狂犬病活疫苗和制備狂犬病口服活疫苗的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了狂犬病活疫苗和制備狂犬病口服活疫苗的方法?？袢』钜呙绨嚎袢RAg3m病毒?？袢《綞RAg3m毒株是通過反向遺傳學方法將狂犬病毒ERA株進行改造獲得的，安全性高，由此含有該狂犬病ERAg3m病毒可以進一步提高狂犬病活疫苗的免疫效力。
【專利說明】狂犬病活疫苗和制備狂犬病口服活疫苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，本發(fā)明涉及狂犬病活疫苗和制備狂犬病口服活疫苗的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]狂犬病(Rabies)又叫瘋狗病或恐水癥，是由狂犬病病毒(Rabies virus)引起的人獸共患急性傳染病?？袢≈饕绊懼袠猩窠?jīng)系統(tǒng)，人一旦發(fā)病，目前尚沒有有效的臨床治療方法，是迄今人類唯一病死率高達100%的急性傳染病。全世界每年約有55000人死于狂犬病，我國自2003年后每年狂犬病死亡人數(shù)均超過2000人，雖然我國每年投入防控狂犬病的費用超過100億，投入費用位居世界第一，防治效果卻是全球倒數(shù)第二，僅次于印度?？袢《镜膫鞑ヒ呀?jīng)嚴重影響到我國的公共衛(wèi)生安全，已成為一個非常突出的社會問題。
[0003]我國現(xiàn)有的狂犬病疫苗為采用Flury株在BHK21細胞上轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)的弱毒活疫苗以及滅活疫苗。Flury弱毒活疫苗因為存在可能的毒力返強以及腦內(nèi)感染致死性，現(xiàn)已基本停止生產(chǎn)。滅活疫苗主要是采用轉(zhuǎn)瓶或微載體生產(chǎn)病毒抗原，然后濃縮、純化，加入佐劑制成，由于生產(chǎn)病毒的滴度低，達到免疫效力要求需要濃縮的倍數(shù)高，如轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)需要濃縮30-50倍；同時，由于細胞和病毒培養(yǎng)時加入2~10%的牛血清，導(dǎo)致下游純化難度加大，所制備的滅活疫苗生產(chǎn)成本高，現(xiàn)有疫苗的銷售價格都在20元/頭份以上，導(dǎo)致各級政府采購成本居高不下，難以大規(guī)模推廣。國外現(xiàn)有的針對犬貓的狂犬病疫苗為采用肌肉注射的滅活疫苗，質(zhì)量較好，但價格昂貴。而采用口服疫苗，優(yōu)勢明顯:一是改變傳統(tǒng)疫苗制劑方式，采用口服，更易于擴大免疫覆蓋范圍，實現(xiàn)大范圍對寵物犬和貓的免疫；二是可避免某些寵物，特別是大型犬和烈性犬注射免疫時可能對人造成的傷害；三是成本低，易于推廣；四是采用緩釋技術(shù)，免疫保護期較常規(guī)疫苗更長。
[0004]我國犬貓的飼養(yǎng)數(shù)目龐大，據(jù)估計可能超過2億只，這其中包括大量的流浪犬和農(nóng)村犬。采用肌肉注射免疫需要將犬保定，對于 大型犬和烈性犬，特別容易傷害到進行免疫注射的醫(yī)務(wù)人員，加上流浪犬難以捕捉，因此采用肌肉注射某些時候難以進行。而口服疫苗卻能很好地解決這一問題，對于大型犬、烈性犬和流浪犬只需將疫苗投撒在飼料中進行飼喂就可以起到免疫預(yù)防的作用，易于推廣。
[0005]國外成功消滅狂犬病的經(jīng)驗是推行野生動物口服狂犬病疫苗，原因在于大多數(shù)的歐美國家狂犬病毒的傳播主要是通過野生動物如狐貍、浣熊等自然宿主傳播，而我國狂犬病毒的主要傳播途徑卻是通過寵物犬的咬傷、舔舐以及人與寵物犬的親密接觸如親吻等，因此我國防控狂犬病的首要措施就是切斷寵物犬對人狂犬病毒的傳播，對犬實現(xiàn)70%以上的免疫，包括流浪犬以及農(nóng)村犬。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種狂犬病活疫苗和制備狂犬病口服活疫苗的方法，該疫苗可有效用于野生動物，如流浪犬等動物的免疫預(yù)防。
[0007]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列研究而完成的:發(fā)明人首先利用反向遺傳學方法將狂犬病毒ERA株進行改造，獲得了一株安全性極高的基因工程毒株，利用該毒株結(jié)合微球技術(shù)和誘餌技術(shù)研制出一種口服疫苗，該疫苗可用于野生動物，如流浪犬等動物的免疫預(yù)防。根據(jù)本發(fā)明實施例，狂犬病毒ERAg3m毒株是通過反向遺傳學方法得到，可用作口服活疫苗生產(chǎn)用毒株，安全性高，免疫效力好。
[0008]為此在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了一種狂犬病活疫苗，包含:狂犬病ERAg3m病毒。由此可以進一步提高狂犬病活疫苗的免疫原性。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述狂犬病活疫苗中狂犬病ERAg3m病毒的濃度為lX 109 0TCID50/mL.由此可以進一步提高狂犬病活疫苗的免疫原性。
[0010]在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了一種制備狂犬病口服活疫苗的方法，該方法包括如下步驟:
[0011]I)利用BHK21細胞對狂犬病ERAg3m病毒進行全懸浮培養(yǎng)，以便獲得狂犬病ERAg3m病毒溶液；
[0012]2)將所述狂犬病ERAg3m病毒溶液與殼聚糖溶液和三聚磷酸鈉溶液進行混合，以便制備得到殼聚糖納米微球；以及
[0013]3)將所述殼聚糖納米微球進行誘餌包裹，以便制備得到所述狂犬病口服活疫苗。
[0014]由此可以有效制備得到狂犬病口服活疫苗，該狂犬病口服活疫苗食用方便，免疫原性強，將狂犬病口服活疫苗制備成微球的形式可以有效保持狂犬病ERAg3m病毒的免疫原性，以便進一步提高狂犬病口服活疫苗免疫性。
[0015]另外，根據(jù)本發(fā)明上述實施 例的制備狂犬病口服活疫苗的方法還可以具有如下附加的技術(shù)特征:
[0016]根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟2)中，將所述狂犬病ERAg3m病毒溶液加入到殼聚糖醋酸溶液中；再將殼聚糖和狂犬病ERAg3m病毒混合溶液加入到三聚磷酸鈉水溶液中，混合均勻并離心處理，以便獲得含有疫苗抗原的納米微球。由此可以進一步提高制備殼聚糖納米微球效果。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述全懸浮培養(yǎng)是在37攝氏度的溫度下培養(yǎng)36小時而完成的。由此可以進一步提高狂犬病ERAg3m病毒繁殖效率，以便進一步提高制備狂犬病口服活疫苗的效率。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述狂犬病ERAg3m病毒溶液的濃度高于I X IO8 tlTCID5ci/ml。由此可以進一步提高狂犬病口服活疫苗的免疫原性。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述殼聚糖溶液中殼聚糖的濃度為0.1%-10%w/v,所述殼聚糖溶液的溶劑是濃度為1%的醋酸；所述三聚磷酸鈉溶液的濃度為0.1%-5%w/v,由此可以進一步提高制備殼聚糖納米微球的效率和質(zhì)量。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述離心處理是在4攝氏度、15000~18000rpm的條件下離心30分鐘而完成的。由此可以進一步提高制備殼聚糖納米微球的效率和質(zhì)量。
[0021 ] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，將所述殼聚糖納米微球進行誘餌包裹之前，進一步包括:向所述殼聚糖納米微球中加入MEM溶液，以便使得所述殼聚糖納米微球中所述狂犬病ERAg3m病毒的濃度為lX109_°TCID5(l/ml。由此可以進一步提高殼聚糖納米微球中的狂犬病ERAg3m病毒的濃度，以便進一步提高狂犬病口服活疫苗的免疫原性。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述誘餌包裹進一步包括:將所述殼聚糖納米微球加入到融化的蠟中進行第一誘餌包裹并晾干，以便得到第一殼聚糖納米微球包裹物；將所述封蠟的殼聚糖納米微球加入到豬油與蠟的混合液體中進行第二誘餌包裹并晾干，以便得到第二殼聚糖納米微球包裹物；以及將所述第二殼聚糖納米微球包裹物加入到豬肉聚合物中進行混勻并定型，以便制備得到所述狂犬病口服活疫苗。由此可以進一步提高狂犬病口服活疫苗的易食性和使用率。
[0023]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0025]圖1是根據(jù)本發(fā)明的另一個實施例的制備狂犬病口服疫苗的方法中制備狂犬病ERAg3m病毒的克隆方法示意圖。
[0026]圖2是根據(jù)本發(fā)明的一個實施例制備狂犬病口服活疫苗的方法的流程圖。
【具體實施方式】
[0027]下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相 同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了一種狂犬病活疫苗，根據(jù)本發(fā)明的實施例，該狂犬活疫苗包含:狂犬病ERAg3m病毒。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，狂犬病毒ERAg3m毒株是通過反向遺傳學方法將狂犬病毒ERA株進行改造獲得的，安全性高，由此含有該狂犬病ERAg3m病毒可以進一步提高狂犬病活疫苗的免疫效力。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，上述狂犬病活疫苗中狂犬病ERAg3m病毒的含量并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，狂犬病活疫苗中狂犬病ERAg3m病毒的濃度可以為I X 109_ °TCID50/ml。由此可以進一步提高狂犬病活疫苗的免疫效力。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，上述狂犬病活疫苗表達編碼狂犬病ERAg3m病毒的糖蛋白，并且狂犬病ERAg3m病毒糖蛋白具有下列突變:信號肽第2位的氨基酸缺失；信號肽的第3位的氨基酸缺失；第333位氨基酸由精氨酸突變?yōu)楣劝彼?；缺失psi假基因區(qū)；所述糖蛋白的G基因插入M基因之如。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，上述狂犬病ERAg3m病毒突變糖蛋白具有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。SEQ ID NO:1氨基酸序列為:
[0032]MQALLFVPLLVFPLCFGKFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCP
[0033]NNLVVEDEGCTNLSGFSYMELKVGYILAIKMNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYRWLRTVKTTKESLVIISPSVADLDPYDRSLHSRVFPSGKCSGVAVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSNETKffCPPDQL[0034]VNLHDFRSDEIEHLVVEELVRKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVETWNEILPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVLIPEMQSSLLQQHMELLESSVIPLVHPLADPSTVFKD⑶EAEDFVEVHLPDVHNQVSGVDLGLPNWGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGETRL。
[0035]根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，上述突變株的基因組中包含SEQ IDNO:2所示核苷酸序列。SEQ ID NO:2核苷酸序列為:
【權(quán)利要求】
1.一種狂犬病活疫苗，其特征在于，包含:狂犬病ERAg3m病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的狂犬病活疫苗，其特征在于，所述狂犬病活疫苗中狂犬病ERAg3m 病毒的濃度為 lX109 °TCID5Q/ml。
3.一種制備狂犬病口服活疫苗的方法，其特征在于，包括: 1)利用BHK21細胞對狂犬病ERAg3m病毒進行全懸浮培養(yǎng)，以便獲得狂犬病ERAg3m病毒溶液； 2)將所述狂犬病ERAg3m病毒溶液與殼聚糖溶液和三聚磷酸鈉溶液進行混合，以便制備得到殼聚糖納米微球；以及 3)將所述殼聚糖納米微球進行誘餌包裹，以便制備得到所述狂犬病口服活疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟2)中，將所述狂犬病ERAg3m病毒溶液加入到殼聚糖醋酸溶液中； 將含有殼聚糖和狂犬病ERAg3m病毒的混合溶液加入三聚磷酸鈉水溶液，混合均勻并離心處理，以便獲得含有疫苗抗原的納米微球。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述全懸浮培養(yǎng)是在37攝氏度的溫度下培養(yǎng)36小時而完成的。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述狂犬病ERAg3m病毒溶液的濃度高于lX108°TCID5(l/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述殼聚糖醋酸溶液中殼聚糖的濃度為0.1%-10%w/v，所述殼聚糖醋酸溶液的溶劑是濃度為1%的醋酸；所述三聚磷酸鈉水溶液的濃度為 0.1%-5%w/v。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述離心處理是在4攝氏度、15000~18000rpm的條件下離心30分鐘而完成的。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3)中的將所述殼聚糖納米微球進行誘館包裹之前，進一步包括: 向所述殼聚糖納米微球中加入MEM溶液，以便使得所述殼聚糖納米微球中所述狂犬病ERAg3m 病毒的濃度為 lX109 °TCID5Q/ml。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3)中的所述誘餌包裹進一步包括: 將所述殼聚糖納米微球加入到融化的蠟中進行第一誘餌包裹并晾干，以便得到第一殼聚糖納米微球包裹物； 將所述封蠟的殼聚糖納米微球加入到豬油與蠟的混合液體中進行第二誘餌包裹并晾干，以便得到第二殼聚糖納米微球包裹物；以及 將所述第二殼聚糖納米微球包裹物 加入到豬肉聚合物中進行混勻并定型，以便制備得到所述狂犬病口服活疫苗。
【文檔編號】A61P31/14GK103877570SQ201410056975
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月19日
【發(fā)明者】熊煒, 高楊, 劉延亭, 劉俊生, 李耀東, 鄭杰 申請人:北京中聯(lián)康生物科技有限公司