專利名稱：：靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白及其制備方法。技術(shù)背景全球至少有3.5億人攜帶乙型肝炎病毒(HBV)，有3億肝硬化與HBV感染有關(guān)，我國(guó)是HBV感染的高發(fā)地區(qū)，人群中乙肝表面抗原(HBsAg)陽性率為9.75%，HBsAg攜帶者達(dá)1億2千萬人；在HBV攜帶者中，四分之一會(huì)發(fā)展為慢性肝病，以此推算，全國(guó)慢性乙肝肝病不小于3千萬人，這些病人如果不及時(shí)療，進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌的機(jī)率較高，而且可通過母嬰傳播給嬰兒和兒童，影響下一代的健康，對(duì)人民的健康危害很大。乙肝被WHO列為人類第九大死因，而且至今還沒有一種藥物可有效的防治它。國(guó)際上對(duì)乙型肝炎的治療，現(xiàn)尚無十分滿意的療法，多是采用綜合治療方法，而其中以抗病毒治療為主。近年來國(guó)外研究表明人乙肝免疫球蛋白除了可以中和HBV表面的HBsAg，還可以有選擇性地對(duì)HBV的S基因施加影響，從而可以成為治療乙型肝炎抗病毒療法的一種良好的配伍藥物。靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白主要用于乙肝病毒攜帶者在進(jìn)行肝移植手術(shù)中的防治。在國(guó)外一些發(fā)達(dá)國(guó)家，乙肝病毒感染的晚期患者唯一的治療途徑是進(jìn)行肝移植手術(shù)，但對(duì)于HBV+的病人來說肝移植后乙肝的復(fù)發(fā)率高達(dá)80X以上，若沒有進(jìn)行積極的抗乙肝治療，這類病人的存活率只有大約50%。采用靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白進(jìn)行預(yù)防性治療，能把肝移植手術(shù)后的乙肝復(fù)發(fā)率降到30%左右，同時(shí)存活率也有相應(yīng)的提高。目前制備靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白的工藝復(fù)雜，并需要專用設(shè)備，不適于規(guī)模生產(chǎn)，因此價(jià)格昂貴。
發(fā)明內(nèi)容為解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白，可保護(hù)特殊患者免受乙肝病毒感染。本發(fā)明的另一目的是提供一種靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白的制備方法，其適合于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)，制得產(chǎn)品具有良好的抗乙肝活性。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白，含有高效價(jià)乙肝病毒抗體，免疫球蛋白含量不低于總蛋白含量的95.0%，乙肝抗體效價(jià)大于50IU/ml,IgG單體和二聚體之和不低于95%，為液體或凍干劑型。一種靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)制作分離FI:將乙肝表面抗體效價(jià)》8IU/ml的血漿輸入到低溫反應(yīng)罐內(nèi)，用低于20°C0.9%NaCl溶液將血漿稀釋至蛋白含量45-60g/L，待血漿降溫到0°C以下時(shí)，緩慢加入-15'C以下95%的乙醇至反應(yīng)液最終乙醇濃度為7-9%，反應(yīng)液溫度控制在-2.(TC-3.(TC繼續(xù)攪拌2小時(shí)，靜放2小時(shí)以上，按2-10g/L反應(yīng)液加入硅藻土后繼續(xù)攪拌60分鐘，將反應(yīng)液輸入過濾器中，濾過液澄清透明后，輸入潔凈的低溫反應(yīng)罐內(nèi)，濾過液溫度控制在0°C以下，壓力控制在0-0.1Mpa;(2)制作分離FII+III:用pH4.0乙酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)過濾液pH為6.75±0.05,緩慢加入-15。C以下95%乙醇，至反應(yīng)液最終乙醇濃度為20-22%，最終溫度控制在-5°C±0.5'C，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，靜放2小時(shí)以上，按2-10g/L反應(yīng)液加入硅藻土，繼續(xù)攪拌60分鐘，反應(yīng)液輸入過濾器中，待濾過液澄清透明后，輸入潔凈的低溫反應(yīng)罐內(nèi)，濾過液溫度控制在-3.(TC以下，壓力控制在0-0.1Mpa，過濾完畢，將沉淀物吹干，刮取FII+FIII沉淀稱重；(3)制作分離FIII:加入FII+FIII沉淀量8倍的0'C0.01mol/LNaCI溶液溶解，待攪拌混均后，用pH4.0乙酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH為5.20±0.05，將反應(yīng)液溫度降至0'C以下,緩慢加入-15。C以下95%乙醇,最終控制乙醇濃度在17-19%,加完乙醇,繼續(xù)攪拌2小時(shí),控制最終溫度在-4'C-5'C,靜放2小時(shí)以上，將反應(yīng)液緩慢輸入過濾器，至濾過液澄清透明后，輸入潔凈的反應(yīng)罐內(nèi)，轉(zhuǎn)入下道工序，濾過液溫度控制在-3.5'C以下，壓力控制在0-0.1Mpa;(4)制作分離FII:將工序(3)的濾過液溫度控制在-3'C以下，按每升濾過液加入(TC以下lmol/L的氯化鈉溶液0.042升，濾過液的離子濃度調(diào)整后，用lmol/L的NaHC03溶液調(diào)整反應(yīng)液pH值為6.90土0.5，降溫到-4.0。C時(shí)，緩慢加入-15°。以下95%乙醇，最終乙醇濃度為23-25%,乙醇加完后,繼續(xù)攪拌2小時(shí)，最終溫度控制在-7'C-8'C，靜放8小時(shí)以上，將FII反應(yīng)液輸入過濾器，過濾過程中,進(jìn)液壓力控制在0-0.14MPa，出液溫度控制在-5.(TC以下，過濾完畢,吹干沉淀，刮取FII沉淀，收集于無熱原的塑料袋內(nèi)，稱重；(5)病毒滅活采用巴氏消毒，將FII沉淀倒入不銹鋼溶解桶內(nèi)，加入沉淀重量35倍體積的0'C2。C的注射用水,并攪拌至完全溶解，按0.6千克/1升蛋白液的比例加入山梨醇保護(hù)劑，調(diào)節(jié)pH5.0，在59.5-60.5^溫度下滅活10小時(shí)。(6)超濾脫醇；(7)制劑灌裝低pH孵放后，將滅活后的制品，超濾濃縮到蛋白濃度〈180g/L、乙肝表面抗體效價(jià)〉50Iu/ml，加麥芽糖至最終體積的10-17g/10ml，氯化鈉至最終體積7g/L，調(diào)節(jié)rae.9土o.3，無菌分裝或凍干分裝。步驟(i)中原料血漿的制備方法，按單采血漿術(shù)規(guī)程操作，選擇符合國(guó)家單采血漿獻(xiàn)漿標(biāo)準(zhǔn)的獻(xiàn)漿員，用3針法每次1支，于0、1、6月對(duì)獻(xiàn)漿員注射乙肝疫苗進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，選擇經(jīng)基礎(chǔ)免疫后乙肝表面抗體陽性的獻(xiàn)漿員于基免完成后6個(gè)月注射乙肝疫苗強(qiáng)化免疫，強(qiáng)化免疫14天后采集乙肝抗體效價(jià)大于8IU/ml的健康人血漿。本發(fā)明的有益效果1.本發(fā)明的靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白是用于肝移植病人防止乙肝病毒再感染的有效藥物，能顯著降低肝移植病人的乙肝病毒感染率，提高患者的存活率。2.本發(fā)明產(chǎn)品將填補(bǔ)國(guó)內(nèi)此類藥物空白。3.與己有發(fā)明相比，本發(fā)明的制備工藝不采用親和層析分離步驟，克服了工藝放大的瓶頸；采用獨(dú)特的工藝參數(shù)控制，用常規(guī)的低溫乙醇沉淀一一壓濾分離設(shè)備即可生產(chǎn)具有抗乙肝特異性免疫球蛋白，適合于規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)，產(chǎn)品具有良好的抗乙肝活性；本發(fā)明采用巴氏消毒和低pH孵放兩種病毒措施，產(chǎn)品安全可靠。4.制造靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白的原料血漿有穩(wěn)定高效的來源，能滿足血漿的供給。具體實(shí)施方式以下通過具體的例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明并不限于此特定例子。1.靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白原料血漿的制備選擇符合國(guó)家單采血漿獻(xiàn)漿標(biāo)準(zhǔn)的獻(xiàn)漿員，用3針法每次1支，乙肝疫苗含量為10mg/支，于0、1、6月對(duì)獻(xiàn)漿員注射乙肝疫苗進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，選擇經(jīng)基礎(chǔ)免疫后乙肝表面抗體陽性的獻(xiàn)漿員于基免完成后6個(gè)月注射乙肝疫苗強(qiáng)化免疫，強(qiáng)化免疫14天后采集乙肝抗體效價(jià)大于8IU/ml的健康人血漿，血漿采集過程按照衛(wèi)生部《血漿單釆技術(shù)要求》通過采漿機(jī)采集，每次每人份釆集500-600ml，封袋后冰凍保存。2.靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白的制備2.1制作分離FI:將乙肝表面抗體效價(jià)^8IU/ml的血漿合并后，輸入到低溫反應(yīng)罐內(nèi)。用低于25°C0.9%NaCI溶液將血漿稀釋至蛋白含量45-60g/L，待血漿降溫到O'C以下時(shí)，緩慢加入-15。C以下95%的乙醇至反應(yīng)液最終乙醇濃度為8%。乙醇加完反應(yīng)液溫度控制在-2.(TC-3.(TC,繼續(xù)攪拌2小時(shí)。按5g/L反應(yīng)液加入硅藻土,繼續(xù)攪拌60分鐘.將反應(yīng)液輸入過濾器中，濾過液澄清透明后,輸入潔凈的低溫反應(yīng)罐內(nèi)。濾過液溫度控制在0°C以下，壓力控制在0-0.lMPa。過濾完畢，用-3'C以下的壓縮氣將沉淀吹干。2.2制作分離FII+III用PH4.0乙酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)過濾液pH為6.75±0.05，緩慢加入-15°〇以下95%乙醇，至反應(yīng)液最終乙醇濃度為20%。乙醇加完,繼續(xù)攪拌15分鐘，最終溫度控制在-5'C土0.5'C。繼續(xù)攪拌2小時(shí),靜止2小時(shí)以上。按5g/L反應(yīng)液加入硅藻土，繼續(xù)攪拌60分鐘.反應(yīng)液輸入過濾器中，待濾過液澄清透明后，輸入潔凈的低溫反應(yīng)罐內(nèi)。濾過液溫度控制在-3.0'C以下，壓力控制在0-0.lMPa。過濾完畢，用2(^乙醇沖洗液沖洗沉淀，再用-3。C以下的壓縮空氣將沉淀物吹干。刮取FII+FIII沉淀稱重。2.3制作分離FIII加入FII+FIII沉淀量8倍的(TC0.01mol/LNaCI溶液溶解。待攪拌混均后，用pH4.0乙酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH為5.20±0.05。將反應(yīng)液溫度降至0'C以下，緩慢加入-15'C以下95%乙醇，最終控制乙醇濃度在17%。加完乙醇,繼續(xù)攪拌2小時(shí)，控制最終溫度在-4°C-5°C,靜放2小時(shí)以上.將反應(yīng)液緩慢輸入過濾器,至濾過液澄清透明后,輸入潔凈的反應(yīng)罐內(nèi)。濾過液溫度控制在-3.5。C以下,壓力控制在0-O.lMPa。過濾完畢，用-3'C以下的壓縮氣將過濾器中殘余反應(yīng)液吹出。濾過液輸入反應(yīng)罐中，轉(zhuǎn)入下道工序。2.4制作分離FII將上道工序?yàn)V過液溫度控制在-3'C以下。按每升濾過液加入(TC以下lmol/L的氯化鈉溶液0.042升。濾過液的離子濃度調(diào)整后，用lraol/L的NaHC03溶液調(diào)整反應(yīng)液pH值為6.90±0.5。降溫到-4.(TC時(shí)，緩慢加入-15'C以下95%乙醇,流速控制在2.0升/分,按每升反應(yīng)液加95%乙醇0.114升。調(diào)節(jié)pH耗用lmol/LNaHC03的溶液與調(diào)整離子濃度用lmol/L的氯化鈉溶液，按每升體積加-151:95%乙醇0.357升，使最終乙醇濃度為25%。乙醇加完后，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，最終溫度控制在-7'C-8。C，靜放8小時(shí)以上。將FII反應(yīng)液輸入過濾器。過濾過程中，進(jìn)液壓力嚴(yán)格控制在0-20psi(0-0.14MPa)以內(nèi)，出液溫度控制在-5.0°C以下，濾過液輸入乙醇回收罐。過濾完畢，用-4。C以下的壓縮氣吹干沉淀。刮取FII沉淀，收集于無熱原的塑料袋內(nèi)，稱重。2.5病毒滅活將FII沉淀倒入不銹鋼溶解桶內(nèi)，加入沉淀重量35倍體積的0'C2'C的注射用水，并攪拌至完全溶解。按0.6千克/1升蛋白液的比例加入山梨醇保護(hù)劑，調(diào)節(jié)pH5.0，在59.5-60.5'C溫度下滅活10小時(shí)。2.6超濾脫醇待沉淀完全溶解后進(jìn)行澄清過濾后輸入超濾容器中。將濾過液進(jìn)行超濾脫醇、脫鹽。超濾濃縮至蛋白濃度為7.5%。用注射用水調(diào)節(jié)制品的蛋白濃度為6%，復(fù)測(cè)pH值。用0.5mol/L鹽酸調(diào)節(jié)制品pH4.1±0.3。2.7制劑灌裝將原液置于24士rC環(huán)境中孵放21天。將滅活后的制品，超濾濃縮到蛋白濃度〈180g/L、乙肝表面抗體效價(jià)〉50Iu/ml，加麥芽糖最終體積的10g/10ml，氯化鈉至最終體積7g/L，調(diào)節(jié)PH6.9±0.3。按1000IU/瓶的規(guī)格無菌分裝或凍干分裝。3.質(zhì)量檢驗(yàn)按上述工藝分3批次制備靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白，制得產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗(yàn)如表1。表l.靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結(jié)論以上3批試制成品檢定合格權(quán)利要求1.一種靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白，含有高效價(jià)乙肝病毒抗體，免疫球蛋白含量不低于總蛋白含量的95.0％，乙肝抗體效價(jià)大于50IU/ml，IgG單體和二聚體之和不低于95％。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白，為液體或凍干劑型。3.—種靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)制作分離FI:將乙肝表面抗體效價(jià)^8IU/ml的血漿輸入到低溫反應(yīng)罐內(nèi)，用低于20°C0.9%NaCl溶液將血漿稀釋至蛋白含量45_60g/L，待血漿降溫到O'C以下時(shí)，緩慢加入-15。C以下95%的乙醇至反應(yīng)液最終乙醇濃度為7-9%,反應(yīng)液溫度控制在-2.(TC-3.(TC繼續(xù)攪拌2小時(shí)，靜放2小時(shí)以上，按2-10g/L反應(yīng)液加入硅藻土后繼續(xù)攪拌60分鐘，將反應(yīng)液輸入過濾器中，濾過液澄清透明后，輸入潔凈的低溫反應(yīng)罐內(nèi)，濾過液溫度控制在0°C以下，壓力控制在0-0.1Mpa;(2)制作分離FII+III:用PH4.0乙酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)過濾液pH為6.75±0.05,緩慢加入-15'C以下95%乙醇，至反應(yīng)液最終乙醇濃度為20-22%，最終溫度控制在_5"±0.5'C，繼續(xù)攪拌2小時(shí),靜放2小時(shí)以上，按2-10g/L反應(yīng)液加入硅藻土，繼續(xù)攪拌60分鐘，反應(yīng)液輸入過濾器中，待濾過液澄清透明后，輸入潔凈的低溫反應(yīng)罐內(nèi)，濾過液溫度控制在-3.0"以下，壓力控制在0-0.1Mpa，過濾完畢，將沉淀物吹干，刮取FII+FIII沉淀稱重；(3)制作分離FIII:加入FII+FIII沉淀量8倍的O'C0.Olmol/LNaCI溶液溶解，待攪拌混均后，用pH4.0乙酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH為5.20±0.05,將反應(yīng)液溫度降至0'C以下,緩慢加入-15。C以下95%乙醇,最終控制乙醇濃度在17-19%，加完乙醇,繼續(xù)攪拌2小時(shí),控制最終溫度在-4'C-5。C，靜放2小時(shí)以上，將反應(yīng)液緩慢輸入過濾器,至濾過液澄清透明后，輸入潔凈的反應(yīng)罐內(nèi)，轉(zhuǎn)入下道工序，濾過液溫度控制在-3.5'C以下，壓力控制在0-0.1Mpa;(4)制作分離FII:將工序(3)的濾過液溫度控制在-3'C以下，按每升濾過液加入(TC以下lmol/L的氯化鈉溶液0.042升，濾過液的離子濃度調(diào)整后，用lmol/L的NaHC(V溶液調(diào)整反應(yīng)液pH值為6.90±0.5，降溫到-4.(TC時(shí)，緩慢加入-15。C以下95%乙醇，最終乙醇濃度為23-25%，乙醇加完后，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，最終溫度控制在-7°C-8'C,靜放8小時(shí)以上，將FII反應(yīng)液輸入過濾器，過濾過程中，進(jìn)液壓力控制在0-0.14MPa,出液溫度控制在-5.(TC以下，過濾完畢，吹干沉淀，刮取FII沉淀，收集于無熱原的塑料袋內(nèi)，稱重；(5)病毒滅活采用巴氏消毒，將FII沉淀倒入不銹鋼溶解桶內(nèi)，加入沉淀重量35倍體積的0'C2'C的注射用水，并攪拌至完全溶解，按0.6千克/1升蛋白液的比例加入山梨醇保護(hù)劑，調(diào)節(jié)pH5.0，在59.5-60.5'C溫度下滅活10小時(shí)。(6)超濾脫醇；(7)制劑灌裝低pH孵放后，將滅活后的制品，超濾濃縮到蛋白濃度〈180g/L、乙肝表面抗體效價(jià)〉50Iu/ml，加麥芽糖至最終體積的10-17g/10ml，氯化鈉至最終體積7g/L，調(diào)節(jié)P朋.9士0.3，無菌分裝或凍干分裝。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中的原料血漿的制備方法為按單采血漿術(shù)規(guī)程操作，選擇符合國(guó)家單采血漿獻(xiàn)漿標(biāo)準(zhǔn)的獻(xiàn)漿員，用3針法每次1支，于0、1、6月對(duì)獻(xiàn)漿員注射乙肝疫苗進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，選擇經(jīng)基礎(chǔ)免疫后乙肝表面抗體陽性的獻(xiàn)槳員于基免完成后6個(gè)月注射乙肝疫苗強(qiáng)化免疫，強(qiáng)化免疫14天后采集乙肝抗體效價(jià)大于8IU/ml的健康人血漿。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中，過濾完畢后，用20%乙醇沖洗液沖洗沉淀,再用-3°0以下的壓縮空氣將沉淀物吹干；所述步驟(4)中，過濾完畢后，用-4'C以下的壓縮氣吹干沉淀。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中，調(diào)節(jié)pH耗用lmol/LNaHC03的溶液與調(diào)整離子濃度用lmol/L的氯化鈉溶液，加_151:95%乙醇使最終乙醇濃度為23-25%。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟(5)的病毒滅活步驟為將FII沉淀倒入不銹鋼溶解桶內(nèi)，加入沉淀重量3~5倍體積的0'C2。C的注射用水，并攪拌至完全溶解，按0.6千克/1升蛋白液的比例加入山梨醇保護(hù)劑，調(diào)節(jié)pH5.0，在59.5-60.5'C溫度下滅活10小時(shí)。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟(6)的超濾脫醇步驟為待沉淀完全溶解后進(jìn)行澄清過濾后輸入超濾容器中，將濾過液進(jìn)行超濾脫醇、脫鹽，超濾濃縮至蛋白濃度為7.5%，用注射用水調(diào)節(jié)制品的蛋白濃度為6%，復(fù)測(cè)pH值，用0.5mol/L鹽酸調(diào)節(jié)制品pH4.1±0.3。9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟(7)中，將原液置于24土1'C環(huán)境中孵放21天。全文摘要本發(fā)明公開了一種靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白及其制備方法，該靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白含有高效價(jià)乙肝病毒抗體，免疫球蛋白含量不低于總蛋白含量的95.0％，乙肝抗體效價(jià)大于50IU/ml，IgG單體和二聚體之和不低于95％，通過對(duì)原料血漿進(jìn)行多步驟分離、病毒滅活、超濾脫醇、灌裝制得。本發(fā)明的靜脈注射用人乙肝免疫球蛋白是用于肝移植病人防止乙肝病毒再感染的有效藥物，能顯著降低肝移植病人的乙肝病毒感染率，提高患者的存活率；制備工藝克服了現(xiàn)有技術(shù)瓶頸，采用獨(dú)特的工藝參數(shù)控制，用常規(guī)的低溫乙醇沉淀——壓濾分離設(shè)備即可生產(chǎn)具有抗乙肝特異性免疫球蛋白，適合于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)，產(chǎn)品具有良好的抗乙肝活性且安全可靠。文檔編號(hào)A61K39/42GK101249265SQ20081002737公開日2008年8月27日申請(qǐng)日期2008年4月11日優(yōu)先權(quán)日2008年4月11日發(fā)明者呂應(yīng)年,朱光祖,王明明,蔣桂香,鄭文東,黃榮強(qiáng)申請(qǐng)人:三九集團(tuán)湛江開發(fā)區(qū)雙林藥業(yè)有限公司