專利名稱：抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY及其分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特異性抗體及其分離方法，特別是涉及一種抗乙肝病毒的免疫球蛋白及其分離方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是一種嚴重的傳染性疾病，全世界約有二億乙肝病毒攜帶者。乙型肝炎病毒表面抗原HbsAg是一組構(gòu)成病毒外膜的蛋白，其重要功能之一是識別肝細胞膜上的受體，使病毒與細胞接觸，然后侵入胞內(nèi)進行復(fù)制。血中HbsAg陽性時，為感染乙肝病毒HBV的標志.HbsAg出現(xiàn)在急性或慢性肝炎和”健康”的病毒攜帶者身上。因此，檢測乙型肝炎病毒表面抗原HbsAg對疾病的診斷及治療具有重要意義。在免疫檢測方面，從特異性抗原免疫的兔，羊等動物血液中獲得特異性抗體IgG，往往能激活標本中的補體系統(tǒng)，使補體系統(tǒng)結(jié)合到抗體上，從而使免疫沉淀被補體再溶解，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。此外，哺乳動物的IgG還能與標本中的類風濕因子RF結(jié)合，產(chǎn)生凝聚，造成假陽性結(jié)果。單克隆抗體在免疫檢測中起著相當重要的作用，但依靠雜交瘤細胞產(chǎn)生單克隆抗體已不能滿足大量的需求。雞蛋卵黃免疫球蛋白IgY則克服了IgG的上述缺點，不會活化標本中的補體系統(tǒng)，也不與類風濕因子結(jié)合，從而可避免上述假陽性和假陰性結(jié)果給免疫檢測帶來的干擾。雞卵黃免疫球蛋白IgY還具有良好的穩(wěn)定性，室溫下放置幾個月，抗體活性仍無明顯下降，冷凍及冷凍干燥對其活性也無影響，酸性條件下pH4以上時很穩(wěn)定。此外，雞蛋卵黃免疫球蛋白的生產(chǎn)成本低，不需要犧牲動物，適于大規(guī)模的生產(chǎn)。由此可見，雞蛋卵黃免疫球蛋白IgY有可能發(fā)展成為廉價的優(yōu)良的免疫診斷試劑。
制備抗乙肝病毒表面抗原HbsAg的雞卵黃免疫球蛋白IgY未見報道。有關(guān)雞卵黃免疫球蛋白IgY的制備純化技術(shù)，國內(nèi)外先后有幾篇專利報道，如US6207807、US6217926、CN1201693A等。其中所述的方法較為復(fù)雜，均與我們的有所不同.。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY的分離方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY，用下述方法分離制成(1)動物免疫 用乙肝病毒表面抗原HbsAg作為免疫原，對產(chǎn)蛋雞進行免疫，收集雞蛋于4℃儲存；(2)分離純化 分離出雞卵黃，用6～9倍體積的去離子水稀釋，用0.1M HCl調(diào)節(jié)pH為4.5～5.5，加入氯化鈉至0.1～0.2M，4℃放置5～6小時，在3500轉(zhuǎn)/分下離心分離20～25分鐘，棄去沉淀，向上清液中加入硫酸鈉至質(zhì)量百分濃度為18～20％，進行第一次鹽析，在3500轉(zhuǎn)/分，離心分離出蛋白質(zhì)沉淀，沉淀加去離子水至沉淀完全溶解為止，加入硫酸鈉至質(zhì)量百分濃度為14～16％，進行第二次鹽析，離心分離，獲得的蛋白質(zhì)沉淀加去離子水至沉淀完全溶解為止，將此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝膠柱過濾，過濾之前，凝膠柱用25mM pH＝8的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡，洗脫液流速200ml/小時，洗脫出的蛋白質(zhì)流分用紫外光度計監(jiān)測，吸收波長為280nm，收集第一條譜帶，用聚乙二醇反透析濃縮，再透析除鹽，得到一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY。
一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY的分離方法，由下述步驟組成(1)動物免疫 用乙肝病毒表面抗原HbsAg作為免疫原，對產(chǎn)蛋雞進行免疫，收集雞蛋于4℃儲存；(2)分離純化 分離出雞卵黃，用6～9倍體積的去離子水稀釋，用0.1M HCl調(diào)節(jié)pH為4.5～5.5，加入氯化鈉至0.1～0.2M，4℃放置5～6小時，在3500轉(zhuǎn)/分下離心分離20～25分鐘，棄去沉淀，向上清液中加入硫酸鈉至質(zhì)量百分濃度為18～20％，進行第一次鹽析，在3500轉(zhuǎn)/分，離心分離出蛋白質(zhì)沉淀，沉淀加去離子水至沉淀完全溶解為止，加入硫酸鈉至質(zhì)量百分濃度為14～16％，進行第二次鹽析，離心分離，獲得的蛋白質(zhì)沉淀加去離子水至沉淀完全溶解為止，將此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝膠柱過濾，過濾之前，凝膠柱用25mM pH＝8的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡，洗脫液流速200ml/小時，洗脫出的蛋白質(zhì)流分用紫外光度計監(jiān)測，吸收波長為280nm，收集第一條譜帶，用聚乙二醇反透析濃縮，再透析除鹽，得到一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY。
本發(fā)明分離制成的一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY具有高活性、高產(chǎn)量、高純度的特點，可用于免疫檢測。本發(fā)明的一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY的穩(wěn)定性遠大于傳統(tǒng)IgG，因而便于商業(yè)運輸，貯存等流通環(huán)節(jié)的操作，可以延長試劑的使用期。另外，較低的生產(chǎn)成本使IgY抗體做為診斷試劑推廣應(yīng)用。
本發(fā)明的一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY分離方法，工藝簡單，成本低廉，所得樣品質(zhì)量較好。
本發(fā)明選擇六月齡產(chǎn)蛋母雞，隔離飼養(yǎng)，經(jīng)肌肉免疫注射乙肝病毒表面抗原，以后進行適當?shù)膸状渭訌娒庖?，卵黃中產(chǎn)生高滴度(40000～80000)的特異性抗體，效價維持9月以上。本發(fā)明的特點在于摸索出的水稀釋脫脂--兩步鹽析--凝膠過濾的分離方法，簡單經(jīng)濟，分離效果好，平均一個雞卵黃中得到65mg電泳純的IgY。


圖1為不同抗原濃度測定的IgY競爭ELISA曲線。
圖2為本發(fā)明的一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY分離技術(shù)工藝路線。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例1(1)動物免疫 六月齡產(chǎn)蛋雞在免疫和產(chǎn)蛋期間隔離狀態(tài)飼養(yǎng)，60μg/ml乙肝病毒表面抗原HbsAg與等體積的佐劑混合作為免疫原。取1ml這種免疫原溶液，分四個位點對每只雞肌肉免疫注射。初次免疫，抗原與完全佐劑混合，兩周后加強免疫注射一次，以后每隔一個月加強免疫注射一次，加強免疫時，抗原與不完全佐劑混合.免疫期間，每天收集雞蛋于4℃儲存待分離；(2)分離純化 分離出雞卵黃，用8倍體積的去離子水稀釋，用0.1M HCl調(diào)節(jié)pH為5，加入氯化鈉至0.15M，4℃放置5.5小時，在3500轉(zhuǎn)/分下離心分離23分鐘，棄去沉淀，向上清液中加入硫酸鈉至質(zhì)量百分濃度為19％，進行第一次鹽析，在3500轉(zhuǎn)/分，離心分離出蛋白質(zhì)沉淀，沉淀加去離子水至沉淀完全溶解為止，加入硫酸鈉至質(zhì)量百分濃度為15％，進行第二次鹽析，離心分離，獲得的蛋白質(zhì)沉淀加去離子水至沉淀完全溶解為止，將此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝膠柱過濾，過濾之前，凝膠柱用25mM pH＝8的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡，洗脫液流速200ml/小時，洗脫出的蛋白質(zhì)流分用紫外光度計監(jiān)測，吸收波長為280nm，收集第一條譜帶，用聚乙二醇反透析濃縮，再透析除鹽，得到一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY。
(3)競爭ELISA實驗96孔微量板用10mg/L HbsAg按50μL/孔4℃包被過夜，10g/L BSA 37℃封閉1小時，2mg/mL IgY溶液與不同濃度的HbsAg溶液等體積混合，室溫下作用30分鐘，然后每孔50μL加入包被板中37℃反應(yīng)1小時，用洗滌液洗三次，加入相應(yīng)的HRP酶標二抗，37℃反應(yīng)30min，用洗滌液洗三次，每孔加50μL顯色劑0.4mmol/L TMB，含3X10-3％H2O2，37℃顯色反應(yīng)30min，每孔加25μL2mol/L H2SO4終止反應(yīng)并測定A450值。
實施例2(1)動物免疫 六月齡產(chǎn)蛋雞在免疫和產(chǎn)蛋期間隔離狀態(tài)飼養(yǎng)，60μg/ml乙肝病毒表面抗原HbsAg與等體積的佐劑混合作為免疫原。取1ml這種免疫原溶液，分四個位點對每只雞肌肉免疫注射。初次免疫，抗原與完全佐劑混合，兩周后加強免疫注射一次，以后每隔一個月加強免疫注射一次，加強免疫時，抗原與不完全佐劑混合.免疫期間，每天收集雞蛋于4℃儲存待分離；；(2)分離純化 分離出雞卵黃，用6倍體積的去離子水稀釋，用0.1M HCl調(diào)節(jié)pH為5.5，加入氯化鈉至0.2M，4℃放置5小時，在3500轉(zhuǎn)/分下離心分離20分鐘，棄去沉淀，向上清液中加入硫酸鈉至質(zhì)量百分濃度為20％，進行第一次鹽析，在3500轉(zhuǎn)/分，離心分離出蛋白質(zhì)沉淀，沉淀加去離子水至沉淀完全溶解為止，加入硫酸鈉至質(zhì)量百分濃度為14％，進行第二次鹽析，離心分離，獲得的蛋白質(zhì)沉淀加去離子水至沉淀完全溶解為止，將此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝膠柱過濾，過濾之前，凝膠柱用25mM pH＝8的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡，洗脫液流速200ml/小時，洗脫出的蛋白質(zhì)流分用紫外光度計監(jiān)測，吸收波長為280nm，收集第一條譜帶，用聚乙二醇反透析濃縮，再透析除鹽，得到一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY。
實施例3(1)動物免疫 六月齡產(chǎn)蛋雞在免疫和產(chǎn)蛋期間隔離狀態(tài)飼養(yǎng)，60μg/ml乙肝病毒表面抗原HbsAg與等體積的佐劑混合作為免疫原。取1ml這種免疫原溶液，分四個位點對每只雞肌肉免疫注射。初次免疫，抗原與完全佐劑混合，兩周后加強免疫注射一次，以后每隔一個月加強免疫注射一次，加強免疫時，抗原與不完全佐劑混合.免疫期間，每天收集雞蛋于4℃儲存待分離；(2)分離純化 分離出雞卵黃，用9倍體積的去離子水稀釋，用0.1M HCl調(diào)節(jié)pH為4.5，加入氯化鈉至0.1M，4℃放置6小時，在3500轉(zhuǎn)/分下離心分離25分鐘，棄去沉淀，向上清液中加入硫酸鈉至質(zhì)量百分濃度為18％，進行第一次鹽析，在3500轉(zhuǎn)/分，離心分離出蛋白質(zhì)沉淀，沉淀加去離子水至沉淀完全溶解為止，加入硫酸鈉至質(zhì)量百分濃度為16％，進行第二次鹽析，離心分離，獲得的蛋白質(zhì)沉淀加去離子水至沉淀完全溶解為止，將此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝膠柱過濾，過濾之前，凝膠柱用25mM pH＝8的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡，洗脫液流速200ml/小時，洗脫出的蛋白質(zhì)流分用紫外光度計監(jiān)測，吸收波長為280nm，收集第一條譜帶，用聚乙二醇反透析濃縮，再透析除鹽，得到一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY。
產(chǎn)蛋母雞被免疫10天左右，即產(chǎn)生相應(yīng)的雞卵黃免疫球蛋白IgY，且很快達到高峰，產(chǎn)生較長時間的免疫應(yīng)答，效價可維持數(shù)月至一年。IgY來源豐富、產(chǎn)量高，在相同的免疫時間內(nèi)由一只雞所產(chǎn)生的雞蛋中提取的抗體遠比一只兔血清制備的抗體多，收集應(yīng)答時期所產(chǎn)雞蛋可分離得到大量的特異性IgY，這一方法革新了傳統(tǒng)應(yīng)用兔、羊等動物制備抗體的方法。母雞易于飼養(yǎng)，費用不高，收集雞蛋方便，無需宰殺動物，符合現(xiàn)代動物保護規(guī)則。
權(quán)利要求
1.一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY，其特征是用下述方法分離制成(1)動物免疫用乙肝病毒表面抗原HbsAg作為免疫原，對產(chǎn)蛋雞進行免疫，收集雞蛋于4℃儲存；(2)分離純化分離出雞卵黃，用6～9倍體積的去離子水稀釋，用0.1MHCl調(diào)節(jié)pH為4.5～5.5，加入氯化鈉至0.1～0.2M，4℃放置5～6小時，在3500轉(zhuǎn)/分下離心分離20～25分鐘，棄去沉淀，向上清液中加入硫酸鈉至質(zhì)量百分濃度為18～20％，進行第一次鹽析，在3500轉(zhuǎn)/分，離心分離出蛋白質(zhì)沉淀，沉淀加去離子水至沉淀完全溶解為止，加入硫酸鈉至質(zhì)量百分濃度為14～16％，進行第二次鹽析，離心分離，獲得的蛋白質(zhì)沉淀加去離子水至沉淀完全溶解為止，將此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝膠柱過濾，過濾之前，凝膠柱用25mM pH＝8的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡，洗脫液流速200ml/小時，洗脫出的蛋白質(zhì)流分用紫外光度計監(jiān)測，吸收波長為280nm，收集第一條譜帶，用聚乙二醇反透析濃縮，再透析除鹽，得到一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY。
2.一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY的分離方法，其特征是由下述步驟組成(1)動物免疫用乙肝病毒表面抗原HbsAg作為免疫原，對產(chǎn)蛋雞進行免疫，收集雞蛋于4℃儲存；(2)分離純化分離出雞卵黃，用6～9倍體積的去離子水稀釋，用0.1MHCl調(diào)節(jié)pH為4.5～5.5，加入氯化鈉至0.1～0.2M，4℃放置5～6小時，在3500轉(zhuǎn)/分下離心分離20～25分鐘，棄去沉淀，向上清液中加入硫酸鈉至質(zhì)量百分濃度為18～20％，進行第一次鹽析，在3500轉(zhuǎn)/分，離心分離出蛋白質(zhì)沉淀，沉淀加去離子水至沉淀完全溶解為止，加入硫酸鈉至質(zhì)量百分濃度為14～16％，進行第二次鹽析，離心分離，獲得的蛋白質(zhì)沉淀加去離子水至沉淀完全溶解為止，將此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝膠柱過濾，過濾之前，凝膠柱用25mM pH＝8的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡，洗脫液流速200ml/小時，洗脫出的蛋白質(zhì)流分用紫外光度計監(jiān)測，吸收波長為280nm，收集第一條譜帶，用聚乙二醇反透析濃縮，再透析除鹽，得到一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY及其分離方法，分離方法是(1)動物免疫；(2)分離純化分離出雞卵黃，用去離子水稀釋，調(diào)節(jié)pH，加氯化鈉放5～6小時，離心分離，棄去沉淀，向上清液中加入硫酸鈉進行第一次鹽析，離心分離出蛋白質(zhì)沉淀，沉淀加去離子水至沉淀完全溶解為止，加入硫酸鈉進行第二次鹽析，離心分離，獲得的蛋白質(zhì)沉淀加去離子水至沉淀完全溶解為止，用凝膠柱過濾，洗脫出的蛋白質(zhì)流分用紫外光度計監(jiān)測，吸收波長為280nm，收集第一條譜帶，經(jīng)反透析濃縮，再透析除鹽，得到一種抗乙肝病毒的雞卵黃免疫球蛋白IgY，本發(fā)明的分離方法，工藝簡單，成本低廉，所得樣品質(zhì)量較好。
文檔編號C07K16/02GK1935841SQ200610015578
公開日2007年3月28日 申請日期2006年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月4日
發(fā)明者孫淑清, 馬向輝 申請人:天津大學