萄糖和卡那霉素的M9ZB中于30。C培養(yǎng)過夜。然后將它們按l:20接種到新鮮培養(yǎng)基中，30。C3小時后，用含有1%甘油(代替葡萄糖、卡那霉素)和lmMIPTG的培養(yǎng)基進行誘導，使其在16。C過夜表達重組CH3-結構域。然后表達細胞的周質在1ml硼酸鈉緩沖液(pH-8.0)中最少裂解6小時。用蛋白質印跡并用抗四組氨酸(tetra-his)抗體(QIAgen)檢測來分析周質提取物中是否存在重組蛋白。結合CD-20克隆的核苷酸序列和推斷的蛋白質序列<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>*在第二組突變殘基中插入2個核苷酸導致在分《t第二組和第三組突變殘基的另外的恒定殘基R和W之間插入G。CD20特異性CH3+3文庫克隆D83的蛋白質序列(1MGT編號)15-1792-94DLV97-98HVARWMVGWFSCSVMHEAIjHNHYTQKSLSLSPGKAAA用FACS分析在細胞上表達的CD-20的結合大約105個Daudi細胞用PBS洗滌(800rpm,5分鐘，室溫)，使在1%BSA-PBS中的重組CH3結構域在冰上結合2小時。細胞用PBS再次洗涂，使其與在1%BSA-PBS中稀釋的2ng/ml抗五組氨酸(pentaHis)-Alexafluor488抗體(QIAgen)在水上反應30分鐘。洗滌后，細胞用FACS進行分析。用未標記的細胞、野生型CH3結構域和K562細胞系作為對照。實施例7:結合CD20抗原的突變蛋白CH1的分離實施3輪淘選。用代表B-細胞分子標記CD20的模擬表位的合成肽包被馬來酰亞胺活化板(Pierce)。每孔加入200pl以下溶液PBS，pH=7.2，含有以下濃度的溶解的肽-第1輪淘選100pg/ml畫第2輪淘選100|ag/ml-第3輪淘選50嗎/ml。在4。C孵育過夜，接著用10昭/ml半胱氨酸-HCl的PBS溶液室溫封閉2小時(每孔200^1)。然后，4a示突變CH1結構域的表面展示噬菌體文庫與結合肽反應，即通過加入噬菌體懸液和2%BSA-PBS到200)id,接著在室溫下震蕩孵育45分鐘，不震蕩孵育90分鐘。未結合的噬菌體顆粒如下洗掉■第1輪淘選后10x200|ilT-PBS,5x200T畫PBS-第l輪淘選后15x200plT陽PBS，10x200piT-PBS-第1輪淘選后20x200plT-PBS，20x200plT畫PBS。通過每孔加入200^的0.1M甘氨酸(pH-2.2)并在室溫震蕩孵育30分鐘，實施結合顆粒的洗脫。隨后，通過加入60pl2MTris-堿中和噬菌體懸液，接著通過讓10ml指數(shù)生長期的培養(yǎng)物與0.5ml洗脫的噬菌體混合并在37。C孵育30分鐘，來感染大腸桿菌TG1細胞。最后，將感染的細菌接種到含有1%葡萄糖和100lag/ml氨千青霉素的TYE培養(yǎng)基并在30。C培養(yǎng)過夜。CH1噬菌體文庫在RplO-L肽上的淘選結果<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>所選用于可溶性表達的克隆的克隆化用PCR分批擴增洗脫的噬菌體顆粒中含有的已改變的編碼CH1結構域的序列。在用Ncol和Notl限制酶切后，將它們插入到pNOTBAD(Invitrogen載體pBAD,含有后來插入的Notl位點)。在轉化到大腸桿菌E104后，于3(TC在含有1%葡萄糖和100pg/ml氨千青霉素的TYE培養(yǎng)基上選擇細胞。所選克隆的可溶性表達和篩選將4x96個氨節(jié)青霉素抗性菌落在200含有氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基(在微量滴定板上)中在搖床上于3(TC培養(yǎng)過夜。然后用加到終濃度為0.1°/。的L-阿拉伯糖誘導它們。在再次過夜孵育后，在室溫下，通過2000rpm離心15分鐘收集細胞，通過重新懸浮于100(il硼酸鈉緩沖液(160mM硼酸鈉、200mMNaCl，pH-8.0)并孵育至少6小時釋放出周質蛋白質。為了篩選，用50pg/ml肽RplO-L溶解于PBS(pH-7.2)的100pg/ml溶液將4塊馬來酰亞胺板于4。C包被過夜。然后，各塊板用10pg/ml半胱氨酸-HCl的PBS溶液在室溫下封閉2小時(每孔200|xl)。然后，通過加入50^il裂解物(lysate)和50iil2。/。BSA-PBS,接著在室溫下過夜孵育，使釋放的周質蛋白質與結合肽反應。帶有his標簽的蛋白的結合如下顯示與每孔IOOpl抗四組氨酸(tetra-his)抗體(QIAgen)溶液(用1%BSA-PBS按1:1000稀釋)孵育90分鐘，并與每孔100|il的用HRP標記的山羊抗小鼠抗體(Sigma)的溶液(用1%BSA-PBS按1:1000稀釋)孵育90分鐘。在加入底物OPD(3mg/ml)的檸檬酸鈉/磷酸鹽緩沖液(pH-4.5)和0.4|il/ml11202后，觀察到信號。通過加入100pl1.25MH2S04來終止反應。在每一克隆單孔中RplO-L結合的篩選結果<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>將顯示陽性信號的克隆在20ml含有氨千青霉素的2xYT中于30。C培養(yǎng)過夜。然后將它們按l:20接種到新鮮培養(yǎng)基中，30。C3小時后，用終濃度為0.1%的L-阿拉伯糖進行誘導，使其在16。C過夜表達重組CHl-結構域。然后表達細胞的周質在1ml硼酸鈉緩沖液(pH二8.0)中最少裂解6小時。使周質提取物與Rpl0-L肽反應，如上所述準確顯示了結合。Rpl0-L結合的篩選結果<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>所選在pET27b中可溶性表達的克隆的克隆化用PCR擴增在結合RplO-L時產生顯著信號的克隆中含有的已改變的編碼CH1結構域的序列。在用NcoI和NotI限制酶切后，將它們插入到pET27b(Novagen)。在轉化到大腸桿菌BL21(DE3)后，于30°C在含有1%葡萄糖和50pg/ml氨芐青霉素的TYE培養(yǎng)基上選擇轉化的細胞。將顯示陽性信號的克隆在20ml含有2%葡萄糖和卡那霉素的M9ZB培養(yǎng)基中于3(TC培養(yǎng)過夜。然后將它們按l:20接種到新鮮培養(yǎng)基中，30°C3小時后，用含有1%甘油(代替葡萄糖、卡那霉素)和lmMIPTG的培養(yǎng)基進行誘導，使其在16。C過夜表達重組CHl-結構域。然后表達細胞的周質在1ml硼酸鈉緩沖液(pH-8.0)中最少裂解6小時。用蛋白質印跡并用抗四組氨酸(tetra-his)抗體(QIAgen)^r測來分析周質提取物中是否存在重組蛋白。CD20特異性CHISMID(克隆C45)的序列C45324bpds-DNASYNWUW0O61gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccsagagcacctctggg61ggcacagcagccct柳ctgcctggtcsaggactacttccccgaaccggtgscggtgtcg121tggaactcsggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctgcagtcctcal日lggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtggcccctctgggtgttggtgggcatctc2"gtcctgcactacstctgcaacgtgaatcacaagcccagcascaccsaggtggacasgasa301gttgagcccaaatctgcggccgctC4551015202530VKSSNH用FACS分析在細胞上表達的CD-20的結合大約105個Daudi細胞用PBS洗滌(800rpm,5分鐘，室溫)，使在1%BSA-PBS中的重組CH3結構域在冰上結合2小時。細胞用PBS再次洗滌，使其與在1%BSA-PBS中稀釋的2pg/ml抗五組氨酸(pentaHis)-Alexafluor488抗體(QIAgen)在冰上反應30分鐘。洗滌后，細胞用FACS進行分析。用未標記的細胞、野生型CH1結構域和K562細胞系作為對照。實施例8:結合CD20抗原的CL突變蛋白的分離實施3輪淘選。用代表B-細胞分子標記CD20的模擬表位的合成肽包被馬來酰亞胺活化板(Pierce)。每孔加入200pl以下溶液PBS，pH=7.2，含有以下濃度的溶解的肽-第1輪淘選100|ag/ml畫第2輪淘選100pg/ml-第3輪淘選50嗎/ml。在4。C孵育過夜，接著用10pg/ml半胱氨酸-HCl的PBS溶液室溫封閉2小時(每孔200nl)。然后，使展示突變的CL結構域的表面展示噬菌體文庫與結合肽反應，即通過加入噬菌體懸液和2%BSA-PBS到200pl，接著在室溫下震蕩孵育45分鐘，不震蕩孵育90分鐘。未結合噬菌體顆粒如下洗滌；-第l輪淘選后10x200plT-PBS,5x200plT-PBS-第l輪淘選后15x200^1T-PBS，10x200plT-PBS53-第l輪淘選后20x200plT-PBS，20x200|ilT國PBS。通過每孔加入200^的0.1M甘氨酸(pl^2.2)并在室溫震蕩將育30分鐘，實施結合顆粒的洗脫。隨后，通過加入60(xl2MTris-堿中和噬菌體懸液，接著通過讓10ml指數(shù)生長期的培養(yǎng)物與0.5ml洗脫的噬菌體混合并在37。C孵育30分鐘，來感染大腸桿菌TG1細胞。最后，將感染的細菌接種到含有1%葡萄糖和100lig/ml氨爺青霉素的TYE培養(yǎng)基并在3(TC培養(yǎng)過夜。CL噬菌體文庫在RplO-L肽上的淘選結果噬菌體滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>所選用于可溶性表達的克隆的克隆化用PCR分批擴增洗脫的噬菌體顆粒中含有的已改變的編碼CL結構域的序列。在用Ncol和Notl限制酶切后，將它們插入到pNOTBAD(Invitrogen載體pBAD,含有后來插入的Notl位點)。在轉化到大腸桿菌E104后，于3(TC在含有1%葡萄糖和100pg/ml氨芐青霉素的TYE培養(yǎng)基上選擇細胞。所選克隆的可溶性表達和篩選將4x96個氨節(jié)青霉素抗性菌落在200^含有氨千青霉素的2xYT培養(yǎng)基(在微量滴定板上)中在搖床上于3(TC培養(yǎng)過夜。然后用加到終濃度為0.1%的L-阿拉伯糖誘導它們。在再次過夜孵育后，在室溫下，通過2000rpm離心15分鐘收集細胞，通過重新懸浮于100|il硼酸鈉緩沖液(160mM硼酸鈉、200mMNaCl，pl^8.0)并孵育至少6小時釋放出周質蛋白質。為了篩選，用50pg/ml肽RplO-L溶解于PBS(pH-7.2)的100pg/ml溶液將4塊馬來酰亞胺板于4。C包被過夜。然后，各塊板用10pg/ml半胱氨酸-HCl的PBS溶液在室溫下封閉2小時(每孔200|al)。然后，通過加入50^d裂解物(lysate)和50ial2。/。BSA-PBS，接著在室溫下過夜孵育，使釋放的周質蛋白質與結合肽反應。帶有his標簽的蛋白的結合如下顯示與每孔IOO)il抗四組氨酸(tetra-his)抗體(QIAgen)溶液(用1%BSA-PBS按1:1000稀釋)孵育90分鐘，并與每孔100iul用HRP標記的山羊抗小鼠抗體(Sigma)的溶液(用1%BSA-PBS按1:1000稀釋)孵育90分鐘。在加入底物OPD(3mg/ml)的檸檬酸鈉/磷酸鹽緩沖液(pH-4.5)和0.4pl/ml&02后，觀察到信號。通過加入100|^11.25MH2S04來終止反應。在每一克隆單孔中RplO-L結合的篩選結果<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>本底反應<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>將顯示陽性信號的克隆在20ml含有氨千青霉素的2xYT中于30。C培養(yǎng)過夜。然后將它們按1:20接種到新鮮培養(yǎng)基中，30。C3小時后，用終濃度為0.1%的L-阿拉伯糖進行誘導，使其在16。C過夜表達重組CL結構域。然后表達細胞的周質在lml硼酸鈉緩沖液(p1^8.0)中最少裂解6小時。使周質提取物與RplO-L肽反應，如上所述準確顯示了結合。<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>所選在pET27b中可溶性表達的克隆的克隆化用PCR擴增在結合RplO-L時產生顯著信號的克隆中含有的已改變的編碼CL結構域的序列。在用Ncol和Notl限制酶切后，將它們插入到pET27b(Novagen)。在轉化到大腸桿菌BL21(DE3)后，于30°C在含有1%葡萄糖和50ng/ml卡那霉素的TYE培養(yǎng)基上選擇轉化的細胞。將顯示陽性信號的克隆在20ml含有2%葡萄糖和卡那霉素的M9ZB培養(yǎng)基中于30。C培養(yǎng)過夜。然后將它們按1:20接種到新鮮培養(yǎng)基中，30°C3小時后，用含有1%甘油(代替葡萄糖、卡那霉素)和lmMIPTG的培養(yǎng)基進行誘導，使其在16。C過夜表達重組CL結構域。然后表達細胞的周質在1ml硼酸鈉緩沖液(pH^8,0)中最少裂解6小時。用蛋白質印跡并用抗四組氨酸(tetra-his)抗體(QIAgen)檢測來分析周質提取物中是否存在重組蛋白。實施例9:結合整聯(lián)蛋白的Fcab的克隆、表達和鑒別按照Koivunen等(1993)(J.Biol.Chem.1993Sep25;268(27):20205-10)的方法，從在絲狀噬菌體上表達的6個氨基酸的肽文庫最初分離出潛在的環(huán)肽CRGDCL，經證明其抑制表達RGD的噬菌體與&整聯(lián)蛋白的結合，或抑制表達av^的細胞與纖連蛋白的連接。該肽還抑制由(Xv(3i、otvP3和av(3s整聯(lián)蛋白介導的細胞連接。我們將序列GCRGDCL插入到人IgGl的CH3結構域的結構環(huán)("EF"環(huán))中。為此目的，用標準克隆技術使殘基Asp92和Lys93(IMGT編號)分別突變?yōu)镚ly和Leu，并在這些突變的殘基92和93之間插入5個殘基CRGDC，以創(chuàng)造具有結合整聯(lián)蛋白的RGD模體的環(huán)。在插入的C端，序列融合在含有載體多克隆位點的讀框中，以使HSV-標簽和His-標簽連接重組蛋白的C端。將該重組蛋白命名為Fcab-RGD4，或簡稱為RGD4。編碼Fcab-RGD4的DNA序列和翻譯的氨基酸序列^t口下戶斤示。MK.YLLPT.A-AA畫.GLiL.L>A-QPA.M^M.AHI'mTHZTjEIOiZZlATGWiATACCTGCTGCCGACi:GCTGCTGciGGTCTGClfGCTCC化GCGGCCCAGCCGGCGATG敏—幽gCCGAGcfcdAAJS5"TT^5SA5"XftXR6iCACATACTTTATGGACGACGGCTGGCGACGACGACCAGAQ3ACG柳W5CGCCGGGTCGGCCGCTACCGGTACCGGCTC咖TTTAGAACACTGTTTTGAGTCT、GCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGTACGGGTGGCACGGGTCGTGGACTTGAGGACCCCCCTGGCAGTCAGAAGGAGAAGGGGGGTTTTGGGTTCCTGTGGGAGTACTAGAGGGCCTGGGGACTGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCCAGTGTACGCACCACCACCTGCACTCGGTGCTTCTGGGACTCCAGTTCAAGTTGACCATGCACCTGCCGCACCTCCACGTATTACGGTT(iTGTTTCGGCCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAGCCCTCCTCGTCATGTTGTCGTGCATGGCACACCAGTCGCAGGAGTGGCAGGACGTGGTCCTGACCGACTTACCGTTCCTCATGTTCACGTTCCAGAGGTootxiht:IGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGATGTTTCGGGAGGGTCGGGGGTAGCTCTTTTGGTAGAGGTTTCGGTTTCCCGTCGGGGCTCTTGGTGTCCACATGTGGGACGGGGGTAGGGCCCTACTCGAMGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTTACCGTGGGTTGCCGCGGTGATTGTCTGAGCAGGTGGCAGCAGTTCTGGTGCGGAGGGCACGACCTGAGGCTGCCGAGGAAGAAGGAGATGTCGTTCGAATGGCACCCAACGGCGCCACTAACAGACTCGTCCACCGTCGTCCACTCGAGATGTTGGTGATGTGCGTCTTCTCGGAGAGGGACAGAGGCCCATTTCGCCGGCGTGAGCTCTA娜菱,被鄉(xiāng)801CAAACGGGCTAGCCAGCCAGAACTCGCCCCGGAAGACCCCGAGGATGTCGAGCACCACCACCACCACCACGTTTGCCCGATCGGTCGGTCTTGAGCGGGGCCTTCTGGGGCTCCTACAGCTCGTGGTGGTGGTGGTGGTG通過常規(guī)克隆技術將編碼Fcab-RGD4和Fcab-wt的序列分別$1入到哺乳動物表達載體pCEP4中。用這些表達質粒瞬時轉染HEK293細胞，在3天和1周后收獲含有Fcab的培養(yǎng)基。經由蛋白質A柱和從該柱酸洗脫純化Fcab，接著立即中和。用PBS對Fcab透析，在ELISA中檢測其對人av(33整聯(lián)蛋白(Chemicon)的結合。為了進行整聯(lián)蛋白ELISA，將溶于PBS的1嗎/ml人av(33整聯(lián)蛋白過夜包被在Maxisorp板上，并用含有1mMCa"的溶于PBS的BSA封閉1小時。讓Fcab-RGD4和Fcab-wt分別從10昭/ml純化的蛋白質起以各種稀釋度結合1小時。通過HRP標記的蛋白A和作為底物的TMB檢測結合的Fcab。RGD4與整聯(lián)蛋白的結合(紅線)從10pg/ml蛋白降至0.16嗎/ml產生顯著信號。作為陰性對照，在缺乏整聯(lián)蛋白時RGD4不與板結合(灰線)，F(xiàn)cab-wt也不結合整聯(lián)蛋白包被的板(綠線)。將市售小鼠抗人avp3整聯(lián)蛋白mAbLM609(Chemicon)的結合(藍線)當作陽性對照。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>表ELISA數(shù)據(jù)表明RGD4和LM609與人av(33整聯(lián)蛋白的結合。測定了如第一欄所示的各種濃度的蛋白質，在450nm產生的信號見各自相應的行。第二欄為HEK產生的和蛋白A純化的Fcab-RGD4與整聯(lián)蛋白結合的數(shù)值，第三欄為Fcab-wt陰性對照，第四欄為Fcab-RGD4包被空白對照。最后一欄為小鼠抗avp3整聯(lián)蛋白mAbLM609的結合值。權利要求1.與一個細胞的至少2個細胞表面分子特異性結合的多價免疫球蛋白或其部分，在所述免疫球蛋白的至少一個結構環(huán)區(qū)中至少一個修飾決定其與所述細胞表面分子的表位結合，其中未經修飾的免疫球蛋白不顯著結合所述表位。2.權利要求1的免疫球蛋白，其中經修飾的結構環(huán)區(qū)位于所述免疫球蛋白或其部分的恒定區(qū)內，優(yōu)選位于CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C內。3.權利要求2的免疫球蛋白，其特征在于所述經修飾的結構環(huán)區(qū)包含至少6個氨基酸修飾。4.權利要求1-3中任一項的免疫球蛋白，其特征在于人源或鼠源的CH1、CH2、CH3或CH4的經修飾的環(huán)區(qū)在第7-21位氨基酸、第25-39位氨基酸、第41-81位氨基酸、第83-85位氨基酸、第89-103位氨基酸或第106-117位氨基酸內包含至少一個修飾。5.權利要求1-3中任一項的免疫球蛋白，其特征在于人源Igk-C或Igl-C的環(huán)區(qū)在第8-18位氨基酸、第27-35位氨基酸、第42-78位氨基酸、第83-85位氨基酸、第92-100位氨基酸、第108-117位氨基酸或第123-126位氨基酸內包含至少一個修飾。6.權利要求1-3中任一項的免疫球蛋白，其特征在于鼠源Igk-C或Igl-C的環(huán)區(qū)在第8-20位氨基酸、第26-36位氨基酸、第43-79位氨基酸、第83-85位氨基酸、第90-101位氨基酸、第108-116位氨基酸或第122-125位氨基酸內包含至少一個修飾。7.權利要求1-3中任一項的免疫球蛋白，其特征在于所述免疫球蛋白恒定區(qū)為駱駝源的。8.權利要求7的免疫球蛋白，其特征在于所述免疫球蛋白包含選自CH1、CH2和CH3的至少一個經修飾的恒定區(qū)。9.權利要求8的免疫球蛋白，其特征在于CH1、CH2和/或CH3的經修飾的環(huán)區(qū)在第8-20位氨基酸、第24-39位氨基酸、第42-78位氨基酸、第82-85位氨基酸、第91-103位氨基酸或第108-117位氨基酸內包含至少一個修飾。10.權利要求1的免疫球蛋白，其特征在于所述可變區(qū)選自VH、Vk、VX、VHH及其組合。11.權利要求1-10中任一項的免疫球蛋白，其特征在于VH、Vk、V入或VHH的經修飾的環(huán)區(qū)在第7-21位氨基酸、第25-39位氨基酸、第41-81位氨基酸、第83-85位氨基酸、第89-103位氨基酸或第106-117位氨基酸內包含至少一個修飾，其中在所述結構域內所述氨基酸位置的編號方式為IMGT編號。12.權利要求1-10中任一項的免疫球蛋白，其特征在于人源VH或Vk或VX的環(huán)區(qū)在第8-20位氨基酸、第44-50位氨基酸、第67-76位氨基酸和第89-101位氨基酸內、最優(yōu)選在第12-17位氨基酸、第45-50位氨基酸、第69-75位氨基酸和第93-98位氨基酸內包含至少一個修飾，其中在所述結構域內所述氨基酸位置的編號方式為IMGT編號。13.權利要求1-10中任一項的免疫球蛋白，其特征在于鼠源VH的環(huán)區(qū)在第6-20位氨基酸、第44-52位氨基酸、第67-76位氨基酸和第92-101位氨基酸內包含至少一個修飾，其中在所述結構域內所述氨基酸位置的編號方式為IMGT編號。14.權利要求1-10中任一項的免疫球蛋白，其特征在于駱駝源VHH的經修飾的環(huán)區(qū)在第7-18位氨基酸、第43-55位氨基酸、第68-75位氨基酸和第91-101位氨基酸內包含至少一個修飾，其中在所述結構域內所述氨基酸位置的編號方式為IMGT編號。15.權利要求1-10中任一項的免疫球蛋白，其特征在于所述經修飾的免疫球蛋白進一步與一種或多種經修飾的免疫球蛋白或其部分或者與未經修飾的免疫球蛋白或其部分組合，以獲得組合免疫球蛋白。16.權利要求1-15中任一項的免疫球蛋白，其特征在于所述修飾為缺失、取代、插入或其組合。17.編碼權利要求1-14中任一項的免疫球蛋白或其部分的核酸。18.用于工程改造權利要求1-16中任一項的多價免疫球蛋白的方法，該方法包括下列步驟-提供編碼包含至少一個結構環(huán)區(qū)的免疫球蛋白的核酸，-修飾所述結構環(huán)區(qū)的至少一個核苷酸殘基，-將所述經修飾的核酸轉移至表達系統(tǒng)，-表達所述多價免疫球蛋白，-使表達的多價免疫球蛋白接觸表位，和-測定所述多價免疫球蛋白是否結合所述表位。19.權利要求1-16中任一項的多價免疫球蛋白在制備藥物中的用全文摘要本發(fā)明提供與一個細胞的至少2個細胞表面分子特異性結合的多價免疫球蛋白或其部分、它們的用途和制備它們的方法，在所述免疫球蛋白的至少一個結構環(huán)區(qū)中至少一個修飾決定其與所述細胞表面分子的表位結合，其中未經修飾的免疫球蛋白不顯著結合所述表位。文檔編號C07K16/00GK101522712SQ200780032991公開日2009年9月2日申請日期2007年6月26日優(yōu)先權日2006年7月5日發(fā)明者F·魯克,G·希姆勒,G·沃茲尼克-諾普申請人:F-星生物科技研究和發(fā)展有限責任公司