專利名稱：端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶融合蛋白、編碼它的核苷酸以及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及癌癥的治療。更具體地，本發(fā)明涉及編碼融合蛋白 的多核苷酸，其中所述融合蛋白包含腫瘤相關(guān)多肽端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 (TERT)的至少一部分。本發(fā)明還提供了包含所述多核普酸的重組載體 和宿主，純化的融合蛋白和使用在此公開的組合物和分子引發(fā)或增強針對 TERT基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫反應(yīng)的方法。
背景技術(shù)：
疫苗接種已經(jīng)成為預(yù)防多種傳染性疾病的標準方法。由于分子工程的 發(fā)展和對肺瘤免疫學(xué)的更好的了解，疫苗對其他疾病例如癌癥的應(yīng)用現(xiàn)在 是一種有吸引力的可能。
癌癥是在世界范圍內(nèi)死亡的主要原因之一。盡管有大量的癌癥相關(guān)研 究，組合了手術(shù)、放射和化學(xué)治療的常規(guī)的治療常常不能有效地治療已建 立的癌癥。預(yù)防的可靠的方法也還是沒有。
癌癥一般涉及基因的功能失常，所述基因有助于細胞周期或細胞增殖 的調(diào)節(jié)，例如生長因子和它們的受體、癌基因和腫瘤抑制基因。許多這些 基因的產(chǎn)物在各種各樣的胂瘤細胞的表面表達，因而，被稱為腫瘤相關(guān)抗 原(TAA)。在許多實驗?zāi)Ｐ椭校幋aTAA的基因直接向受試者中導(dǎo)入 已經(jīng)顯示了產(chǎn)生針對TAA的保護性免疫反應(yīng)，使得這些分子成為疫苗療 法的耙點。然而，由于這些基因產(chǎn)物中的許多也在正常細胞中表達，雖然 是低水平的，靶向TAA的許多免疫學(xué)治療已經(jīng)祐_證明由于自身耐受性是 無效的。
編碼幾種腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的基因已經(jīng)被分離、表征并插入到遺 傳載體，例如質(zhì)粒DNA和病毒載體中。已經(jīng)與癌癥的發(fā)病原理相關(guān)聯(lián)的 一種胂瘤相關(guān)抗原是端粒酶(TERT)。
6端粒酶是DNA聚合酶，其通常在維持染色體末端處端粒長度方面起 作用。在正常細胞生長期間，RNA引物附著在DNA的5'末端并啟動復(fù)制。 在除去RNA引物時，長度上的缺口被導(dǎo)入產(chǎn)生的DNA子代鏈中。因而， 使用常規(guī)聚合酶的DNA線性鏈的復(fù)制在復(fù)制的每個漸進的輪次中引起端 粒長度的縮短。端粒長度的這種縮短導(dǎo)致細胞衰老或正常人類體細胞的老 化。
端粒酶是包含RNA組件和催化蛋白組件(端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶)的核糖 核蛋白。人類端粒酶的催化組件描述于Meyerson等(Ce〃 1197: 785-95 (1990)和Nakamura等(277: 955-59 ( 1997) ) 。 TERT酶利用 它的RNA組件作為端粒DNA合成的才莫板，因而容許端粒在細胞生長的連 續(xù)世代中維持它們的長度。在多個增殖循環(huán)中這種端粒長度的維持允許細 胞逃避正常的衰老并成為永生的，容許腫瘤在長時間上生長和轉(zhuǎn)移。由于 端粒酶為細胞賦予了復(fù)制永生性，在癌性細胞系和各種腫瘤類型中已經(jīng)檢 測到端粒酶活性(Kim".肚膨266: 2011-15 ( 1994))。反之，端粒 酶在正常人組織和正常的體細胞培養(yǎng)物中是無活性的或僅以低水平短暫 地表達。端粒酶在大多數(shù)癌癥類型中過量表達以及在正常細胞中低表達或 不表達的組合，使得TERT成為與異常的細胞增殖相關(guān)的疾病例如癌癥的 治療和/或預(yù)防的革巴點。
由于已經(jīng)克隆和表征了端粒酶的催化和RNA組件，端粒酶特異性疫 苗的開發(fā)現(xiàn)在是可能的(參見，例如，美國專利6， 166,178)。然而，許 多疫苗的開發(fā)和商業(yè)化已經(jīng)受到一些難點的阻礙，所述難點與在成功地轉(zhuǎn) 化的宿主生物體中獲得期望的免疫原的高水平表達相關(guān)。有效的基于DNA
的疫苗的開發(fā)也受到在治療的個體中不能產(chǎn)生足夠量的免疫反應(yīng)以引起 臨床條件下的腫瘤退化的阻礙。因此，盡管如上所述的鑒定了編碼端粒酶 蛋白的野生型核苷酸序列，高度期望的是開發(fā)出一種疫苗，當遞送給哺乳 動物時能夠引發(fā)相對于野生型全長TERT cDNA的增強的TERT-特異性免 疫反應(yīng)。同樣期望的是開發(fā)用于治療和預(yù)防TERT相關(guān)性癌癥的方法，其 利用了安全和有效地強化TERT-特異性免疫反應(yīng)的核酸分子或蛋白。
發(fā)明概述
如上所述，胂瘤相關(guān)抗原端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)基因的表達通常 與腺癌、包括結(jié)腸直腸癌的發(fā)展或存在相關(guān)。為此，本發(fā)明涉及組合物和方法，來引發(fā)或增強針對人類TERT (hTERT)基因表達的蛋白產(chǎn)物的免 疫性。特別地，本發(fā)明提供了編碼融合蛋白的多核苷酸，其中所述融合蛋 白包含與大腸桿菌(Eco/纟)熱不穩(wěn)定腸毒素的B亞基(LTB )的實質(zhì)部分 融合的hTERT蛋白或其變體。本發(fā)明還提供了包含所述多核普酸的重組 載體，包括但不限于，腺病毒和質(zhì)粒載體，和包含所述重組載體的宿主細 胞。在此還提供的是由本發(fā)明的多核苷酸編碼的純化的融合蛋白。 hTERT-LTB融合蛋白和編碼所述融合蛋白的多核苦酸作為用于端粒酶相 關(guān)癌癥的預(yù)防和/或治療的疫苗是有用的。所述疫苗作為單一治療或作為治 療方案的部分是有用的，所述方案包括施用第二疫苗，例如多核苷酸、基 于細胞的、蛋白、或基于肽的疫苗，或包括放射治療或化學(xué)治療。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，編碼hTERT的核苷酸的序列和/或編 碼LTB的核苦酸的序列包含已經(jīng)為在人類宿主細胞中高水平表達而優(yōu)化 的密碼子。換句話說，在本發(fā)明的某些實施方式中，多核苷酸序列的密碼 子利用才莫式相似于高度表達的哺乳動物和/或人類基因的密碼子利用才莫式。
本發(fā)明的另一個方面是包含編碼hTERT-LTB的核苷酸的表達構(gòu)建 體。在本發(fā)明的這個部分的優(yōu)選的實施方式中，所述構(gòu)建體包含處在TERT 基因的編碼序列之前的TPA前導(dǎo)序列以確保TERT-LTB融合蛋白被分泌。
在本發(fā)明的另外的優(yōu)選的實施方式中，端粒酶抗原的端粒酶催化活性 被滅活，從而對于疫苗目的，編碼的TERT融合蛋白是比野生型TERT更 安全的。TERT融合蛋白的酶活性可以通過向TERT編碼核苷酸序列添加 突變/刪除來滅活。在本發(fā)明的特定的示范性實施方式中，核苷酸已經(jīng)-故突 變，以改變?nèi)祟怲ERT蛋白序列中特定的氨基酸D712A和V713I,以及小 鼠TERT蛋白序列中的D702A和V703I。
本發(fā)明進一步提供了包含編碼hTERT-LTB融合蛋白的核苷酸序列的 腺病毒和質(zhì)粒載體。本發(fā)明還描述了所述腺病毒和質(zhì)粒載體在用于hTERT 相關(guān)癌癥的預(yù)防和/或治療的免疫原性組合物和疫苗中的用途。
還提供的是腺病毒載體，其包含編碼人類TERT蛋白或TERT蛋白變 體的核苷酸的序列。在本發(fā)明的這個方面中有用的變體包含用作消除端粒 酶催化活性的突變。在本發(fā)明的這個部分的優(yōu)選的實施方式中，所述腺病 毒載體是Ad6載體。在其他優(yōu)選的實施方式中，所述腺病毒載體是Ad5 載體。
本發(fā)明進一步提供了通過施用包含本發(fā)明提供的TERT融合物或
8TERT融合蛋白的疫苗或藥物組合物、引發(fā)針對TERT蛋白的免疫反應(yīng)， 預(yù)防患者中癌癥的發(fā)展或治療具有端粒酶相關(guān)腫瘤的患者的方法。在本文 方法的優(yōu)選的實施方式中，相對于野生型TERT引發(fā)的反應(yīng)，所述免疫反 應(yīng)被增強了。
在整個說明書中和所附權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式"一種"、"一個" 和"該"包括復(fù)數(shù)的內(nèi)容，除非上下文中明顯地另外指示了 。
如在整個說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，采用以下定義和縮寫
術(shù)語"啟動子"是指在DNA鏈上、RNA聚合酶能與之結(jié)合的識別位點。 啟動子與RNA聚合酶形成起始復(fù)合物來啟動和驅(qū)動轉(zhuǎn)錄活性。通過稱為 "增強子"的活化序列，或稱為"沉默子"的抑制序列，可以修飾所述復(fù)合物。
術(shù)語"盒，，是指要從載體表達的核苷酸或基因序列，例如，編碼hTERT (AI) -LTB融合物的核苦酸或基因序列。 一般地，盒包含可被插入到載 體中的基因序列，在某些實施方式中其提供了用于表達核苷酸或基因序列 的調(diào)節(jié)序列。在其他實施方式中，核苷酸或基因序列提供了用于其表達的 調(diào)節(jié)序列。在進一步的實施方式中，所述載體提供了某些調(diào)節(jié)序列，所述 核苷酸或基因序列提供了其他調(diào)節(jié)序列。例如，所述載體可以提供用于轉(zhuǎn) 錄所述核苷酸或基因序列的啟動子，所述核苷酸或基因序列提供轉(zhuǎn)錄終止 序列?？捎奢d體提供的調(diào)節(jié)序列包括，但不限于，增強子、轉(zhuǎn)錄終止序列、 剪接接受體和供體序列、內(nèi)含子、核糖體結(jié)合序列和聚(A)附加序列。
術(shù)語"載體"是指一些工具，通過它們能將DNA片段導(dǎo)入到宿主有機 體或宿主組織中。存在著各種型式的載體，包括質(zhì)粒、病毒(包括腺病毒)、 噬菌體和粘粒。
所述術(shù)語"第一代"對于腺病毒載體使用時，描述了復(fù)制缺陷性的腺病 毒載體。笫一代腺病毒載體一般具有刪除的或失活的El基因區(qū)域，優(yōu)選 的具有刪除的或失活的E3基因區(qū)域。
名稱"pVlJnsA/TPA-mTERT (AI) -LTBopt"是指在此公開的質(zhì)粒構(gòu)建 體，其包含具有內(nèi)含子A的CMV即時早期(IE)啟動子、與密碼子優(yōu)化 的LTB基因融合的全長的密碼子優(yōu)化的鼠TERT基因，和源于牛生長激素 的聚腺苷酸化以及轉(zhuǎn)錄終止序列(參見實施例2)。另外，編碼人類組織 纖溶酶原激活物(TPA)信號序列的前導(dǎo)序列存在于編碼mTERT-LTB的 核苷酸序列的5'。名稱"AT表明突變被添加給TERT序列來功能上地消除 端粒酶催化活性。名稱"pVlJnsA/mTERT (AI) opt"是指基本上如上所述的構(gòu)建體，只是該構(gòu)建體包含未融合到LTB或TPA的鼠的優(yōu)化的TERT 核苷酸序列。
名稱"pVlJnsA/TPA-hTERT ( AI) -LTBopt"是指在此公開的質(zhì)粒構(gòu)建 體，其包含具有內(nèi)含子A的CMV即時早期(IE)啟動子、與密碼子優(yōu)化 的LTB基因融合的全長的密碼子優(yōu)化的人類TERT基因，和源于牛生長激 素的聚腺苷酸化以及轉(zhuǎn)錄終止序列(參見實施例2)。另外，編碼人類組 織纖溶酶原激活物(TPA)信號序列的前導(dǎo)序列存在于編碼hTERT-LTB 的核苷酸序列的5'。這種構(gòu)建體中的hTERT序列包含突變來功能上地消 除端粒酶催化活性。
名稱"Ad6/TPAmTERT (AI) "LTBopt"和"Ad6/hTERT ( AI)"是指在 此公開的兩種構(gòu)建體，其包含El和E3區(qū)域刪除的Ad6腺病毒基因組。 在"Ad6/TPAmTERT (AI) -LTBopt"構(gòu)建體中，El區(qū)域被密碼子優(yōu)化的鼠 TERT-LTB基因以El平行方向替代，處在沒有內(nèi)含子A的人類CMV啟 動子的控制之下，之后是牛生長激素聚腺苷酸化信號。TERT編碼序列包 含突變來消除端粒酶催化活性。該構(gòu)建體進一步包含編碼人類組織纖溶酶 原激活物(TPA)信號序列的序列，其處在TERT (AI) -LTB編碼核苷酸 序列的5'。 "Ad6/hTERT (AI)"構(gòu)建體是基本上如上所述的，只是Ad6基 因組的E1區(qū)域被TERT cDNA序列替換，所述序列包含突變來消除酶活 性。
縮寫"LTB"—般指大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的B亞基，或其實質(zhì)部分， 包括在C-末端或N-末端截短的但維持了佐劑活性的亞基，以及含有內(nèi)部 的氨基酸插入、刪除或替換但維持了佐劑活性的亞基(Fingerut等F"c"'"e 23:4685-4696 (2005))。
如在此使用的，"融合蛋白，，是指具有共價連接的至少兩個異源多肽的 蛋白，其中一個多肽來自一個蛋白序列或結(jié)構(gòu)域，另一個多肽來自第二蛋 白序列或結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的融合蛋白包含TERT多肽或其片段或變體，和 第二多肽，其包含LTB的實質(zhì)部分。TERT多肽、其片段或變體可以是人 類TERT或來自另一個物種，例如小鼠的TERT同源物。包含融合蛋白的 多肽優(yōu)選的是N-末端到C-末端連接的。所述TERT多肽和所述LTB多肽 可以以任何順序融合。在本發(fā)明的某些實施方式中，TERT多肽的C-末端 被融合到LTB的N-末端，如附

圖1和2中例示的。然而，其中LTB亞基 被融合到TERT多肽的N-末端的融合蛋白也是期待的。術(shù)語"TERT融合蛋白"或"TERT-LTB融合蛋白"在此作為指代如上所 述的融合物的通稱可互換地使用，其包含融合到LTB多肽的TERT多肽或 其片段或變體。術(shù)語"TERT-LTB融合物"是指一種核酸序列，其中TERT 基因的至少一部分融合到大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的LTB亞基的實質(zhì)部 分。術(shù)語"TERT-LTB融合蛋白"是指由在此描述的TERT-LTB融合物編碼 的多肽。術(shù)語"TERT-LTB融合物"和"TERT-LTB融合蛋白"還理解為是指 其片段、其同源物、和其功能等效物(集體地稱為"變體")，例如在其中 一個或更多個氨基酸被插入、刪除或被其他氨酸替換的那些。本發(fā)明的 TERT-LTB融合物在向哺乳動物例如人類施用時，可以刺激輔助T細胞或 細胞毒性T細胞的免疫反應(yīng)，至少與"野生型，，hTERT序列一樣好。在本發(fā) 明的優(yōu)選的實施方式中，與野生型hTERT相比，TERT-LTB融合物可以 增強免疫反應(yīng)
術(shù)語"治療"是指治療性治療以及預(yù)防或防護性手段。需要治療的對象
對象。如在此使用的，"治療"還包括降低獲得病癥的可能性，以及在已經(jīng) 患病的當中降低病癥的嚴重度。
"病癥，，是將受益于本發(fā)明的分子的治療的任何狀況，所述分子包括在 此描述的核酸分子和由所述核酸分子編碼的融合蛋白。術(shù)語"病癥"所包括 的是慢性的和急性的病癥或疾病，包括那些使得哺乳動物易患所討論的病 癥的病理學(xué)狀況。本發(fā)明的分子意圖用作對以異常細胞增殖為特征的病癥 或狀況的治療，所述病癥或狀況包括但不限于乳腺癌、結(jié)腸直腸癌和肺癌。
術(shù)語"有效量"是指導(dǎo)入足夠的疫苗組合物來產(chǎn)生充足水平的多肽，從 而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這種水平可以變化。
"保守性絲酸替換"是指一個氨基酸歹驢被另 一個化學(xué)上類似的絲 酸殘基替換。這種保守性替換的實例包括用一個疏水殘基(異亮氨酸、 亮氨酸、纈氨酸、或曱硫氨酸)替換另一個；或用一個極性殘基替換另一 個相同電荷的極性殘基(例如，精氨酸替換賴氨酸；谷氨酸替換天冬氨酸)。
"hTERT"是指人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶抗原或編碼人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 抗原的核普酸。"hTERTopt"是指編碼人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶抗原的密碼子優(yōu) 化的核苷酸序列。
"基本上類似"意思是給定的核酸或氨基酸序列與參考序列享有至少 75%、優(yōu)選的至少85%、更優(yōu)選的至少90%,再更優(yōu)選的至少95%的同
ii一性。在本發(fā)明中，所述參考序列可以是野生型人類TERT核苷酸或M 酸序列的相關(guān)部分，如分別在SEQ ID NO: 11和12中所列的，或是LTB 的核苷酸或氨基酸序列，如在SEQ ID NO: 13 ( opt序列)和14中所列的， 如文本的上下文中所指示的。所述參考序列也可以是，例如，野生型恒河 猴的或鼠的TERT序列。因而，與野生型人類TERT蛋白或其片段"基本 上類似"的TERT蛋白序列，將在片段的長度上與野生型人類TERT的相 關(guān)片段享有至少75 %的同一性，優(yōu)選的85 %的同一性，更優(yōu)選的90%的 同 一性，再更優(yōu)選的95 %的同 一性。給定的mTERT、 hTERT或LTB 酸序列或核苷酸序列與參考序列是否是"基本上類似的"，例如可以通過使 用序列分一斤專欠^牛如可乂人University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG )獲得的GAP計算機程序、版本6.0比較序列信息來確定。GAP 程序利用了由Smith和Waterman(Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981 )修正的、 Needleman和Wunsch ( J. Mol. Biol. 48 : 443,1970 )的比對方法。
基因、其變體、片段或亞基的"實質(zhì)部分，，是指參考序列的至少50%、 優(yōu)選的75%、更優(yōu)選的90%、再更優(yōu)選的95%的部分。
"基因"是指一種核酸分子，其核苷酸序列編碼多肽分子?；蚩梢允?核苷酸的連續(xù)序列，或者它們可以包括插入的片段如內(nèi)含子、啟動子區(qū)域、 剪接位點和重復(fù)序列。基因可以是RNA或DNA。優(yōu)選的基因是編碼本發(fā) 明的肽的基因。
術(shù)語"核酸"或"核酸分子"意指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸 (DNA)、探針、寡核苷酸、其片段或部分、和引物。
"野生型TERT"或"野生型蛋白"或"wt蛋白"是指包含天然存在的^J^ 酸序列或其變體的蛋白。野生型人類TERT的氮基酸序列在SEQ ID NO: 12中列出。早先描述了野生型人類TERT的氮基酸序列(美國專利No. 6,166,178;美國專利6,261,836;美國專利 No. 6,927,285;美國專利申 請2003-0096344/ Meyerson等，0〃 90: 785-95( 1997 ); Nakamura等， 277: 955-59 ( 1997))。
"野生型TERT基因"是指包含編碼天然存在的TERT蛋白的核苷酸序 列的基因，所述蛋白包括人類來源的蛋白或從其他有機體獲得的蛋白，其 他有機體包括但不限于其他哺乳動物，例如大鼠、小鼠和恒河猴。人類 TERT基因的核苷酸序列是本領(lǐng)域可獲得的(上述)。
名稱"TERT (AI)"是指包含突變來消除或降低端粒酶催化活性的端
12粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶序列。
術(shù)語"哺乳動物"是指任何哺乳動物，包括人類。 始籃"Acr，，罷始標,周
縮寫"ORF'是指基因的開放閱讀框。 附圖的簡要說明
附圖1顯示了示范性的TPA-hTERT (AI) -LTBopt融合物的核苷酸 (SEQIDNO: 1)和^J^酸序列(SEQIDNO: 2)。
附圖2顯示了示范性的TPA-mTERT (AI) -LTBopt融合物的核苷酸 (SEQIDNO: 3)和氨基酸序列(SEQIDNO: 4)。
附圖3顯示了對用質(zhì)粒pVlJ/TPA-mTERT (AI) -LTBopt重復(fù)注射接 種的BALB/c小鼠的IFNyELIspot分析的結(jié)果。利用肽庫，每組5只小鼠 被用于監(jiān)視針對mTERT或LTB的免疫反應(yīng)。繪圖的數(shù)據(jù)來自6只獨立的 小鼠(空心圓形)。標明了幾何平均值(實心圓形)。在沖莫擬治療的小鼠 中沒有檢測到對mTERT的T細胞反應(yīng)(未顯示)。參見實施例7。
附圖4顯示了對來自接種的BALB/c小鼠的脾細胞IFNy細胞內(nèi)染色的 結(jié)果。針對小鼠TERT的CD4+和CD8+ T細胞反應(yīng)利用覆蓋全部蛋白的重 疊肽的庫來測量。還監(jiān)視了對LTB的免疫反應(yīng)。繪圖的數(shù)據(jù)來自6只獨立 的小鼠(實心三角形)。標明了幾何平均值(直線)。在才莫擬治療的小鼠 中沒有檢測到對TERT的T細胞反應(yīng)(未顯示)。參見實施例7。
附圖5顯示了用CD8+T細胞特異性肽mTERTaa167 (AYQVCGSPL; SEQ ID NO: 20 )脈沖的4T1粑細胞的效應(yīng)T細胞的51Cr釋放CTL殺傷 的結(jié)果。效應(yīng)細胞從雙免疫的BALB/c小鼠的脾細胞制備，用特異性肽體 外重新刺激。結(jié)果表示為在不同的效應(yīng)物/靶標比例下的特異性殺傷的百分 比。參見實施例8。
附圖6顯示了對小鼠TERT的免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)。C57BL/6小鼠用質(zhì)粒 pVlJ/TPA-mTERT (AI) -LTBopt的5次每周一次的注射來免疫。利用小 鼠TERT肽庫通過IFNYELIspot分析對小鼠脾細胞評估免疫反應(yīng)?？乖?異性CD4+和CD8+ T細胞反應(yīng)被顯示為從6只免疫的小鼠獲得的幾何平均 值，還標明了標準偏差。參見實施例7。
附圖7顯示了 BALB/c小鼠中mTERT特異性免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)。小鼠 用構(gòu)建體pVl J-mTERT (AI) opt或pVl J-TPAmTERT (AI) -LTBopt的5次每周 一 次的注射來免疫。利用相應(yīng)于肽序列mTERTaa167 (AYQVCGSPL; SEQ ID NO: 20 )的CD8+表位通過對PBMC的IFNy細 胞內(nèi)染色來測定免疫反應(yīng)。繪圖的數(shù)據(jù)來自8只獨立的小鼠(實心三角形)。 標明了幾何平均值(直線)。
附圖8顯示了，在注射表達mTERT (AI) -LTBopt的腺病毒載體時 TERT特異性免疫反應(yīng)被增強。10只BALB/c小鼠的組經(jīng)歷 pVlJ/TPA-mTERT (AI) -LTBopt ( 50嗎/inj.)的5次每周一次的注射。在 質(zhì)粒DNA的最后注射之后兩周，小鼠用質(zhì)粒DNA(DNA-EP)或用101Gvp 的AdWTPA-mTERT (AI) -LTB叩t (Ad)的一次另外的注射來強化。通過 對PBMC的IFNy ICS來監(jiān)視對TERT的免疫反應(yīng)。繪圖的數(shù)據(jù)來自10只 獨立的小鼠(實心菱形)。還顯示了每個組的幾何平均值(直線)。參見 實施例10。
附圖9描繪了用來分析BALB/c小鼠中的DMH誘導(dǎo)的癌發(fā)生和疫苗 接種的方案。DMH每周 一 次i.p.施用。在標明的時點進行用 pVlJ/TPA-mTERT (AI) -LTBopt的疫苗接種。腸病變的分析在12周進行。 參見實施例11。
附圖10顯示了 pVlJ/TPA-mTERT (AI) -LTBopt對DMH i秀導(dǎo)的癌發(fā) 生的抗腫瘤效果。如附圖9中標明的，BALB/c小鼠用DMH和DNA-EP 處理。結(jié)腸中ACF和腺瘤形成的分析在治療開始12周時進行。接種的小 鼠中ACF和腺瘤的數(shù)量與未接種的對照中檢測的相比較。參見實施例11。
附圖11描繪了用來分析BALB/c小鼠中的DMH誘導(dǎo)的癌發(fā)生和疫苗 接種的方案。DMH每周 一次i.p.施用。在標明的時點進行用 pVlJ/TPA-mTERT-LTB DNA和Ad的疫苗接種。腸病變的分析在30周進 行。參見實施例11。
附圖12展現(xiàn)了 pVlJ/TPA-mTERT (AI) -LTBopt DNA初免/Ad強化 對腫瘤病變的數(shù)量的抗腫瘤效果。如附圖9中標明的，BALB/c小鼠用DMH 和DNA-EP處理。結(jié)腸中ACF和腺瘤形成的分析在治療開始30周時進行。 接種的小鼠中ACF和腺瘤的數(shù)量與未接種的對照中檢測的相比較。參見實 施例11。
附圖13展現(xiàn)了 pVlJ/TPA-mTERT-LTB (AI) opt DNA初免/Ad強化 對腫瘤病變的體積和分化階段的抗腫瘤效果。如標明的，BALB/c小鼠用 DMH和DNA-EP處理。接種的和對照小鼠中存在的結(jié)腸腺瘤的體積(欄A)和組織分化階段(欄B)在治療開始30周時分析。肺瘤如下分類Gl: 分化良好的腺癌；G2:中度分化的腺癌；G3:不良分化的腺癌)。參見實 施例11。
附圖14顯示了對人類TERT的免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)。兩次每兩周一次的 注射質(zhì)粒pVlJ/TPA-hTERT (AI) -LTBopt的(DNA-DNA),或通過質(zhì)粒 pVlJ/TPA-hTERT (AI) -LTBopt的一次注射、兩周后Ad6hTERT (AI) 1010 pp (DNA/Ad)的一次注射來免疫HHD轉(zhuǎn)基因小鼠。通過IFNy ICS分析 對小鼠PBMC評估免疫反應(yīng)。小鼠PBMC與HLA-A2等位基因hTERT865 (SEQ ID NO: 22 )的CD8免疫顯性肽孵育。繪圖的數(shù)據(jù)來自10只獨立 的小鼠(實心三角形)。標明了幾何平均數(shù)值(直線)。參見實施例12 和13。
附圖15顯示了對Cr"標記的把HeLa-HHD細胞的CTL分析的結(jié)果。 從一只免疫的小鼠獲得的CD8+ T細胞在針對HeLa-HHD細胞的CTL分析 中測試，其在用于肽稀釋的DMSO的存在下用hTERT865肽或w/o肽外源 地加載。HeLa-HHD細胞還用編碼hTERT的Ad載體或編碼GFP的Ad感 染作為對照。參見實施例14。
附圖16顯示了在通過DNA-EP免疫的恒河猴中對hTERT的細胞介 導(dǎo)的免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)。對來自hTERT免疫的恒河猴 (pVl J/TPA-hTERT-LTB; DNA-EP/DNA-EP )的PBMC進行ELIspot分 析。 一式兩份地進行分析，顯示了來自復(fù)本的平均值。顯示了在第二次 DNA-EP之后進行的分析(欄A)。還顯示了在第五次DNA-EP之后進 行的分析(欄B)。參見實施例15。
附圖17顯示了，在用DNA-EP接種、用表達hTERT的腺病毒強化的 恒河猴中，與通過單獨的DNA-EP接種的猴子中引發(fā)的CMI相比，對 hTERT的細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)增強了 。在免疫過程的結(jié)束時對來自hTERT 免疫的恒河猴的PBMC進行ELIspot,所述免疫過程包括五次DNA-EP (pVlJ/TPA-hTERT-LTB)注射，之后是兩次Ad (Ad6-hTERT )注射。一 式兩份地進4亍分析，顯示了來自復(fù)本的平均值。參見實施例15。
發(fā)明的詳細說明
端粒酶的催化成分，稱為端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的表達通常在多 種范圍的肺瘤類型中檢測到。端粒酶在大多數(shù)癌癥類型中過量表達以及在正常細胞中低表達或不表達的組合，使得TERT成為與異常的細胞增殖相關(guān)的疾病例如癌癥的治療和/或預(yù)防的靶點。為此，本發(fā)明涉及組合物和方法，來通過TERT腫瘤相關(guān)抗原引發(fā)或增強對表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫性，其中異常的TERT表達與癌或它的發(fā)展相關(guān)。異常的TERT表達與癌的相關(guān)性不需要TERT蛋白在腫瘤發(fā)展的所有時點在腫瘤組織中表達，因為異常的TERT表達可能在腫瘤初始期出現(xiàn)而在肺瘤發(fā)展的晚期檢測不到，或反之。
從而，本發(fā)明提供了用于疫苗和藥物組合物的包含TERT序列或其變體的多核苷酸、載體、宿主細胞和編碼的蛋白，所述疫苗和藥物組合物用于癌癥的治療和/或預(yù)防。本發(fā)明的多核苷酸包含編碼TERT蛋白或其變體的核苷酸序列，其與編碼大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的B亞基(LTB)的核普酸序列融合，能有效地輔佐針對相連的TERT抗原的免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明的某些實施方式中，在此公開的核苷酸序列進一步包含處在TERT基因的編碼序列之前的TPA前導(dǎo)序列以確保TERT-LTB融合蛋白被分泌。在本發(fā)明的這個方面的優(yōu)選的實施方式中，TPA-hTERT (AI)-LTB融合物編碼SEQ ID NO: 2中列出的氨基酸序列。優(yōu)選的核苷酸序列在SEQID NO: 1中列出。在進一步優(yōu)選的實施方式中，TPA-mTERT (AI) -LTB融合物編碼SEQ ID NO: 4中列出的氨基酸序列。優(yōu)選的核苷酸序列在SEQID NO: 3中列出。
本發(fā)明的TERT核苷酸序列可以是人類來源的，或可以是來自另一物種例如小鼠的TERT同源物。在SEQ ID NO: 12中列出了野生型人類TERT核苷酸序列，早先已經(jīng)報道了 (參見，例如，美國專利No. 6,166,178;美國專利 6,261,836 ;美國專利No. 6,927,285 ;美國專利申請2003-0096344/ Meyerson等，Ce〃 90: 785-95 ( 1997) ; Nakamura等，Scze"ce 277: 955-59 ( 1997 ) ) 。 TERT融合物的TERT部分可以是全長的，或是足以在哺乳動物中引發(fā)TERT特異性T細胞免疫反應(yīng)的任何變體。本發(fā)明的TERT變體包括，但不限于C-或N-末端截短的序列、具有保守性替換的序列，和具有內(nèi)部的刪除或插入的序列。本發(fā)明的優(yōu)選的TERT變體包含功能上地消除端粒酶催化活性的突變。本發(fā)明的編碼的TERT融合蛋白當導(dǎo)入有需要的疫苗接受者或患者時能夠誘導(dǎo)細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
如上所述，在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，端粒酶抗原的端粒酶催化活性被滅活(在此稱為"TERT(AI)"),從而對于疫苗目的，所述編碼的
16TERT融合蛋白是比野生型TERT更安全的。TERT融合蛋白的酶活性可以通過向TERT編碼核香酸序列添加突變/刪除來滅活。因此，本發(fā)明包括編碼TERT-LTB融合蛋白的核酸分子，其中所述核香酸序列編碼變體hTERT蛋白，其中所述變體包含相對于SEQ ID NO: 12中所列野生型hTERT氨基酸序列的 一個或更多個突變，并且其中所述突變用作消除所編碼的hTERT蛋白的端粒酶催化活性。在本發(fā)明的特定的示范性實施方式中，核苷酸已經(jīng)被突變，以改變?nèi)祟怲ERT蛋白序列中特定的氨基酸D712A和V713I( SEQ ID NO: 10中列出)，以及小鼠TERT蛋白序列中的D702V和V7031。編碼SEQ ID NO: 10中列出的突變的人類TERT序列的核苷酸序列在SEQ ID NO: 9中公開。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，TERT-LTB融合物的TERT部分是人類TERT或其變體，例如hTERT(AI)。在其他優(yōu)選的實施方式中，所述TERT部分是鼠TERT，或其變體，例如mTERT(AI)。本發(fā)明的TERT變體和TERT編碼核苷酸序列變體包含消除端粒酶酶活性的突變。
因此，本發(fā)明涉及包含編碼TERT-LTB融合蛋白的核苷酸序列的合成多核苷酸，所述融合蛋白包含與LTB蛋白或其變體融合的TERT蛋白或TERT蛋白的生物學(xué)無活性的片段或突變形式，所述LTB蛋白或其變體能有效地增強對TERT蛋白的免疫反應(yīng)。所述TERT蛋白的突變形式包括但不限于保守性氨基酸替換、氨基末端截短、羧基末端截短、刪除或添加。任何這樣的TERT變體，片段和/或突變體將編碼蛋白或蛋白片段，其至少基本上沖莫擬了 SEQ ID NO : 12中所列TERT蛋白的免疫學(xué)性質(zhì)。優(yōu)選的TERT變體是催化上無活性的，例如，SEQ ID NO: IO中所列的TERT變體。
本發(fā)明的合成多核苷酸編碼mRNA分子，所述mRNA分子表達TERT(AI) -LTB融合蛋白，所述融合蛋白能夠刺激或增強針對相連的TERT蛋白的免疫反應(yīng)，從而在治療或預(yù)防性癌癥疫苗的開發(fā)中是有用的。本發(fā)明的TERT-LTB融合物的LTB部分已經(jīng)顯示了強烈地強化共同遞送的抗原的免疫原性(參見，例如，Simmons等Sca"t/. / /mmwwo/. 53:218-26(2001 ))。
還考慮用于本發(fā)明的是編碼LTB變體或突變體的核苷酸序列，其包括但不必限于核苷酸替換、刪除、添加，氨基末端截短和羧基末端截短。在某些情況下，向編碼LTB的核苷酸序列添加特定的點突變來降低或消除
17編碼的蛋白的毒性可能是有益的。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，與TERT序列融合的所述LTB序列被截短了它的信號序列。
本發(fā)明的TERT-LTB融合物的LTB部分或其變體可以融合到TERT序列的氨基末端或羧基末端。進一步的，LTB序列和TERT序列可以N-末端到N-末端、C-末端到C-末端、C-末端到N-末端或N-末端到N-末端地融合。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，TERT多肽的C-末端與LTB的N-末端融合。
本發(fā)明涉及包含核苦酸序列的合成核酸分子(多核苷酸)，所述核苷酸序列編碼表達新的TERT-LTB融合蛋白的mRNA;例如，編碼SEQ IDNO: 6和8中所列融合蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明的特別優(yōu)選的TERT融合物是SEQ ID NO: 5中所列的hTERT (AI) -LTB融合物序列。本發(fā)明的核酸分子基本上不含其他核酸。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，其他核苷酸序列對于疫苗目的是有用的，例如，編碼SEQ ID NO: 6中所列hTERT (AI) -LTB蛋白序列的核苷酸序列。本發(fā)明還包括編碼無活性hTERT-LTB融合蛋白的核苷酸序列，所述融合蛋白與SEQIDNO: 6基本上相似、但不是確切相同的，特別是由于克隆策略所產(chǎn)生的在TERT (AI)序列和LTB序列的接點處的氮基酸差異。
本發(fā)明還涉及重組載體以及原核和真核的重組宿主細胞，它們含有在整個說明書中公開的核酸分子。本發(fā)明的合成的DNA分子、相關(guān)的載體和宿主對于癌癥疫苗的開發(fā)是有用的。
本發(fā)明的示范性的核酸分子包括選自由如附圖l-2所示SEQIDNO:5和7構(gòu)成的組的核苷酸序列，其編碼本發(fā)明的示范性的hTERT-LTB和mTERT-LTB融合蛋白。
本發(fā)明還包括SEQIDNO: 5和7的生物學(xué)活性片段或突變體，SEQID NO: 5和7編碼表達示范性的TERT-LTB融合蛋白的mRNA。任何這樣的生物學(xué)活性片段和/或突變體將編碼蛋白或蛋白片段，其至少基本上模擬了 hTERT蛋白的免疫學(xué)性質(zhì)，所述hTERT蛋白包括但不限于SEQ IDNO: 12中所列的hTERT蛋白。這樣的多核苷酸包括但不必限于核苷酸替換、刪除、添加、氨基末端截短和羧基末端截短。本發(fā)明的優(yōu)選的突變核苦酸序列編碼mRNA分子，所述mRNA分子在真核細胞中表達酶學(xué)失活的TERT-LTB融合蛋白，所述融合蛋白能夠在有需要的患者中引發(fā)預(yù)防性或治療性免疫反應(yīng)，從而在癌癥疫苗開發(fā)中是有用的。
還包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是基本上不改變表達的蛋白的最終物理
性質(zhì)的DNA序列中的突變體。例如，纈氨酸對亮氨酸、精氨酸對賴氨酸、 或天冬酰胺對谷氨酰胺的替換可能不會引起多肽所需功能方面的變化，例 如，引發(fā)免疫反應(yīng)的能力。
如上所述，本發(fā)明進一步涉及重組載體，其包含整個說明書中公開的 核酸分子。這些載體可以由DNA或RNA組成。對于大多數(shù)克隆目的， DNA載體是優(yōu)選的。典型的載體包括質(zhì)粒、修飾的病毒、桿狀病毒、噬菌 體、粘粒、酵母人工染色體，或可以編碼TERT-LTB融合蛋白的其他形式 的游離或整合的DNA。對于特定的基因轉(zhuǎn)移或其他用途確定合適的載體是 在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的。
本發(fā)明還提供的是由在整個說明書中公開的核酸編碼的純化的 TERT-LTB融合蛋白，特別是TERT (AI) -LTB融合蛋白。在本發(fā)明的這 個方面的示例性實施方式中，所述TERT-LTB融合蛋白包含選自由SEQ ID NO: 6和8構(gòu)成的組的氬基酸序列。
本發(fā)明包括在嚴才各條件下與SEQ ID NO: 5和7的互補物雜交的DNA 序列。舉例來說，但不是限制，使用高嚴格條件的過程如下。含有DNA 的濾膜的預(yù)雜交在緩沖液中在約65。C進行約2小時到過夜，所述緩沖液由 6xSSC, 5xDenhardt's溶液和lOO^g/ml變性的鮭魚精子DNA組成。在含有 100嗎/ml變性的鮭魚精子DNA和5-20xl06cpm的"P標記的探針的預(yù)雜交 混合物中，在65tM吏濾膜雜交約12到48小時。濾膜的洗滌在含有2xSSC、 0.1 % SDS的溶液中在37。C下進行約1小時。隨后在放射自顯影之前用 O.lxSSC、 0.1 。/。SDS在50。C洗滌45分鐘。使用高嚴才各條件的其他過程包 括，在5xSSC、 5xDenhardt's溶液、50%曱酰胺在約42。C進行雜交步驟約 12到48小時，或在0.2xSSPE、 0.2%SDS中在約65。C進行洗滌約30到60 分鐘。在上述過程中提及的用于進行高嚴格雜交的試劑是本領(lǐng)域公知的。 可以在 Sambrook 等,Molecular Cloning: A Laboratory Manual2nd Edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, ( 1989 )或Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY (2001 )中找到這些試劑的組成的細節(jié)。除上述的以外，可以使用的其他 高嚴格條件也是本領(lǐng)域公知的。含有TERT-LTB融合蛋白編碼核酸分子的表達載體可用于在重組宿 主細胞中高水平表達TERT-LTB融合蛋白。表達載體可以包括，但不限 于，克隆載體、修飾的克隆載體、特別設(shè)計的質(zhì)?；虿《尽２⑶?，如果需 要，各種細菌表達載體可以用于在細菌細胞中表達重組TERT-LTB融合物 序列。此外，各種真菌細胞表達載體可以用于在真菌細胞中表達重組 TERT-LTB融合物序列。進一步的，各種昆蟲細胞表達載體可以用于在昆 蟲細胞中表達重組蛋白。
本發(fā)明還涉及用包含本發(fā)明的核酸分子的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細 胞。重組宿主細胞可以是原核或真核的，包括但不限于，細菌例如大腸桿 菌、真菌細胞例如酵母、哺乳動物細胞，包括但不限于，牛、豬、猴和嚙 齒動物來源的細^^系；和昆蟲細胞，包括但不限于源于果蠅(Dmyop/^7a) 和蠶的細胞系。這種重組宿主細胞可以在適合的條件下培養(yǎng)以產(chǎn)生 TERT-LTB融合蛋白或生物學(xué)等同形式。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中， 宿主細胞是人類的。如在此定義的，術(shù)語"宿主細胞"不打算包括在轉(zhuǎn)基因 人類的身體、人類胎兒或人類胚胎中的細胞。
如上所述，含有編碼TERT-LTB融合蛋白的DNA的表達載體可用于 在重組宿主細胞中表達TERT融合蛋白。因而，本發(fā)明的另一個方面是在 重組宿主細胞中表達TERT-LTB融合蛋白的方法，包括(a)將包含核 酸的載體導(dǎo)入適合的人類宿主細胞中，所述核酸包含編碼TERT-LTB融 合蛋白的核苷酸序列，其中所述TERT-LTB融合蛋白包含與LTB蛋白的 實質(zhì)部分融合的TERT蛋白或其無活性變體，并且其中所述融合蛋白能夠 在哺乳動物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)；和(b)在容許所述TERT-LTB融合蛋白 表達的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞。
在如上所述表達TERT-LTB融合蛋白的方法的優(yōu)選的實施方式中，所 述LTB序列刪除了它的信號序列。
在宿主細胞中表達TERT-LTB融合物之后，可以回收TERT-LTB融 合蛋白來提供純化的TERT-LT融合蛋白。數(shù)種蛋白純化方法是可用和適 用的?？梢酝ㄟ^鹽分餾、離子交換層析、尺寸排阻層析、羥磷灰石吸附層
提取物中純化重組蛋白。此外，通過使用對TERT蛋白或TERT蛋白的多 肽片段特異的單克隆或多克隆抗體制成的免疫親和柱，從其他細胞蛋白中 分離重組的TERT-LTB融合蛋白。
20為用于疫苗開發(fā)，相對于編碼TERT的全長野生型cDNA，本發(fā)明的 包含TERT-LTB融合物的核酸分子和所編碼的融合蛋白被設(shè)計以增強 TERT-特異性免疫反應(yīng)。為了進一步增強本發(fā)明的TERT-LTB融合物序列 的免疫原性，在本文描述的某些實施方式中，編碼TERT-LTB融合蛋白的 多核苷酸包含為在宿主細胞中進一步高水平表達的優(yōu)化的密碼子，如下所 述。在這些實施方式中，設(shè)計TERT-LTB融合物的密碼子的至少一部分以 使用計劃的宿主細胞偏愛的密碼子，在優(yōu)選的實施方式中所述宿主細胞是 人類細胞。優(yōu)化的TERT-LTB融合物可以用于開發(fā)基于重組腺病毒或質(zhì)粒 的DNA疫苗，其通過細胞介導(dǎo)的免疫提供了針對TERT-相關(guān)癌癥的有效 的免疫預(yù)防。合成分子可以被用做免疫原性組合物。本發(fā)明提供了密碼子 優(yōu)化的TERT-LTB融合物多核苷酸，當其被直接體內(nèi)導(dǎo)入脊推動物時在所 述動物內(nèi)誘導(dǎo)所編碼的蛋白的表達，所述脊稚動物包括哺乳動物，例如靈 長類和人類。
如上所述，在本發(fā)明的某些實施方式中，合成分子包括核苷酸的序列， 其中 一些核苷酸已經(jīng)改變以使用人類細胞偏愛的密碼子，因而容許在人類 宿主細胞中高水平的融合蛋白表達。所述合成的分子可以用作TERT-LTB 融合蛋白的來源，其可以在癌癥疫苗中使用來通過細胞介導(dǎo)的免疫提供針 對TERT相關(guān)癌癥的有效的免疫預(yù)防。在此公開的核酸分子也可以用做基 于DNA的癌癥疫苗的基礎(chǔ)。
四種可能的核苷酸石成基的"三聯(lián)體"密碼子可以存在超過60種變化形 式。由于這些密碼子提供了僅20種不同氨基酸(以及轉(zhuǎn)錄起始和終止) 的信息，某些氨基酸可以由超過一個密碼子編碼，這是一種稱為密碼子冗 余的現(xiàn)象。由于某些未完全了解的原因，在不同類型細胞的內(nèi)源DNA中， 可選擇的密碼子不是一致地出現(xiàn)的。實際上，在某些類型的細胞中對于某 些密碼子似乎存在可變的天然等級或"偏愛"。作為例子，氬基酸亮氨酸由 六種DNA密碼子的任何一個指定，包括CTA、 CTC、 CTG、 CTT、 TTA 和TTG。對微生物的基因組密碼子頻率的徹底分析揭示了，大腸桿菌的內(nèi) 源DNA最通常地含有CTG亮氨酸指定密碼子，而酵母和粘菌類的DNA 最通常地包括TTA亮氨酸指定密碼子。鑒于這種等級，普遍認為，通過 大腸桿菌宿主獲得富含亮氨酸多肽的高水平表達的可能性將在一定程度 上取決于密碼子使用的頻率。例如，可能的是，富含TTA密碼子的基因 將在大腸桿菌中較弱地表達，而富含CTG的基因?qū)⒖赡茉谶@種宿主中高
21度表達。類似地，對在酵母宿主細胞中表達富含亮氨酸多肽的優(yōu)選的密碼
子是TTA。
密碼子偏愛現(xiàn)象對重組DNA技術(shù)的意義是明顯的，該現(xiàn)象可以用來 解釋先前在成功轉(zhuǎn)化的宿主有機體中實現(xiàn)外源基因高水平表達的許多失 敗，在插入的基因中較不"偏愛"的密碼子可能重復(fù)地出現(xiàn)，用于表達的宿 主細胞機制可能不能有效地運作。這種現(xiàn)象提示了，已經(jīng)被設(shè)計以包括計 劃的宿主細胞偏愛的密碼子的合成基因，提供了對于重組DNA技術(shù)的實 踐最佳形式的外源遺傳物質(zhì)。因而，本發(fā)明的一個方面是為在人類細胞中 表達而密碼子優(yōu)化了的TERT-LTB融合基因。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式 中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用編碼相同蛋白序列的可選擇的密碼子可以消除對在人 類細胞中表達外源TERT-LTB融合蛋白的制約。
根據(jù)本發(fā)明的某些實施方式，將編碼TERT-LTB融合蛋白的核酸分 子轉(zhuǎn)換成具有相同的翻譯序列但具有可選擇的密碼子利用的多核苷酸序 歹寸,如Lathe,"Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Amino Acid Sequence Data: Theoretical and Practical Considerations"J.Molec.Bio. 183 : 1-12 ( 1985 )所描述的，通過引用將其合并在此。該方法一般由在野生型 序列中鑒定與高度表達的人類基因通常不相關(guān)的密碼子，和用在人類細胞 中高度表達的最佳密碼子替換它們組成。然后檢查該新的基因序列中由這 些密碼子替換產(chǎn)生的不期望的序列(例如，"ATTTA"序列，內(nèi)含子剪接識 別位點的無意產(chǎn)生，不需要的限制性內(nèi)切酶位點，等等)。通過用編碼相 同氨基酸的不同密碼子替^:現(xiàn)有的密碼子來消除不期望的序列。然后測試 合成基因片段的改善的表達。
要理解的是，這種方法將不必產(chǎn)生一種多核苷酸序列，該多核苷酸序 列中所有的密碼子是根據(jù)高度表達的人類和/或哺乳動物細胞的密碼子利 用的最佳密碼子。然而，優(yōu)選的是，在期待TERT和/或LTB的密碼子優(yōu) 化的多核苷酸變體的本發(fā)明的實施方式中，產(chǎn)生的密碼子的實質(zhì)部分類似 于高度表達的人類和/或哺乳動物基因的密碼子利用。
如上所述的方法用于產(chǎn)生編碼TERT-LTB融合蛋白的合成基因序列， 產(chǎn)生包含為在人類細胞中高水平表達而優(yōu)化的密碼子的基因。雖然上述的 方法提供了設(shè)計用于癌癥疫苗的密碼子優(yōu)化基因的代表性方法的概述，本 領(lǐng)域技術(shù)人員要理解的是，基因的類似疫苗效力或提高的表達可以通過方 法中的微小改變或通過序列中的微小改變來實現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將認識到，可以構(gòu)建其他的核酸分子提供在人類細
胞中的高水平TERT-LTB融合物表達，其中該DNA分子的密碼子的僅一 部分是密碼子優(yōu)化的。例如，在本發(fā)明的某些實施方式中，包含TERT-LTB 融合物的TERT部分的密碼子是為在人類細胞中高水平表達而優(yōu)化的，包 含TERT-LTB融合物的LTB部分的密碼子基本上類似于野生型LTB。在 本發(fā)明的其他實施方式中，包含TERT-LTB融合物的LTB部分的密碼子 是為在人類細胞中高水平表達而優(yōu)化的，包含TERT-LTB融合物的TERT 部分的密碼子基本上類似于野生型TERT基因。仍然在本發(fā)明的其他的實 施方式中，TERT-LTB融合物的TERT和LTB部分都是為在人類細胞中高 水平表達而密碼子優(yōu)化的，例如，如SEQ ID NO: 5中所列的hTERT-LTBopt 序列。在其中僅處在TERT-LTB融合物的TERT和/或LTB部分內(nèi)的密碼 子的亞組一皮優(yōu)化的TERT-LTB融合物，也是本發(fā)明期待的。
本發(fā)明的核酸可以裝配到表達盒中，所述表達盒包含祐:設(shè)計以提供在 人類細胞中的有效蛋白表達的序列。所述盒優(yōu)選地含有TERT-LTB融合蛋 白編碼基因，具有與其可操縱連接的相關(guān)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列，例如啟 動子和終止序列。在優(yōu)選的實施方式中，所述啟動子是具有內(nèi)含子A序列 的巨細胞病毒啟動子(CMV),而本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到，可以使用 任何許多其他已知的啟動子例如強的免疫球蛋白或其他真核基因啟動子。 優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止子是牛生長激素終止子，而其他已知的轉(zhuǎn)錄終止子也可以 使用。CMV-BGH終止子的組合是特別優(yōu)選的。
根據(jù)本發(fā)明，TERT-LTB融合物表達盒被插入載體中。載體優(yōu)選的是 腺病毒或質(zhì)粒載體，然而也可以使用與啟動子相連的線性DNA,或其他載 體，例如腺病毒相關(guān)病毒或修飾的牛痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，所述載體是腺病毒載體(在此與"腺 載體，，可互換地使用)。腺載體可以基于不同的腺病毒血清型，例如在人 類或動物中發(fā)現(xiàn)的那些。動物腺病毒的實例包括牛的、豬的、黑猩猩的、 鼠的、犬的和禽類的(CELO)。優(yōu)選的腺載體是基于人類血清型的，更 優(yōu)選的是B、 C或D組血清型。人類腺病毒B、 C、 D或E組血清型的實 例包括2型("Ad2") 、 4型("Ad4") 、 5型("Ad5") 、 6型("Ad6")、 24型("Ad24") 、 26型("Ad26") 、 34型("Ad34")和35型("Ad35")。 在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方式中，所述表達載體是腺病毒6型(Ad6) 載體。
23如果選擇的載體是腺病毒，優(yōu)選的是，該載體是所謂的笫一代腺病毒
載體。這些腺病毒載體的特征是具有無功能的El基因區(qū)域，和優(yōu)選刪除 的腺病毒E1基因區(qū)域。此外，第一代載體可以具有無功能的或刪除的E3 基因區(qū)域(Danthinne等Owe 77zera/ y 7:1707-1714 (2000 ) ; F丄.Graham, /m;m/"o/ogv7b^y21 (9) :426-428 (2000))。腺載體不必要完全移除它 們的El和E3區(qū)域。而是，足夠數(shù)量的El區(qū)域被移除以使得缺失反式( frara)提供的El蛋白時載體復(fù)制無法完成；所述El刪除或所述El和E3 刪除的組合是足夠大的以容納基因表達盒。
在某些實施方式，所述表達盒一皮插入到腺病毒El基因通常所處的位 置。此外，這些載體任選的具有無功能的或刪除的E3區(qū)域。優(yōu)選的是， 使用的腺病毒基因組刪除了 El和E3區(qū)域(AE1AE3)。該腺病毒可以在 表達病毒El基因的已知細胞系中增殖，例如293細胞或PERC.6細胞，或 在被瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化以表達額外的蛋白的、來源于293或PERC.6細胞的 細胞系中增殖。例如，當使用具有受控的基因表達的構(gòu)建體，例如四環(huán)素 可調(diào)節(jié)啟動子系統(tǒng)時，所述細胞系可以表達該調(diào)節(jié)系統(tǒng)中涉及的成分。這 種細胞系的一個實例是T-Rex-293;其他的是本領(lǐng)域已知的。
為了方便操作腺病毒載體，腺病毒可以是穿梭質(zhì)粒形式。本發(fā)明還涉 及穿梭質(zhì)粒載體，其包含質(zhì)粒部分和腺病毒部分，所述腺病毒部分包含刪 除的El和任選的E3刪除，并具有包含TERT-LTB融合蛋白編碼核苷酸序 列的插入的表達盒的腺病毒基因組。在優(yōu)選的實施方式中，存在位于質(zhì)粒 的腺病毒部分側(cè)翼的限制性位點，從而可以容易地除去腺病毒載體。穿梭 質(zhì)?？梢栽谠思毎蛘婧思毎袕?fù)制。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，所述表達盒凈皮插入到Ad6 ( AE1AE3 ) 腺病毒質(zhì)粒中(參見Emini等，US20040247615,通過引用合并在此)。 這個載體包含刪除了 El和E3區(qū)域的Ad6腺病毒基因組。在本發(fā)明其他 優(yōu)選的實施方式中，表達盒插入到pMRKAd5-HV0腺病毒質(zhì)粒中(參見 Emini等，US20030044421,通過引用將其合并在此)。這個質(zhì)粒包含刪 除了 El和E3區(qū)域的Ad5腺病毒基因組。通過將5，順式作用包裝區(qū)域進 一步延伸到El基因中來引入被認為在優(yōu)化病毒包裝方面重要的元件，引 起增強的病毒擴增，改進pMRKAd5-HV0質(zhì)粒的設(shè)計以超過先前的腺病毒 載體。有利地，這種增強的腺病毒載體能夠在高傳代增殖之后維持遺傳穩(wěn) 定性。
24制備和純化DNA構(gòu)建體的分子生物學(xué)標準技術(shù)允許制備本發(fā)明的腺 病毒、穿梭質(zhì)粒和DNA免疫原。
根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)確定了，用編碼TPA-mTERT (AI) -LTBopt的質(zhì)粒 DNA的基因疫苗接種可以破壞BALB/c和B6小鼠中的免疫耐受性(參見 實施例7)。在此還顯示的是，使用質(zhì)粒TPA-mTERT (AI) -LTBopt的免 疫可以在BALB/c小鼠中引發(fā)細胞毒性免疫反應(yīng)(參見實施例8)。進一 步展現(xiàn)的是，這種構(gòu)建體能夠比單獨的mTERT (AI)誘導(dǎo)更強的CD8+免 疫反應(yīng)(參見實施例9),并且能夠控制腫瘤生長(實施例11)。因而在 此描述的數(shù)據(jù)證明了 ，TERT編碼序列與LTB cDNA的融合物引起了 TERT 特異性免疫反應(yīng)的提高。
根據(jù)本發(fā)明還顯示了的是，hTERT (AI)國LTBopt可以誘導(dǎo)HLA-A2 限制性CD8+免疫反應(yīng)(參見實施例12)，并且這種免疫反應(yīng)可以通過用 Ad6-hTERT (AI)強化來增高。
因而，如上所述的載體可以用于免疫原性組合物和疫苗，所述免疫原 性組合物和疫苗用于預(yù)防與異常的TERT表達相關(guān)的肺瘤的發(fā)展，和/或用 于治療現(xiàn)有的癌癥。通過消除在成功地轉(zhuǎn)化的宿主有機體中獲得外源 TERT的高表達水平的難題，和通過提供當施用給哺乳動物例如人類時能 引發(fā)增強的免疫反應(yīng)的TERT-LTB融合蛋白，本發(fā)明的載體允許了疫苗開 發(fā)和商業(yè)化。
為此，本發(fā)明的一個方面是預(yù)防或治療TERT相關(guān)癌癥的方法，包括 給哺乳動物施用包含多核苷酸的疫苗載體，所述多核苷酸包含編碼 TERT-LTB融合蛋白的核苷酸序列，其中所述TERT-LTB融合蛋白包含融 合到LTB的實質(zhì)部分的無活性的TERT蛋白或其變體，其中所述融合蛋白 能夠在哺乳動物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
根據(jù)如上所述的方法，可以施用所述疫苗載體用于在任何哺乳動物中 治療或預(yù)防癌癥，包括但不限于肺癌、乳腺癌和結(jié)腸直腸癌。在本發(fā)明 的優(yōu)選的實施方式中，所述哺乳動物是人類。
進一步的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇用于所描述的治療和預(yù)防方法
的任何類型的載體。優(yōu)選的，所述載體是腺病毒載體或質(zhì)粒載體。在本發(fā) 明的優(yōu)選的實施方式中，所述載體是腺病毒載體，其包含具有在腺病毒E1 區(qū)域中的刪除和在腺病毒El區(qū)域中的插入的腺病毒基因組，其中所述插 入包含表達盒，所述表達盒包含(a)編碼TERT-LTB融合蛋白的核苷酸序列，其中所述TERT-LTB融合蛋白包含與LTB的實質(zhì)部分融合的無 活性的TERT蛋白或其變體，并且其中所述融合蛋白能夠在哺乳動物中產(chǎn) 生免疫反應(yīng)；和(b)與所述多核苷酸可操縱地連接的啟動子。
本發(fā)明進一步涉及腺病毒疫苗載體，其包含具有在腺病毒E1區(qū)域中 的刪除和在腺病毒E1區(qū)域中的插入的腺病毒基因組，其中所述插入包含 表達盒，所述表達盒包含(a)編碼TERT融合蛋白的核苷酸序列，其 中所述TERT-LTB融合蛋白包含與LTB的實質(zhì)部分融合的無活性的TERT 蛋白或其變體，并且其中所述融合蛋白能夠在哺乳動物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)； 和(b)與所述多核苷酸可操縱地連接的啟動子。
在本發(fā)明這個方面的優(yōu)選實施方式中，所述腺病毒載體是Ad6載體。 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方式中，所述腺病毒載體是Ad5載體。 在又一個優(yōu)選的實施方式中，所述腺病毒載體是Ad24載體。 還考慮用于本發(fā)明的是包含腺病毒基因組的腺病毒疫苗載體，其天然 地感染除了人類以外的物種，包括但不限于，黑猩猩腺病毒載體。本發(fā)明 的這個方面的優(yōu)選的實施方式是黑猩猩Ad 3疫苗載體。
在另 一個方面，本發(fā)明涉及包含質(zhì)粒部分和表達盒部分的疫苗質(zhì)粒， 所述表達盒部分包含(a)編碼TERT融合蛋白的核苷酸的序列，其中 所述TERT融合蛋白包含與LTB的實質(zhì)部分融合的無活性的TERT蛋白或 其變體，并且其中所述融合蛋白能夠在哺乳動物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)；和(b) 與所述多核苷酸可操縱地連接的啟動子。適合的質(zhì)粒的實例將是如所描述 的哺乳動物表達質(zhì)粒VlJns (J. Shiver等in Z)A^4 !^cc,'"m， M. Liu等 eds., N.Y. Acad. Sci.， N.Y.， 772:198-208 ( 1996),通過引用合并在此)。 在本發(fā)明的某些實施方式中，在此公開的基于重組腺病毒和質(zhì)粒的多 核苷酸疫苗被用于各種初免/強化(prime/boost)組合以誘導(dǎo)增強的免疫反 應(yīng)。在這種情況下，以"初免和強化，，方式施用兩種載體。例如施用第一類 型的載體一次或更多次，在預(yù)定的時間之后，例如，2周、l個月、2個月、 六個月或其他適當?shù)拈g隔時間，施用第二類型的載體一次或更多次。優(yōu)選 的，所述載體攜帶編碼相同的多核苷酸或多核苷酸組合的表達盒。
在也使用質(zhì)粒DNA的實施方式中，優(yōu)選的是，該載體含有被哺乳動 物或昆蟲細胞識別的一種或更多種啟動子。在優(yōu)選的實施方式中，所述質(zhì) 粒將含有強啟動子，例如但不限于，CMV啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認 識到，許多其他的已知啟動子的任一種可以被選擇用于驅(qū)動本發(fā)明的TERT-LTB核香酸序列的表達。啟動子的其他實例包括天然存在的啟動子， 例如EF1 alpha啟動子、勞氏肉瘤病毒啟動子，和SV40早期/晚期啟動子 和p-肌動蛋白啟動子；以及人工啟動子，例如合成的肌肉特異性啟動子和 嵌合的肌肉特異性/CMV啟動子(Li等，iVW.說o&c/z"o/. 17:241-245 (1999); Hagstrometal.,95:2536-2542 (2000 ))。要表達的合成 TERT-LTB融合物基因或其他基因?qū)⑴c這樣的啟動子連接。
如上所述，可以將腺病毒載體疫苗和質(zhì)粒疫苗施用給脊推動物作為單 一治療方式的部分來誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。為此，本發(fā)明涉及保護哺乳動物免于 TERT相關(guān)癌癥的方法，包括(a)向所述哺乳動物中導(dǎo)入第一載體， 所述第一載體包含i )編碼TERT融合蛋白的核苷酸序列，其中所述TERT 融合蛋白包含與LTB的實質(zhì)部分融合的無活性的TERT蛋白或其變體，并 且其中所述融合蛋白能夠在哺乳動物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)；和ii)與所述多核 苷酸可操縱地連接的啟動子；(b)容許經(jīng)過預(yù)定的時間；和(c)向所 述哺乳動物中導(dǎo)入第二載體，所述第二載體包含i)編碼TERT融合蛋白 的核苦酸序列，其中所述TERT融合蛋白包含與LTB的實質(zhì)部分融合的無 活性的TERT蛋白或其變體，并且其中所述融合蛋白能夠在哺乳動物中產(chǎn) 生免疫反應(yīng)；和ii)與所述多核苷酸可操縱地連接的啟動子。
在如上所述的保護方法的一個實施方式中，所述第一載體是質(zhì)粒，第 二載體是腺病毒載體。在可選擇的實施方式中，第一載體是腺病毒載體， 第二載體是質(zhì)粒。在本發(fā)明的某些實施方式中，在施用所述第二載體之前， 所述第 一載體被施用給患者超過一次。
在如上所述的方法中，施用第一類型的載體超過一次，每次載體施用 間隔預(yù)定的時間。這種第一類型載體的系列施用在經(jīng)過預(yù)定的時間之后可 以跟隨著一次或更多次第二類型載體的施用。類似于第一類型載體的治 療，第二類型載體也可以按照著預(yù)定的時間間隔給予一次或超過一次。
本發(fā)明進一步涉及治療患有TERT相關(guān)癌癥的患者的方法，包括(a) 向所述哺乳動物中導(dǎo)入笫一載體，所述第一載體包含i)編碼TERT融合 蛋白的核苷酸序列，其中所述TERT融合蛋白包含與LTB的實質(zhì)部分融合 的TERT (AI)蛋白或其變體，并且其中所述融合蛋白能夠在哺乳動物中 產(chǎn)生免疫反應(yīng)；和ii)與所述多核苷酸可操縱地連接的啟動子；(b)容許 經(jīng)過預(yù)定的時間；和(c)向所述患者中導(dǎo)入第二載體，所述第二載體包 含i)編碼TERT融合蛋白的核普酸序列，其中所述TERT融合蛋白包含與LTB的實質(zhì)部分融合的TERT (AI)蛋白或其變體，并且其中所述融合 蛋白能夠在患者中產(chǎn)生免疫反應(yīng)；和ii)與所述多核苷酸可操縱地連接的 啟動子。
在如上所述的治療方法的一個實施方式中，所述第一載體是質(zhì)粒，笫
二載體是腺病毒載體。在可選擇的實施方式中，第一載體是腺病毒載體， 第二載體是質(zhì)粒。在如上所述的方法的進一步優(yōu)選的實施方式中，在向所
述患者施用第二載體之前，所述第一載體^皮施用給所述患者超過一次。
在如上所述的方法的優(yōu)選的實施方式中，所述載體包含編碼TERT (AI)-LTB融合蛋白的核苷酸序列，其中所述TERT融合蛋白包含與LTB 的實質(zhì)部分融合的無活性的TERT蛋白。
待導(dǎo)入疫苗接受者的可表達DNA或可轉(zhuǎn)錄RNA的數(shù)量部分地取決于 使用的啟動子的強度和表達的基因產(chǎn)物的免疫原性。 一般地，將約lng到 100 mg、優(yōu)選的約IO昭到300嗎的免疫或預(yù)防有效劑量的質(zhì)粒疫苗載體 直接施用到肌肉組織中。重組腺病毒的有效劑量是約106-1012個粒子，優(yōu) 選的約10、10"個粒子。皮下注射、皮內(nèi)導(dǎo)入、壓過皮膚，和其他施用才莫 式，例如腹膜內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的或吸入遞送也是考慮的。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，通過肌肉內(nèi)注射將疫苗載體導(dǎo)入接受者。
本發(fā)明的疫苗載體可以是棵露的，即，未與任何蛋白或影響接受者的 免疫系統(tǒng)的其他試劑締合。在這種情況下，希望的是疫苗載體處在生理學(xué) 可接受的溶液中，例如但不限于，無菌鹽水或無菌緩沖鹽水?；蛘撸幸?的是，施用幫助DNA的細胞攝取的試劑，例如但不限于鈣離子。這些試 劑一般稱為轉(zhuǎn)染促進試劑和藥學(xué)上可接受的載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠 確定特定的試劑或藥學(xué)上可接受的載體以及施用的合適次數(shù)和方式。
為了描述和公開可以與本發(fā)明相聯(lián)系使用的方法和材料，在此提及的 所有出版物通過引用合并。在此的任何內(nèi)容都不能解釋為承認本發(fā)明因為 在先發(fā)明而無權(quán)早于所述公開。
參考附圖描述了本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，要理解的是本發(fā)明不限于 這些明確的實施方式，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以實行各種改變和修改而不背 離如所附權(quán)利要求中所定義的本發(fā)明的范圍和精神。
以下實施例說明、但不限制本發(fā)明。
28實施例1
TERT融合蛋白的構(gòu)建
為了確定端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT )抗原與大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素 的LTB亞基((Fingerut等！^c""e 23 ( 38 ): 4685-96 (2005 ); Rigano等 尸/朋f Ce〃Aep. 22(7): 502-8(2004))的融合物是否可以增強單獨的TERT 的免疫原性，構(gòu)建了具有數(shù)個修飾的、編碼全長端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的載體。 首先，DNA序列被密碼子優(yōu)化來包括人類宿主細胞偏愛的密碼子。另夕卜， 為了確保編碼的抗原對于疫苗用途是安全的，向TERT核苷酸序列中導(dǎo)入 突變來滅活編碼的蛋白質(zhì)的端粒酶催化活性。具體地，突變D712A和V7131 一皮添加到人類TERT序列，突變D702A和V703I ;故添加到小鼠TERT序 歹廿(Arai 等 Two independent regions of human telomerase reverse transcriptase are important for its oligomerization and telomerase activity./, 所o/. C/zem. 277 ( 10 ) : 8538-44 ( 2002 ))。
通過將如上所述的修飾的TERT核苷酸序列的C-末端連接到已經(jīng)除 去信號肽編碼序列的、編碼修飾的LTB的核苷酸序列(nt64到375),來 工程化TERT融合物。另外，將編碼人類組織纖溶酶原激活物(TPA)信 號序列的前導(dǎo)序列添加到TERT編碼核苷酸序列的5'以確保TERT蛋白的 分〉必(Haddad等Comparative study of DNA-based immunization vectors: effect of secretion signals on the antibody responses in mice.F￡MS" /m膽"o/.
A^'cto&o/.18 (3) :193-202 ( 1997))。利用計算機算法，全部序列 被密碼子優(yōu)化來包括人類宿主細胞偏愛的密碼子。合成的密碼子優(yōu)化的基 因通過合成的寡核苷酸來組裝。在最終的構(gòu)建體中，由于克隆策略，在 TERT序列和LTB序列之間添加了兩個氨基酸(S和R)。
將編碼TERT融合物的核苷酸序列克隆到載體pVlJnsA中處在人類巨 細胞病毒(CMV) /內(nèi)含子A啟動子以及牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化 信號的控制下。質(zhì)粒pVlJ/TPA-hTERT-LTBopt帶有密碼子優(yōu)化的、失活 的人類TERT的cDNA,其在N-末端上融合到TPA信號序列的編碼序列， 在C-末端上融合到LTB 的編碼序列。類似地，質(zhì)粒 pVlJ/TPA-mTERT-LTBopt帶有融合到TPA和LTB的、密碼子優(yōu)化的、失 活的、小鼠TERT的cDNA。
實施例2質(zhì)粒和腺病毒構(gòu)建體
pVlJnsA/TPA畫mTERT (AI)國LTBopt:含有TPA-mTERT (AI) -LTB 序歹'J的質(zhì)粒041046pucKana獲自 GENEART ( Geneart GmbH , Regensburg, Germany)。該質(zhì)粒用Sg/II和消化，產(chǎn)生的片段克隆到 質(zhì)粒pVlJnsA中的Sg/IIASa/I位點中(Montgomery等，Ce〃說o/. ， 12 (9 ) :777-83 ( 1993 ))。
pVlJnsA/mTERT (AI) opt: pVlJnsA/TPA國mTERT (AI) -LTB用 消化來除去LTB編碼序列(處在兩個^YZ^I位點之間)，產(chǎn)生的構(gòu)建體 pVlJnsA/TPA-mTERT具有處在最后的mTERT氮基酸之后和終止密碼子 之前的3個氛基酸(S; R; N) 。 TPA編碼序列的去除通過BamHI和五coRF 消化在pVlJnsA/TPA-mTERT (AI)上進行。TPA編碼序列凈皮用有義引物
C C C A G A T G陽3; SEQ ID NO: 15 )和反義引物(5'誦A GGGGGGATC
NO:16))擴增mTERT序列獲得的PCR產(chǎn)物替換，并克隆回Bamffl和 EcoAK消化的載體。
pVlJnsA/TPA陽hTERT (AI)國LTBopt:通過GENEART獲得的相應(yīng)于 TPA-hTERT (AI) -LTB的合成片段利用萬g瓜/Sa/1限制性位點克隆到 pVlJnsA中。
Ad6-TPAmTERT (AI) -LTBopt:含有TPA-mTERT (AI) -LTBopt序 列的質(zhì)粒041046pucKana獲自GENEART。該質(zhì)粒用Sg/H和&/I消化， 片段6g/II/5^ZI克隆到質(zhì)粒pNEBAd6-CMVpA穿梭載體中。用Bg/1/HindIII 消化的質(zhì)粒pNEBAd6-CMVpA-TPA-mTERT (AI) -LTB重組到Clal線性 化的質(zhì)粒pMRK Ad6 AE1 AE3中。用尸ad酶切質(zhì)粒來釋放Ad ITRs,并在 PerC-6細胞中轉(zhuǎn)染。Ad6載體擴增通過連續(xù)傳代來進行，通過標準的CsCL 梯度純化來進行純化。
Ad6-hTERT (AI):含有hTERT的野生型序列(hTERT野生型序列通 過人類腫瘤細胞的mRNA的逆轉(zhuǎn)錄來被恢復(fù))的質(zhì)粒pCRsript Sg/II/Jft"I 消化，用Klenow酶填充，克隆到EcoAK和Sg/II消化的pVlJnsA中。通 過利用寡核苷酸(5，-C TGTACTTTGTCAAGGTGGCTATCA CGGGCGCGTACG畫3，； SEQ ID NO: 17)和Stratagene quikchange多 重定點誘變試劑盒(Stratagene， LA Jolla, CA; Cat: 200513 )誘變pVlJnsA-hTERT來獲得pVlJnsA-hTERT (AI)。該質(zhì)粒用和 消化，片段克隆到質(zhì)粒pNEBAd6-CMVpA穿梭載體中。用 尸acl/尸mel消化質(zhì)粒pNEBAd6-CMVpA-hTERT (AI),重組到Clal線性化 的質(zhì)粒pMRK Ad6 AE1 AE3中。用尸acl酶切質(zhì)粒來釋放Ad ITRs,并在 Perc-6細胞中轉(zhuǎn)染。Ad6載體擴增通過連續(xù)傳代來進行，通過標準的CsCL 梯度純化來進行純化。
實施例3
IFN吖ELISPOT分析
利用標準的酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)分析(Miyahim等J/附m柳o/ tW^/^A 181 ( 1 ): 45-54 ( 1995 ))檢測以抗原特異性方式分泌IFN-y的小 鼠脾細月包。九十六孔MAIP平^反(MilliporeCorp., Billerica, MA)用100 (xl/孔的、在無菌PBS中稀釋到2.5昭/ml的純化的大鼠抗小鼠IFN-y(IgGl, 克隆R4-6A2， Pharmingen)包被。用PBS洗滌之后，平板的封閉用200 p1/ 孔的R10培養(yǎng)基在37匸進行2小時。
以無菌方式通過從安樂死的小鼠移除脾臟，然后在金屬篩網(wǎng)上搓擦破 壞脾臟來獲得脾細胞。通過向細胞團添加lmlO.lxPBS并旋渦約15秒，來 通過滲透裂解除去紅細胞。然后添加lml 2xPBS,用lxPBS將體積調(diào)至 4ml。通過在RT在1200rpm離心IO分鐘將細胞團粒化，將團粒重懸浮在 lml R10培養(yǎng)基中。使用Ttirks染色對活細胞計數(shù)。
以5xl()s和2.5\105細胞/孔一式兩份將脾細胞平板接種，用每種肽的 l|iig/ml懸浮液在37。C孵育20h。對每個小鼠以5ng/ml使用伴刀豆球蛋白A (ConA)作為陽性內(nèi)部對照。用PBS、 0.05%吐溫20洗滌之后，平板與 分析緩沖液中1:2500稀釋的50^1/孔結(jié)合生物素的大鼠抗小鼠IFNy (RatlgGl,克隆XMG1.2， PharMingen)在4。C孵育0/N。在徹底洗滌之后， 通過添加50nl/孔NBT/B-CIP (Pierce)培育平板直到斑點的顯影明顯可見。 通過用蒸餾水徹底地洗滌平板來停止反應(yīng)。風(fēng)干平板，使用自動化 ELISPOT讀取器對斑點進行計數(shù)。
實施例4
細胞內(nèi)細胞因子染色.
將加入EDTA通過眶后放血獲得的一到兩百萬小鼠脾細胞或PBMC
31重懸浮在lml RPMI10% FCS中，與肽庫(每種肽5-6 ng/ml終濃度)和布 雷菲爾德菌素A (1 pg/ml; BD Pharmingen cat #555028/2300kk)在37。C和 5% C02孵育12-16小時。然后用FACS緩沖液(PBS 1% FBS， 0.01% NaN3)洗滌細胞，在4。C與純化的抗小鼠CD16/CD32 Fc片段(BD Pharmingen cat # 553142 )孵育15分鐘。然后洗滌細胞，用表面抗體 CD4-PE結(jié)合的抗小鼠(BD Pharmingen, cat.# 553049 ) 、 PercP CD8結(jié)合 的抗小鼠(BD Pharmingen cat# 553036 )和APC結(jié)合的抗小鼠CD3e (BD Pharmingen cat# 553066)在暗處室溫下染色30分鐘。洗滌之后將細胞固 定，在暗處4°C用 Cytofix國Cytoperm溶液(BD Pharmingen cat #555028/2300kk)滲透化20分鐘。用PermWash溶液(BD Pharmingen cat #555028/2300kk)洗滌之后，細胞與IFNy - FITC抗體(BD Pharmingen) 孵育。然后洗滌細胞，用PBS中的1%曱醛固定，使用CellQuest軟件 (Becton Dickinson, San Jose, CA )在FACS-Calibur流動血細胞計數(shù)器上 進行分析。
實施例5
細胞毒T淋巴細胞(CTL)分析
以無菌方式通過從安樂死的小鼠移除脾臟，然后在金屬篩網(wǎng)上搓擦破 壞脾臟來獲得脾細胞。通過向細胞團添加lml0.1xPBS并旋渦約15秒，來 通過滲透裂解除去紅細胞。R10中2xl(^細胞/ml的脾臟細胞在存在終濃度 10 pg/ml的免疫原性肽的情況下平板接種到24孔細胞培養(yǎng)物平板(2 ml 細胞/孔)上。平板在37。C、 95°/。濕度、5% C02孵育6天。在培養(yǎng)的第3 天，添加終濃度10 U/ml的重組人IL-2。
收獲生長到指數(shù)期的靶細胞，在存在10 |ig/ml終濃度的免疫原性肽的 情況下調(diào)節(jié)為lxl()S細胞/ml/試管。細胞用50-100iiCi"Cr/試管在37。C標記 2小時。通過在250g離心，用10ml培養(yǎng)基洗滌靶細胞三次，室溫5分鐘， 調(diào)節(jié)為lxl()5細胞/ml。
通過按100:1、 50:1、 25:1和12.5:1的E/T比例平板接種效應(yīng)物/靼細 胞，進行CTL分析。在4小時的孵育之后，平板在1200rpm離心5分鐘， 收獲上清液(30 pl/孔)。平板干燥過夜，利用Beta-平板計數(shù)器來計數(shù)。
實施例6小鼠免疫
雌性C57BL/6小鼠(H-2b)購自Charles River (Lecco， Italy)。 HLA隱A2.1小鼠(HHD )由F. Lemmonier (Institute Pasteur, Paris, France) 惠贈。BALB/c小鼠(H-2d)購自Charles River (Lecco, Italy)。在8周齡 的時候免疫小鼠。如早先描述的(Rizzuto等尸rac. Ato/. Jem/. t/S.A 96
(11 ) :6417-22 ( 1999)),將50微克質(zhì)粒DNA以體積電注射到小 鼠四頭肌中。電穿孔(EP)如早先描述的進行(Zucchelli等Kz>o/. 74
(24) : 11598-607 (2000) ; Rizzuto等，上文)。筒要地，電擊由具有 IOOO個方形雙極脈沖(90V/cm, 75mA, 200ps/相)的10個串列組成。以 50jLil體積在小鼠四頭肌中進行Ad注射。在標明的時間分析細胞介導(dǎo)的免 疫反應(yīng)。
實施例7
編碼TPA-mTERT (AI) -LTB的質(zhì)粒DNA的基因疫苗接種破壞免疫耐受 性
為了確定TPA-mTERT (AI) -LTB的小鼠疫苗接種是否可以破壞免疫 耐受性，20只BALB/c小鼠的組用質(zhì)粒pVlJ/TPA-mTERT (AI) -LTB的5 次每周一次的注射(5 weekly injections )、隨后電穿孔來免疫，如實施例 6中描述的。在最后的注射之后11天，從單個小鼠獲得脾細胞，用于通過 IFN-y ELISPOT分析和通過細胞內(nèi)細胞因子染色(ICS )來分析細胞介導(dǎo)的 免疫反應(yīng)。
使用重疊11個氣基酸并包括完整mTERT蛋白的15mer mTERT肽的 三個庫來測量來自刺激的脾細胞的抗原特異性IFNy分泌。mTERT-1庫由 覆蓋從氨基酸1到388的mTERT區(qū)域的94個單獨的肽組成。mTERT-2 庫由覆蓋從氮基酸377到811的mTERT區(qū)域的106個單獨的肽組成。 mTERT-3庫由覆蓋從氨基酸801到1122的mTERT區(qū)域的78個單獨的 肽組成。作為陰性對照，在用與溶解TERT肽所使用的相同濃度的DMSO 刺激脾細胞時，測量了細胞因子產(chǎn)生。通過使用重疊11個氨基酸并覆蓋 整個LTB序列的24個單獨的15-mer肽的庫，還檢測了針對LTB佐劑誘 導(dǎo)的免疫反應(yīng)。ELIspot結(jié)果表明，TPA-mTERT (AI) -LTBopt的小鼠疫 苗接種引發(fā)了針對TERT-1和TERT-2肽庫中所含的、TERT蛋白的N-末 端和中央?yún)^(qū)域的細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(CMI)(附圖3)。還通過ELIspot檢測了針對LTB的CMI (附圖3 )。
為了更好地表征質(zhì)粒pVlJ/TPA-mTERT (AI) -LTBopt引發(fā)的T細胞 反應(yīng)和鑒定導(dǎo)致IFN-y產(chǎn)生的CD8+和CD4+T細胞亞群，對接種的小鼠脾 細胞進行IFN-y細胞內(nèi)染色并通過FACS分析。ICS獲得的數(shù)據(jù)展現(xiàn)了 ， TPA-mTERT (AI) -LTBopt接種的BALB/c小鼠的基因疫苗接種引發(fā)了針 對TERT蛋白的N-末端區(qū)域(mTERT-l肽庫中所含的，參見附圖4)的 顯著的CD8+ T細胞反應(yīng)。CD4+ T細胞反應(yīng)凈皮定位在TERT的中央?yún)^(qū)域 (mTERT-2肽庫)。相比之下，在這些小鼠中沒有檢測到針對蛋白的C-末端區(qū)域(mTERT-3肽庫)的CMI。還檢測到針對LTB的CD4+ T細胞 反應(yīng)(附圖4)。
為了進一步定位CD8+ T細胞反應(yīng)，使用了 mTERT 15mer肽的中型庫 (midipool)。每個中型庫含有十個15mer，它們各自獨立地被包含在獨立的 中型庫中。因而，2個中型庫的陽性反應(yīng)將明確地鑒定出單個15mer是免 疫原性的。因為CD8+表位總是9氨基酸長度，任何CD8+肽被包含在兩個 鄰近的llmer肽中。結(jié)果表明，CD8+ T細胞免疫反應(yīng)被定位到包括在以 下15mer mTERT肽中的TERT區(qū)域mTERT-41 ( TERTaal61 ; LVPPSCAYQVCGSPL ( SEQ ID NO: 18)和mTERT-42 (TERTaal65; SCAYQVCGSPLYQIC; SEQ ID NO: 19)。通過重疊兩個15mer肽
(mTERT41和mTERT-42 ),合成了三種可能的反應(yīng)性九聚物，并在ICS 中測試。最后，BALB/c小鼠中的免疫顯性CD8+表位被鑒定為在以下序列 中(mTERTaal67; AYQVCGSPL; SEQ ID NO: 20)。這些結(jié)果表明， 使用pVlJ/TPA-mTERT-LTB的BALB/c小鼠疫苗接種可以破壞對mTERT 抗原的免疫耐受性。
為了證實BALB/c小鼠中獲得的數(shù)據(jù)，還用質(zhì)粒pVlJ/TPA-mTERT
(AI) -LTBopt的5次每周一次的注射免疫了 C57BL/6 (B6)小鼠。對接 種的小鼠脾細胞進行IFN-y細胞內(nèi)染色，通過FACS分析。類似于用BALB/c 小鼠獲得的結(jié)果，在所有B6小鼠中針對mTERT的耐受性^皮破壞。另夕卜， 在用TERT肽刺激時，通過ICS檢測到產(chǎn)生IFNy的CD4+和CD8+T細胞
(參見附圖6)。
C57BL/6小鼠中通過DNA疫苗接種引發(fā)的CD8+免疫反應(yīng)主要偏向 TERT蛋白的中央?yún)^(qū)域(肽庫mTERT-2)。還在mTERT肽庫-1中檢測到 較弱的CD8+免疫反應(yīng)。如上所述利用中型庫在B6小鼠中定位了 CD8+免疫反應(yīng)。在B6中鑒定到兩個CD8+表位。第一個免疫原性序列被定位到氨 基酸序列mTERT198 (VGRNFTNL; SEQ ID NO: 21),第二個CD8+表 位被定位到序列mTERT486 ( SLGKYGKL; SEQIDNO: 22)。另夕卜，CD4+ 免疫反應(yīng)^皮定位到TERT的N-末端(肽庫mTERT-l)。針對mTERT的 C-末端區(qū)域沒有檢測到免疫反應(yīng)。
類似于如上所述用BALB/c小鼠獲得的結(jié)果，B6小鼠的隨后的免疫 反應(yīng)的免疫和分析證實了， TPA-mTERT (AI) -LTBopt免疫可以石皮壞對 mTERT抗原的免疫耐受性。因而，結(jié)合起來，用BALB/c和B6小鼠獲得 的結(jié)果表明，TPA-mTERT (AI) -LTBopt融合物是獨立于所使用的小鼠林 系的、自身有效的免疫原。
實施例8
TERT特異性CD8+ T細胞的細胞溶解活性
細胞毒性T淋巴細胞(CTL )分析被用于檢測通過用pVlJ/TPA-mTERT
(AI) -LTBopt免疫BALB/c小鼠引發(fā)的TERT特異性CD8+ T細胞的細胞 溶解活性。用質(zhì)粒pVlJ/TPA-mTERT (AI) -LTBopt的5次每周一次的注 射、隨后電穿孔來免疫小鼠。從2只單獨的小鼠獲得的小鼠脾細胞在最后 一次免疫之后10天采集。這些脾細胞用免疫原性肽mTERTaa167
(AYQVCGSPL; SEQ ID NO: 20 )刺激一周來獲得體外活化的T細胞。 BALB/c同系胂瘤細胞系4T1 (Aslakson等C薩"版52 ( 6 ) : 1399-405
(1992))凈皮用作靶標。4T1細胞用免疫反應(yīng)性肽加載，用Cr"標記作為 CTL分析的靶標。以不同的效應(yīng)物/靶標比例，將活化的T細胞與靶4T1 細胞共同孵育。當用免疫原性肽mTERTaa167( AYQVCGSPL; SEQ ID NO: 20)加載時，從小鼠#1和小鼠#2獲得的活化的T細胞顯示了對把細胞的 細胞溶解活性。在50/1的效應(yīng)物/耙標比例下，兩只小鼠顯示了從80%(小 鼠#1)到25% (小鼠#2)的不同程度的細胞毒性活性。
結(jié)果表明，在BALB/c小鼠中在用TPA-mTERT (AI) -LTBopt作為自 身抗原DNA免疫時誘導(dǎo)了細胞毒性免疫反應(yīng)(附圖5)。
實施例9
TPA-mTERT (AI) -LTBopt構(gòu)建體的比較性免疫原性
為了比較由pVlJ/TPA-mTERT (AI) -LTBopt編碼的、與LTB融合的分泌的mTERT (AI)蛋白，與沒有融合到LTB的mTERT (AI)的非分 泌形式的免疫原性，構(gòu)建了攜帶mTERT(AI)的質(zhì)粒pVlJ衍生物，如實 施例2中描述的。
6只BALB/c小鼠的組用質(zhì)粒pVlJ/TPA-mTERT (AI) -LTBopt或 pVlJ/mTERT( AI )opt的5次每周一次的注射來免疫。利用早先對BALB/c 小鼠鑒定的mTERTaa167 CD8+免疫顯性表位序列(AYQVCGSPL( SEQ ID NO: 20),通過IFNy細胞內(nèi)染色來監(jiān)視免疫反應(yīng)。
結(jié)果表明，與mTERT (AI)相比，對于誘導(dǎo)針對鼠端粒酶的CD8+ 免疫反應(yīng)，TPA-mTERT (AI) -LTBopt是更好的構(gòu)建體(附圖7)。在由 TPA-mTERT-LTB (AI) opt免疫的組中誘導(dǎo)的CD8+ T細胞反應(yīng)中所觀察 到的差異，統(tǒng)計學(xué)上不同于在DNA免疫的情境中利用mTERT (AI) opt 所獲得的(p-0.04studentt檢驗)。
實施例10
免疫方式的比4交
通過用DNA TPA-mTERT (AI) -LTBopt加單獨的電刺激免疫BALB/c 小鼠引發(fā)的抗mTERT細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，與利用DNA TPA-mTERT (AI) -LTBopt加電刺激作為初免、Ad6 TPA-mTERT (AI) -LTBopt作為 免疫反應(yīng)的最終強化劑的多樣化初免/強化免疫方式所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)進 行了比較。
用質(zhì)粒pVlJ/TPA-mTERT (AI) -LTBopt的5次每周一次的注射來免 疫10只小鼠的組。 一周以后，給予強化劑注射，其由50 pgDNA的一次 額外的注射加電穿孔(EP)組成，或用1(^vp的Ad6/TPA-mTERT (AI) -LTBopt。對小鼠PBMC進行IFNy細胞內(nèi)染色來評估產(chǎn)生的細胞介導(dǎo)的免 疫反應(yīng)。早先定位到TERT的N-末端區(qū)域的、包含CD8+ T細胞特異性表 位mTERT 167 (AYQVCGSPL; SEQ ID NO: 20)的肽凈皮用作抗原。結(jié)果 表明，DNA-EP/Ad組合所引發(fā)的免疫反應(yīng)的幅度是在僅接受DNA-EP方 式的小鼠中觀察到的4.6倍(參見附圖8)。
實施例11
TPA-mTERT-LTB的疫苗接種控制肺瘤生長
為了確定mTERT特異性免疫反應(yīng)是否可以產(chǎn)生抗胂瘤效果，在疫苗
36接種之前通過腹膜內(nèi)(i.p.)注射用化學(xué)致癌物二甲基肼處理BALB/c小鼠。 小鼠用這種致癌物質(zhì)處理導(dǎo)致結(jié)腸中漸進性的肺瘤發(fā)展，特征是異常的隱 窩形成、腺瘤和最后的癌。這些小鼠的化學(xué)處理不使它們成為免疫妥協(xié)的， 因為用TPA-mTERT (AI) -LTBopt的免疫引發(fā)了與早先在未處理小鼠中 所發(fā)現(xiàn)的相當?shù)拿庖叻磻?yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。
為了評估基因疫苗接種對DMH誘導(dǎo)的癌發(fā)生的早期階段的影響，根 據(jù)附圖9中描述的進度表，BALB/c小鼠用DMH處理并通過用 pVlJ/TPA-mTERT (AI) -LTBopt進行DNA隨后電穿孑L (DNA-EP)來免 疫。
在開始DMH處理之后12周對二十只小鼠安樂死來統(tǒng)計ACF (異常 的隱窩病灶)的數(shù)目和已經(jīng)形成的腺瘤的數(shù)目。與未接種的小鼠相比，接 種的小鼠中觀察到存在的ACF的數(shù)量和腺瘤的數(shù)量的顯著降低(附圖10)。
還監(jiān)視了 mTERT疫苗接種對肺瘤發(fā)展的晚期階段的效力。為了增強 和維持對mTERT的免疫反應(yīng)，小鼠接受了重復(fù)的DNA-EP TPA-mTERT (AI) -LTBopt和Ad6TPA-mTERT (AI) -LTBopt (附圖11)。這些小鼠 中引發(fā)的免疫反應(yīng)與在用相同的DNA/Ad方式免疫的、未用DMH處理的 BALB/c小鼠中所檢測的是可比較的。
在開始DMH處理之后30周對二十只小鼠安樂死來統(tǒng)計ACF (異常 的隱窩病灶)和已經(jīng)形成的腺瘤的數(shù)目。如同早期腫瘤發(fā)展所見的結(jié)果， 與未接種的'j 、鼠相比，接種的小鼠中觀察到ACF和腺瘤的數(shù)量的顯著P爭低 (附圖12)。
最后，與未接種的小鼠中發(fā)現(xiàn)的相比，在接種的小鼠中存在的腺瘤體 積上更小(附圖13A)。此外，組織學(xué)分析顯示了，與未接種的動物中的 胂瘤相比，在接種的小鼠中存在的腫瘤處在發(fā)展較低的階段(附圖13B)。
實施例12
pVlJTPA-hTERT (AI) -LTBopt的表征
由于hTERT的小鼠轉(zhuǎn)基因是不可獲得的，在非自身環(huán)境中評估了 pVlJ/TPA-hTERT (AI) -LTBopt的免疫原性潛力。使用具有人HLA-A2的 轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠(HHD轉(zhuǎn)基因小鼠)，從而TERT免疫原性肽將存 在于人I型HLA的環(huán)境中。通過50叱質(zhì)粒pVlJ/TPA-hTERT( AI )-LTBopt 的2次每兩周一次的注射(2 biweekly injections )、通過DNA-EP接種HHD轉(zhuǎn)基因小鼠。對小鼠PBMC通過ICS評估了誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。與hTERT 865 表位RLVDDFLLV( SEQ IDNO: 23 )相應(yīng)的hTERT免疫原性肽用作抗原。 如早先描述的，這個表位序列是在T細胞體外初敏實驗中HLA-A2的強結(jié) 合物和CTL活性的強談導(dǎo)物(Dupont等C""ceri ^earc/z 65( 12 ): 5417-27 (2005))。
從10只小鼠獲得的結(jié)果顯示了 ，平均起來，當用免疫原性hTERT 865 肽刺激時，12%的CD8+細胞產(chǎn)生IFN-y (附圖14)。結(jié)果表明， pVlJTPA-hTERT ( AI) -LTB叩t疫苗候選物是免疫原性的，并誘導(dǎo)了 HLA-A2限制性CD8免疫反應(yīng)。
實施例13
在Ad6-hTERT ( AI)強化之后接種的小鼠中免疫反應(yīng)的表征
如實施例2中的描述組裝Ad6 hTERT (AI)構(gòu)建體。這種構(gòu)建體包含 野生型密碼子，只是添加了兩個突變來消除端粒酶催化活性。還制備了 Ad6hTERT-LTB融合物構(gòu)建體，但是不能被恢復(fù)，所以只能用Ad6hTERT (AI)進行進一步的測試。
在HHD轉(zhuǎn)基因小鼠中測試了 Ad6 hTERT (AI)構(gòu)建體對DNA-EP 誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的強化能力。10只小鼠的組用50 pg質(zhì)粒 pVlJ/TPA-hTERT ( AI) -LTBopt的一次注射通過DNA-EP免疫，并在第 一次DNA注射后兩周用第二次DNA注射或用Ad6 hTERT 1C^。pp來強 化。利用早先鑒定的HLA-A2等位基因hTERT865的免疫顯性肽測量了 誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。以高頻率檢出了產(chǎn)生IFN-y的反應(yīng)性CD8+ T細胞。 如附圖14中所示，DNA-EP/Ad組合所引發(fā)的免疫反應(yīng)的幅度是僅接受 DNA-EP方式的小鼠中所觀察到的3倍。
結(jié)果表明，通過注射pVlJ/TPA-hTERT (AI) -LTBopt DNA激發(fā)的 hTERT特異性免疫反應(yīng)，通過用Ad6-hTERT (AI)強化被增強了。
實施例14 hTERT免疫誘導(dǎo)的CTL活性的表征
通過測試活化的T細胞對胂瘤耙細胞的細胞毒活性(CTL),進一步 表征了在接種的小鼠中引發(fā)的針對hTERT的CD8+ T細胞反應(yīng)。來自免疫 的小鼠脾細胞在存在hTERT865肽(SEQ ID NO: 23，參見實施例12 )和
38IL-2的情況下在培養(yǎng)物中刺激6天。此后，在Cr"釋放分析中測試了活化 的CD8+T細胞針對靶細胞的溶胞活性。被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染以表達HHD小鼠上存 在的嵌合MHC I型分子的HeLa細胞(HeLa-HHD)被用作耙細胞。HeLa -HHD耙細月包用免疫原性肽hTERT865外源加載，或24小時之前用編碼 hTERT的Ad6載體感染，以外源過量表達TERT抗原。作為對照，用編 碼GFP的Ad6載體感染耙細胞。結(jié)果表明，通過所描述的疫苗接種誘導(dǎo) 的CD8+T細胞能夠殺死過量表達hTERT抗原的粑細胞(附圖15 )。
實施例15
恒河猴中人類TERT疫苗的免疫原性的表征
在恒河猴中評估使用hTERT、基于DNA初免、Ad強化的基因疫苗 接種平臺的免疫原性。由于人類TERT和恒河猴TERT序列的同源性是 96%,預(yù)計耐受性在確定疫苗接種效力方面起到重要作用。
疫苗接種方案由每兩周給予的五次DNA-EP 注射 (pVlJ/TPA-hTERT-LTB, 5mg/注射)組成。最后的DNA-EP治療之后四 周，用表達hTERT的Ad載體(Ad6-hTERT, 1011 vp)以兩周的間隔強化 猴子2次。每周采集體重和臨床征象的數(shù)據(jù)。沒有觀察到對動物體重的消 極影響或臨床征象的出現(xiàn)。
利用類似于在實施例7中描述的hTERT肽庫和覆蓋LTB序列的肽 庫，通過PBMC的IFN-yELISPOT分析，監(jiān)視了誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。如果 獲得的信號是背景反應(yīng)性(DMSO)的至少四倍，免疫反應(yīng)被計為陽性。 誘導(dǎo)的CMI的ELIspot分析表明，在四只接種的猴子中的四只中，在第 一輪2次DNA-EP治療之后存在著可檢測的免疫反應(yīng)(附圖16A)。在 第五次DNA-EP之后，觀察到反應(yīng)的輕微提高(附圖16B)。還在完整 的免疫方案的結(jié)束時，在兩次Ad強化之后測量了免疫反應(yīng)。結(jié)果表明， Ad強化誘導(dǎo)了 CMI幅度的一致的增加(附圖17)。因而，通過這個實 驗進一步確認了異源的初免/強化形式的能力。
權(quán)利要求
1. 一種核酸分子，包含編碼人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)融合蛋白的核苷酸的序列，其中所述hTERT融合蛋白包含融合到大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的B亞基(LTB)蛋白的實質(zhì)部分的hTERT蛋白或其變體，并且其中所述融合蛋白能在哺乳動物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
2. 權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述核苷酸的序列編碼變體hTERT 蛋白，其中所述變體包含相對于SEQIDNO: 12中所列野生型hTERT氨 基酸序列的一個或更多個突變，并且其中所述突變用作消除或降#<所編碼 的hTERT蛋白的端粒酶催化活性。
3. 權(quán)利要求2的核酸分子，其中所述突變由D712A和V713I組成。
4. 權(quán)利要求3的核酸分子，其中所述編碼hTERT的核苷酸的序列為 在人類細胞中高水平表達而被密碼子優(yōu)化。
5. 權(quán)利要求3的核酸分子，其中所編碼的LTB蛋白被截短了它的信 號序列。
6. 權(quán)利要求5的核酸分子，其中所述編碼LTB的核苷酸的序列為在 人類細胞中高水平表達而被密碼子優(yōu)化。
7. 權(quán)利要求6的核酸分子，其中所述編碼LTB的核苷酸的序列和所 述編碼hTERT的核苦酸的序列為在人類細胞中高水平表達而被密碼子優(yōu)化。
8. 權(quán)利要求7的核酸分子，其中所述核苷酸的序列包含SEQ ID NO: 5中所列的序列。
9. 權(quán)利要求3的核酸分子，其中所述核苷酸的序列編碼SEQIDNO: 6中所列的hTERT-LTB融合蛋白。
10. —種純化的融合蛋白，包含與大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的B亞基 (LTB)蛋白融合的人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)蛋白或其變體。
11. 權(quán)利要求10的純化的融合蛋白，其中所述hTERT蛋白的C-末端 被融合到LTB蛋白的N-末端。
12. 權(quán)利要求11的純化的融合蛋白，其中所述hTERT蛋白包含用作 消除端粒酶催化活性的突變。
13. 權(quán)利要求12的純化的融合蛋白，其中所述蛋白包含SEQ ID NO: 6中所列的氨基酸序列。
14. 包含權(quán)利要求1的核酸分子的載體。
15. 包含權(quán)利要求9的核酸分子的載體。
16. 權(quán)利要求15的載體，其中所述載體是質(zhì)粒載體或腺病毒載體。
17. 權(quán)利要求16的載體，其中所述載體是質(zhì)粒pVlJ。
18. 包含權(quán)利要求15的載體的宿主細胞。
19. 權(quán)利要求7的核酸分子，其中所述核苷酸的序列進一步包含編碼 人類組織纖溶酶原激活物(TPA)信號序列的前導(dǎo)序列。
20. 權(quán)利要求19的核酸分子，其中所述核苷酸的序列包含SEQ ID NO: 1中所列的序列。
21. 包含權(quán)利要求20的核酸分子的載體。
22. —種腺病毒疫苗載體，包含編碼人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT) 的核苷酸的序列；其中所述核苷酸的序列包含用作消除端粒酶催化活性的 突變。
23. 權(quán)利要求22的腺病毒疫苗載體，其中所述核苷酸的序列編碼SEQ ID NO: 10中所列的hTERT蛋白。
24. 權(quán)利要求23的載體，其中所述載體是Ad5載體或Ad6載體。
25. —種在重組宿主細胞中表達hTERT-LTB融合蛋白的方法，包括 (a)將包含權(quán)利要求1的核酸分子的載體導(dǎo)入適合的宿主細胞中；和,(b )在容許所述hTERT-LTB融合蛋白表達的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞。
26. —種預(yù)防或治療癌癥的方法，包括給有需要的患者施用包含權(quán)利 要求2的核酸分子的疫苗載體。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述載體是腺病毒載體或質(zhì)粒載體。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述載體是包含腺病毒基因組的腺 病毒載體，所述腺病毒基因組具有在腺病毒El區(qū)域中的刪除和在腺病毒 El區(qū)域中的插入物，其中所述插入物包含表達盒，所述表達盒包含(a)多核苷酸，其包含編碼hTERT-LTB融合蛋白的核苷酸的序列， 其中所述hTERT-LTB融合蛋白包含hTERT蛋白變體；所述hTERT蛋白 變體包含突變來消除端粒酶催化活性，其與大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素亞基 B (LTB)的實質(zhì)部分融合，并且其中所述融合蛋白能夠在哺乳動物中產(chǎn) 生免疫反應(yīng)；和，(b)與所述多核苷酸可操縱地連接的啟動子。
29. 根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述載體是質(zhì)粒疫苗載體，其包含 質(zhì)粒部分和可表達的盒，所述盒包含(a) 多核苷酸，其包含編碼hTERT-LTB融合蛋白的核苷酸的序列， 其中所述hTERT-LTB融合蛋白包含hTERT蛋白變體；所述hTERT蛋白 變體包含突變來消除端粒酶催化活性，其與大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素亞基 B (LTB)的實質(zhì)部分融合，并且其中所述融合蛋白能夠在哺乳動物中產(chǎn) 生免疫反應(yīng)；和，(b) 與所述多核苷酸可操縱地連接的啟動子。
30. —種包含腺病毒基因組的腺病毒疫苗載體，所述腺病毒基因組具 有在E1區(qū)域中的刪除，和在E1區(qū)域中的插入物，其中所述插入物包含表 達盒，所述表達盒包含(a) 多核苷酸，其包含編碼SEQIDNO: 10中所列人類端粒酶逆轉(zhuǎn) 錄酶變體的核苷酸的序列；和(b) 與所述多核苷酸可操縱地連接的啟動子。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30的腺病毒載體，其是Ad5或Ad6載體。
32. —種治療患有或易患TERT-相關(guān)癌癥的患者的方法，包括(a) 向所述患者中一次或更多次導(dǎo)入第一載體，所述第一載體包含(i) 多核苷酸，其包含編碼hTERT-LTB融合蛋白的核苷酸的 序列，其中所述hTERT-LTB融合蛋白包含hTERT蛋白變體；所述hTERT 蛋白變體包含突變來消除端粒酶催化活性，其與大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素 亞基B (LTB)的實質(zhì)部分融合，并且其中所述融合蛋白能夠在哺乳動物 中產(chǎn)生免疫反應(yīng)；和，(ii) 與所述多核苷酸可操縱地連接的啟動子；(b) 容許經(jīng)過預(yù)定的時間；和(c) 向所述患者中導(dǎo)入笫二載體，所述第二載體包含(i) 多核苷酸，其包含編碼SEQIDNO: 10中所列人類端粒酶 逆轉(zhuǎn)錄酶變體的核苷酸的序列；和(ii) 與所述多核苦酸可操縱地連接的啟動子； 其中所述第 一載體和所述第二載體不是相同的。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述第一載體是質(zhì)粒，所述第二載 體是腺病毒載體。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中在所述腺病毒載體被導(dǎo)入之前， 所述質(zhì)粒載體被導(dǎo)入所述患者中超過一次。
全文摘要
提供了編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)融合蛋白的多核苷酸，所述TERT融合蛋白包含與熱不穩(wěn)定腸毒素的B亞基(LTB)的實質(zhì)部分融合的TERT蛋白或其功能性變體。在本發(fā)明的TERT-LTB融合蛋白中有用的TERT變體包含用作消除端粒酶催化活性的突變。本發(fā)明的多核苷酸可以在哺乳動物中引發(fā)免疫反應(yīng)，在優(yōu)選的實施方式中，其比由野生型TERT引發(fā)的免疫反應(yīng)更強。TERT表達通常與人類癌的發(fā)展相關(guān)。本發(fā)明提供組合物和方法，來通過TERT腫瘤相關(guān)抗原引發(fā)或增強對表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫性，其中異常的TERT表達與癌或它的發(fā)展相關(guān)。本發(fā)明具體地提供了攜帶編碼TERT融合蛋白和TERT變體的多核苷酸的腺病毒載體和質(zhì)粒構(gòu)建體，公開了它們在用于預(yù)防和治療癌癥的疫苗和藥物組合物中的用途。
文檔編號C07K14/435GK101522706SQ200780037882
公開日2009年9月2日 申請日期2007年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月12日
發(fā)明者C·門努尼, E·斯卡塞利, G·奇利伯托, N·拉莫妮卡 申請人:P.安杰萊蒂分子生物學(xué)研究所