專利名稱：：液體抗狂犬病抗體制劑的制作方法液體抗狂犬病抗體制劑發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及藥物。本發(fā)明特別涉及特異性抗狂犬病抗體的穩(wěn)定制劑。
背景技術(shù)：
：在過去的十年中，生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的進(jìn)展使得可以鑒別、開發(fā)和產(chǎn)生多種抗體用于診斷、預(yù)防和治療許多不同疾病和病癥。這種抗體的例子是在WO2005/118644中描述的抗狂犬病病毒抗體。兩種這樣的抗體CR57和CR4098的抗體混合劑(cocktail)是特別有利的，可用于狂犬病暴露后預(yù)防中。在WO2005/118644中，制備了這些抗體并用于PBS。與任何蛋白質(zhì)一樣，抗體的生物學(xué)活性例如其結(jié)合親和性或者中和活性依賴于至少核心氨基酸序列的構(gòu)象完整性保持完整同時保護(hù)蛋白質(zhì)的多個功能基團(tuán)免于降解?；瘜W(xué)和物理不穩(wěn)定性均可導(dǎo)致抗體降解。因為抗體比傳統(tǒng)的有機(jī)和無機(jī)藥物更大且更復(fù)雜，因此這種抗體的制劑會出現(xiàn)特殊問題?？贵w穩(wěn)定性可以受到這樣的因素影響，即離子強(qiáng)度、pH、溫度、重復(fù)冷凍/解凍循環(huán)、抗體濃度和剪切力?；钚钥贵w可以由于物理不穩(wěn)定性和化學(xué)不穩(wěn)定性的結(jié)果而喪失，所述物理不穩(wěn)定性包括變性、聚集(可溶及不可溶聚集體形成)、沉淀與吸附，所述化學(xué)不穩(wěn)定性包括例如外消旋化、(3-消除或者二硫化物交換、水解、脫酰胺作用和氧化等等。任何這些不穩(wěn)定性均可以潛在地導(dǎo)致具有降低的生物學(xué)活性、增加的毒性和/或增加的免疫原性的抗體副產(chǎn)物或者衍生物的形成。雖然現(xiàn)有
技術(shù)領(lǐng)域：
指出了可適用于產(chǎn)生特定抗體的抗體制劑的許多賦形劑的例子，但是不能預(yù)測為了克服特定抗體可能具有的特定的不穩(wěn)定性問題而應(yīng)該加入哪些賦形劑以及應(yīng)該加入的量。此外，難以發(fā)現(xiàn)在特定制劑內(nèi)保持特定抗體的化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性的最佳條件如抗體濃度、pH和貯存溫度。鑒于可以變化的所有因素，找尋用于配制單一的單克隆抗體的合適賦形劑和最佳條件孕育著挑戰(zhàn)。顯然，找尋用于配制在單一制劑中的兩種不同的單克隆抗體的合適賦形劑和最佳條件更加困難重重。特別地，本領(lǐng)域未提供含有兩種不同的重組單克隆抗體的長期穩(wěn)定的藥物制劑。因此，本領(lǐng)域需要揭示這樣的制劑，即不僅是一種狂犬病病毒的單克隆抗體、而是甚至兩種不同的特定單克隆抗體在長期貯存的情況下也是穩(wěn)定的。貯存穩(wěn)定性在轉(zhuǎn)運期間的剪切力作用下以及在改變的氣候條件下、特別是在溫度和空氣濕度增加的情況中也應(yīng)保持。此外，所述制劑應(yīng)適于指定的給予途徑，應(yīng)良好耐受并且應(yīng)具有簡單結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的目的是提供這種制劑。發(fā)明概述符合本發(fā)明要求的制劑已經(jīng)令人驚奇地以水溶液形式被發(fā)現(xiàn)，其除了包含兩種不同的單克隆抗體之外還包含檸檬酸鹽緩沖液、張力劑和表面活性劑。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)磷酸鹽緩沖液導(dǎo)致特定抗體的不穩(wěn)定性，甚至這種不穩(wěn)定性由于加入表面活性劑而增加。本發(fā)明因此提供了特異的抗狂犬病病毒抗體CR57和CR4098或其功能變體的制劑。本發(fā)明還涉及包含CR57和CR4098二者或其功能變體的抗體制劑。所述制劑除了含有活性成分(抗體)之外還含有擰檬酸鹽緩沖液、張力劑和表面活性劑。本發(fā)明的制劑在-70'C和5'C可穩(wěn)定至少一年。附圖描述通過HP-SEC測量的在40士2'C/75士5y。相對濕度條件下貯存0周(白色柱)、2周(黑色柱)和4周(陰影柱)后抗狂犬病病毒抗體CR57(圖1)、CR4098(圖2)及CR57與CR4098的混合劑(圖3)的穩(wěn)定性。從左至右檢測了如下緩沖液系統(tǒng)檸檬酸鹽(20mM，pH6.0)、檸檬酸鹽(20mM，pH6.5)、磷酸鹽(20mM，pH7.0)、磷酸鹽(20mM，0.01%w/v聚山梨醇酯80，pH7.0)。發(fā)明詳述本發(fā)明的制劑至少包含抗體CR57(重鏈SEQIDNO:1和輕鏈SEQIDNO:2)和抗體CR4098(重鏈SEQIDNO:3和輕鏈SEQIDNO:4)之一，優(yōu)選包含這兩種抗體。抗狂犬病病毒單克隆抗體CR57和CR4098的鑒別、分離、制備與鑒定己經(jīng)在并入本文作參考的WO2005/118644中詳細(xì)描述。這些抗體的功能變體基于其高度相似性而可以具有相似的物理化學(xué)性質(zhì)，因此也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明定義的功能變體是指這樣的抗體，其與CR59或CR4098具有至少95%、優(yōu)選至少97%、例如至少98%或99%同源的氨基酸序列且能競爭結(jié)合由親代分子(所述親代分子分別是CR59和CR4098)識別的靶以及具有狂犬病病毒中和活性。抗體的靶是抗原(對于本發(fā)明的抗體而言，其靶是狂犬病病毒，特別是其G蛋白)，也可以進(jìn)一步定義為表位。所述親代分子的耙己經(jīng)在WO2005/118644中揭示，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法確定與靶的競爭性結(jié)合。優(yōu)選所述功能變體是人抗體，優(yōu)選是IgGl分子。在優(yōu)選的實施方案中，功能變體的氨基酸序列與親代分子至少95%、97%、98%或99%相同。如本文所用，術(shù)語"功能變體"是指這樣的單克隆抗體，其包含與親代單克隆抗體的氨基酸序列相比有一或多個氨基酸被改變的氨基酸序列。所述功能變體可具有保守序列修飾，包括氨基酸取代、添加和缺失。氨基酸修飾可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入，例如在編碼抗體的核酸中進(jìn)行定點誘變、分子克隆、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變和隨機(jī)PCR介導(dǎo)的誘變。保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基由具有相似結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸殘基取代的那些。本領(lǐng)域已經(jīng)確定了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，無電荷的極性側(cè)鏈氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非極性側(cè)鏈氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，p-分支的側(cè)鏈氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳族側(cè)鏈氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知也可以使用除了上述之外的其他類別氨基酸家族。此外，變體可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸殘基置換。相似的較小變化也包括氨基酸缺失或插入，或者這二者。使用本領(lǐng)域熟知的計算機(jī)程序可以找到關(guān)于確定哪些氨基酸殘基可以被取代、插入或缺失而不消除其免疫學(xué)活性的指導(dǎo)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的計算機(jī)算法例如Gap或者Bestfit可用于優(yōu)化對比氨基酸序列以對比及限定相似或相同的氨基酸殘基。7功能變體與其親代抗體相比可具有相同或不同(更高或更低)的結(jié)合親和性，但是仍能特異性結(jié)合狂犬病病毒或其片段，以及與其親代抗體相比可具有相同、更高或更低的狂犬病病毒中和活性。在一個特異的實施方案中，本發(fā)明的制劑包含第一種抗狂犬病病毒單克隆抗體和第二種抗狂犬病病毒單克隆抗體，所述第一種抗體具有K輕鏈，所述第二種抗體具有X輕鏈。這樣使得易于確定每種抗體的濃度，因為可以對K和X輕鏈進(jìn)行特異性ELISA。如本文所用，術(shù)語"單克隆抗體"是指單一分子成分的抗體分子制備物。單克隆抗體對于特定表位顯示單一的結(jié)合特異性和親和性。本發(fā)明制劑中的單克隆抗體(CR57和CR4098及其功能變體)是人抗體且是IgG類抗體，優(yōu)選IgGl。產(chǎn)生單克隆抗體的方法為本領(lǐng)域所熟知，見例如并入本文作參考的Antibodies:ALaboratoryManual,Editedby:E.HarlowandD，Lane(1988)，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork所述。術(shù)語"特異性結(jié)合"是指與抗原或其片段免疫特異性結(jié)合，但是與其它抗原非免疫特異性結(jié)合。與抗原免疫特異性結(jié)合的單克隆抗體可以與其它肽或多肽以較低親和性結(jié)合，例如通過放射性免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、BIACORE或者本領(lǐng)域己知的其它測定方法確定。與抗原免疫特異性結(jié)合的單克隆抗體或其片段可以與相關(guān)抗原交叉反應(yīng)。優(yōu)選地，與抗原免疫特異性結(jié)合的單克隆抗體或其片段與其它抗原不交叉反應(yīng)。"藥物可接受的賦形劑"是指任何惰性物質(zhì)，其與活性分子如單克隆抗體組合用以制備適當(dāng)或適宜的劑型。所述"藥物可接受的賦形劑"是在使用劑量和濃度對于接受者無毒性、且與包含單克隆抗體的制劑中的其它成分相容的賦形劑。術(shù)語"副產(chǎn)物"包括不希望得到的產(chǎn)物，其降低或者減少給定制劑中治療/預(yù)防性抗體的比例。典型的副產(chǎn)物包括抗體的聚集體，抗體片段，例如由于脫酰胺作用或水解導(dǎo)致抗體降解而產(chǎn)生的片段，或者其混合物。典型地，聚集體是分子量大于單體抗體分子量的復(fù)合物?？贵w降解產(chǎn)物可包括例如抗體的片段，例如由于脫酰胺作用或者水解產(chǎn)生的片段。典型地，降解產(chǎn)物是分子量低于單體抗體的復(fù)合物。在IgG抗體的情況中，這種降解產(chǎn)物分子量低于大約150kD。如本文所用，"穩(wěn)定/穩(wěn)定化"制劑是指其中的抗體在貯存時基本上保持其物理穩(wěn)定性/同一性/完整性和/或化學(xué)穩(wěn)定性/同一性和/或完整性和/或生物學(xué)活性的制劑。本領(lǐng)域可利用各種測量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的分析技術(shù)，所述技術(shù)在例如PeptideandProteinDrugDelivery,247-301，VincentLeeEd.,MarcelDekker，Inc.,NewYork,N.Y.，Pubs.(1991)禾PJones,A.Adv.DrugDeliveryRev.10:29-卯(1993)中綜述。穩(wěn)定性可以在選擇的時間在選擇的溫度及其它貯存條件下測量。穩(wěn)定性可以通過選自如下的至少一種方法確定目測，SDS-PAGE，正F，HPSEC，RFFIT以及k/XELISA。如果經(jīng)目測顏色和/或澄清度或者通過UV光散射、SDS-PAGE或者通過(高壓)大小排阻層析(HPSEC)測量，單克隆抗體示出無聚集、沉淀和/或變性的跡象時，則其在藥物制劑中"保持其物理穩(wěn)定性"。優(yōu)選地，當(dāng)使用本發(fā)明的制劑時，通過HPSEC或者測量聚集形成的任何其它合適方法測定，5%或更低、典型為4°/?；蚋佟?yōu)選3%或更少、更優(yōu)選2%或更少以及特別是1%或更少的抗體形成聚集體。例如，如果通過HPSEC測量抗體單體在特定制劑中在一定的貯存條件下在一定的預(yù)定時間之后具有》大約90%、優(yōu)選》大約95%、特別是》大約98%的純度，則認(rèn)為該抗體在所述特定制劑中是穩(wěn)定的。因此，CR57和CR4098抗體在本發(fā)明的制劑中在5士3。C貯存至少18個月時是穩(wěn)定的，即HPSEC層析圖中單體峰包含〉95n/。的所有峰的總面積的面積(在表9中可以看出主峰面積甚至>99%)?；瘜W(xué)穩(wěn)定性可以通過檢測和量化蛋白質(zhì)的化學(xué)改變形式而確定?；瘜W(xué)改變可包含大小修飾(例如剪切)，這可以例如使用(HP)SEC、SDS-PAGE和/或基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜法(MALDI/TOFMS)進(jìn)行評估。其它類型的化學(xué)改變包括電荷改變(例如由于脫酰胺作用的結(jié)果而發(fā)生)，這可以例如通過離子交換層析方法評估。如果抗體的生物學(xué)活性在指定時間是藥物制劑在制備時呈現(xiàn)的生物學(xué)活性的至少大約90%(在測定誤差之內(nèi))，則所述藥物制劑中所述抗體在指定時間"保持其生物學(xué)活性"，這是例如通過抗原結(jié)合測定或者病毒中和測定方法確定的。如本文所用，除非特別指出，則"大約"是指在±10%范圍內(nèi)。在第一方面中，本發(fā)明涉及藥物制劑，其包含至少一種活性成分、優(yōu)選治療有效量的活性成分以及包含至少一種藥物可接受的賦形劑。優(yōu)選地，所述藥物制劑包含檸檬酸鹽緩沖液、張力劑、表面活性劑以及兩種抗狂犬病病毒單克隆抗體，其中所述抗體彼此不同。所述制劑可以是固體，例如冷凍或凍干的，但是優(yōu)選是液體，例如水溶液。所述制劑可包含至少兩種不同的抗狂犬病病毒單克隆抗體，特別是(i)CR57(具有重鏈SEQIDNO:1和輕鏈SEQIDNO:2氨基酸序列的抗體)或其功能變體，以及(ii)CR4098(具有重鏈SEQIDNO:3和輕鏈SEQIDNO:4氨基酸序列的抗體)或其功能變體。在特定的實施方案中，本發(fā)明的制劑具有從大約250IU/ml至大約1500IU/ml的狂犬病病毒中和效力，例如從大約300IU/ml至大約1400IU/ml，典型從大約380IU/ml至大約1350IU/ml。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知測量狂犬病病毒中和作用的方法。中和作用可例如如Laboratorytechniquesinrabies,Editedby:F,X.Meslin，M.M.KaplanandH.Koprowski(1996)，第4版第15-17章，WorldHealthOrganization,Geneva所述。中和活性的適當(dāng)且已知的測定方法是RFFIT測定法。在一個實施方案中，在5土3'C溫度下貯存12個月后，本發(fā)明制劑的狂犬病病毒中和效力是本發(fā)明制劑貯存前的狂犬病病毒中和效力的至少80%，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，甚至更優(yōu)選至少98%,尤其是100°/0。在某些實施方案中，在25士2'C溫度下貯存3個月后，本發(fā)明制劑的狂犬病病毒中和效力是本發(fā)明制劑貯存前的狂犬病病毒中和效力的至少90%，優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少98%，尤其是100%。本發(fā)明的制劑包含表面活性劑，也稱作穩(wěn)定劑。表面活性劑可包括但非限于聚山梨醇酯。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到其它表面活性劑例如非離子型或者離子型去污劑也可以用作表面活性劑，只要其是藥物可接受的即可，即其適于給予人體。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了這樣的制劑，其中所述表面活性劑是聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65或者聚山梨醇酯80，優(yōu)選聚山梨醇酯80。在一個實施方案中，所述制劑中聚山梨醇酯80的量是大約0.0005%w/v至大約0.05%w/v，優(yōu)選大約0.005%w/v至大約0.03°/。w/v，更優(yōu)選大約0.008%w/v至大約0.015%w/v。在一個優(yōu)選的實施方案中，聚山梨醇酯80的存在量是大約0.01%w/v。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了這樣的制劑，其中檸檬酸鹽緩沖液例如二水檸檬酸鈉(sodiumcitratedehydrate)(2.5mg/m1)/—水?dāng)Q檬酸(0.3mg/ml)緩沖液的濃度是大約5mM至大約25mM，優(yōu)選大約7mM至大約20mM，更優(yōu)選大約8mM至大約15mM，特別優(yōu)選大約9mM至大約12mM。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述檸檬酸鹽緩沖液的存在濃度是大約lOrnM。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及這樣的制劑，其中pH范圍是大約5.2至大約6.8，典型是大約5.5至大約6.5，優(yōu)選大約5.7至大約6.3，更優(yōu)選大約5.8至大約6.2,特別是大約5.9至大約6.1。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述pH為大約6.0。在一個特定的非限制性實施方案中，張力劑是氯化鈉。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，例如其它鹽也可以用作張力劑，或者例如糖等也可以用作張力劑，只要其是藥物可接受的即可。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述張力劑的存在量是大約50mM至大約250mM，典型是大約75mM至大約225mM，優(yōu)選大約100mM至大約200mM,更優(yōu)選大約125mM至大約175mM。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述張力劑的存在濃度是大約150mM。在某些實施方案中，本發(fā)明制劑的滲透壓是大約250mOsm/kg至大約350mOsm/kg，優(yōu)選大約270mOsm/kg至大約330mOsm/kg，更優(yōu)選大約280mOsm/kg至大約320mOsm/kg，特別優(yōu)選大約290mOsm/kg至大約310mOsm/kg。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述滲透壓是大約300mOsm/kg。換句話說，所述制劑優(yōu)選是基本等滲的，即與人體血液具有基本相同的滲透壓力。等滲性可例如通過使用蒸汽壓或者冰凍型滲透壓計測量。本發(fā)明制劑的滲透壓可例如通過一或多種張力劑調(diào)節(jié)。本發(fā)明制劑中每種抗體的濃度優(yōu)選是在大約0.1與2.0mg/ml之間，典型是在大約0.1與1mg/ml之間。在某些非限制性實施方案中，每種抗體的濃度是0.15(土20。/。)mg/ml。在其它非限制性實施方案中，每種抗體的存在濃度是03(±20%)mg/ml(即兩種抗體共0.6mg/ml)。在某些實施方案中，兩種抗體的(蛋白質(zhì))比率在5:1與1:5之間，優(yōu)選在2:1與1:2之間，特別是大約1:1。此外，本發(fā)明的制劑可包含其它賦形劑，包括但不限于氨基酸及其鹽、糖、蛋白質(zhì)、稀釋劑、增溶劑、pH調(diào)節(jié)劑、安撫劑、其它緩沖液、其它無機(jī)鹽或有機(jī)鹽、抗氧化劑等。然而，本發(fā)明的制劑優(yōu)選除了檸檬酸鹽緩沖液、張力劑和表面活性劑之外幾乎不含有其它賦形劑。在本發(fā)明的制劑中，所述抗狂犬病病毒單克隆抗體CR57和CR4098在大約2'C至大約8-C可穩(wěn)定至少大約1年，典型可穩(wěn)定至少大約18個月。優(yōu)選其在大約2-8"C可穩(wěn)定至少大約2年、更優(yōu)選3年。此外，本發(fā)明制劑中抗狂犬病病毒單克隆抗體在大約25士2'C可穩(wěn)定至少2個月。除此之外，本發(fā)明制劑中抗狂犬病病毒單克隆抗體在大約40±2'C可穩(wěn)定至少2周。在某些實施方案中，所述制劑適于肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、局部注射至傷口或者這些組合方式給予。因此，所述制劑優(yōu)選是無菌的。生產(chǎn)所述制劑的方法為本領(lǐng)域所熟知，包括例如通過過濾滅菌膜過濾或者對除了抗體之外的制劑成分在大約12(TC高壓滅菌大約30分鐘。在優(yōu)選的實施方案中，所述制劑基本上沒有內(nèi)毒素。內(nèi)毒素是大約10kDa的低分子量復(fù)合物，其與革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁外部結(jié)合，在胃腸外給予患者時可產(chǎn)生發(fā)熱反應(yīng)。因此，F(xiàn)DA已經(jīng)規(guī)定了在一小時靜脈內(nèi)給予藥物的上限是5EU每劑每kg體重(見例如TheUnitedStatesPharmacopeialConvention(USP)，PharmacopeialForum26(1):223(2000》。在某些實施方案中，所述制劑的內(nèi)毒素濃度低于大約5.0內(nèi)毒素單位每毫升(EU/ml)(濃度低于大約5.0EU/ml在本文稱作基本上沒有內(nèi)毒素)，優(yōu)選低于大約2.5EU/ml，更優(yōu)選低于大約1.0EU/ml，甚至更優(yōu)選低于大約0.5EU/ml，特別是低于大約0.30EU/ml。在某個實施方案中，所述制劑的內(nèi)毒素濃度范圍是大約0.001EU/ml至大約5.0EU/ml。測量內(nèi)毒素的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，包括但不限于膠凝測定法、比濁(分光光度)測定法和顯色測定法。"暴露后預(yù)防"(PEP)是指針對可能暴露于狂犬病動物的人進(jìn)行預(yù)防?？赡艿谋┞栋ㄒ┞?即牙齒對皮膚的任何穿透)包括動物咬傷以及非咬傷暴露。本發(fā)明的制劑可以給予需要其的對象用于預(yù)防和/或治療狂犬病病毒感染例如進(jìn)行暴露后預(yù)防。本發(fā)明的制劑可以與用于診斷、預(yù)防和/或12治療狂犬病病毒的其它分子聯(lián)合應(yīng)用。例如，它們可以與狂犬病病毒疫苗共同給予?；蛘?，所述疫苗也可以在給予本發(fā)明的制劑之前或之后給予。給予本發(fā)明的制劑與疫苗適于進(jìn)行暴露后預(yù)防?？袢∫呙绨ǖ幌抻诩兓碾u胚細(xì)胞(PCEQ疫苗(RabAvert，Rabipur)、人二倍體細(xì)胞疫苗(HDCV;Imovax疫苗)或者吸附型狂犬病疫苗(RVA)。優(yōu)選地，給予一次推注本發(fā)明的制劑。暴露后預(yù)防的給藥方案是先前未進(jìn)行狂犬病免疫接種的個體在暴露后第0、3、7、14和28天在三角肌通過肌內(nèi)給予5劑狂犬病疫苗。本發(fā)明的制劑應(yīng)在暴露后第0天或者盡可能迅速地給予傷口內(nèi)或傷口周圍，剩余量在遠(yuǎn)離疫苗的部位肌內(nèi)給予。告知未免疫接種的個體給予抗狂犬病病毒抗體。給予治療有效量的抗體，該量對于狂犬病PEP是有效或者至少部分有效的，即狂犬病病毒被中和。另一方面，本發(fā)明提供了藥物單位劑量形式，其包含有效量的本發(fā)明制劑，通過給予對象該劑量形式以暴露后預(yù)防性治療對象。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述對象是人。人可以是成年人或者可以是嬰幼兒。如本文所用，術(shù)語"藥物單位劑量形式"是指適于作為單位劑量給予被治療對象的物理分立單位，每單位含有經(jīng)計算產(chǎn)生預(yù)期治療/預(yù)防作用的預(yù)定數(shù)量的活性化合物以及含有必需的藥物載體、稀釋劑或賦形劑。所述單位劑量形式可以是包含所述制劑的容器。合適的容器包括但不限于密封的安瓿、小瓶、瓶子、注射器和試管。所述容器可以是由各種材質(zhì)制成，例如玻璃或塑料，且可具有無菌存取端(例如該容器可以是具有皮下注射針可穿透的塞子的小瓶)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述容器是小瓶。所述小瓶優(yōu)選包含大約0.3ml至大約3ml體積。優(yōu)選地，所述小瓶含有大約0.1mg至大約2.0mg量的抗狂犬病病毒抗體。在一個實施方案中，所述小瓶每瓶含有共750-2000IU的狂犬病病毒中和單克隆抗體。這種類型的小瓶可適用于給予成人，而每瓶共含有250-750IU狂犬病病毒中和單克隆抗體的小瓶適用于給予嬰幼兒。所述抗體在本發(fā)明的制劑中典型以治療有效量配制?？梢詫o藥方案進(jìn)行調(diào)整以提供最佳的預(yù)期應(yīng)答(例如治療應(yīng)答)。合適的劑量范圍可例如是10-30IU/kg體重，如大約20IU/kg體重。所述藥物單位劑量形式可以存在于試劑盒中，所述試劑盒中進(jìn)一步包含使用說明書。所述試劑盒可進(jìn)一步包括包含藥物可接受的賦形劑的更多容器，且包括為商業(yè)和使用觀點所需的其它材料，包括過濾器、針頭、注射器。與所述試劑盒連帶的是說明書，其通常包含在治療、預(yù)防或診斷產(chǎn)品的商業(yè)包裝中，含有關(guān)于例如與這種治療、預(yù)防或診斷產(chǎn)品的使用相關(guān)的適應(yīng)癥、用法、劑量、制造、給予、禁忌癥和/或警告的信息。在某些實施方案中，所述試劑盒包含使用達(dá)到大約5IU/kg至大約40IU/kg、例如20IU/kg劑量所需的合適體積的說明書。此外，本發(fā)明涉及改善一種制劑中的兩種抗狂犬病病毒單克隆抗體的貯存的方法，通過將抗體(CR57和CR4098或其功能變體)配制成本發(fā)明的液體藥物制劑而進(jìn)行。所述制劑可以在大約2-C至大約4(TC的溫度貯存，例如在大約2-8匸之間貯存。然而，所述制劑也可以在低于2i:的溫度下貯存，例如在大約-20'C、-70。C等溫度貯存。通過將抗體在本發(fā)明的特異制劑中貯存降低了抗體的副產(chǎn)物形成量。就實際應(yīng)用而言，優(yōu)選在混合之前將CR57與CR4098抗體單獨冷凍貯存，例如在-70士10'C冷凍貯存，而終產(chǎn)物(CR57與CR4098的混合劑)優(yōu)選以液體形式在5士3。C貯存。另一方面，本發(fā)明還涉及液體藥物制劑，其包含單一的抗狂犬病病毒單克隆抗體，即抗體CR57或者CR4098或者其一的功能變體。優(yōu)選地，這些制劑包含如上所述的所有特征和賦形劑。因此，在優(yōu)選的實施方案中，它們含有檸檬酸鹽緩沖液(5-25mM)，pH為5.5-6.5，例如pH為大約6.0;含有張力劑(例如氯化鈉，50-250mM，例如大約150mM);包含表面活性劑，例如聚山梨醇酯80(0.0005%-0.05%，例如大約0.01%)，且優(yōu)選基本上是等滲、無菌的并且基本上沒有內(nèi)毒素。下文指出了可能與上述包含兩種不同抗狂犬病病毒單克隆抗體的制劑不同的特征和賦形劑。在某些實施方案中，本發(fā)明的制劑可以包含單一的抗狂犬病病毒單克隆抗體，其量為大約0.1mg/ml至大約6.0mg/ml，典型為大約1.0mg/ml至大約4.0mg/ml，例如大約2.0mg/ml至大約3.0mg/ml。在特定的實施方案中，所述制劑的狂犬病病毒中和效力范圍是大約300IU/mg至大約1600IU/mg，例如是大約500IU/mg至大約1250IU/mg。包含上述單一抗體的制劑可以與另一種組合/混合以獲得包含兩種抗體即抗體混合劑的本發(fā)明制劑。實施例14為了闡述本發(fā)明提供了如下實施例。所述實施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。除非特別指出，通常本發(fā)明采用常規(guī)的化學(xué)、分子生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、免疫學(xué)如抗體技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)多肽制備技術(shù)，如Sambrook，F(xiàn)ritschandManiatis,MolecularCloning:ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)、AntibodyEngineeringProtocols(MethodsinMolecularBiology),volume51,Ed.:PaulS.,HumanaPress(1996)、AntibodyEngineering:APracticalApproach(PracticalApproachSeries,169)，Eds.:McCaffertyJ.a/.，HumanaPress(1996);Antibodies:ALaboratoryManual,HarlowandLane,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1999)以及CurrentProtocolsinMolecularBiology,Eds.Ausubel"a/.，JohnWiley&Sons(1992)中所述技術(shù)。CR57和CR4098抗體的氨基酸序列在表10中示出。這些中和性抗狂犬病病毒抗體的鑒別、克隆、制備與鑒定己經(jīng)在WO2005/118644中詳細(xì)描述。所述抗體以基本相似的方式大規(guī)模生產(chǎn)。將穩(wěn)定表達(dá)抗狂犬病病毒抗體的PER.C6細(xì)胞的起始培養(yǎng)物解凍，培養(yǎng)該細(xì)胞并擴(kuò)增培養(yǎng)物并用于接種生物反應(yīng)器。首先將該生物反應(yīng)器以分批模式(batchmode)運轉(zhuǎn)，隨后以補(bǔ)料分批模式(fed-batchmode)運轉(zhuǎn)。收獲含有各自抗體的培養(yǎng)基并通過離心和過濾澄清，之后進(jìn)行進(jìn)一步下游處理。所述下游純化過程由標(biāo)準(zhǔn)的層析和過濾步驟組成，隨后緩沖液交換成無聚山梨醇酯80的配制緩沖液并濃縮獲得希望的抗體濃度。在加入聚山梨醇酯80和過濾之后，將獲得的藥物物質(zhì)(抗體CR57或者抗體CR4098)在-8(TC貯存直至進(jìn)一步使用。為了生產(chǎn)藥物制品，將藥物物質(zhì)用配制緩沖液稀釋，測量抗體濃度，混合兩種抗體稀釋液并過濾，之后最終填充。為了進(jìn)行穩(wěn)定性研究，制備并分析藥物物質(zhì)(單一抗體)與藥物制品(抗體混合劑)的不同制劑。使用本領(lǐng)域熟知的各種分析方法在不同時間點和溫度分析不同制劑的樣品。使用HPSEC、SDS-PAGE(還原性與非還原性)、蛋白質(zhì)濃度(A280)、正F、外觀、pH和滲透壓評估不同配制緩沖液對于CR57抗體、CR4098抗體及其混合物的穩(wěn)定化作用。HPSEC用于部分評定由于聚集或者蛋白酶解而導(dǎo)致的抗體降解產(chǎn)物的存在情況。SDS-PAGE用于部分評定完整抗體的完整性以及雜質(zhì)和潛在的降解產(chǎn)物的存在情況。測量蛋白質(zhì)濃度以評定所述制劑的蛋白質(zhì)濃度在可接受范圍內(nèi)的保持情況。IEF用于評定所述制劑中可能存在的抗體同種型的存在和完整性并對其進(jìn)行全程監(jiān)測以評定由于脫酰胺作用或者唾液酸喪失而可能發(fā)生的變化?；谀繙y所述制劑的澄清度、顏色和顆粒物的存在觀察其外觀。測量pH以評定所述制劑的pH保持在可接受的大約5.5至大約6.5的范圍內(nèi)。測量滲透壓以評定所述制劑的滲透壓保持在可接受的大約250mOsm/kg至大約350mOsm/kg范圍內(nèi)。在第一項研究中檢測不同的緩沖液系統(tǒng)。為此將在檸檬酸鹽緩沖液中配制的抗狂犬病病毒抗體制劑與在磷酸鹽緩沖液中配制的抗狂犬病病毒抗體制劑進(jìn)行對比。如HPSEC分析所示出，包含在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)或者20mM擰檬酸鹽緩沖液(pH6.5)中的CR57(0.1mg/ml)、CR4098(0.15mg/ml)或CR57(0.1mg/ml)與CR4098(0.15mg/ml)的混合物/混合劑(l:1.5混合物)的制劑在5士3'C/環(huán)境相對濕度、25士2。C/60士5。/。相對濕度以及40±2°。/75±5%相對濕度的條件下貯存直至4周是穩(wěn)定的。通過HPSEC確定，所有制劑均具有>96%的抗體單體純度(面積％)(見圖1-3)。在20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中包含CR57(0.1mg/ml)、CR4098(0,15mg/ml)或者CR57(0.1mg/ml)與CR4098(0.15mg/ml)的混合物(l:1.5混合物)的制劑與相同時間及相同溫度條件下在檸檬酸鹽緩沖液中的制劑相比在40±2°C/75±5%相對濕度貯存直至4周條件下其抗體單體的純度明顯較低(見圖1-3)。當(dāng)將聚山梨醇酯80(0.01%w/v)加入磷酸鹽緩沖液中時，在40士2'C/75士5。/。相對濕度貯存直至4周的條件下，抗體單體的純度進(jìn)一步降低，對于CR4098而言降低至大約70%，對于CR57及混合物而言降低至大約85%(見圖1-3)。該結(jié)果顯然示出單獨的抗體以及抗體混合物的穩(wěn)定性在檸檬酸鹽緩沖液中優(yōu)于在磷酸鹽緩沖液中的穩(wěn)定性。在磷酸鹽緩沖液中，抗體通過斷裂而降解。所述抗體在包含pH6.0和pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液的制劑中相同程度穩(wěn)定。此外，總結(jié)出在磷酸鹽緩沖液中加入聚山梨醇酯80產(chǎn)生額外的抗體雜質(zhì)?；贖PSEC的結(jié)果通過其它分析方法證實，所述其它分析方法包括IEF和SDS-PAGE(還原性和非還原性)傲據(jù)未示出)?；谘芯拷Y(jié)果，檸檬酸鹽緩沖液用作緩沖液系統(tǒng)。為了確定所述制劑的最佳表面活性劑濃度，分析了包含不同聚山梨醇酯80濃度的基于檸檬酸鹽的制劑(見表1)。所述制劑如下制備?；救缟纤鲋苽淇贵wCR57和CR4098(藥物物質(zhì))。將它們用O.lKim濾器過濾。通過A280蛋白質(zhì)濃度測定法測定蛋白質(zhì)濃度在過濾之前與之后是相同的。CR57的濃度為2.5mg/ml，CR4098的濃度為1.0mg/ml。隨后制備含有10mM檸檬酸鹽(pH6.0)禾卩50mM氯化鈉的緩沖液以及含有10mM檸檬酸鹽(pH6.0)、50mM氯化鈉和5%聚山梨醇酯80的緩沖液。如表2所述制備所述制劑。用含有10mM檸檬酸鹽(pH6.0)和50mM氯化鈉的緩沖液達(dá)到終體積。確定所有制劑的滲透壓，加入氯化鈉以使得所述制劑的滲透壓達(dá)到大約300mOsm/kg(等滲的)，即所述制劑中氯化鈉的終濃度為150mM。最后，用0.22nm濾器對所有制劑進(jìn)行過濾，并濾出(400pl)到2mlEppendorf杯中用于所有檢測，除了外觀測試、搖動研究和pH分析之外，其中使用用20mm塞子蓋上并用鋁帽密封的5ml注射瓶(填充2ml樣品)。將所述制劑在5±3。C/環(huán)境相對濕度、25±2°〇/60±5%相對濕度或者40±2"€/75±5%相對濕度條件下貯存在穩(wěn)定性盒中。在指定時間點取兩種樣品，根據(jù)表3所示時間表進(jìn)行分析。如上所述，通過A280蛋白質(zhì)濃度確定法測定蛋白質(zhì)濃度在過濾之前與之后是相同的。HPSEC分析的結(jié)果示于表4。使用等度洗脫方法通過HPSEC分離蛋白質(zhì)成分，這樣可以快速分析和高度分辨蛋白質(zhì)成分，且還具有改善的重復(fù)性。結(jié)果示出在t-0周時，通過HPSEC確定所有制劑的純度均為98-10(P/0。在5土3'C/環(huán)境相對濕度(即2-8-C/環(huán)境相對濕度)條件下，所有制劑在t-13周(以及在t=0與t=13周之間所有中間時間點)均示出與在t=0周相似的純度，表明在這個溫度下的穩(wěn)定性為至少13周。僅制劑2在t=8和t=13周的純度略低于98%。此外，從表4中可以總結(jié)出，所有制劑在25±2'C/60±5%相對濕度在所有時間點均示出純度高于95%，表明所述抗體在這個溫度下也穩(wěn)定至少13周。在升高溫度40±2°0/75±5%相對濕度條件下，所有制劑在前兩周均示出純度>95%，表明所述抗體在這個升高的溫度下可穩(wěn)定至少兩周。在超過兩周的所有時間點，所有制劑均示出純度高于大約卯％，表明所述抗體在這個升高的溫度下相對穩(wěn)定至少13周。這種方法發(fā)現(xiàn)的雜質(zhì)包括抗體單體的聚集體和片段。該結(jié)果進(jìn)一步表明具有0.01。/。(w/v)聚山梨17醇酯80的制劑與具有0.03。/。(w/v)聚山梨醇酯80的相似制劑相比具有較高的純度(對比制劑1與2，制劑3與4，以及制劑5與6的純度)。在這兩種聚山梨醇酯濃度下觀測到相同雜質(zhì)。SDS-PAGE分析的結(jié)果與HPSEC的數(shù)據(jù)一致?；诜沁€原性和還原性SDS-PAGE分析，在5士3'C/環(huán)境相對濕度和25±2°。/60±5%相對濕度條件下貯存的制劑當(dāng)與參考標(biāo)準(zhǔn)對比時示出在所有時間點均無明顯降解跡象，而在40士2'C/75i5。/。相對濕度條件下貯存的制劑在不同時間點示出一些微弱降解(數(shù)據(jù)未示出)。所有制劑在不同聚山梨醇酯80濃度之間未觀測到差異。通過SDS-PAGE對抗體樣品的鑒別僅證實抗體的完整性，但是其未例證抗體的天然或變性狀態(tài)。正F例證了抗體的pl，有助于顯示抗體構(gòu)象的微不均一性。正F與SDS-PAGE的組合是檢測抗體結(jié)構(gòu)和性質(zhì)中微小差異的有力工具?；谡鼺結(jié)果，發(fā)現(xiàn)所有制劑在不同聚山梨醇酯80濃度之間無顯著差異(數(shù)據(jù)未示出)。當(dāng)所述制劑在40±21/75±5%相對濕度條件下貯存時，在t6周時間點觀測到較小的降解(很可能由于脫酰胺作用導(dǎo)致)。對在5±3°。/環(huán)境相對濕度、25土2。C/60i5。/。相對濕度和40±2°C/75±5%相對濕度條件下貯存的所有制劑的澄清度和顏色進(jìn)行目測，示出所述制劑在直至，13周幾乎沒有顆粒，盡管觀測到當(dāng)在較高溫度貯存時具有顆粒的制劑量略有增加。包含CR57和CR4098及0.0P/。(w/v)聚山梨醇酯80的制劑與包含CR57和CR4Q98及0.03n/。(w/v)聚山梨醇酯80的制劑相比含有較少的顆粒。搖動研究表明每個制劑的外觀無差異。所有制劑的pH值在貯存期間在指定溫度和時間無明顯變化。在穩(wěn)定性研究期間，當(dāng)保持在25±2°。/60±5%相對濕度和40±2°C/75±5%相對濕度條件下時，所有制劑的滲透壓數(shù)值均示出極小量增加。包含0.01%(w/v)聚山梨醇酯80的制劑與包含0.03%(>/力聚山梨醇酯80的制劑相比無顯著差異。總之，研究結(jié)果表明單一抗狂犬病病毒抗體以及抗狂犬病病毒抗體的混合物/混合劑在5士3'C/環(huán)境相對濕度、25士2'C/60土5。/。相對濕度和40±2°C/75±5%相對濕度條件下在包含0.0P/。(w/v)聚山梨醇酯80的基于檸檬酸鹽的制劑中在13周后均具有最好的穩(wěn)定性。在進(jìn)一步的研究中，對在5土3'C和-70士1(TC這兩個溫度下貯存的制劑進(jìn)18行研究，所述制劑包含檸檬酸鹽(10mM，pH6.0)、氯化鈉(150mM)、0.01%(w/v)聚山梨醇酯80以及單一抗體CR57(1.2mg/ml)或者CR4098(1.2mg/ml)。將制劑(250pl)填入1.2ml試管中進(jìn)行IEF、SDS-PAGE(還原性和非還原性)和HPSEC分析。對于pH和外觀分析，使用充填2ml制劑的2ml試管。所述制劑在5土3i:或者-70士l(rC貯存在穩(wěn)定性盒中。在指定時間點(l、2和3個月)取樣分析。研究結(jié)果見表5和表6。對在這兩個溫度下的CR57和CR4098制劑的SDS-PAGE分析(還原性和非還原性分析均進(jìn)行)表明抗體的完整性保持至少3個月，與t=0月相比觀測到無額外降解條帶。這些結(jié)果通過IEF和HPSEC這兩種分析證實，示出在5士3'C/環(huán)境相對濕度或者-70士l(TC條件下所述抗體結(jié)構(gòu)和聚集體水平在3個月后與t=0月無差異。另外，蛋白質(zhì)濃度和pH隨著時間無顯著變化。對每個制劑進(jìn)行目測均示出清澈無色液體，幾乎沒有顆粒。對在-70士10'C貯存的制劑在貯存1個月或3個月后進(jìn)行一次額外的冷凍/解凍循環(huán)，基于上述測定示出與t=0月相比無顯著差異，所述測定即SDS-PAGE(還原性和非還原性)、HPSEC、IEF、外觀、OD280和pH(數(shù)據(jù)未示出)?？偠灾Y(jié)果表明抗體CR57和CR4098在5士3'C/環(huán)境相對濕度和在-70±101:條件下在包含檸檬酸鹽緩沖液(10111]^，pH6.0)、聚山梨醇酯80(0.01%w/v)和氯化鈉(150mM)的制劑中是穩(wěn)定的，從而證實上述結(jié)果。另外，在-70士l(TC貯存的抗體樣品在長期貯存后(t^或1=3月)的額外冷凍/解凍循環(huán)對于抗體CR57或CR4098的穩(wěn)定性無影響。在相似的穩(wěn)定性研究中，對在5士3'C和-70士10'C這兩個溫度下貯存超過3個月的制劑進(jìn)行了研究，所述制劑包含檸檬酸鹽(10mM，pH6.0)、氯化鈉(150mM)、0.01。/。(w/v)聚山梨醇酯80和單一抗體CR57(2.47mg/ml)或者CR4098(2.48mg/ml)。通過0.22jnm濾器過濾制劑，并濾出到聚丙烯試管(4ml)中。另外，對在兩個不同溫度即5士3"C和-70il(TC下貯存直至6個月的CR57與CR4098抗體組合進(jìn)行研究，所述組合基于蛋白質(zhì)含量(每種抗體0.3mg/ml，總蛋白質(zhì)濃度為0.6mg/ml)以1:1比率組合。通過0.22nm濾器過濾包含抗體混合劑/混合物的制劑并濾出到玻璃小瓶(2.6ml)中。使用如下分析方法檢測所述制劑SDS-PAGE(還原性和非還原性)、正F、HPSEC、RFFIT、外觀、pH(見表7和表8)。對具有CR57/CR4098組合的制劑還進(jìn)行K/人ELISA和滲透壓檢測(見表9)。此外，確定包含單一抗體或者抗體混合劑的制劑在t-0月的內(nèi)毒素水平。使用膠凝技術(shù)，通過鱟變形細(xì)胞溶解物(LAL)測定法評定內(nèi)毒素水平。包含CR57的制劑含有<0.30EU/ml，包含CR4098的制劑含有<0.30EU/ml，包含兩種抗體的混合劑的制劑含有<0.24EU/ml。將所述制劑在-70士10。C、5土3。C、25士2。C或者40士2。C溫度在穩(wěn)定性盒中貯存指定時間。分析貯存6個月以上的含有單一抗體的制劑并與在t=0月獲得的初始結(jié)果對比。在-70士10。C和5士3。C溫度貯存1、2、3和6個月的CR57和CR4098制劑的正F及SDS-PAGE條帶模式分別與在t=0月的CR57和CR4098制劑的條帶模式相似(見表7和表8)。檢測到無額外條帶。在-70ilO'C和5士3'C溫度貯存6個月的這兩種抗體的HPSEC模式與在t-0月的模式非常相似。"主峰面積>95%"的目標(biāo)說明(targetspecification)在所有情況中均符合。二聚體峰保持<1%(表面面積)，在檢測的任何樣品中均無降解峰?；谶@三種方法獲得的結(jié)果總結(jié)出CR57和CR4098在指定制劑中在-70士1(TC和5土3X:溫度貯存6個月期間均未發(fā)生降解。此外，在-70士1(TC和5士3'C貯存的所述制劑中CR57和CR4098的蛋白質(zhì)含量和pH在6個月的檢測時期均是穩(wěn)定的。效力分析(RFFIT-測定)表明在兩種檢測條件下(即-70士10'C和5士3'C)這兩種抗體在第2、3和6個月時間點與在t-0月和1=1月時間點相比增加的效力值。這種效力的明顯增加是由于在該測定中用作陽性參考的不穩(wěn)定SRIG對照樣品引起的(見Laboratorytechniquesinrabies,Editedby:F.畫X.Meslin,M.M.KaplanandH.Koprowski(1996)，她edition,Chapters15-17，WorldHealthOrganization,Geneva.)。這種作用通過將該結(jié)果表示為50%中和終點效價而消除(數(shù)據(jù)未示出)?；谶@些結(jié)果總結(jié)出指定制劑中CR57和CR4098在這兩種貯存條件下示出直至至少6個月的穩(wěn)定終點效價及因此的穩(wěn)定效力?？傊谶@些結(jié)果認(rèn)為在包含檸檬酸鹽(10mM，pH6.0)、氯化鈉(150mM)和0.0P/。(w/v)聚山梨醇酯80的制劑中CR57和CR4098在-70±10°C的實時貯存條件下穩(wěn)定至少6個月以及在5士3。C的加速條件下穩(wěn)定至少6個月。分析在更長期貯存后的穩(wěn)定性?；赟DS-PAGE(NR+R)、正F、HP-SEC、RFFIT和OD280獲得的穩(wěn)定性結(jié)果總結(jié)出在包含檸檬酸鹽(10mM，pH6.0)、氯化鈉(150mM)和0.01。/。(w/v)聚山梨醇酯80的制劑中CR57和CR4098在-70士l(rC貯存條件下穩(wěn)定至少18個月以及在5士3"C加速條件下穩(wěn)定至少12個月(在9個月后發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果，數(shù)據(jù)未示出)。分析貯存超過6個月的含有抗體CR57和CR4098的混合劑的制劑并與在t=0月獲得的初始結(jié)果對比。6個月后，在5±3°〇和25士2X:貯存的所述混合劑的外觀保持在目標(biāo)說明范圍內(nèi)，即所述混合劑/混合物是澄清無色液體，幾乎沒有顆粒(見表9)。此外，觀測到當(dāng)在40士2'C貯存直至3個月時所述抗體混合劑仍保持在目標(biāo)說明范圍內(nèi)。監(jiān)測在5士3"C和25士2'C在t=0月和t=6月的pH和滲透壓，以及在40"C士2-C的1和3個月時間點的pH和滲透壓。所有數(shù)據(jù)均在目標(biāo)說明范圍內(nèi)。此外，所述抗體混合劑示出在5土3'C和25士2i:直至6個月的穩(wěn)定效力(見表9)。在40士2'C忙存3個月后獲得略微降低的效力值。所有數(shù)據(jù)均在大約380至大約1350IU/ml的目標(biāo)說明范圍內(nèi)。如通過OD280確定，所述抗體混合劑中存在的總蛋白質(zhì)量在40土2'C貯存3個月以及在5士3'C和25士2'C貯存6個月期間是穩(wěn)定的。IgGK和XELISA結(jié)果(即以抗體混合劑中兩種抗體的比率表示)在5±3。C和25士2X:溫度貯存直至6個月保持在目標(biāo)說明范圍內(nèi)，在40i2'C貯存直至3個月保持在目標(biāo)說明范圍內(nèi)?；谶@些結(jié)果總結(jié)出抗體混合劑中CR57和CR4098含量在5士3'C和25士2'C貯存6個月以及在40士2。C貯存3個月期間不改變。在5士3。C貯存6個月的抗體混合劑的正F凝膠模式與在t=0月時相似(見表9)。在25土2X:it存的樣品中在3和6個月后觀測到額外條帶，在40士2'C貯存的樣品中在1和3個月后檢測到幾條額外條帶(見表9)。在升高的貯存溫度獲得的這些額外條帶可能是降解的最初指征。6個月后，在5士3'C貯存的抗體混合劑的SDS-PAGE(還原性和非還原性)條帶模式與在t=0月的條帶模式相似(見表9)。經(jīng)檢測無額外條帶。在25土2T:貯存直至3個月的抗體混合劑在還原性SDS-PAGE條件下示出與在t=0月的條帶模式相同的條帶模式。在非還原性條件下，在25士2'C貯存321個月后觀測到大小為大約43kDa的微弱條帶。在25士2。C貯存6個月后，還原性和非還原性SDS-PAGE分析示出40kDa的微弱條帶。通過SDS-PAGE分析(還原性和非還原性)在40士2。C貯存的抗體混合劑獲得相似結(jié)果。此外，在這個貯存條件下檢測到大小為10-15kDa的較小條帶?；谶@些結(jié)果總結(jié)出在25士2t:和40土2'C溫度下CR57和CR4098的重鏈和/或輕鏈隨時間可能發(fā)生一些降解。在5士3'C和在25士2'C溫度貯存直至6個月的抗體混合劑的HPSEC模式與在t=0月時的模式非常相似。"主峰面積>95%"的目標(biāo)說明在所有情況中均符合(見表9)。二聚體峰保持<1%(表面面積)，在檢測的任何樣品中均無降解峰。與在所述兩個較低溫度下貯存的抗體混合劑相比，在40士2"C貯存的抗體混合劑在3個月后示出較少降解，以及略微增加的二聚體峰(2.6%(表面面積))。然而，即使在40i2'C，"主峰面積>95%"的目標(biāo)說明在檢測的所有貯存時期均符合(見表9)?；诤笕N方法獲得的結(jié)果總結(jié)出在5士3。C或者25±2"溫度貯存6個月期間所述抗體混合劑中的抗體未發(fā)生明顯降解，在40士2。C溫度貯存直至3個月后觀測到一些較微弱的聚集和降解。簡而言之，總結(jié)出所述抗體混合劑在5士3'C及25士2。C貯存條件下穩(wěn)定至少6個月，在40士2-C貯存條件下穩(wěn)定至少3個月?；?2個月后通過SDS-PAGE(NR+R)、IEF、HP-SEC、RFFIT、k/XELISA獲得的結(jié)果(在9個月后獲得相似結(jié)果;數(shù)據(jù)未示出)總結(jié)出所述抗體混合劑在5土3'C貯存條件下穩(wěn)定至少12個月?；?8個月后的分析測定獲得的結(jié)果(SDS-PAGE、IEF、HP-SEC、ELISA;數(shù)據(jù)未示出)總結(jié)出所述抗體混合劑在5士3'C貯存條件下穩(wěn)定至少18個月。22表l:抗體制劑的成分<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表3:在指定時間點利用指定方法對各種制劑樣品的分析<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表4:通過HPSEC確定的抗體單體的純度(面積。/。)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表6:在指定時間點利用指定方法對各種制劑樣品的分析<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>+:認(rèn)可的(清澈無i3且?guī)缀鯚oS頃粒)ND:未確定表7:CR57的穩(wěn)定性檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>NDND:未確定#:CR57工作標(biāo)準(zhǔn)(WS)和CR4098WS+:符合目標(biāo)說明表8:CR4098的穩(wěn)定性檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>ND:未確定#:CR57工作標(biāo)準(zhǔn)(WS)和CR4098WS+:符合目標(biāo)說明表9:抗體混合劑的穩(wěn)定性檢測檢測目標(biāo)說明貯存條件1=0月1個月2個月3個月6個月12個月滲透壓300±50mOsmol/kg50C307NDNDND31031525°CNDNDNDND314ND40°CND308ND312NDNDpH6±0.55°C5.7NDNDND5.75.725°CNDNDNDND5.7ND40°CND5.7ND5.8NDND外觀潔澈無色液體，幾乎無顆粒5°C++++++25°CND+++ND40°CND+ND+NDNDOD280湖!l得的數(shù)量0.48"0.72mg/ml5°C0.600.600.600.610.600.6125°CND0.610.600.600.60ND40。CND0.62ND0.60NDNDCR57/CR4098比率0.6-1.450C0.90.80.90.90.91.025°CND0.80.90.90.9ND40°CND0.8ND0.9NDND非還原性SDS-PAGE條帶模式與wss相當(dāng)且不含有其它雜質(zhì)條帶5°C++++++250CND++ND40oCND+2ND+NDND還原性SDS-PAGE條帶模式與ws#相當(dāng)且不含有其它雜質(zhì)條帶5°C++++++25°CND++++4ND40°CND+2ND+NDNDHP-SEC主峰面積％>95%5。C99.610099.599.599.999.225°CND99.699.599.599.4ND40°CND99.0ND95.1(degr.peakof2.6%)NDNDIEF條帶模式符合ws#(報道含有其它條帶)5。C++++++25°CND+++6+ND40。CND+8ND+9NDND28效力380-1350IU/ml5°C10069331089140199983025°CND93710151001847ND40°CND807ND621NDND無菌性符合5。C+NDNDNDND+ND:未確定#:工作標(biāo)準(zhǔn)(WS)CR57和CR4098抗體混合劑+:符合目標(biāo)說明+1:清澈無色液體，>10個顆粒/ml+2:條帶模式與WS^相當(dāng)且含有微弱的其它雜質(zhì)條帶，大小為大約43kDa+3:條帶模式與WStf相當(dāng)且含有微弱的其它雜質(zhì)條帶，大小為大約IO、15和43kDa+4:偏差、微弱條帶看起來為大約40kDa+5:條帶模式與WS弁相當(dāng)且含有微弱的其他雜質(zhì)條帶，大小為大約10kDa、15kDa以及25-50kDa+6:條帶模式符合WS#;在8.0-8.5pi區(qū)域的較高染色強(qiáng)度+7:偏差、微弱條帶看起來低于pl7.5,在8.0-8.5pl區(qū)域的不同染色強(qiáng)度+8:條帶模式符合WS弁以及微弱的其它條帶(p17.2,7.3,8.6)+9:條帶模式符合WS弁以及微弱的其它條帶(pl范圍6.3-7.4和pl8.6)29<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>權(quán)利要求1.兩種抗狂犬病單克隆抗體的藥物制劑，其在大約2℃至大約8℃之間的溫度下穩(wěn)定至少12個月，所述制劑包含(i)抗狂犬病病毒單克隆抗體CR59(重鏈SEQIDNO1和輕鏈SEQIDNO2)或者與其序列至少95％同源且能競爭結(jié)合由CR59識別的靶并具有狂犬病病毒中和活性的抗體；及(ii)抗狂犬病病毒單克隆抗體CR4098(重鏈SEQIDNO3和輕鏈SEQIDNO4)或者與其序列至少95％同源且能競爭結(jié)合由CR4098識別的靶并具有狂犬病病毒中和活性的抗體；其中所述制劑包含檸檬酸鹽緩沖液、張力劑和表面活性劑。2.權(quán)利要求1的制劑，其中所述檸檬酸鹽緩沖液的濃度為大約5mM至大約25mM、優(yōu)選大約10mM。3.權(quán)利要求1或2的制劑，其中pH范圍是從大約5.5至大約6.5，優(yōu)選所述pH為大約6.0。4.權(quán)利要求1-3任一項的制劑，其中所述張力劑是氯化鈉，其濃度為大約50mM至大約250mM優(yōu)選大約150mM。5.權(quán)利要求1-4任一項的制劑，其中所述表面活性劑是聚山梨醇酯、優(yōu)選聚山梨醇酯80。6.權(quán)利要求5的制劑，其中所述聚山梨醇酯80的存在量為大約0.005%w/v至大約0.05%w/v、優(yōu)選大約0.01%w/v。7.前述任一項權(quán)利要求的制劑，其中所述制劑的滲透壓為大約250mOsm/kg至大約350mOsm/kg，優(yōu)選其中滲透壓為大約300mOsm/kg。8.前述任一項權(quán)利要求的制劑，其中所述兩種抗狂犬病病毒單克隆抗體每一種的量為木約0.1mg/ml至大約2.0mg/ml。9.前述任一項權(quán)利要求的制劑，其中所述制劑的狂犬病病毒中和效力為大約250IU/ml至大約1500IU/ml。10.前述任一項權(quán)利要求的制劑，其中所述兩種抗體的比率在5:1與1:5之間，優(yōu)選在2:1與l:2之間，例如是大約l:l。11.前述任一項權(quán)利要求的制劑，其中所述制劑是無菌的。12.前述任一項權(quán)利要求的制劑，其中所述制劑基本上沒有內(nèi)毒素。13.前述任一項權(quán)利要求的制劑，其中在40士2。C溫度及相對濕度75士5。/。條件下貯存兩周后通過HPSEC確定的所述制劑的抗體單體的純度為至少95%。14.一種包含有效量的前述任一項權(quán)利要求的制劑的藥物單位劑量形式，通過給予對象該劑型以在暴露后預(yù)防性治療該對象。15.—種改善一種制劑中兩種抗狂犬病病毒單克隆抗體的貯存的方法，包括將所述抗體配制為權(quán)利要求1-13任一項的藥物制劑。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述制劑貯存在大約2'C至大約40°C，優(yōu)選大約2'C至大約8'C。17.權(quán)利要求15或16的方法，其中所述抗體副產(chǎn)物形成量降低。18.權(quán)利要求17的方法，其中通過HPSEC測量在大約2。C至大約8°C溫度貯存12個月內(nèi)，5%或者更少的抗體形成聚集體。19.抗狂犬病病毒單克隆抗體CR59(重鏈SEQIDNO:l和輕鏈SEQIDNO:2)或者與其具有至少95%的序列相同性且能競爭結(jié)合CR59識別的靶并具有狂犬病病毒中和活性的抗體的藥物制劑，該制劑在大約2"C與大約8'C之間以及在大約"60'C與-80'C之間的溫度下穩(wěn)定至少18個月，其中所述制劑包含擰檬酸鹽緩沖液、張力劑和表面活性劑。20.抗狂犬病病毒單克隆抗體CR4098(重鏈SEQIDNO:3和輕鏈SEQIDNO:4)或者與其具有至少95%的序列相同性且能競爭結(jié)合CR4098識別的靶并具有狂犬病病毒中和活性的抗體的藥物制劑，該制劑在大約2'C與大約8。C之間以及在大約-6(TC與-8(rC之間的溫度下穩(wěn)定至少18個月，其中所述制劑包含檸檬酸鹽緩沖液、張力劑和表面活性劑。全文摘要本發(fā)明提供了包含抗狂犬病病毒抗體的藥物抗體制劑，特別是液體藥物制劑。所述制劑可用于狂犬病的暴露后預(yù)防中。文檔編號C07K16/00GK101557799SQ200780044844公開日2009年10月14日申請日期2007年12月4日優(yōu)先權(quán)日2006年12月5日發(fā)明者A·B·H·巴克,W·E·馬里森申請人:克魯塞爾荷蘭公司