專利名稱：用作蛋白激酶抑制劑的苯乙酰胺類的制作方法
專利說明用作蛋白激酶抑制劑的苯乙酰胺類 本發(fā)明涉及苯乙酰胺衍生物；其作為蛋白激酶抑制劑的用途；包含所述化合物的新藥物制劑；用于診斷性或治療性地處理動物(尤其是人類)的所述化合物；其在治療疾病或制備用于治療對蛋白激酶調(diào)節(jié)有響應(yīng)的疾病的藥物制劑中的用途；藥物制劑，例如包含所述化合物的用于治療對蛋白激酶調(diào)節(jié)有響應(yīng)的疾病的藥物制劑；治療方法，其包括對溫血動物施用所述化合物；和/或所述化合物的制備方法。

背景技術(shù)：
蛋白激酶可以分為受體型激酶和非受體型激酶，以及酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸激酶。根據(jù)其定位，可分為與細胞核、細胞質(zhì)和細胞膜相關(guān)聯(lián)的激酶。與細胞膜相關(guān)聯(lián)的酪氨酸激酶經(jīng)常同時是生長因子的受體。
蛋白激酶(PK)是催化細胞蛋白中特定的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基磷酸化的酶。這些底物蛋白的翻譯后修飾充當(dāng)了調(diào)控細胞增殖、活化和/或分化步驟的分子開關(guān)。在許多疾病階段、包括良性和惡性增殖病癥中，已經(jīng)觀察到了異?；蜻^度的或更概括地講是不適宜的PK活性。通過利用PK抑制劑，在許多情況下體外治療和在許多情況下體內(nèi)治療疾病，例如增殖性病癥，已經(jīng)成為可能。
蛋白激酶抑制劑的數(shù)目很大。此外，存在大量增殖性的和其它PK相關(guān)的疾病。在一些情況下，被治療的疾病發(fā)展出對于治療劑的抗藥性。此外，一些病人需要非常特異性的治療。因此，仍然需要提供可用作PK抑制劑并因此可用于治療這些蛋白酪氨酸激酶(PTK)相關(guān)疾病的新類型的化合物，以豐富現(xiàn)有的有效藥物。所需要的正是藥用有效的抑制PK的新類型化合物。
費城染色體是慢性骨髓性白血病(CML)的標志并且攜帶包含bcr基因N-末端外顯子和c-abl基因主要的C-末端部分(外顯子2-11)的雜合基因。該基因產(chǎn)物是210kD的蛋白(p210 Bcr-Abl)。Bcr-Abl蛋白的Abl部分包含abl-酪氨酸激酶，其受到野生型c-abl的嚴格調(diào)控，但是在Bcr-Abl融合蛋白中組成型激活。該失控的酪氨酸激酶與多種細胞信號通路發(fā)生作用，導(dǎo)致細胞的轉(zhuǎn)化與失控的增殖(Lugo等人，Science 247，1079[1990])。Bcr-Abl蛋白的突變型也已被鑒定。Bcr-Abl突變型的詳細綜述已經(jīng)發(fā)表(Cowan-Jones等人，Mini Reviews in Medicinal Chemistry，2004，4285-299)。通過c-abl和其突變體的抑制劑的治療可用于白血病，例如AML和CML。
c-Kit是屬于PDGF受體家族的酪氨酸激酶受體，通過結(jié)合其配體SCF(干細胞因子)而活化。已經(jīng)在例如一組不同的原發(fā)性實體瘤中研究了c-kit的表達譜。特別是在肉瘤、胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)、精原細胞瘤和類癌中發(fā)現(xiàn)了kit的高表達(Weber等人，J.Clin.Oncol.22(14S)，9642(2004))。GIST是非上皮腫瘤，在診斷學(xué)上可與其它普通類型的腸癌區(qū)分開。多發(fā)生于胃，較少發(fā)生于小腸且更少發(fā)生在食道。可觀察到向肝臟、網(wǎng)膜和腹腔的傳播。GIST可能源自腸卡扎爾細胞(ICC)，ICC通常構(gòu)成部分腸自主神經(jīng)系統(tǒng)并參與腸蠕動的控制。多數(shù)GIST(50-80％)是由c-kit基因突變產(chǎn)生。在腸中，c-kit/CD117染色陽性可能就是GIST。c-kit的突變可使c-kit功能不依賴于SCF的激活，導(dǎo)致高細胞分裂速率并且可能導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性。在肥大細胞瘤以及肥大細胞增生病和相關(guān)的骨髓增生綜合征及色素性蕁麻疹中也能觀察到c-kit的異常。在急性骨髓性白血病(AML)和惡性淋巴瘤中也可觀察到c-kit的表達和/或異常。在小細胞支氣管癌、精原細胞瘤、無性細胞瘤、睪丸上皮內(nèi)瘤樣病變、黑色素瘤、乳房癌、神經(jīng)母細胞瘤、尤因肉瘤、某些軟組織的肉瘤和乳頭狀/濾泡狀甲狀腺癌中也能證實c-kit的表達(參見Schütte等人，innovartis 3/2001)。
已知RET(在轉(zhuǎn)染過程中重排)原癌基因的遺傳突變例如可使2型多發(fā)性內(nèi)分泌瘤病(MEN 2)的病人發(fā)生腫瘤，其可引起嗜鉻細胞瘤、甲狀腺髓樣癌和甲狀旁腺的增生/腺瘤(參見Huang等人，Cancer Res.60，6223-6(2000))。在患有MEN 2的病人中，通常可鑒定到RET的種系突變和有時在三體10中突變的RET等位基因的重復(fù)或野生型RET等位基因的丟失，并被認為可以激活，即引起受體的不依賴配體的二聚化。
血小板衍生生長因子受體例如PDGFR-α和-β也是跨膜的酪氨酸激酶受體。通過結(jié)合由兩個A、兩個B或一個A和一個B鏈的異源二聚體形成的配體(PDGF-A、PDGF-B或PDGF-AB)，該受體發(fā)生二聚化且其酪氨酸激酶被激活。這引起下游的信號傳導(dǎo)并因此支持腫瘤生長。該基因的突變使受體不依賴于配體結(jié)合而激活并顯示出對腫瘤形成的驅(qū)動力。GIST還可能具有血小板衍生生長因子受體-α(PDGRF)基因的激活突變的特征?？杉せ頟DGFR的生長因子，即PDGF，其表達可在多種不同的腫瘤細胞系，特別是在乳房、結(jié)腸、卵巢、前列腺的腺癌、肉瘤和成膠質(zhì)細胞瘤的細胞系中觀察到。在這些腫瘤中，腦腫瘤和前列腺癌(包括腺癌和骨轉(zhuǎn)移)特別值得關(guān)注。關(guān)于惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤(星形細胞瘤/成膠質(zhì)細胞瘤)也存在令人感興趣的數(shù)據(jù)。在隆突性皮膚纖維肉瘤(一種遺傳學(xué)特征為Iα1型膠原(COLIA1)與PDGF-A融合的軟組織腫瘤)的治療中也獲得了令人感興趣的臨床前數(shù)據(jù)。
已知VEGFR(血管內(nèi)皮生長因子受體)參與血管生成的啟動的控制。由于實體瘤特別依賴于良好的血液供應(yīng)，所以抑制VEGFR并抑制血管生成正在進行治療這類腫瘤的臨床研究，其表現(xiàn)出有希望的結(jié)果。VEGF也是白血病和淋巴瘤的主要參與者并在多種實體惡性腫瘤中高表達，與惡性疾病的進展密切相關(guān)。具有VEGFR-2(KDR)表達的腫瘤疾病的實例是肺癌、乳腺癌、非霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、惡性胸膜間皮瘤和黑色素瘤。除了其血管生成的活性外，VEGFR的配體，即VEGF，可通過在腫瘤細胞中直接的促存活作用來促進腫瘤生長。多種其它疾病也與血管生成失控有關(guān)，例如如下所述。
FLT3是III型受體酪氨酸激酶(RTK)家族的成員。FLT3(fms樣酪氨酸激酶)也稱為FLk-2(胎肝激酶2)。FLT3基因的異常表達特別是在成人與兒童白血病中已被證實，包括急性骨髓性白血病(AML)、伴有三系骨髓發(fā)育不良的AML(AML/TMDS)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)和骨髓增生異常綜合征(MDS)以及MLL(混合性白血病)。FLT3受體的激活突變已經(jīng)在約35％的急性骨髓性白血病(AML)患者中發(fā)現(xiàn)，并與預(yù)后不良有關(guān)。最常見的突變涉及近膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)的閱讀框內(nèi)重復(fù)，另外5-10％的病人具有第835位天冬酰胺的點突變。這兩種突變都與FLT3酪氨酸激酶活性的組成型激活有關(guān)，并引起在缺少配體情況下的增殖和生存信號。表達突變型受體的病人顯示出治愈機會的降低。因此，有越來越多的證據(jù)證明了過度激活的(突變的)FLT3激酶活性在人類白血病和骨髓增生異常綜合征的作用。
血管生成素(Tie-2的配體)和Tie-2參與血管穩(wěn)定和血管重構(gòu)。已知Tie-2被其配體之一，血管生成素-1所激活，而該配體受到第二種配體，血管生成素-2(ang2)的拮抗。在發(fā)生血管生成的部位，拮抗物ang2被上調(diào)。
本發(fā)明所要解決的問題是提供蛋白激酶、特別是剛才述及的一種或多種激酶的新抑制劑，從而為現(xiàn)有的少數(shù)有效化合物中增加新的化合物。
發(fā)明概述 目前已發(fā)現(xiàn)式I化合物顯示出對許多蛋白激酶的抑制作用。式I化合物詳細描述于下文，其特別表現(xiàn)出對一種或多種下列蛋白激酶的抑制作用tie-2，優(yōu)選c-Abl、Bcr-Abl、c-Kit、RET原癌基因、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、FLT3受體激酶和血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)，例如特別是VEGFR2。式I化合物也抑制所述激酶的突變體?？紤]到這些活性，式I的化合物可以用于治療特別是與這些類型的激酶、尤其是所提到的那些激酶異?；蜻^度的活性相關(guān)的疾病。
發(fā)明詳述 本發(fā)明一方面提供了下式的化合物，
其中 (i)R1和R2各自獨立地選自氫、鹵素和C1-C7-烷基； 如果Z是N則R3不存在，或者如果Z是C(碳)則R3是氫、未取代的或取代的芳基或未取代的或取代的雜環(huán)基； X是N(氮)或CH(被氫取代的碳)， Y是CH或N， Z是C或N，且 Q是式A的基團
其中 (a)R4是氫、鹵素、未取代或取代的氨基、未取代或取代的芳基、通過氮以外的環(huán)原子結(jié)合的未取代或取代的雜環(huán)基、未取代或取代的環(huán)烷基、未取代或取代的烷基、未取代或取代的鏈烯基或未取代或取代的炔基； R5是1-甲基-哌啶-4-基氧基、1-甲基-哌啶-4-基、2-二甲基氨基-乙基或4-乙基-哌嗪-1-基；且 R6是氫、未取代或取代的環(huán)烷基或者未取代或(優(yōu)選)取代的烷基；或 (b)R4是1-甲基-哌啶-4-基甲基、1-乙基-哌啶-4-基甲基、1-甲基-哌啶-4-基氧基或1-異丙基-哌啶-4-基甲基； R5是氫、未取代或取代的烷基、未取代或取代的氨基、未取代或取代的芳基或未取代或取代的雜環(huán)基；且 R6是氫、未取代或取代的環(huán)烷基或未取代或(優(yōu)選)取代的烷基； 其中式(A)中的星號＊表示該部分與式I中酰胺基團的NH通過該鍵相結(jié)合；且 R9和R10各自獨立地選自氫、羥基和C1-C7-烷基；或者 R9和R10一起表示氧代；或者 R1和R9一起形成-C(O)-CH2-或-CH2-CH2-，R2選自氫、鹵素和C1-C7-烷基，且R10表示氫；或 (ii)所述化合物選自 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[4-(4-異丙基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-(4-二乙基氨基甲基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺)， 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-(4-吡咯烷-1-基甲基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺， 2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-(4-二乙基氨基甲基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺， 2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-(4-吡咯烷-1-基甲基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺， N-[3-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯基]-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酰胺， N-(3-二乙基氨基甲基-5-三氟甲基-苯基)-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酰胺， 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-(3-二乙基氨基甲基-5-三氟甲基-苯基)-乙酰胺 2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-[3-(4-甲基-哌嗪-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， N-[3-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯基]-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-乙酰胺， 2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[3-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，和 2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺。
在式I的化合物中，優(yōu)選 -X是C或NH； -Y是CH； -Z是C； -R1是H； -R2是氫、鹵素或C1-C7-烷基，例如甲基， -R3是H； -R9是H； -R10是H； -Q選自以下基團

在式I的化合物中，所述各組取代基可以是獨立于所定義的其它組的優(yōu)選的組；并且所述每個單個取代基可以是獨立于所定義的其它取代基的優(yōu)選的取代基。
另一方面，本發(fā)明提供了選自下述的化合物 N-[3-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基]-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酰胺， 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[4-(4-異丙基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-(4-二乙基氨基甲基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺)， 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-(4-吡咯烷-1-基甲基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺， 2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-(4-二乙基氨基甲基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺， 2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-(4-吡咯烷-1-基甲基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺， N-[3-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯基]-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酰胺， N-(3-二乙基氨基甲基-5-三氟甲基-苯基)-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酰胺， 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-(3-二乙基氨基甲基-5-三氟甲基-苯基)-乙酰胺， N-[4-(1-乙基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酰胺， 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[4-(1-乙基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[4-(1-乙基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[4-(1-異丙基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[4-(1-異丙基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[4-(1-異丙基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-[3-(4-甲基-哌嗪-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， N-[3-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯基]-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-乙酰胺， 2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[3-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-{3-[(2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基]-5-三氟甲基-苯基}-乙酰胺， N-{3-[(2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基]-5-三氟甲基-苯基}-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-乙酰胺， N-{3-[(2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基]-5-三氟甲基-苯基}-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酰胺， 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-{3-[(2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基]-5-三氟甲基-苯基}-乙酰胺， 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-{3-[甲基-(1-甲基-哌啶-4-基)-氨基]-5-三氟甲基-苯基}-乙酰胺， 2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-{3-[甲基-(1-甲基-哌啶-4-基)-氨基]-5-三氟甲基-苯基}-乙酰胺， 2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-{3-[甲基-(1-甲基-哌啶-4-基)-氨基]-5-三氟甲基-苯基}-乙酰胺， 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-{3-[甲基-(1-甲基-哌啶-4-基)-氨基]-5-三氟甲基-苯基}-乙酰胺， 2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[3-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-[3-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺， 2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[3-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，和 2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[3-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺。
本發(fā)明提供的化合物在下文中稱為“本發(fā)明化合物”。本發(fā)明化合物包括以任何形式的化合物，例如游離形式、鹽形式、溶劑化物形式以及鹽和溶劑化物形式。
本發(fā)明也涉及如上文或下文所定義的式I化合物或其可藥用鹽，其用于診斷性或治療性地處理動物(特別是溫血動物或人)的特別是對蛋白激酶的調(diào)節(jié)(尤其是抑制)有響應(yīng)的疾病或病癥，所述蛋白激酶優(yōu)選為一種或多種選自tie-2和/或特別是PDGFR、VEGFR-2、c-Abl、Flt3、Ret、kit和IGF1R的蛋白激酶和/或它們中的任何一種或多種激酶的一種或多種改變或突變的形式。
本發(fā)明另一個實施方案涉及藥物組合物，其包含如上文或下文所定義的式I化合物或其可藥用鹽以及至少一種可藥用的賦形劑，例如載體物質(zhì)。
本發(fā)明的另一個實施方案還涉及式I化合物或其可藥用鹽在制備治療疾病或病癥的藥物組合物中的用途，其中所述疾病或病癥依賴于蛋白激酶(尤其是不適宜的)活性，特別是蛋白酪氨酸激酶，更特別是一種或多種選自tie-2和/或尤其是PDGFR、VEGFR-2、c-Abl、Flt3、Ret和kit的蛋白激酶和/或它們中的任何一種或多種激酶的一種或多種改變或突變的形式；或者所述化合物在治療依賴于蛋白激酶、特別是蛋白酪氨酸激酶、尤其是所定義的那些激酶(尤其是不適宜的)活性的疾病中的用途。
本發(fā)明也涉及治療激酶依賴性疾病和/或增殖性疾病的方法，該方法包括向動物、優(yōu)選溫血動物、特別是人施用式I化合物或其可藥用鹽。
定義 下面列出了用于描述本發(fā)明化合物以及其應(yīng)用和合成、原料和中間體等的各種術(shù)語的定義。當(dāng)在說明書中被使用時，除非其在特定的情況中進行了其它限制，否則這些定義可通過代替本文中所用的一個、一個以上或者全部的一般性表述或符號并因此產(chǎn)生本發(fā)明的優(yōu)選實施方案而優(yōu)選地以單獨或作為較大基團的一部分的形式適用于該術(shù)語。換句話說，一個或多個更一般性的表述可彼此獨立地被更具體的定義所代替，從而產(chǎn)生本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。
術(shù)語“低級”或“C1-C7-”定義了一種具有多達并最多包括7個，尤其是多達并最多包括4個碳原子的部分，所述部分是支鏈(分支一次或多次)或直鏈的并且通過末端或非末端的碳進行連接。低級或C1-C7-烷基是例如正-戊基、正-己基或正-庚基或優(yōu)選C1-C4-烷基，尤其是甲基、乙基、正-丙基、異-丙基、正-丁基、異丁基、仲-丁基、叔-丁基。
鹵代或鹵素優(yōu)選氟、氯、溴或碘，最優(yōu)選氟、氯或溴，除非另有定義。
在未取代或取代的芳基中，芳基優(yōu)選是不超過20個碳原子，尤其是不超過16個碳原子的、優(yōu)選單環(huán)、二環(huán)或三環(huán)的不飽和碳環(huán)系統(tǒng)，且其未被取代或作為被取代的芳基，優(yōu)選被一個或多個，優(yōu)選最多三個，例如一個或兩個獨立地選自下列的取代基所取代苯基；萘基；苯基-或萘基-低級烷基，例如苯甲基；羥基-低級烷基，例如羥甲基；低級烷氧基-低級烷基；(低級烷氧基)-低級烷氧基-低級烷基；低級烷酰基-低級烷基；鹵代低級烷基，例如三氟甲基；苯氧基-或萘氧基-低級烷基；苯基-或萘基-低級烷氧基-低級烷基，例如芐氧基-低級烷基；低級烷氧基-羰基氧基-低級烷基，例如叔丁氧基羰基氧基低級烷基；苯基-或萘基-低級烷氧基羰基氧基-低級烷基，例如芐氧基羰基氧基-低級烷基；氰基-低級烷基；未取代的或被未取代或取代的氨基取代的低級鏈烯基；低級炔基；低級烷?；?，例如乙?；?；羥基；低級烷氧基；低級烷氧基-低級烷氧基；(低級烷氧基)-低級烷氧基-低級烷氧基；苯氧基；萘氧基；苯基-或萘基-低級烷氧基，例如芐氧基；氨基-低級烷氧基；低級烷酰氧基；苯甲酰氧基；萘甲酰氧基；硝基；鹵素，特別是氟、氯、溴或碘；氨基；單、二取代的氨基，其中氨基的取代基獨立地選自低級烷基、低級烷?；?、苯基、萘基、苯基-和萘基-低級烷基；氰基；羧基；低級烷氧基羰基，例如甲氧基羰基、正丙氧基羰基、異丙氧基羰基或叔丁氧基羰基；苯基-或萘基-低級烷氧基羰基，例如芐氧基羰基；低級烷?；槐郊柞；?；萘甲?；?；氨基甲酰基；N-單-或N，N-二取代的氨基甲?；?，例如其中的取代基選自低級烷基和羥基-低級烷基的N-單-或N，N-二取代的氨基甲酰基；脒基；胍基；脲基；巰基；低級烷硫基；苯基-或萘基硫基；苯基-或萘基-低級烷硫基；低級烷基-苯硫基；低級烷基-萘硫基；鹵代-低級烷基巰基；低級烷基-亞磺?；?；苯基-或萘基-亞磺?；?；苯基-或萘基-低級烷基亞磺?；?；低級烷基-苯基亞磺?；?；低級烷基-萘基亞磺?；换腔?；低級烷基磺?；?；苯基或萘基-磺酰基；苯基-或萘基-低級烷基磺?；?；烷基苯基磺?；?；鹵代-低級烷基-磺?；缛谆酋；?；磺酰氨基和苯磺酰氨基；其中上面述及的苯基或萘基(也包括苯氧基或萘氧基中的)作為取代基或被取代的芳基的取代基的一部分，其可以是未取代的或被1個或多個，例如最多3個，優(yōu)選1或2個獨立地選自下述基團的取代基所取代鹵素(尤其是氟、氯、溴或碘)、鹵代-低級烷基(例如三氟甲基)、羥基、低級烷氧基、氨基、N-單-或N，N-二-(低級烷基、苯基、萘基、苯基-低級烷基和/或萘基-低級烷基)氨基、硝基、羧基、低級烷氧基羰基氨基甲酰基、氰基和/或氨磺?；?。
在未取代或取代的雜環(huán)基中，雜環(huán)基優(yōu)選是不飽和、飽和或部分飽和的雜環(huán)基團并且優(yōu)選單環(huán)或者在本發(fā)明的廣義上是二環(huán)或三環(huán)；其具有3至24個，更優(yōu)選4至16個，最優(yōu)選4到10個環(huán)原子；其中一個或多個，優(yōu)選一至四個，尤其是一個或兩個碳環(huán)原子被選自氮、氧和硫的雜原子所代替，結(jié)合環(huán)優(yōu)選地具有4至12個，尤其是5至7個環(huán)原子；所述雜環(huán)基未被取代或被一個或多個，尤其是1至3個獨立地選自上面“被取代的芳基”中所定義的取代基所取代；其中雜環(huán)基特別是選自下述雜環(huán)基基團環(huán)氧乙基、氮雜環(huán)丙基、氮雜環(huán)丙烯基、1，2-氧硫雜環(huán)戊基、噻吩基、呋喃基、四氫呋喃基、吡喃基、噻喃基、噻蒽基、異苯并呋喃基、苯并呋喃基、色烯基、2H-吡咯基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑基、咪唑烷基、苯并咪唑基、吡唑基、吡嗪基、吡唑烷基、噻唑基、異噻唑基、二噻唑基、噁唑基、異噁唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哌啶基、哌嗪基、噠嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、(S-氧代或S，S-二氧代)硫代嗎啉基、吲嗪基、異吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、苯并咪唑基、香豆素基(cumaryl)、吲唑基、三唑基、四唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、異喹啉基、喹啉基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、八氫異喹啉基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、苯并噻吩基、二苯并噻吩基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、喹唑啉基、噌啉基、喋啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、萘嵌間二氮雜苯基、菲咯啉基、呋咱基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、色烯基、異色滿基和色滿基，這些基團各自是未被取代的或被一至兩個選自低級烷基(尤其是甲基、乙基、異丙基或叔-丁基)、低級烷氧基(尤其是甲氧基)和鹵素(尤其是溴或氯)的基團所取代。在R4的情況中，未取代的或取代的雜環(huán)基優(yōu)選不是通過環(huán)氮原子而是通過碳原子結(jié)合，以避免與被取代的氨基的定義重疊。
在未取代或取代的環(huán)烷基中，環(huán)烷基是優(yōu)選具有3到16個，更優(yōu)選具有3到9個環(huán)碳原子的飽和單環(huán)或二環(huán)的烴基團，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基或環(huán)辛基，其被一個或多個、優(yōu)選一至三個獨立地選自被取代的芳基中所述的取代基所取代，或(優(yōu)選)未被取代。
未取代或取代的氨基是指氨基(-NH2)或者其中一個或兩個氫原子被獨立地選自下述基團的取代基所代替的氨基未取代或取代的烷基，尤其是如下所述；未取代或取代的芳基，尤其是如上所述；未取代或取代的雜環(huán)基，尤其是如上所述；未取代或取代的環(huán)烷基，尤其是如上所述；和/或酰基，尤其是如下所述(其中優(yōu)選僅有一個氫原子被?；?，另一個為氫或是除?；酝獾膭偛潘龅幕鶊F)；或者是如上所定義的具有至少一個氮環(huán)原子的未取代或取代的雜環(huán)基形式的被取代的氨基，其經(jīng)由環(huán)氮原子(優(yōu)選不帶電荷的，即包括結(jié)合鍵在內(nèi)為三價的)結(jié)合于該分子的其余部分(因此所述被取代的氨基是通過其取代基與氨基氮一起構(gòu)成相應(yīng)的(未取代的或被進一步取代的)雜環(huán)基環(huán))，尤其是選自下述基團氮雜環(huán)丙基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑基、咪唑烷基、苯并咪唑基、吡唑基、吡嗪基、吡唑烷基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、(S-氧代或S，S-二氧代)硫代嗎啉基、異吲哚基、吲哚基、苯并吲哚基、三唑基、四唑基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、八氫異喹啉基，優(yōu)選上文述及的具有至少一個氮原子的單環(huán)飽和雜環(huán)基；其中雜環(huán)基是未取代的或被一個或多個、優(yōu)選一個或兩個獨立地選自如芳基的取代基所述的基團所取代，優(yōu)選低級烷基(尤其是甲基或叔丁基)、低級烷氧基(尤其是甲氧基)和鹵素(尤其是溴或氯)。特別優(yōu)選的未取代或被取代的氨基是氨基、N-單-或N，N-二-[低級烷基、N-單-或N，N-二-(低級烷基、苯基和/或苯基-低級烷基)-氨基-低級烷基、(未取代的或被低級烷基取代的)-哌啶基、苯基和/或苯基-低級烷基]-氨基，例如N，N-二甲氨基、N，N-二乙基氨基、3-[N-(N，N-二甲氨基)-丙基氨基、2-[N-(N，N-二甲氨基)-乙基氨基或N-(N，N-二甲氨基)-甲基氨基；N-[(N-單-或N，N-二-(C1-C7-烷基)-氨基)-C1-C7-烷基]-N-(未取代的或C1-C7-烷基)-氨基，例如N-3-[N-(N，N-二甲氨基)-丙基-N-甲基-氨基、N-2-[N-(N，N-二甲氨基)-乙基-N-甲基-氨基或N-(N，N-二甲氨基)-甲基-N-甲基-氨基；N-哌啶基氨基或N-低級烷基-N-哌啶基氨基，其中哌啶基是未取代的或被低級烷基所取代，例如N-低級烷基-N-(1-低級烷基-哌啶-4-基)-氨基；吡咯烷-1-基；哌啶-1-基；哌嗪-1-基；4-低級烷基哌嗪-1-基，例如4-(甲基、乙基或異丙基)-哌嗪-1-基；嗎啉代或硫代嗎啉代。
未取代或取代的烷基優(yōu)選C1-C20-烷基，更優(yōu)選低級烷基，其可以是直鏈的或分支一次或多次的支鏈的(條件是碳原子數(shù)允許這樣)，并且其未被取代或被一個或多個，優(yōu)選最多三個獨立地選自下述的取代基所取代如上所述的未取代或被取代的雜環(huán)基，如上所述的未取代或被取代的環(huán)烷基，如上所定義的未被取代或被取代的芳基(尤其是苯基或萘基)；低級鏈烯基、低級炔基、低級烷?；缫阴；?；羥基、低級烷氧基、低級烷氧基-低級烷氧基、(低級烷氧基)-低級烷氧基-低級烷氧基、苯氧基、萘氧基、苯基-或萘基-低級烷氧基，例如芐氧基；氨基-低級烷氧基、低級烷酰基氧基、苯甲酰氧基、萘甲酰氧基、硝基、鹵素、氰基、羧基、低級烷氧基羰基，例如甲氧基羰基、正丙氧基羰基、異丙氧基羰基或叔丁氧基羰基；苯基-或萘基-低級烷氧基羰基，例如芐氧基羰基；低級烷酰基、苯甲?；?、萘甲?；?、氨基甲酰基、N-單-或N，N-二-取代的氨基甲酰基，例如其中的取代基選自低級烷基和羥基-低級烷基的N-單-或N，N-二-取代的氨基甲?；?；脒基、胍基、脲基、巰基、低級烷硫基、苯基-或萘基硫基、苯基-或萘基-低級烷硫基、低級烷基-苯硫基、低級烷基-萘硫基、鹵代-低級烷基巰基、低級烷基-亞磺酰基、苯基-或萘基-亞磺?；?、苯基-或萘基-低級烷基亞磺?；?、低級烷基-苯基亞磺酰基、低級烷基-萘基亞磺?；?、磺基、低級烷基磺酰基、苯基或萘基-磺?；?、苯基-或萘基-低級烷基磺?；?、烷基苯基磺酰基、鹵代-低級烷基-磺?；?，例如三氟甲基磺?；?；磺酰氨基、苯磺酰氨基、氨基；N-單-或N，N-二-[低級烷基、哌啶基、其中哌啶基是未取代或被低級烷基所取代的N-低級烷基哌啶基、N-單-或N，N-二-(低級烷基、苯基和/或苯基-低級烷基)-氨基]-(低級烷基、苯基和/或苯基-低級烷基)-氨基，例如N，N-二甲氨基、N，N-二乙基氨基、3-[N-(N，N-二甲氨基)-丙基氨基、2-[N-(N，N-二甲氨基)-乙基氨基或N-(N，N-二甲氨基)-甲基氨基；吡咯烷-1-基、哌啶-1-基、通過環(huán)碳原子結(jié)合的未取代的或N-低級烷基取代的哌啶基，例如1-異丙基-哌啶-4-基；哌嗪-1-基、4-低級烷基哌嗪-1-基，例如4-(甲基、乙基或異丙基)-哌嗪-1-基、嗎啉代或硫代嗎啉代；其中上面述及的各苯基或萘基(也包括苯氧基或萘氧基中的)作為取代基或被取代的烷基的取代基的一部分，是未取代的或被一個或多個，例如最多3個，優(yōu)選1或2個獨立地選自下述的取代基所取代鹵素(尤其是氟、氯、溴或碘)、鹵代-低級烷基(例如三氟甲基)、羥基、低級烷氧基、氨基、N-單-或N，N-二-(低級烷基、苯基、萘基、苯基-低級烷基和/或萘基-低級烷基)-氨基、硝基、羧基、低級烷氧基羰基氨基甲?；⑶杌?或氨磺?；?。特別優(yōu)選的是低級烷基、鹵代低級烷基(例如三氟甲基)、氨基-低級烷基(例如3-氨基丙基、2-氨基乙基或2-氨基甲基)、N-單-或N，N-二-(低級烷基、哌啶基、N-低級烷基哌啶基、苯基和/或苯基-低級烷基)-氨基-低級烷基，例如3-(N，N-二甲氨基)-丙基、2-(N，N-二甲氨基)-乙基、N，N-二甲基-氨基甲基、N，N-二乙基氨基甲基或N-甲基-N-哌啶-4-基-氨基-甲基；吡咯烷-1-基-低級烷基、哌啶-1-基-低級烷基、1-低級烷基哌啶-4-基-低級烷基、哌嗪-1-基-低級烷基，例如哌嗪-1-基-甲基，4-低級烷基哌嗪-1-基-低級烷基，例如4-(甲基、乙基或異丙基)-哌嗪-1-基-甲基，或者(嗎啉代或硫代嗎啉代)-低級烷基。
?；鶅?yōu)選地是通過羰基(-C(＝O)-)或磺?；?-S(＝O)2-)基團結(jié)合到分子的其他部分的選自各自優(yōu)選如上所述的未取代或被取代的烷基、未取代或被取代的芳基、未取代或被取代的雜環(huán)基或未取代或被取代的環(huán)烷基的有機部分，即，衍生自有機羧酸或磺酸的部分。優(yōu)選的是烷?；?尤其是低級烷?；?，例如乙酰基)、苯甲?；?＝苯基羰基)、萘甲?；?＝萘基羰基)、苯基-C1-C7-烷基羰基、萘基-C1-C7-烷基羰基、苯基磺?；虻图壨榛酋；?，其中作為酰基的各低級烷?；蜃鳛轷；徊糠值母鞅交蜉粱俏慈〈幕虮灰粋€或多個，例如最多3個，優(yōu)選1個或2個獨立的選自下述基團的取代基所取代鹵素(尤其是氟、氯、溴或碘)、鹵代-低級烷基(例如三氟甲基)、羥基、低級烷氧基、氨基、N-單-或N，N-二-(低級烷基、苯基、萘基、苯基-低級烷基和/或萘基-低級烷基)氨基、硝基、羧基、低級烷氧基羰基、氨基甲?；⑶杌?或氨磺?；?。優(yōu)選低級烷?；⒈郊柞；?、苯磺?；蚣妆交酋；?。
在未取代或取代的鏈烯基中，鏈烯基具有一個或多個雙鍵并優(yōu)選具有2到20個、更優(yōu)選最多12個碳原子；其為直鏈的或可分支一次或多次(條件是碳原子數(shù)允許這樣)。優(yōu)選C2-C7-鏈烯基，尤其是C3或C4-鏈烯基，例如烯丙基或2-丁烯基。鏈烯基可以是未取代或取代的，特別是被一個或多個，尤其是最多3個如上面被取代的烷基所述的取代基所取代，條件是帶有活潑氫的N、S或O優(yōu)選不結(jié)合于形成雙鍵的碳原子上(因為這樣將導(dǎo)致互變異構(gòu))。也優(yōu)選排除其它不夠穩(wěn)定的取代基。優(yōu)選未取代的鏈烯基，特別是C2-C7-鏈烯基。
未取代或取代的炔基優(yōu)選是具有一個或多個三鍵且優(yōu)選具有2到20個，更優(yōu)選最多12個碳原子的部分；其是直鏈的或可分支一次或多次(條件是碳原子數(shù)允許這樣)。優(yōu)選C2-C7-炔基，尤其是C3或C4-炔基，例如乙炔基或丙-2-炔基。炔基可以是未取代或取代的，特別是被一個或多個，尤其是最多三個如上面被取代的烷基所述的取代基所取代。例如氨基或羥基等取代基(具有易于解離的氫)優(yōu)選不結(jié)合于參與三鍵的碳原子，也優(yōu)選排除其它不夠穩(wěn)定的取代基。優(yōu)選未取代的炔基，特別是C2-C7-炔基，或N，N-二-(低級烷基、苯基和/或苯基低級烷基)-C3-C7-炔基，例如3-(N，N-二甲氨基)-丙-1-炔基。
術(shù)語“治療”或“療法”(尤其是酪氨酸蛋白激酶依賴性疾病或病癥的治療)指的是對所述疾病，尤其是下述的任何一種或多種疾病的預(yù)防性(包括預(yù)防性的，例如在已發(fā)現(xiàn)能表明其易于或可能易于發(fā)展疾病的突變或改變的病人中)或優(yōu)選治療性的(非限制性地包括減輕、治愈、緩解癥狀、減輕癥狀、抑制疾病或癥狀、延遲進展、調(diào)控激酶和/或抑制激酶的)處理。
術(shù)語“治愈”是指在治療正在進行的涉及(尤其是失控的)受體酪氨酸激酶活性的事件中的效能。
術(shù)語“預(yù)防”是指防止涉及失控的受體酪氨酸激酶活性的疾病的發(fā)作或復(fù)發(fā)。
本文所用的術(shù)語“延遲進展”特別是指對處于所要治療的疾病的前期或早期的患者給予活性化合物，其中患者例如已被診斷出相應(yīng)疾病的前期形式或處于有可能引起相應(yīng)疾病的情況下，例如在醫(yī)學(xué)治療的過程中或在由突發(fā)事件引起的情況下，或在不進行治療可能會出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的情況下。
動物優(yōu)選溫血動物(或病人)，更優(yōu)選哺乳動物，尤其是人。
在下文或上文提及術(shù)語“應(yīng)用”或“用途”(作為動詞或名詞)(涉及式I化合物或其可藥用鹽的用途)的情況中，如果適宜和方便并且沒有另外說明的話，其(如果在上下文中沒有不同的表述或提示的話)分別包括本發(fā)明下面實施方案中的任何一種或多種(如果沒有另外說明的話)用于治療蛋白激酶(尤其是酪氨酸蛋白激酶)依賴性疾病的應(yīng)用、用于制造治療蛋白激酶依賴性疾病的藥物組合物的應(yīng)用、用一種或多種本發(fā)明化合物來治療蛋白激酶依賴性和/或增殖性疾病的方法、用于治療所述蛋白激酶依賴性疾病的包含一種或多種式I化合物的藥物組合物、以及用于治療所述蛋白激酶依賴性疾病的一種或多種式I的化合物。具體而言，所治療的并因此優(yōu)選用于式I化合物的“應(yīng)用”的疾病選自下述蛋白激酶(尤其是酪氨酸蛋白激酶)依賴性疾病(“依賴性”不僅指“單獨依賴”，而且指“基于”，也包括對蛋白激酶的調(diào)節(jié)、尤其是抑制有響應(yīng)的疾病的情況)，特別是下述的增殖性疾病。
在提及蛋白激酶的情況中，其涉及任何類型的蛋白激酶，尤其是絲氨酸/蘇氨酸和/或優(yōu)選的蛋白酪氨酸激酶，最優(yōu)選一種或多種選自tie-2和/或尤其是PDGFR、VEGFR-2、c-Abl、Flt3、Ret、kit和/或IGF1-R的酪氨酸激酶，包括任何一種或多種這些激酶的一種或多種改變或突變的形式或等位基因形式(例如那些引起各自的原癌基因轉(zhuǎn)化為癌基因的，例如組成型激活的突變體，例如Bcr-Abl)。尤其是包括異常高表達的、組成型激活的或雖然正常但在患者的其他調(diào)控機制的給定背景下是相對過度活化的形式，和/或突變的形式。
另一方面，本發(fā)明提供了鹽形式的本發(fā)明化合物。
鹽尤其是式I化合物的可藥用鹽。它們在存在成鹽基團，例如堿性或酸性基團的情況下可以形成，所述鹽可以以至少部分解離的形式存在，例如在pH 4-10的水性環(huán)境中可以以至少部分解離的形式存在，或者尤其可以以固體形式被分離出來。
鹽包括式I化合物的可藥用鹽和不可藥用的鹽，例如用于制備/分離/純化目的的鹽；優(yōu)選可藥用鹽。對于藥物用途而言，本發(fā)明化合物的不可藥用的鹽被排除在外。
在存在成鹽基團，例如堿性或酸性基團的情況下可以形成鹽，所述鹽可以以至少部分解離的形式存在，例如在pH 4-10的水性環(huán)境中可以以至少部分解離的形式存在，或者可以例如固體形式被分離出來。
這些鹽可以形成例如酸加成鹽，優(yōu)選由具有堿性氮原子的式I化合物與有機酸或無機酸形成鹽，尤其是可藥用鹽。適宜的無機酸是例如氫鹵酸如鹽酸、硫酸或磷酸。適宜的有機酸是，例如羧酸、磷酸、磺酸或氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、乳酸、富馬酸、琥珀酸、檸檬酸、氨基酸，例如谷氨酸或天冬氨酸，馬來酸、羥基馬來酸、甲基馬來酸、苯甲酸、甲磺酸或乙磺酸、乙烷-1，2-二磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、1，5-萘-二磺酸、N-環(huán)己基氨基磺酸，N-甲基-、N-乙基-或N-丙基-氨基磺酸，或其它有機質(zhì)子酸，如抗壞血酸。
在存在帶負電的基團例如羧基或磺基的情況中，還可與堿形成鹽，例如金屬或銨鹽，例如堿金屬或堿土金屬鹽，例如鈉、鉀、鎂或鈣鹽，或者與氨或適宜的有機胺，例如一元叔胺，例如三乙胺或三(2-羥基乙基)胺，或雜環(huán)堿，例如N-乙基-哌啶或N，N’-二甲基哌嗪形成銨鹽。
當(dāng)在同一分子中存在堿性基團和酸性基團時，式I的化合物還可形成內(nèi)鹽。
為了制備、分離或純化的目的，還可以使用不可藥用的鹽，例如苦味酸鹽或高氯酸鹽。對于治療用途，僅使用可藥用鹽或游離化合物(在適用的情況下其包含于藥物制劑中)，并且因此優(yōu)選這些鹽。
考慮到化合物的游離形式和其鹽形式(包括那些可用作中間體，例如用于該化合物或其鹽的純化或鑒定的中間體的鹽)之間的緊密關(guān)系，在上下文中，當(dāng)提及“化合物”(包括原料和“中間體”)，尤其是式I的化合物時，在適宜和方便的情況下并且如果沒有另外的明確描述，則應(yīng)當(dāng)被理解為還涉及它的一種或多種鹽或游離化合物與其一種或多種鹽的混合物，其各自也包括式I化合物的任何溶劑化物、代謝前體例如酯或酰胺，或者任何一種或多種這些物質(zhì)的鹽。可獲得不同的晶形和溶劑化物，并且也包括于本發(fā)明之內(nèi)。
在化合物、鹽、藥物制劑、疾病、病癥等使用復(fù)數(shù)形式的情況中，也意味著表示單個化合物、鹽、藥物制劑、疾病等，當(dāng)使用“一種”時，是指不定冠詞或優(yōu)選指“一種”。
游離形式的本發(fā)明化合物可以被轉(zhuǎn)化為化合物相應(yīng)的鹽形式；并且反之亦然。游離形式或鹽形式和溶劑化物形式的本發(fā)明化合物可以被轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的游離形式或鹽形式的化合物的非溶劑化物形式；并且反之亦然。
本發(fā)明化合物可以以異構(gòu)體及其混合物的形式存在；例如光學(xué)異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、順/反構(gòu)象異構(gòu)體。本發(fā)明化合物可以例如包含不對稱碳原子，因此可以以對映異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體及其混合物的形式存在，例如外消旋物。對本發(fā)明化合物中不對稱碳原子上的各取代基而言，本發(fā)明化合物可以以(R)-、(S)-或(R，S)-構(gòu)型存在，優(yōu)選為(R)-或(S)-構(gòu)型。
異構(gòu)體混合物可以按照適宜的方法，例如根據(jù)類似于常規(guī)的方法進行分離，以得到純的異構(gòu)體。本發(fā)明包括任何異構(gòu)體形式和任何異構(gòu)體混合物形式的本發(fā)明化合物。
例如，在一些情況中，本發(fā)明的化合物可在取代基中包含一個或多個手性中心或者表現(xiàn)出其它不對稱性(導(dǎo)致產(chǎn)生對映異構(gòu)體)，或者還可以以一種以上立體異構(gòu)體的形式存在，例如由于存在一個以上的手性中心或一個以上其他類型的不對稱中心，或者由于存在導(dǎo)致Z/E(或順式-反式)異構(gòu)現(xiàn)象(非對映異構(gòu)體)的環(huán)或雙鍵。本發(fā)明包括兩種或多種該類異構(gòu)體的混合物，例如對映異構(gòu)體的混合物，尤其是外消旋物，并優(yōu)選純化的異構(gòu)體，尤其是純化的對映異構(gòu)體或?qū)τ钞悩?gòu)體富集的混合物。
在可能存在互變異構(gòu)體時，本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物的互變異構(gòu)體。
制備方法 本文所述的各化合物可以按照適宜的方法，例如本文所述的方法或者根據(jù)例如類似于常規(guī)的方法進行制備。式I化合物可按照類似于本領(lǐng)域中通常已知的其它化合物的合成方法進行制備，因此對于式I的新化合物而言，該方法是新的類似方法。
本發(fā)明的另一方面提供了制備式I化合物的方法，其中基團如上所定義，包括以下步驟 i)將式II的羧酸化合物，
或其反應(yīng)性衍生物，其中R1、R2、R3、R9、R10、X、Y和Z如式I化合物所定義， 與式III的氨基化合物進行反應(yīng)， Q-NH2 (III) 其中Q如式I化合物中所定義，和 ii)從反應(yīng)混合物中分離所得式I化合物； 例如并且任選地 -將所得的式I化合物轉(zhuǎn)化為不同的式I化合物， -將所得的式I化合物的鹽轉(zhuǎn)化為游離化合物或不同的鹽， -將所得的游離的式I化合物轉(zhuǎn)化為其鹽，和/或 -將所得的式I化合物的異構(gòu)體混合物分離成單個異構(gòu)體； -其中，任何一種或兩種式II和/或式III的原料中，不參加反應(yīng)的官能團可以以被保護形式存在，并且除去保護基團得到式I的化合物。
式II的酸或其反應(yīng)性衍生物的縮合優(yōu)選在常規(guī)縮合條件下進行，其中，在可能的式II的酸的反應(yīng)性衍生物中，優(yōu)選反應(yīng)性的酯(例如羥基苯并三唑(HOBT)、五氟苯基、4-硝基苯基或N-羥基琥珀酰亞胺的酯)、酸鹵化物(例如酰氯或酰溴)或反應(yīng)性的酸酐(例如與低級鏈烷酸的混合酸酐或?qū)ΨQ酸酐)。反應(yīng)性的碳酸衍生物也可以并優(yōu)選在原位形成。接著可通過將式II和III的化合物溶于合適的溶劑，例如鹵代烴如二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯酮、二氯甲烷，或兩種或多種這些溶劑的混合物，并加入合適的堿(例如三乙胺、二異丙基乙胺(DIEA)或N-甲基嗎啉)以及(如果式II的酸的反應(yīng)性衍生物是在原位形成的話)可在原位形成式III碳酸優(yōu)選的反應(yīng)性衍生物的合適偶聯(lián)劑來進行該反應(yīng)，所述偶聯(lián)劑例如二環(huán)己基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑(DCC/HOBT)；雙(2-氧代-3-噁唑烷基)次磷酰氯(BOPCl)；O-(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TPTU)；O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)；(苯并三唑-1-基氧基)-三吡咯烷-1-基鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/羥基苯并三唑或/1-羥基-7-氮雜苯并三唑(EDC/HOBT或EDC/HOAt)或者單獨的或與(1-氯-2-甲基-丙烯基)-二甲胺一起的HOAt。關(guān)于其他可能的偶聯(lián)劑的綜述，參見例如Klauser；Bodansky，Synthesis 1972，453-463。該反應(yīng)混合物優(yōu)選在約-20到50℃，尤其是-5℃到30℃，例如0℃到室溫下攪拌。該反應(yīng)可以優(yōu)選在惰性氣體中進行，例如氮氣或氬氣。如果需要，隨后進行保護基團的脫去。如果需要，保護基團(例如叔丁氧羰基、甲氧基甲基、芐基、2-(三甲基硅烷基)-乙氧基羰基或叔丁基二甲基硅烷基)的后續(xù)脫去在標準條件下進行，也參見在下文“通用處理條件”中所述及的文獻。
任選的反應(yīng)和轉(zhuǎn)化 式I的化合物或其被保護的形式(根據(jù)前面方法直接獲得的或者在重新引入保護基團后獲得的，包括其隨后用于進行轉(zhuǎn)化的原料形式，即使沒有具體提及時也是如此)在需要時，在除去保護基團之后，可以根據(jù)已知方法轉(zhuǎn)化成不同的式I化合物。
例如，在其中的Q是被碘或溴和可能的一個或多個其他取代基(例如三氟)所取代的芳基，例如其中Q是4-碘-3-三氟甲基苯基的式I化合物中，該溴或碘可被取代的或未取代的苯基(例如4-氰基苯基)所置換，該反應(yīng)是通過與相應(yīng)的取代或未取代的式IV的苯基硼酸， Phe-B(OH)2 IV 其中Phe是未取代或被取代的芳基，在催化劑、特別是PdCl2(dppf)存在下并優(yōu)選在堿(例如堿金屬的碳酸鹽，例如碳酸鈉)的存在下，于適宜的溶劑或溶劑混合物如甲苯/水中，在(例如)升高的溫度下，例如30℃和(優(yōu)選的)回流溫度之間的溫度下進行的偶聯(lián)反應(yīng)。
具有至少一種成鹽基團的式I化合物的鹽可按照本身已知的方法進行制備。例如，具有酸基團的式I化合物的鹽可通過，例如用金屬化合物(例如合適的有機羧酸的堿金屬鹽，例如2-乙基-己酸的鈉鹽)、用有機堿金屬或堿土金屬化合物(例如相應(yīng)的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽，例如鈉或鉀的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽)、用相應(yīng)的鈣化合物或用氨或合適的有機胺處理所述的化合物而形成，優(yōu)選使用化學(xué)計量量或僅少量過量的成鹽試劑。式I化合物的酸加成鹽可以常規(guī)方式獲得，例如通過用酸或適宜的陰離子交換試劑對所述化合物進行處理來獲得。包含酸性和堿性成鹽基團(例如游離羧基和游離氨基)的式I化合物可以形成內(nèi)鹽，例如通過用弱堿將鹽如酸加成鹽中和至等電點，或者通過用離子交換劑進行處理來形成。
可以用常規(guī)方式將式I化合物的鹽轉(zhuǎn)化成游離化合物；金屬和銨鹽可以例如，通過用適宜的酸進行處理來轉(zhuǎn)化，并且例如可以通過用適宜的堿性試劑進行處理來對酸加成鹽進行轉(zhuǎn)化。在這兩種情況中，都可以使用適宜的離子交換劑。
立體異構(gòu)體混合物，例如非對映異構(gòu)體的混合物，可以用本身已知的方式通過適宜的分離方法將其分離成其相應(yīng)的異構(gòu)體。例如，可以通過分步結(jié)晶、色譜法、溶劑分配以及類似方法，將非對映異構(gòu)體的混合物分離成其單個的非對映異構(gòu)體。這種分離可以在起始化合物之一的水平或者在式I化合物本身的水平上進行。可以通過形成非對映體鹽，例如通過與對映異構(gòu)體純的手性酸形成鹽，或者通過色譜法，例如使用具有手性配體的色譜底物的HPLC來分離對映異構(gòu)體。
中間體和終產(chǎn)物可以根據(jù)標準方法，例如采用色譜法、分配法、(重)結(jié)晶等進行后處理和/或純化。
原料 用于合成式I化合物的原料，包括中間體，例如式II和III的化合物可以例如根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法、實施例所述的方法或者類似于實施例所述的方法來進行制備，和/或它們是已知的或市售的。
在以下對原料和中間體及其合成的描述中，如果沒有另外直接說明或者通過上下文來說明，則R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、X、Y、Z和Q具有上面給出的含義或者在實施例中對各原料或中間體所給出的含義。如果沒有特別提及的話，可在適當(dāng)?shù)牟襟E引入和脫去保護基團以防止官能團在相應(yīng)的反應(yīng)步驟中發(fā)生不希望的反應(yīng)，使用保護基團、其引入和除去的方法如上文或下文所述，例如在“通用處理條件”中所述及的參考文獻中所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定是否采用或是否需要保護基團以及何種保護基團。
例如，式II的原料可以從相應(yīng)的式V的酯(如果其是活化的酯，其可在制備式I化合物的過程中直接用作式II化合物的反應(yīng)性衍生物)，
其中R是醇的部分，例如烷基或苯基-低級烷基，例如甲基、乙基或芐基，通過例如在堿(例如堿金屬氫氧化物，例如氫氧化鋰)存在下，于適宜的溶劑(例如醚，例如四氫呋喃)中，在常規(guī)溫度下(例如20-50℃下)水解，或者在酸(例如氫鹵酸，例如鹽酸)存在下，于適宜的溶劑(例如水)中，在常規(guī)溫度下(例如50℃到反應(yīng)混合物的回流溫度下)水解而制備。
式V的化合物可以例如從式VI的氨基化合物，
其中R如式V的化合物所定義并且其他基團如式I化合物所定義，通過與甲酸的適宜形式，尤其是原甲酸三低級烷基酯，例如原甲酸三乙酯，優(yōu)選在較高溫度下，例如在回流條件下，和存在或優(yōu)選不存在適宜溶劑的條件下進行反應(yīng)而制備。
式VI的氨基化合物可以例如通過將相應(yīng)的式VII的硝基前體化合物，
其中R如式V的化合物所定義并且其他基團如式I化合物所定義，優(yōu)選通過催化氫化，例如在阮內(nèi)催化劑如阮內(nèi)鎳存在下，于適宜的溶劑例如醇，例如甲醇中，在常規(guī)溫度例如0-50℃下用氫氣進行還原而制備。
式VII的硝基化合物可以例如通過將式VIII的鹵代化合物，
其中Hal是鹵素，尤其是氟、氯或溴，且X、Y、Z和R3如式I化合物所定義，在取代反應(yīng)條件下與式IX的胺在適宜條件下進行反應(yīng)而獲得，
其中R如式V的化合物中所定義并且其他基團如式I化合物所定義，例如，當(dāng)式VIII化合物中Z是N且Y和X各自是CH且Hal是氯或溴時，在優(yōu)選較高的溫度(例如30℃到反應(yīng)混合物的回流溫度)下，于適宜的溶劑例如醇和/或醚，例如甲醇和/或二噁烷中進行反應(yīng)；當(dāng)式VIII化合物中的X是N、Y是CH且Z是C時，在存在或(尤其當(dāng)R2是鹵素時)不存在酸(例如鹽酸)的條件下，于適宜的溶劑例如醇和/或醚，例如甲醇和/或二噁烷中，優(yōu)選在較高溫度(例如30℃到反應(yīng)混合物的回流溫度)下進行反應(yīng)；或者當(dāng)式VIII化合物中的X和Y是CH、Z是C且Hal是氟時，在存在或優(yōu)選不存在適宜溶劑的條件下，于較高的溫度下，例如在100-150℃的封閉管中進行反應(yīng)；或者使用這些反應(yīng)條件的適當(dāng)?shù)淖兓问?。式VII化合物也可按WO 97/21665中所述進行制備，該文獻，特別是有關(guān)該合成反應(yīng)的內(nèi)容，優(yōu)選地引入本文作為參考。
式III的原料可通過文獻或類似于文獻所述的方法進行制備，例如WO03099771或WO 0009495中所述，該文獻，特別是有關(guān)制備這類原料的內(nèi)容，優(yōu)選地引入本文作為參考。
式III的原料，其中Q是式A的基團，其中R’4是未取代或被取代的芳基、未取代或被取代的環(huán)烷基、未取代或被取代的雜環(huán)基、未取代或被取代的烷基、未取代或被取代的鏈烯基或未取代或被取代的炔基，可以在常規(guī)偶聯(lián)條件下，例如在Suzuki偶聯(lián)條件下獲得。例如，下式的化合物 R’4-BA2 其中R’4如上所定義、特別是未取代或被取代的芳基，BA2是B(OD)2(其中D是氫或低級烷基)、9-硼雜二環(huán)[3.3.1]壬基或B(CHCH3CH(CH3)2)2，可以在適宜的催化劑(例如Pd(PPh3)4或PdCl2(dppf))存在下，在堿存在下，例如在堿金屬碳酸鹽(例如碳酸鈉)、堿金屬醇化物(例如乙醇鈉)、氫氧化物(例如TlOH)、叔胺(例如三乙胺)或堿金屬磷酸鹽(例如磷酸鉀)存在下，于適宜的溶劑例如甲苯和/或水中，優(yōu)選在較高溫度(例如在回流條件下)下與式XI的化合物進行反應(yīng)，
其中Hal是鹵素，尤其是溴；并且其它基團如式I化合物所定義，以得到式XII的化合物，其中R’4是如上所定義，
它是其中R’4具有式I化合物中所定義的R4含義的式III化合物。
式III的化合物，其中Q是式A的基團，其中R’5是未取代或被取代的芳基或未取代或被取代的雜環(huán)基，可以例如在常規(guī)偶聯(lián)條件下，例如在Suzuki偶聯(lián)條件下，例如按上面對式X化合物與式XI化合物的反應(yīng)所述，例如通過將式XIII的化合物，
其中Hal是鹵素，尤其是溴，且R4和R6如式I化合物中所定義，優(yōu)選R4是氫，與式XIV的化合物進行反應(yīng)而獲得， R’5-BA2 (XIV) 其中R’5如上所定義且BA2如上文對式X化合物所定義。
式III的化合物，其中Q是式A的部分，其中R4是未取代或被取代的氨基，可以例如通過將式XV的化合物，
其中Hal是鹵素，尤其是溴，并且R5和R6如式I化合物所定義，與式XVI的化合物， H-R4＊(XVI) 其中R4＊是未取代的或(優(yōu)選)被取代的氨基，在存在或優(yōu)選不存在適宜溶劑的條件下，優(yōu)選在較高溫度例如100-150℃下，例如在封閉管中反應(yīng)，以獲得式XVII的化合物，
其中R4＊如上文所定義且R5和R6如式I化合物所定義。式XVII化合物中的硝基基團可被還原為氨基以產(chǎn)生相應(yīng)的式III的氨基化合物，例如通過催化氫化，例如在氫氣和氫化催化劑(例如阮內(nèi)催化劑如阮內(nèi)鎳，或貴金屬催化劑，例如鈀，優(yōu)選在載體例如炭上)存在下，于適宜的溶劑例如醇，例如甲醇或乙醇中，在例如0-50℃的溫度下進行。
式XI的化合物(其也屬于式III的化合物)，其中Hal是鹵素，尤其是碘，可以例如通過將式XVIII的硝基化合物中的硝基基團，
其中Hal是鹵素，尤其是碘，例如在按式XVII化合物的氫化所述的條件下還原成氨基基團而獲得。式XVIII的化合物(例如其中R5是三氟甲基，Hal是碘且R6是氫)可以例如按照或以類似于WO 0009495所述的方法獲得，該文獻，特別是有關(guān)該合成的內(nèi)容，優(yōu)選地引入本文作為參考。
其它原料，例如式VIII、IX、X、XI、XIII、XIV、XVI和XVIII的化合物是已知的、市售的和/或可以根據(jù)例如類似于常規(guī)的方法，例如根據(jù)類似于已知或標準的方法，或者通過本文所述方法進行制備。
通用處理條件 下面的敘述通常適用于上下文所述的所有方法，同時優(yōu)選上下文特別提及的反應(yīng)條件 在上下文所提及的任何反應(yīng)中，在適宜或需要的情況下，即使沒有特別提及，也可使用保護基團對不需要參與給定反應(yīng)的官能團進行保護，并且可以在適宜或需要的階段將其引入和/或除去。因此，在本說明書中沒有特別提及保護和/或去保護的反應(yīng)的情況下，在可能時使用保護基團的反應(yīng)也包括在內(nèi)。
在本文的范圍中，除非上下文特別說明，否則僅有并非特定所需的式I終產(chǎn)物的組成部分的容易除去的基團被稱為“保護基團”。例如在標準的參考著作，如J.F.W.McOmie，“有機化學(xué)中的保護基團(Protective Groupsin Organic Chemistry)”，Plenum Press，倫敦和紐約1973、T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“有機合成中的保護基團(Protective Groups in OrganicSynthesis)”，第三版，Wiley，紐約1999、“肽類(The Peptides)”；第3卷(主編E.Gross和J.Meienhofer)，Academic Press，倫敦和紐約1981、“Methoden der organischen Chemie”(有機化學(xué)方法)，Houben Weyl，第4版，第15/1卷，Georg Thieme Verlag，Stuttgart 1974、H.-D.Jakubke和H.Jesch-keit，“

Peptide，Proteine”(氨基酸、肽類、蛋白質(zhì))，Verlag Chemie，Weinheim，Deerfield Beach，和Basel 1982以及JochenLehmann，“Chemie der KohlenhydrateMonosaccharide und Derivate”(碳水化合物化學(xué)單糖和衍生物)，Georg Thieme Verlag，Stuttgart 1974中，描述了保護基團對官能團進行的保護、保護基團本身、以及適合于除去保護基團的反應(yīng)。保護基團的特性在于其可以容易地被除去(即不會發(fā)生不希望的繼發(fā)反應(yīng))，例如可以通過溶劑解、還原、光解被除去或者可以在生理條件下被除去(例如通過酶裂解)。
所有上述處理步驟都可以在本身已知的反應(yīng)條件下進行，優(yōu)選那些具體提及的條件，在不存在或通常存在溶劑或稀釋劑(優(yōu)選對所用試劑為惰性并且可溶解所用試劑的溶劑或稀釋劑)的情況下，在不存在或存在催化劑、縮合劑或中和劑，例如離子交換劑如陽離子交換劑、例如H+型交換劑的情況下進行，根據(jù)該反應(yīng)和/或反應(yīng)物的性質(zhì)，在降低、正常或升高的溫度下，例如約-100℃至約190℃，優(yōu)選約-80℃至約150℃，例如-80至-60℃、室溫、-20至40℃或在回流溫度下，在大氣壓下或在密封容器中在適宜時加壓和/或在惰性氣氛，例如氬氣或氮氣氣氛下進行。
除非在方法的描述中另外說明，否則可以從其中選擇適合于任何特定反應(yīng)的溶劑，包括那些具體提及的溶劑或者是例如水；酯類，如低級鏈烷酸低級烷基酯，例如乙酸乙酯；醚類，如脂族醚類，例如乙醚，或環(huán)醚類，例如四氫呋喃或二噁烷；液態(tài)芳香烴類，如苯或甲苯；醇類，如甲醇、乙醇或1-或2-丙醇；腈類，如乙腈；鹵代烴類，例如二氯甲烷或氯仿；酰胺類，如二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺；堿類，如雜環(huán)氮堿，例如吡啶或N-甲基吡咯烷-2-酮；羧酸酸酐，如低級鏈烷酸酐，例如乙酸酐；環(huán)狀、直鏈或支鏈烴類，如環(huán)己烷、己烷或異戊烷，或這些溶劑的混合物，例如水溶液。這些溶劑混合物也可用于后處理，例如通過色譜法或分配進行后處理。
中間體和終產(chǎn)物可以根據(jù)標準方法，例如用色譜法、分配法、(重)結(jié)晶法、蒸餾(常壓或減壓)、水蒸汽蒸餾等進行后處理和/或純化。
本發(fā)明還涉及其中使用在所述方法的任何階段以中間體形式獲得的化合物作為原料并進行其余處理步驟的那些形式的方法，或者其中在所述反應(yīng)條件下形成原料或原料以其衍生物形式、例如以被保護形式或者鹽形式進行使用，或者在所述處理條件下制備用本發(fā)明方法獲得的化合物并在原位對其進一步處理的那些形式的方法。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選使用那些產(chǎn)生優(yōu)選的式I化合物的原料。特別優(yōu)選與實施例中所述反應(yīng)條件相同或相似的反應(yīng)條件。在存在成鹽基團的情況下，本發(fā)明也涉及新的中間體及其鹽，以及它們的合成。
試驗測定和試驗方法 式I的化合物具有有價值的藥理學(xué)特性并可用于治療激酶、特別是tie-2和/或更尤其是PDGFR、VEGFR-2、c-Abl、Flt3、Ret和/或kit依賴性的疾病，例如用作治療一種或多種增殖性疾病的藥物。
本發(fā)明的化合物調(diào)節(jié)蛋白激酶、尤其是作為激酶抑制劑的有用性可通過以下測試體系對上述優(yōu)選的蛋白激酶進行特別地和例證性地證明 c-Abl、Bcr-Abl 式I化合物作為c-Abl蛋白酪氨酸激酶活性抑制劑的效能可進行證明如下 根據(jù)Geissler等人在Cancer Res.1992，524492-4498中所述的過濾結(jié)合試驗，對該方法進行如下修改后在96孔板中進行體外酶試驗?？寺is-標記的c-Abl的激酶結(jié)構(gòu)域并按Bhat等人，J.Biol.Chem.1997，27216170-16175中所述，在桿狀病毒/Sf9系統(tǒng)中進行表達。將37kD的蛋白(c-Abl激酶)通過兩步方法進行純化，先經(jīng)過Cobalt金屬螯合物柱，再經(jīng)過陰離子交換柱，產(chǎn)量為每升Sf9細胞1-2mg(Bhat等人，引入?yún)⒖?。通過SDS-PAGE在考馬斯藍染色后測定c-Abl激酶的純度為＞90％。該試驗液含有(總體積為30μL)c-Abl激酶(50ng)、20mM Tris·HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2、10μM Na3VO4、1mM DTT和0.06μCi/試驗[γ33P]-ATP(5μM ATP)，采用存在1％DMSO的30μg/mL的聚-Ala，Glu，Lys，Tyr-6∶2∶5∶1(Poly-AEKY，Sigma P1152)。通過加入10μL的250mM EDTA中止反應(yīng)，將30μL的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到Immobilon-PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，USA)上，該膜預(yù)先用甲醇浸泡5分鐘，用水洗滌，然后用0.5％H3PO4浸泡5分鐘并且將其置于斷開真空源的多頭真空抽吸裝置上。點上所有的樣品后，連接真空，用200μL的0.5％H3PO4沖洗各孔。移去膜并在震蕩器上用0.5％H3PO4洗滌(四次)并且用乙醇洗滌一次。在環(huán)境溫度下干燥、置于Packard TopCount 96孔架上并且加入10μL/孔的Microscint TM(Packard)后，對膜進行計數(shù)。采用該試驗體系，式I化合物顯示抑制作用的IC50值的范圍為0.002-100μM，通常為0.01-5μM。
可通過捕獲ELISA進行如下的Bcr-Abl抑制測定用p210Bcr-Abl表達載體pGDp210Bcr/Abl(32D-bcr/abl)轉(zhuǎn)染的鼠骨髓祖細胞系32Dcl3來自J Griffin(Bazzoni等人，J.Clin Invest.98，521-8(1996)；Zhao等人，Blood 90，4687-9(1997))。該細胞表達具有組成型激活的abl激酶的融合bcr-abl蛋白并且其增殖不依賴生長因子。細胞在RPMI 1640(AMIMED；cat#1-41F01)、10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺(Gibco)(“完全培養(yǎng)基”)中擴增，并通過在冷凍介質(zhì)(95％胎牛血清、5％二甲基亞砜(SIGMA，D-2650))中冷凍等份的每小瓶2×106細胞來制備工作儲備液。解凍后，在最多10-12個傳代期間采用該細胞進行實驗。使用來自Upstate Biotechnology的抗abl SH3結(jié)構(gòu)域的抗體cat.#06-466進行ELISA。采用標記了來自ZYMED(cat.#03-7722)的堿性磷酸酶(PY10(AP))的抗-磷酸化酪氨酸的抗體Ab PY20測定bcr-abl的磷酸化。使用(N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺的甲磺酸鹽(單甲磺酸鹽)(STI571)(市售為

或

Novartis公司)作為對比和參考化合物。在DMSO中制備10mM的儲備液并將其存放于-20℃。對于細胞試驗，將儲備液在完全培養(yǎng)基中進行兩步稀釋(1∶100和1∶10)得到10μM的初始濃度，然后在完全培養(yǎng)基中制備系列的3倍稀釋液。應(yīng)用該方法沒有遇到溶解度的問題。對測試的式I化合物進行類似的處理。將200,00032D-bcr/abl細胞以每孔50μL的量接種于96孔的圓底組織培養(yǎng)板中進行分析。將每孔50μL的測試化合物的系列3倍稀釋液加入細胞中，一式三份。測試化合物的終濃度范圍為例如5μM至0.01μM。未處理的細胞用作對照。將化合物與細胞一起于37℃、5％CO2中培養(yǎng)90分鐘，隨后于1300rpm離心組織培養(yǎng)板(Beckman GPR離心機)，并小心抽吸除去上清液，注意不要移出任何沉淀的細胞。加入150μL裂解緩沖液(50mM Tris/HCl(pH 7.4)、150mM氯化鈉、5mM EDTA、1mM EGTA、1％NP-40(非離子型去污劑，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國)、2mM原釩酸鈉、1mM苯甲基磺酰氟、50μg/mL抑肽酶和80μg/mL亮抑酶肽)使細胞沉淀物裂解，可以將其直接用于ELISA或者凍存于-20℃?zhèn)溆?。將?abl SH3結(jié)構(gòu)域的抗體以每孔50μL PBS中200ng的量涂覆于黑色ELISA板(PackardHTRF-96黑色板，6005207)，于4℃過夜。采用含有0.05％Tween20的200μL/孔的PBS(PBST)和0.5％TopBlock(Juro，Cat.#TB 232010)洗滌三次后，將剩余的蛋白結(jié)合位點用200μL/孔的PBST、3％TopBlock于室溫下封閉4小時，隨后與50μL未處理的或測試化合物處理的細胞的裂解產(chǎn)物(每孔總蛋白20μg)一起于4℃培養(yǎng)3-4小時。洗滌三次后，以50μL/孔的量，加入在封閉緩沖液中稀釋至0.5μg/mL的PY20(AP)(Zymed)并孵育過夜(4℃)。對于所有的孵育步驟，均采用板密封器(Costar，cat.#3095)將板子密封。最后，用洗滌緩沖液將板子再洗滌三次，并用去離子水洗滌一次，隨后以90μL/孔的量加入含有Emerald II的AP底物CPDStar RTU。將采用Packard Top SealTM(一種板密封器(cat.#6005185))密封的板子在黑暗中于室溫下孵育45分鐘，用Packard Top Count Microplate ScintillationCounter(Top Count)測定每秒計數(shù)(CPS)來對發(fā)光進行定量。對于最終的優(yōu)化形式的ELISA，將在96孔組織培養(yǎng)板中生長、處理和裂解的細胞的50μL溶胞產(chǎn)物直接從這些板子轉(zhuǎn)移到ELISA板上，ELISA板預(yù)先用50ng/孔的來自Upstate的兔抗-abl-SH3結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體AB 06-466涂布。抗-磷酸酪氨酸的抗體AB PY20(AP)的濃度可以降低到0.2μg/mL。洗滌、封閉以及與發(fā)光底物一起孵育如上文所述。采用如下的方法完成定量計算未處理的32D-bcr/abl細胞的裂解產(chǎn)物得到的ELISA讀數(shù)(CPS)與試驗背景(含有所有成分，但沒有細胞裂解產(chǎn)物)的讀數(shù)之間的差異，并以此作為100％，以反映這些細胞中存在的組成型磷酸化的bcr-abl蛋白?；衔飳cr-abl激酶活性的活性以bcr-abl磷酸化降低的百分率來表示。通過圖形的內(nèi)插法或外推法從劑量效應(yīng)曲線測定IC50的值。
RET RET激酶的抑制可以測定如下 克隆和表達采用桿狀病毒供體載體pFB-GSTX3產(chǎn)生重組桿狀病毒，它表達人RET-Men2A的激酶胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的第658-1072位氨基酸區(qū)域(Swiss prot No.Q9BTB0)，該激酶結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)RET的野生型激酶結(jié)構(gòu)域(wtRET)和RET-Men2B，RET-Men2B與wtRET的區(qū)別在于激活環(huán)中的激活突變M918T。使用特異性引物從cDNA庫中PCR擴增wtRET細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的編碼序列。通過造成M918T突變的定點突變產(chǎn)生RET-Men2B。使所擴增的DNA片段和pFB-GSTX3載體適合于通過SalI和KpnI消化進行連接。連接這些DNA片段，分別產(chǎn)生桿狀病毒供體質(zhì)粒pFB-GX3-RET-Men2A和pFB-GX3-RET-Men2B。
病毒的制備將含有激酶結(jié)構(gòu)域的桿狀病毒供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到DH10Bac細胞系(GIBCO)中，并將轉(zhuǎn)染的細胞涂布于選擇性的瓊脂平板上。病毒基因組(由細菌攜帶)中未插入融合序列的菌落為藍色。收集白色的單菌落，通過標準的質(zhì)粒純化方法從細菌中分離病毒DNA(桿狀病毒穿梭載體)。然后在25cm2培養(yǎng)瓶中，使用Cellfectin試劑以病毒DNA轉(zhuǎn)染Sf9細胞或Sf21細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC))。
在Sf9細胞中的蛋白表達從轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)物中收集含有病毒的介質(zhì)，用于感染以增加其效價。經(jīng)兩輪感染后得到的含有病毒的介質(zhì)用于大規(guī)模蛋白表達。對于大規(guī)模蛋白表達，以5×107個細胞/板接種到100cm2圓底組織培養(yǎng)板，用1mL的含有病毒的介質(zhì)(約5MOI)進行感染。3天后，將細胞自板中刮出并在500rpm下離心5分鐘。將得自10-20個100cm2板的細胞沉淀重懸于50ml冰冷的裂解緩沖液(25mM Tris-HCl(pH 7.5)、2mM EDTA、1％NP-40、1mM DTT，1mM PMSF)。細胞在冰上攪拌15分鐘，然后在5,000rpm下離心20分鐘。
純化GST-標記的蛋白將離心后的細胞裂解物加入2mL谷胱甘肽-瓊脂糖柱(Pharmacia)，用10mL的25mM Tris-HCl(pH 7.5)、2mMEDTA、1mM DTT、200mM NaCl洗滌三次。然后將GST-標記的蛋白質(zhì)用25mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM還原型谷胱甘肽、100mM NaCl、1mM DTT、10％甘油的溶液洗脫10次(每次1mL)，儲存于-70℃。
酶活性的測定在含有15ng GST-wtRET或GST-RET-Men2B蛋白、20mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM MnCl2、10mM MgCl2、1mM DTT、3μg/mL多聚(Glu，Tyr)4∶1、1％DMSO、2.0μM ATP(0.1μCi的γ-[33P]-ATP)的終體積為30μL的溶液中，用純化的GST-wtRET或GST-RET-Men2B蛋白進行酪氨酸蛋白激酶試驗。在有或無抑制劑的存在下，通過測定從[γ33P]ATP摻入多聚(Glu，Tyr)4∶1中的33P來分析活性。試驗在環(huán)境溫度下按上述條件于96孔板中進行15分鐘，通過加入20μL的125mM EDTA中止試驗。隨后將40μL的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到Immobilon-PVDF膜(Millipore)上，該膜預(yù)先用甲醇浸泡5分鐘，用水洗滌，然后用0.5％H3PO4浸泡5分鐘并且將其置于斷開真空源的多頭真空抽吸裝置上。點上所有的樣品后，連接真空，用200μL的0.5％H3PO4洗滌各孔。移出膜并在震蕩器上用1.0％H3PO4洗滌四次，用乙醇洗滌一次。在環(huán)境溫度下干燥并置于Packard TopCount 96孔架上，加入10μL/孔的Microscint TM(Packard)后，對膜進行計數(shù)。通過每個化合物在四種濃度下(通常為0.01、0.1、1和10μM)(一式兩份)的抑制百分率的線性回歸分析來計算IC50值。蛋白激酶活性的一個單位定義為于37℃下每分鐘每mg蛋白從[γ33P]ATP向底物蛋白轉(zhuǎn)移1nmol的33P。式I化合物在此顯示的IC50值范圍從0.07到20μM，特別是0.1到5μM。
PDGFR 式I化合物作為c-Kit和PDGFR酪氨酸激酶活性抑制劑的效能可以證明如下 BaF3-Tel-PDGFRβ為BaF3鼠的原B細胞淋巴細胞衍生物[BaF3細胞系可得自德國微生物與細胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)，Braunschweig，德國]，其通過分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)Tel-融合-激活的PDGFR-β野生型(Golub T.R.等人，Cell 77(2)307-316，1994)或D816V-突變-激活的c-kit而成為IL-3非依賴型。細胞培養(yǎng)于補加2％L-谷氨酰胺(Animed#5-10K50-H)和10％胎牛血清(FCS，Animed#2-01F16-I)的RPMI-1640(Animed#1-14F01-I)培養(yǎng)基中。野生型、未轉(zhuǎn)染的BaF3細胞保存在添加了10U/mL的IL-3(小鼠白介素-3，羅氏公司商品號1380745)的上述培養(yǎng)基中。
將細胞在新鮮的培養(yǎng)基中稀釋至終密度為3×105細胞/mL，并按50μL的等分量接種到96孔板(1.5×104細胞/孔)中。加入50μL的2×化合物溶液。通常采用激酶抑制劑PKC412作為內(nèi)標。用DMSO(0.1％終濃度)處理對照細胞作為生長對照(設(shè)為100％生長)。另外，按照慣例在僅含有100μL培養(yǎng)基而不含細胞的孔中測定板的空白值。自10μM開始，基于測試化合物的8個3倍系列稀釋液進行IC50測定。將細胞于37℃和5％CO2中培養(yǎng)48小時后，基本按文獻所述(O′Brien J.等人，Eur.J.Biochem.2675421-5426，2000)通過刃天青鈉鹽染料還原試驗(商業(yè)上稱為AlamarBlue試驗)來測定抑制劑對細胞活力的影響。每孔加入10μL的AlamarBlue，將板于37℃和5％CO2中孵育6小時。然后，用Gemini 96孔讀板器(Molecular Devices)測定熒光，讀板器設(shè)置如下544nm激發(fā)和590nm發(fā)射。將所得原始數(shù)據(jù)輸出至Excel-文檔表格中。從所有的數(shù)據(jù)點減去板的空白值以進行數(shù)據(jù)分析。然后通過AlamarBlue讀數(shù)來計算化合物的抗增殖作用，以對照細胞值(設(shè)為100％)的百分比表示。采用XLfit軟件程序確定IC50值。式I化合物對PDGFR-β的IC50值范圍為0.001-20μM，特別是0.002和0.1μM之間。
c-Kit可采用BaF3-KitD816V鼠的原B淋巴細胞衍生物進行類似的測定。
FLT3受體激酶 為了尋找靶向于FLT3的化合物，可以采用兩種不同類型的試驗 Flt3激酶活性測定如下使用桿狀病毒供體載體pFbacG01(GIBCO)產(chǎn)生重組桿狀病毒，它表達人Flt3的細胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域的第563-993位氨基酸區(qū)域。從人cDNA庫(Clontech)中通過PCR擴增Flt3細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的編碼序列。使所擴增的DNA片斷和pFbacG01載體適合于通過BamH1和HindIII消化連接。連接這些DNA片斷，產(chǎn)生桿狀病毒供體質(zhì)粒Flt-3(1.1)。按照下述進行病毒的制備、在Sf9細胞中表達蛋白和純化GST-融合蛋白 病毒的制備將含有Flt-3激酶結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)染載體(pFbacG01-Flt-3)轉(zhuǎn)入DH10Bac細胞系(GIBCO)并將轉(zhuǎn)染的細胞涂布于選擇性的瓊脂平板。病毒基因組(由細菌攜帶)中未插入融合序列的菌落為藍色。收集白色的單菌落，通過標準的質(zhì)粒純化方法從細菌中分離病毒DNA(桿狀病毒穿梭載體)。然后在培養(yǎng)瓶中用Cellfectin試劑以病毒DNA轉(zhuǎn)染Sf9細胞或Sf21細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC))。
Sf9細胞的小規(guī)模蛋白表達的測定從轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)物中收集含有病毒的介質(zhì)，用于感染以增加其效價。經(jīng)兩輪感染后得到的含有病毒的介質(zhì)用于大規(guī)模蛋白表達。對于大規(guī)模蛋白表達，以5×107個細胞/板接種到100cm2圓底組織培養(yǎng)板，用1mL的含有病毒的介質(zhì)(約5MOI)進行感染。3天后，將細胞自板中刮出并在500rpm下離心5分鐘。將得自10-20個100cm2板的細胞沉淀重懸于50ml冰冷的裂解緩沖液(25mM Tris-HCl(pH 7.5)、2mM EDTA、1％NP-40、1mM DTT，1mM PMSF)。細胞在冰上攪拌15分鐘，然后在5000rpm下離心20分鐘。
純化GST-標記的蛋白將離心后的細胞裂解物加入2mL谷胱甘肽-瓊脂糖柱(Pharmacia)，并用10mL的25mM Tris-HCl(pH 7.5)、2mMEDTA、1mM DTT、200mM NaCl洗滌三次。然后將GST-標記的蛋白質(zhì)用25mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM還原型谷胱甘肽、100mM NaCl、1mM DTT、10％甘油的溶液洗脫10次(每次1mL)，儲存于-70℃。
酶活性的測定在終體積為30μL的含有200-1800ng酶蛋白(取決于比活性)、20mM Tris-HCl(pH 7.6)、3mM MnCl2、3mM MgCl2、1mMDTT、10μM Na3VO4、3μg/mL多聚(Glu，Tyr)4∶1、1％DMSO、6.0μM ATP和0.1μCi[γ33P]ATP的溶液中，用純化的GST-Flt2進行酪氨酸蛋白激酶試驗。在有或無抑制劑存在下，通過測定從[γ33P]ATP摻入多聚(Glu，Tyr)底物中的33P來分析活性。試驗在環(huán)境溫度下按上述條件于96孔板中進行20分鐘(30μl/孔)，通過加入20μL的125mM EDTA中止試驗。隨后將40μL的各反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到Immobilon-PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，USA)上，該膜預(yù)先用甲醇浸泡5分鐘，用水洗滌，然后用0.5％H3PO4浸泡5分鐘并且將其置于斷開真空源的多頭真空抽吸裝置上。點上所有的樣品后，連接真空，用200μL的0.5％H3PO4洗滌各孔。移出膜并在震蕩器上用1.0％H3PO4洗滌四次，用乙醇洗滌一次。在環(huán)境溫度下干燥并置于Packard TopCount 96孔架上，加入10μL/孔的Microscint TM(Packard)后，分別對膜進行計數(shù)。通過每個化合物在四種濃度下(通常為0.01、0.1、1和10μM)(一式兩份)的抑制百分率的線性回歸分析來計算IC50值。蛋白激酶活性的一個單位定義為于37℃下每分鐘每mg蛋白從[γ33P]ATP向底物多肽轉(zhuǎn)移1nmol的33P ATP。本發(fā)明化合物在此顯示的IC50值范圍從0.03到100μM，優(yōu)選0.2-10μM。
基于細胞的試驗可用于替代地或另外地鑒定突變的FLT3酪氨酸激酶受體的抑制劑。一般的方法包括在依賴突變的FLT3進行增殖的細胞系與不依賴突變的FLT3進行增殖的細胞系中，對可能的抑制劑的作用進行比較。使用表達兩種不同類型的突變、激活的FLT3的細胞系 -表達在受體近膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)具有“內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)”(ITD)的FLT3突變體的Ba/F3-FLT3-ITD細胞。
-表達含有第835位天冬酰胺轉(zhuǎn)變成酪氨酸的突變的FLT3受體的Ba/F3-FLT3-D835Y細胞。
所測定的本發(fā)明化合物顯示出抑制Ba/F3-FLT3-ITD和Ba/F3-D835Y細胞的增殖，另一方面，它們在高達500nM的濃度下通常不抑制未轉(zhuǎn)化的Ba/F3細胞的生長，且本發(fā)明化合物對Ba/F3-FLT3-ITD細胞的生長抑制作用可通過加入高濃度的IL-3以提供替代的生存信號而逆轉(zhuǎn)。在抑制FLT3-依賴性細胞系增殖所需的濃度下，本發(fā)明化合物顯示出對于一些不具有突變的FLT3受體(過度活化的激酶)的人類白血病與淋巴瘤細胞系沒有細胞毒性，提示該藥物作為細胞毒的藥物具有意料不到的高度特異性?？傮w而言，這些結(jié)果說明本發(fā)明化合物可以成為突變的FLT3受體酪氨酸激酶活性的有效抑制劑，是用于治療具有突變的FLT3受體的患者的有希望的候選物。具體而言，所測試的本發(fā)明化合物顯示可以在0.00015到1.0μM的濃度范圍內(nèi)抑制FLT3受體酪氨酸激酶的活性。
IGF1R BaF3-Tel-IGF1R是BaF3鼠的原B細胞淋巴細胞衍生物[BaF3細胞系可得自德國微生物與細胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)，Braunschweig，德國]，其通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)成為IL-3-依賴性的并具有激活的融合蛋白，該融合蛋白由人的Tel(aa1-452，UniProtP41212；GenBankU11732)、Ser-Arg接頭和人的IGF1R(aa976-1367，UniProtP08069；GenBankX04434)(Dr.J.Griffin，DanaFarber Cancer Institute，波士頓，美國，未發(fā)表)組成。將細胞培養(yǎng)在添加了2％L-谷氨酰胺(Animed#5-10K50-H)和10％胎牛血清(FCS，Animed#2-01F16-I)的RPMI-1640(Animed#1-14F01-I)中。野生型的未轉(zhuǎn)染的BaF3細胞維持在添加10U/ml IL-3(小鼠白介素-3，羅氏公司商品號1380745)的上述培養(yǎng)基中。
將細胞在新鮮的培養(yǎng)基中稀釋至終密度為3×105細胞/mL，并按50μL的等分量接種到96孔板(1.5×104細胞/孔)中。加入50μL的2×化合物溶液。通常采用激酶抑制劑PKC412作為內(nèi)標。用DMSO(0.1％終濃度)處理對照細胞作為生長對照(設(shè)為100％生長)。另外，按照慣例在僅含有100μL培養(yǎng)基而不含細胞的孔中測定板的空白值。自10μM開始，基于測試化合物的8個3倍系列稀釋液進行IC50測定。將細胞于37℃和5％CO2中孵育48小時后，基本按文獻所述(O′Brien J.等人，Eur.J.Biochem.2675421-5426，2000)通過刃天青鈉鹽染料還原試驗(商業(yè)上稱為AlamarBlue試驗)來評價化合物對細胞活力的影響。每孔加入10μL的AlamarBlue，將板于37℃和5％CO2中培養(yǎng)6小時。然后，用Gemini 96孔讀板器(Molecular Devices)測定熒光，讀板器設(shè)置如下544nm激發(fā)和590nm發(fā)射。
將所得原始數(shù)據(jù)輸出至Excel-文檔表格中。從所有的數(shù)據(jù)點減去板的空白值以進行數(shù)據(jù)分析。每個化合物濃度的殘余細胞活力表示為溶媒處理的對照細胞測定值(設(shè)為100％)的百分比。采用XLfit曲線擬合軟件確定IC50值(使細胞活力下降50％的值)。
VEGF-R(KDR)自身磷酸化 VEGF-誘導(dǎo)的受體自身磷酸化的抑制可以采用在細胞中的體外試驗證實，例如將轉(zhuǎn)染的CHO細胞(其永久性表達人VEGF-R2(KDR))接種于6-孔細胞培養(yǎng)板中的完全培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清＝FCS)中，于37℃在5％CO2中培養(yǎng)直到它們顯示約80％匯合。然后將待測化合物在培養(yǎng)基(不含F(xiàn)CS，含有0.1％牛血清白蛋白)中稀釋并加入細胞中。(對照含有培養(yǎng)基但不含受試化合物)。在37℃下培養(yǎng)2小時后，加入重組VEGF，使VEGF的終濃度為20ng/mL。再于37℃孵育5分鐘后，將細胞用冰冷的PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌兩次，立即在每孔100μL的裂解緩沖液中裂解。然后將溶胞產(chǎn)物離心除去細胞核，上清液中蛋白質(zhì)的濃度采用商業(yè)化的蛋白分析(BIORAD)進行測定。然后，溶胞產(chǎn)物可以立即使用，或者如果需要的話，存放于-20℃。
進行夾心ELISA以測定VEGF-R2的磷酸化作用將VEGF-R2的單克隆抗體(例如Mab 1495.12.14，由H.Towbin，Novartis制備，或類似的單克隆抗體)固定在黑色的ELISA板(OptiPlateTM HTRF-96，得自Packard)上。然后洗滌板子，剩余的游離蛋白結(jié)合位點用在含有Tween

(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單月桂酸酯，ICI/Uniquema)的磷酸鹽緩沖液(PBST)中的3％

(Juro，Cat.#TB232010)進行飽和。然后將細胞裂解產(chǎn)物(每孔20μg蛋白)和與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗磷酸酪氨酸抗體(PY20:AP，得自Zymed)一起在這些板中于4℃孵育過夜。將板子再次洗滌后，采用發(fā)光AP底物(CDP-Star，即開即用型，含有Emerald II，Applied Biosystems)證明抗磷酸酪氨酸抗體與捕捉的磷酸化受體的結(jié)合。在Packard TopCount Microplate閃爍計數(shù)器中測定發(fā)光。陽性對照(采用VEGF刺激)的信號和陰性對照(沒有采用VEGF刺激)的信號的差異對應(yīng)于VEGF-誘導(dǎo)的VEGF-R2磷酸化(＝100％)。受試物質(zhì)的活性以VEGF-誘導(dǎo)的VEGF-R2磷酸化的抑制百分率進行計算，其中誘導(dǎo)產(chǎn)生最大抑制的一半的物質(zhì)濃度被定義為IC50(達到50％抑制的抑制劑量)。本發(fā)明化合物在此顯示的IC50的范圍為0.01-20μM，特別是在0.1和1.0μM之間。
VEGF-R1 VEGF-R1的抑制可以顯示如下使用Flt-1VEGF-受體酪氨酸激酶進行該試驗。詳細方法如下將在20mM Tris·HCl(pH 7.5)、3mM二氯化錳(MnCl2)、3mM氯化鎂(MgCl2)和3μg/mL聚(Glu，Tyr)4∶1(Sigma，Buchs，瑞士)、8μM[33P]-ATP(0.2μCi/批)、1％二甲亞砜中的30μL激酶溶液(Flt-1的激酶結(jié)構(gòu)域，Shibuya等人，Oncogene 5，519-24[1990]，根據(jù)其比活性進行調(diào)整以便在沒有抑制劑的樣品中獲得4000-6000每分鐘計數(shù)[cpm]的活性)和0-50μM的受試化合物一起于室溫下培養(yǎng)10分鐘。然后通過加入10μL的0.25M、pH 7的乙二胺四乙酸鹽(EDTA)中止反應(yīng)。采用多通道分配器(LAB SYSTEMS，USA)按20μL的等分量置于PVDF(＝聚二氟乙烯)Immobilon P膜(Millipore，USA)上，將其裝配到Millipore微量滴度過濾器歧管上，連接真空。完全除去液體后，將膜在含有0.5％磷酸(H3PO4)的浴中連續(xù)洗滌四次，每次孵育10分鐘同時振搖，然后置于Hewlett Packard TopCount Manifold中，加入10μL

(β-閃爍計數(shù)液，Packard USA)后測定放射性。通過每個化合物3種濃度(通常為0.01、0.1和1μM)的抑制百分率的線性回歸分析來確定IC50值。
本發(fā)明化合物作為腫瘤生長抑制劑的效能可使用多種體內(nèi)模型來證明，例如，如下所述 例如，為了測試本發(fā)明的化合物，例如下面所給出的實施例之一的化合物是否能在體內(nèi)抑制VEGF-介導(dǎo)的血管生成，測試了其在生長因子移植小鼠模型中對VEGF誘導(dǎo)的血管生成效應(yīng)的影響將填充了含有肝素(20單位/ml)且含有或不含生長因子(2μg/ml人VEGF)的0.8％w/v瓊脂的多孔聚四氟乙烯室(體積為0.5ml)皮下植入到C57/C6小鼠的背側(cè)脅腹。在植入所述室的當(dāng)天開始并在其后持續(xù)4天用試驗化合物(例如25、50或100mg/kg口服，每天一次)或賦形劑對小鼠進行處理。在所述的處理結(jié)束時，處死小鼠，取出所述的室。小心地取下在該室周圍生長的血管化組織并對其稱重，通過測量該組織的血紅蛋白含量來評估其含血量(Drabkins法；Sigma，Deisenhofen，德國)。先前已證實這些生長因子以劑量依賴性方式誘導(dǎo)生長于所述室周圍的組織(組織學(xué)特征為含有成纖維細胞和小血管)的重量和含血量增加，并且該效應(yīng)被特異性地中和VEGF的抗體所阻斷(參見Wood JM等人，Cancer Res.60(8)，2178-2189，(2000)；和Schlaeppi等人，J.Cacner Res.Clin.Oncol.125，336-342，(1999))。
如果測試的話，采用這類模型能夠顯示本發(fā)明化合物對腫瘤生長的抑制作用。
Tie-2受體自身磷酸化 可以使用細胞的體外試驗證實Tie-2受體自身磷酸化的抑制，例如，將轉(zhuǎn)染的COS細胞(ATCC號CRL-1651)(其永久性表達人Tie-2(SwissProt AccNo Q02763))接種于6-孔細胞培養(yǎng)板中的完全培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清＝FCS)中，并將其在37℃、5％CO2下培養(yǎng)至其表現(xiàn)出約90％的匯合。然后，將待測化合物用培養(yǎng)基(不含F(xiàn)CS，含有0.1％牛血清白蛋白)稀釋并將其加入到所述細胞中。對照含有無待測化合物的培養(yǎng)基。將其在37℃下培養(yǎng)40分鐘后，向其中加入原釩酸鹽至終濃度10mM。將其在37℃下再培養(yǎng)20分鐘后，這些細胞用冰冷的PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌兩次并立即在每孔100μl的裂解緩沖液中進行裂解。然后，離心該溶胞產(chǎn)物以除去細胞核，并用商業(yè)化的蛋白分析(BIORAD)測定上清液中的蛋白濃度。然后，可立即使用該溶胞產(chǎn)物或者如果需要的話，儲存于-20℃。
進行夾心ELISA以測定Tie-2磷酸化將Tie-2的單克隆抗體(例如抗-Tie2的克隆AB33，Upstate，目錄號05-584，或類似的單克隆抗體)用0.1ml的2μg/ml溶液在黑色的ELISA板(OptiPlateTM HTRF-96，得自Packard)上進行固定。然后，洗滌這些板并將剩余的游離蛋白結(jié)合位點用在含有Tween

(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單月桂酸酯，ICI/Uniquema)的磷酸鹽緩沖液(PBST)中的3％

(Juro，目錄號TB232010)進行飽和。然后，將該溶胞產(chǎn)物(100μg蛋白/孔)在這些板中在4℃下與偶聯(lián)了堿性磷酸酶的抗磷酸酪氨酸抗體(PY20:AP，得自Zymed)一起孵育過夜。再次洗滌這些板子后，用發(fā)光AP底物(CDP-Star，即開即用型，含Emerald II；Applied Biosystem)測定抗磷酸酪氨酸抗體與所捕捉的磷酸化受體的結(jié)合。在Packard Top Count Microplate閃爍計數(shù)器中對發(fā)光進行測量。陽性對照(用釩酸鹽刺激)的信號和陰性對照(未刺激)的信號之間的差異對應(yīng)于Tie-2磷酸化的最大值(＝100％)。受試物質(zhì)的活性以Tie-2磷酸化最大值的抑制百分率進行計算，并將誘導(dǎo)了最大抑制的一半的物質(zhì)濃度定義為IC50(50％抑制的抑制劑量)。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物的IC50值優(yōu)選在0.05至20μM的范圍內(nèi)，例如更優(yōu)選0.1-10μM。
本發(fā)明化合物在本文所述的試驗測定和試驗方法中表現(xiàn)出活性，因此表明可用作藥物，例如用于治療由蛋白激酶活性介導(dǎo)的病癥。
考慮到它們調(diào)節(jié)(尤其是抑制)蛋白激酶的特性和/或可能的其它還未了解的機制，本發(fā)明化合物可以用于治療多種包括下面所述的增殖性疾病和/或依賴于(尤其是不適宜的)蛋白激酶活性的疾病。
例如，本發(fā)明的化合物可用于治療(成人或兒童型的)白血病，尤其是慢性骨髓性白血病(CML)、AML(急性骨髓性白血病)、伴有三系骨髓發(fā)育不良的AML(AML/TMDS)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、骨髓增生異常綜合征(MDS)，以及MLL(混合性白血病)；不同的(尤其是原發(fā)性的，還有衍生的)實體瘤(包括良性的或尤其是惡性的)，例如肉瘤(例如尤因肉瘤、卡波西肉瘤或軟組織肉瘤例如隆突性皮膚纖維肉瘤)、胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)、精原細胞瘤、類癌、肥大細胞瘤、肺癌(例如小細胞或大細胞肺癌)、支氣管癌(例如小細胞支氣管癌)、精原細胞癌、無性細胞癌、睪丸上皮內(nèi)瘤樣變、黑色素瘤、乳房癌、成神經(jīng)細胞瘤、乳頭狀/濾泡狀甲狀腺癌、惡性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、2型多發(fā)性內(nèi)分泌瘤病(MEN 2)、嗜鉻細胞瘤、甲狀腺癌(例如甲狀腺髓樣癌)、甲狀旁腺過度增生/腺瘤、乳房癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、前列腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、腦瘤、前列腺癌(也包括腺癌和骨轉(zhuǎn)移)、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤(星形細胞瘤/成膠質(zhì)細胞瘤)、胰腺癌、惡性胸膜間皮瘤、成血管細胞瘤、血管瘤、腎癌、肝癌、腎上腺癌、膀胱癌、胃部癌癥(尤其是胃癌)、直腸癌、陰道癌、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、多發(fā)性骨髓瘤、頸部和頭部的腫瘤(例如頭部和頸部的鱗狀癌)，包括瘤的形成，尤其是上皮特征的瘤形成(例如在乳房癌的情況中)，惡性腎硬化； 或其它增生或增殖性疾病，例如肥大細胞增生病、相關(guān)的骨髓增生綜合征、色素性蕁麻疹、表皮過度增生(并非癌癥)，尤其是牛皮癬；前列腺肥大；炎性疾病，例如風(fēng)濕樣或風(fēng)濕性炎性疾病(特別是關(guān)節(jié)炎，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、其它慢性炎性病癥(例如慢性哮喘)、動脈或移植手術(shù)后的動脈粥樣硬化、其它與失控的血管生成有關(guān)的疾病，例如纖維化(尤其是肺纖維化，還有其它類型的纖維化，例如腎纖維化)、血管生成、血管平滑肌增生(例如狹窄或血管成形術(shù)后(例如支架誘導(dǎo)的)再狹窄)；(例如缺血性)視網(wǎng)膜病變、(例如，年齡相關(guān)性)黃斑變性、其它眼病，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病和新生血管性青光眼；腎病，例如腎小球腎炎；糖尿病性腎?。谎仔阅c病(例如克羅恩病)、血栓性微血管綜合征；(例如慢性)移植排斥和腎小球??；纖維變性的疾病，例如肝硬化；腎小球系膜細胞增殖性疾病和或神經(jīng)組織的損傷。
此外，本發(fā)明化合物可用作免疫抑制劑，例如作為無疤痕的傷口愈合的輔劑，以及用于治療老年斑與接觸性皮炎。
雖然在“發(fā)明背景”中已陳述了機制，但是tie-2的抑制還是令人驚奇地表現(xiàn)出對增殖性疾病、尤其是實體瘤有效。
本文所用的病癥包括疾病。
通過蛋白激酶活性介導(dǎo)的以及易于使用蛋白激酶活性介導(dǎo)劑，例如調(diào)節(jié)劑、例如抑制劑(例如本發(fā)明的化合物)來成功進行治療的病癥，包括例如其中一種或多種蛋白激酶發(fā)揮病因或參與作用的病癥，例如與阻斷蛋白激酶與其底物結(jié)合有關(guān)的病癥，例如對本發(fā)明的化合物對蛋白激酶的調(diào)節(jié)、特別是抑制有響應(yīng)的病癥。
易于通過本發(fā)明化合物調(diào)節(jié)的蛋白激酶活性優(yōu)選地是例如蛋白酪氨酸激酶，例如一種或多種選自tie-2和/或PDGFR、VEGFR-2、c-Abl、Flt3、Ret、kit和IGF1R的蛋白激酶，例如和/或任何一種或多種這些蛋白激酶的一種或多種改變或突變的形式的蛋白激酶的活性。
通過例如本發(fā)明化合物所調(diào)節(jié)的蛋白激酶活性介導(dǎo)的病癥，包括例如但不限于以下病癥或與其相關(guān)的病癥 -白血病、實體瘤或其他增生或增殖性疾病， -炎性疾病，慢性炎性病癥， -與失控的血管發(fā)生有關(guān)的疾病， -眼病， -腎病， -炎性腸病， -血栓性微血管病綜合征， -(慢性)移植排斥和腎小球病， -纖維變性疾病， -腎小球系膜細胞增殖性疾病， -神經(jīng)組織損傷， -呼吸道和肺， -風(fēng)濕病， -移植， -血栓性微血管病綜合征， -腎小球系膜細胞增殖性疾病， -神經(jīng)組織損傷， -免疫抑制。
優(yōu)選本發(fā)明的化合物可以用作治療一種或多種增殖性病癥的藥物。
在另一方面，本發(fā)明提供了 -用作藥物的本發(fā)明化合物， -本發(fā)明化合物作為藥物的用途， 例如用于治療由蛋白激酶活性介導(dǎo)的病癥的藥物。
對于藥物用途，可以使用本發(fā)明的一種或多種化合物，例如一種化合物，或者兩種或多種本發(fā)明化合物的組合，優(yōu)選使用一種本發(fā)明化合物。
本發(fā)明化合物可以以藥物組合物的形式用作藥物。
在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明化合物和至少一種可藥用的賦形劑的藥物組合物，所述賦形劑例如適宜的載體和/或稀釋劑，例如包括填充劑、粘合劑、崩解劑、流動調(diào)節(jié)劑、潤滑劑、糖類或甜味劑、香味劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑和/或乳化劑、增溶劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽類和/或緩沖劑。
在另一方面，本發(fā)明提供了 -用于治療由蛋白激酶活性介導(dǎo)的病癥的本發(fā)明的藥物組合物。
-本發(fā)明的藥物組合物在治療由蛋白激酶活性介導(dǎo)的病癥中的用途。
-用于治療由蛋白激酶活性介導(dǎo)的病癥的本發(fā)明的化合物。
本發(fā)明的另一方面提供了治療由蛋白激酶活性介導(dǎo)的病癥的方法，例如包括如上所述的病癥，該治療包括向需要這種治療的個體施用治療有效量的本發(fā)明化合物；例如以藥物組合物的形式。
“需要這種治療的個體”，例如本文所用的，包括患者，例如動物，例如溫血動物，更優(yōu)選哺乳動物，特別是人。
“治療有效量”優(yōu)選地是指對所述病癥有效的量。
在另一方面，本發(fā)明提供了 -用于制備藥物的本發(fā)明化合物， -本發(fā)明化合物在制備治療由蛋白激酶活性介導(dǎo)的病癥的藥物、例如藥物組合物中的用途。
本文所用的病癥(疾病)的治療包括預(yù)防。
對于所述治療而言，適宜的劑量當(dāng)然將根據(jù)例如所用的本發(fā)明化合物的化學(xué)性質(zhì)和藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)、個體宿主，例如需要這種治療的個體的體重、年齡和個體情況、給藥方式以及所治療病癥的性質(zhì)和嚴重性而變化。但是一般而言，為了在大型哺乳動物例如人類中獲得滿意的結(jié)果，推薦的日劑量包括以下范圍 -約0.0001g到約1.5g，例如0.001g到1.5g； -約0.001mg/kg體重到約20mg/kg體重，例如0.01mg/kg體重到20mg/kg體重， 例如，以每日最多四次的分次劑量進行給藥。
通常，兒童可以接受成人劑量的一半。
藥物組合物包含約1％到約96％、優(yōu)選約20％到約95％的活性成分。
本發(fā)明的化合物可以通過任何常規(guī)的途徑給藥，例如胃腸內(nèi)，例如包括經(jīng)鼻、含服、直腸、口服給藥；胃腸外，例如包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、心內(nèi)、皮下、骨內(nèi)輸注，經(jīng)皮(通過完整的皮膚的擴散)、經(jīng)粘膜(通過粘膜的擴散)、吸入給藥；局部給藥，例如包括經(jīng)表皮、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)給藥；腹膜內(nèi)給藥(注射或輸注到腹腔中)；硬膜外給藥(注射或輸注到硬膜外腔中)；鞘內(nèi)給藥(注射或輸注到腦脊液中)；玻璃體內(nèi)(通過眼睛給藥)；或者通過醫(yī)療裝置給藥，例如用于局部遞送，例如支架； 例如以包衣或未包衣的片劑、膠囊、(可注射的)溶液劑、固體溶液、混懸液、分散體系、固體分散體系的形式；例如以安瓿劑、小瓶劑的形式，以霜劑、凝膠劑、糊劑、吸入器粉末、泡沫劑、酊劑、唇膏、滴劑、噴霧劑的形式，或者以栓劑的形式給藥。
對于局部應(yīng)用，例如包括對眼部給藥，采用每日數(shù)次、例如每日2-5次局部施用0.5-10％、例如1-3％濃度的活性成分，可以得到滿意的結(jié)果。
本發(fā)明的化合物可以以可藥用鹽的形式或游離形式給藥；任選地為溶劑化物形式。鹽形式和/或溶劑化物形式的本發(fā)明化合物具有與游離形式的本發(fā)明化合物相同等級的活性。
本發(fā)明化合物可以單獨地用于或者與一種或多種、至少一種其他的第二藥物組合用于本文所述的任何方法或用途。
在另一方面，本發(fā)明提供了 -本發(fā)明化合物與至少一種第二藥物的組合； -藥物組合產(chǎn)品，其包含本發(fā)明化合物與至少一種第二藥物； -藥物組合物，其包含本發(fā)明化合物與至少一種第二藥物以及一種或多種可藥用的賦形劑； -與至少一種第二藥物組合的本發(fā)明化合物，例如以藥物組合產(chǎn)品或組合物的形式用于本文所定義的任何方法，例如 -組合、藥物組合產(chǎn)品或藥物組合物，其包括用作藥物的本發(fā)明化合物與至少一種第二藥物； -本發(fā)明化合物與至少一種第二藥物作為藥物的用途，例如以藥物組合產(chǎn)品或組合物的形式； -本發(fā)明化合物在制備用于與第二藥物組合的藥物中的用途； -一種在需要其的個體中治療由蛋白激酶活性介導(dǎo)的病癥的方法，該方法包括同時或先后地聯(lián)合施用治療有效量的本發(fā)明化合物和至少一種第二藥物，例如以藥物組合產(chǎn)品或組合物的形式； -與至少一種第二藥物組合的本發(fā)明化合物，例如以藥物組合產(chǎn)品或組合物的形式，用來制備用于由蛋白激酶活性介導(dǎo)的病癥的藥物。
組合包括固定組合，其中本發(fā)明化合物和至少一種第二藥物在同一制劑中；藥盒，其中本發(fā)明化合物和至少一種第二藥物在由同一包裝提供的不同制劑中，例如帶有聯(lián)合給藥的說明書的包裝；以及自由組合，其中本發(fā)明化合物和至少一種第二藥物分別進行包裝，但是給出了用于同時或先后給藥的說明書。
在另一方面，本發(fā)明提供了 -藥物包裝，其包含第一藥物即本發(fā)明化合物和至少一種第二藥物，此外還有用于聯(lián)合給藥的說明書； -藥物包裝，其包含本發(fā)明化合物，此外還有用于和至少一種第二藥物聯(lián)合給藥的說明書； -藥物包裝，其包含至少一種第二藥物，此外還有用于和本發(fā)明化合物聯(lián)合給藥的說明書。
采用本發(fā)明的組合進行治療可以提供與單一治療相比更好的改進。
在另一方面，本發(fā)明提供了 -藥物組合產(chǎn)品，其包含一定量的本發(fā)明化合物和一定量的第二藥物，其中所述的量適合產(chǎn)生協(xié)同的療效； -改進本發(fā)明化合物的治療應(yīng)用的方法，該方法包括例如同時或先后地聯(lián)合施用治療有效量的本發(fā)明化合物和第二藥物； -改進第二藥物的治療應(yīng)用的方法，該方法包括例如同時或先后地聯(lián)合施用治療有效量的本發(fā)明化合物和第二藥物。
本發(fā)明的組合以及作為組合伙伴的第二藥物可以通過任何常規(guī)途徑施用，例如如上文對本發(fā)明化合物所述的那樣。第二藥物可以酌情按照適宜的劑量進行施用，例如以類似于單一治療所用劑量的劑量范圍進行施用，或者，例如在有協(xié)同效應(yīng)的情況下，甚至可低于常規(guī)的劑量范圍。
本發(fā)明的藥物組合物可以按照例如類似于常規(guī)的方法進行制備，例如通過混合、制粒、包衣、溶解或凍干的方法制備。單位劑量形式可以包含例如約0.1mg到約1500mg，例如1mg到約1000mg。
包含本發(fā)明的組合的藥物組合物以及包含如本文所述的第二藥物的藥物組合物可以在適宜情況下，例如按照，例如類似于常規(guī)方法或如本文所述的用于本發(fā)明藥物組合物的方法來提供。
優(yōu)選使用活性成分的溶液劑以及混懸劑，特別是等滲的水性溶液劑或混懸劑，例如在凍干組合物的情況下，其可能是包含單獨的活性成分或活性成分與載體如甘露醇的凍干組合物，用于在使用前制備所述的溶液劑或混懸劑。藥物組合物可以是滅菌的和/或可以包含賦形劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑和/或乳化劑、增溶劑、用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽類和/或緩沖劑，并且以本身已知的方法進行制備，例如借助常規(guī)的溶解或凍干方法。所述溶液劑或混懸劑可以包含增加粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮或明膠。
口服給藥的藥物組合物可以通過下述過程獲得將活性成分與固體載體混合，如果需要的話將所得混合物制粒，并且在需要或必需的情況下加入適宜的賦形劑，隨后將混合物加工成片劑、糖錠劑核或膠囊劑。也可能將其摻入塑料載體中，所述載體能使活性成分以預(yù)定的量擴散或釋放。
術(shù)語“第二藥物”是指化療藥物，特別是本發(fā)明化合物以外的任何化療劑。
例如，本文所用的第二藥物包括抗癌藥。
抗癌藥包括但不限于芳香酶抑制劑；抗雌激素藥物；拓撲異構(gòu)酶I抑制劑；拓撲異構(gòu)酶II抑制劑；微管活性藥物；烷化劑；組蛋白去乙酰酶抑制劑；誘導(dǎo)細胞分化過程的化合物；環(huán)氧化酶抑制劑；MMP抑制劑；mTOR抑制劑；抗腫瘤的抗代謝物；鉑化合物；靶向/降低蛋白或脂類激酶活性并進而抗血管生成的化合物；靶向、降低或抑制蛋白或脂類磷酸酶活性的化合物；戈那瑞林激動劑、抗雄激素藥物；甲硫氨酸氨基肽酶抑制劑；二膦酸鹽；生物學(xué)響應(yīng)調(diào)節(jié)劑；抗增殖的抗體；乙酰肝素酶抑制劑；Ras癌基因亞型的抑制劑；端粒酶抑制劑；蛋白酶體抑制劑；用于治療血液惡性腫瘤的藥物；靶向、降低或抑制Flt-3活性的化合物；Hsp90抑制劑；以及替莫唑胺
為了治療急性骨髓性白血病(AML)，式I化合物可與標準的白血病療法聯(lián)合應(yīng)用，尤其是與用于治療AML的療法聯(lián)合。具體而言，式I化合物可以與例如法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和/或其他用于治療AML的藥物，例如柔紅霉素、阿霉素、阿糖胞苷、VP-16、替尼泊苷、米托蒽醌、伊達比星、碳鉑和PKC412聯(lián)合給藥。
通過代碼編號、通用名或商品名鑒別的活性藥物的結(jié)構(gòu)可從標準一覽表“The Merck Index”的實際版本或從數(shù)據(jù)庫例如Patents International(例如IMS World Publications)中獲得。
可以用于與本發(fā)明化合物組合的第二藥物可以按照適宜的方式，例如常規(guī)方式，例如上文所引用的方式進行制備和給藥。
本發(fā)明化合物還可以用來與已知治療方法例如施用激素或特別是輻射相組合以突出其優(yōu)點。
式I的化合物特別是可以用作放射增敏劑，特別是用于治療對放療敏感性差的腫瘤。
如果本發(fā)明化合物與其他藥物聯(lián)合給藥，那么在本發(fā)明化合物的情況下，共同給藥的第二藥物的劑量當(dāng)然會根據(jù)所用共同藥物的類型、所用的具體藥物、所治療的病癥而變化。一般而言，與第二藥物的供應(yīng)商所提供劑量類似的劑量可能是適宜的。
下列實施例用于說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍。
溫度 以攝氏度來表示。除非另有說明，反應(yīng)在室溫下進行。
TLC條件Rf值表示每種物質(zhì)所移動的距離與展開劑前沿所移動距離的比例，其在硅膠薄層板，5×10cm TLC板、硅膠F254(Merck，Darm-stadt，德國)上用下述溶劑系統(tǒng)通過薄層色譜進行測定。
分析型HPLC條件 系統(tǒng)1 線性梯度20-100％CH3CN 5分鐘和100％CH3CN(0.1％TFA)1.5分鐘；于215nm處檢測，流速1mL/分鐘，在30℃下。柱Nucleosil 100-3C18(70×4.0mm) 系統(tǒng)2 線性梯度5-95％CH3CN 2.2分鐘和95％CH3CN(0.1％TFA)0.5分鐘；于215nm處檢測，流速2mL/分鐘，在35℃下。柱Sun Fire(Waters)3.5μmC18(3.0×20mm) 系統(tǒng)3 線性梯度5-100％CH3CN 8分鐘和100％CH3CN(0.1％HCOOH)1.8分鐘；于215nm處檢測，流速2mL/分鐘，在40℃下。柱XERRA-MS(Waters)5μm C18(50×4.6mm) 系統(tǒng)4 線性梯度20-100％CH3CN 5分鐘和100％CH3CN(0.1％TFA)1分鐘；于215nm處檢測，流速1mL/分鐘，在30℃下。柱Nucleosil 100-3C18(70×4.0mm) 縮寫與縮略語 ACN 乙腈(CH3CN) AcOH 乙酸 鹽水 NaCl飽和水溶液 t-Bu3P 三叔丁基膦 conc.濃的 CuI 碘化亞銅(I) DCM 二氯甲烷(CH2Cl2) DIEA 二異丙基乙胺 DMAP 4-(二甲氨基)吡啶 DMF N，N-二甲基甲酰胺 DMP 1，3-二甲基-3，4，5，6-四氫-2-(1H)-嘧啶酮 DMSO 二甲基亞砜 equiv當(dāng)量 Et3N 三乙胺 Et2NH二乙胺 Et2O 乙醚 EtOAc 乙酸乙酯 EtOH乙醇 h 小時 HPLC高壓液相色譜 L 升 Me 甲基 MeOH甲醇 ml 毫升 min 分鐘 MPLC中壓液相色譜 MS 質(zhì)譜 NMR 核磁共振 NMP 1-甲基-2-吡咯烷酮 PdCl2(dppf)2[1，1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(II) Pd(PhCN)2Cl2雙(芐腈)氯化鈀(II) Pd(PPh3)4 四(三苯基膦)鈀(0) Ph 苯基 i-Pr2NH 二異丙胺 Rf 遷移率(TLC) rt 室溫 TBTUO-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽 TFA 三氟乙酸 THF 氫呋喃 TLC 薄層色譜 tR 保留時間(HPLC) 商標 Celite

(西萊特公司)＝基于硅藻土的濾材 Nucleosil

Machery & Nagel的商標，Düren，F(xiàn)RG， 用于HPLC的材料 參考實施例02-(4-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基-苯基)-N-(3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺
將0.15ml的DIEA逐滴加入冷卻的(0℃)55mg粗的(4-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基-苯基)-乙酸、39mg的3-氨基三氟甲基苯和77mg的TBTU在0.5ml的DMF的混合物中。將所得混合物加溫至室溫，攪拌2小時，用EtOAc稀釋并用飽和NaHCO3水溶液、H2O和鹽水洗滌。將所得有機相干燥(Na2SO4)，過濾并在真空下濃縮。所得蒸發(fā)殘余物經(jīng)硅膠柱色譜純化。得到2-(4-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基-苯基)-N-(3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，為固體形式ES-MS397.0[M+H]+；單峰，位于tR＝3.52分鐘(系統(tǒng)1)；Rf＝0.18(CH2Cl2/MeOH，94∶6)。
起始原料按照如下步驟制備 步驟0.1(4-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基-苯基)-乙酸 將0.349g的(4-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基-苯基)-乙酸甲酯和3.5ml 6N的HCl水溶液的混合物攪拌并回流3小時。將所得混合物冷卻至室溫并在真空下濃縮。得到鹽酸鹽形式的(4-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基-苯基)-乙酸ES-MS254.0[M+H]+；單峰，位于tR＝1.20分鐘(系統(tǒng)1)。
步驟0.2(4-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基-苯基)-乙酸甲酯 攪拌0.356g的[4-(3-氨基-吡啶-4-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯和9.2ml原甲酸三乙酯的混合物并回流2小時。將所得混合物冷卻至室溫并真空濃縮。得到固體形式的(4-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基-苯基)-乙酸甲酯ES-MS268.1[M+H]+；單峰，位于tR＝2.03分鐘(系統(tǒng)1)。
步驟0.3[4-(3-氨基-吡啶-4-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯 將0.500g的4-氯-3-硝基-吡啶(LANCASTER)和0.467g的(4-氨基-苯基)-乙酸(Aldrich)在10ml MeOH/二噁烷(1/1v/v)中的混合物攪拌并回流6小時。將所得混合物冷卻到室溫，真空濃縮。得到粗的[4-(3-硝基-吡啶-4-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯。
在室溫下、在氫氣氛中將0.569g粗的[4-(3-硝基-吡啶-4-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯和0.140g的阮內(nèi)鎳在15ml MeOH中的混懸液攪拌21小時。通過一層硅藻土過濾所得混合物，并濃縮所得濾液。所得濃縮殘余物在CH2Cl2中研磨。得到固體形式的[4-(3-氨基-吡啶-4-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯ES-MS258.0[M+H]+；單峰，位于tR＝2.54分鐘(系統(tǒng)1)。
參考實施例1N-(3’-溴-2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酰胺
其按照類似于參考實施例0所述的方法來獲得，但是使用3’-溴-2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基胺代替3-氨基三氟甲基苯，使用(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酸代替(4-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基-苯基)-乙酸作為原料。ES-MS552.8[M+H]+；tR＝5.24分鐘(系統(tǒng)1)；Rf＝0.20(CH2Cl2/MeOH，96∶4)。
原料制備如下 步驟1.1(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酸 方法A 按照類似于步驟0.1所述的方法，但是使用(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酸甲酯代替(4-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基-苯基)-乙酸甲酯作為原料，得到(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酸。ES-MS254.0[M+H]+；tR＝2.35分鐘(系統(tǒng)1)。
方法B 在125℃下攪拌400mg的4-碘苯基乙酸、273mg的4-氮雜苯并咪唑、17.9mg的反式，反式-二芐亞基丙酮、303mg的1，10-菲咯啉、19.2mg銅(I)三氟甲磺酸鹽苯絡(luò)合物和547mg的Cs2CO3在1.5ml二甲苯中的混合物80小時。將所得混合物冷卻至室溫并真空濃縮。將所得濃縮殘余物溶于1N的NaOH水溶液中并用EtOAc萃取。向水層加入1N的HCl水溶液使其獲得酸性pH并用CH2Cl2萃取所得混合物。干燥所得有機層(Na2SO4)，過濾并濃縮。所得濃縮殘余物經(jīng)反相MPLC(CH3CN/H2O/TFA)純化。得到(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酸。
步驟1.2(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酸甲酯 其按照類似于步驟0.2所述的方法來獲得，但是使用[4-(3-氨基-吡啶-2-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯代替[4-(3-氨基-吡啶-4-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯作為原料。ES-MS268.0[M+H]+；tR＝3.20分鐘(系統(tǒng)1)。
步驟1.3[4-(3-氨基-吡啶-2-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯 將2g的[4-(3-硝基-吡啶-2-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯和0.600g阮內(nèi)鎳在40ml的MeOH(40ml)中的混懸液于室溫下在氫氣中攪拌4小時。所得混合物經(jīng)一層硅藻土過濾并濃縮。得到固體形式的[4-(3-氨基-吡啶-2-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯ES-MS258.0[M+H]+；tR＝2.30分鐘(系統(tǒng)1)；Rf＝0.15(己烷/EtOAc，1∶1)。
步驟1.4[4-(3-硝基-吡啶-2-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯 攪拌5.0g的2-氯-3-硝基-吡啶、4.75g的(4-氨基-苯基)-乙酸和HCl在7.85ml二噁烷中的4N溶液在100ml的MeOH/二噁烷(1∶1，v/v)中的混合物并回流30小時。向所得混合物中加入4.75g的(4-氨基-苯基)-乙酸，攪拌所得混合物并回流18小時。將所得混合物冷卻至室溫并真空濃縮。將所得濃縮殘余物溶于EtOAc中，用飽和NaHCO3水溶液洗滌所得混合物，干燥(Na2SO4)，過濾并濃縮。所得濃縮殘余物經(jīng)硅膠柱色譜純化。得到固體形式的[4-(3-硝基-吡啶-2-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯ES-MS288.0[M+H]+；tR＝4.71分鐘(系統(tǒng)1)；Rf＝0.20(己烷/EtOAc，4∶1)。
步驟1.53’-溴-2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-胺 將500mg的5-氨基-2-溴三氟甲基苯(Dakwood Products公司)、6.2mMol的3-溴苯基硼酸(Aldrich)、70mg的Pd(PPh3)4和5ml Na2CO3的2M水溶液在14ml甲苯中的混合物攪拌回流1小時。將所得混合物冷卻至室溫并經(jīng)硅藻土層過濾。分離所得濾層并用CH2Cl2萃取所得水相。用鹽水洗滌所得有機相，干燥(Na2SO4)，過濾并真空濃縮。所得濃縮殘余物經(jīng)MPLC(CH3CN/H2O/TFA)純化。得到3’-溴-2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-胺。MS315.9[M-1]-；HPLC DtRet＝4.9；Rf＝0.16(己烷/EtOAc，4∶1)。
參考實施例22-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺
其按照類似于實施例1所述的方法來獲得，但是使用(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-乙酸代替(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酸和4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯基胺代替3’-溴-2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基胺作為原料(參見WO 03/099771)。ES-MS508.0[M+H]+；單峰，位于tR＝2.84分鐘(系統(tǒng)1)；Rf＝0.10(CH2Cl2/MeOH+1％NH3aq，9∶1)。
原料制備如下 步驟2.1(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-乙酸 方法A 按照類似于步驟1.1所述的方法來獲得(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-乙酸，但是使用(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-乙酸甲酯代替4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酸甲酯作為原料。ES-MS253.1[M+H]+；單峰，位于tR＝2.36分鐘(系統(tǒng)1)。
方法B 在45℃下將0.535g的(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-乙酸甲酯和2ml LiOH的1N水溶液在2ml的THF中的混合物攪拌3小時。將所得混合物冷卻至室溫并通過加入0.5N的鹽酸水溶液酸化至pH5。固體沉淀并經(jīng)真空過濾收集。得到(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-乙酸。ES-MS253.1[M+H]+；單峰，位于tR＝2.36分鐘(系統(tǒng)1)。
方法C 在125℃下攪拌4.4g的4-碘苯基乙酸、2.98g的苯并咪唑、197mg的反式，反式-二芐亞基丙酮、3.33g的1，10-菲咯啉、211mg銅(I)三氟甲磺酸鹽苯絡(luò)合物和6g的Cs2CO3在12ml二甲苯中的混合物88小時。將所得混合物冷卻至室溫并真空濃縮。將所得濃縮殘余物溶于1N的NaOH水溶液中并用EtOAc萃取所得混合物。通過加入1N的HCl水溶液將所得水層的pH調(diào)至酸性pH。沉淀形成并經(jīng)真空過濾收集(第1批)。用CH2Cl2萃取所得濾液中的水相。干燥有機相(Na2SO4)，過濾并濃縮。所得濃縮殘余物(第2批)與第1批合并，并在Et2O中研磨。得到3.58g的(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-乙酸。
步驟2.2(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-乙酸甲酯 其按照類似于步驟1.2所述的方法來獲得，但是使用[4-(2-氨基-苯基氨基)-苯基]-乙酸甲酯代替4-(3-氨基-吡啶-2-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯作為原料。ES-MS267.1[M+H]+；單峰，位于tR＝3.00分鐘(系統(tǒng)1)。
步驟2.3[4-(2-氨基-苯基氨基)-苯基]-乙酸甲酯 將0.700g[4-(2-硝基-苯基氨基)-苯基]-乙酸甲酯和0.240g的Pd/C(10％)在20ml的MeOH中的混懸液于室溫下在氫氣中攪拌3小時。將所得混合物經(jīng)硅藻土層過濾并濃縮所得濾液。得到油形式的[4-(2-氨基-苯基氨基)-苯基]-乙酸甲酯ES-MS257.1[M+H]+；單峰，位于tR＝3.04分鐘(系統(tǒng)1)。
步驟2.4[4-(2-硝基-苯基氨基)-苯基]-乙酸甲酯 將1.0g的[4-(2-硝基-苯基氨基)-苯基]-乙酸和0.4ml濃HCl在20ml的MeOH中的混合物攪拌并回流1小時。將所得混合物冷卻至室溫，并真空濃縮。用CH2Cl2稀釋所得濃縮物，用飽和NaHCO3水溶液、H2O和鹽水洗滌所得混合物，干燥(Na2SO4)，過濾并濃縮。所得濃縮物經(jīng)硅膠柱色譜純化。得到油形式的[4-(2-硝基-苯基氨基)-苯基]-乙酸甲酯ES-MS287.0[M+H]+；單峰，位于tR＝5.01分鐘(系統(tǒng)1)；Rf＝0.20(己烷/EtOAc，4∶1)。
步驟2.5[4-(2-硝基-苯基氨基)-苯基]-乙酸 在170℃將1.5ml的2-硝基氟苯(Aldrich)、1.44g的4-氨基苯基乙酸和0.550g的KF的混合物在密封試管中攪拌16小時。將所得混合物冷卻至室溫，在CH2Cl2/MeOH(95∶5)中研磨并過濾。濃縮所得濾液并將濃縮物經(jīng)硅膠柱色譜純化。得到固體形式的[4-(2-硝基-苯基氨基)-苯基]-乙酸ES-MS273.0[M+H]+；單峰，位于tR＝4.44分鐘(系統(tǒng)1)；Rf＝0.20(CH2Cl2/MeOH，95∶5)。
參考實施例32-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[4-(4-異丙基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺
其按照類似于實施例1所述的方法來獲得，但是使用(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酸代替(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酸，使用4-(4-異丙基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯基胺代替3’-溴-2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基胺(參見WO 03/099771)。ES-MS570.9[M+H]+；單峰，位于tR＝3.46分鐘(系統(tǒng)1)；Rf＝0.26(CH2Cl2/MeOH+1％NH3aq，9∶1)。
原料制備如下 步驟3.1(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酸 在40℃將0.325g的(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酸乙酯和2ml的0.5N LiOH水溶液在2ml的THF中的混合物攪拌1小時。將所得混合物冷卻至室溫并通過加入0.5N的HCl水溶液調(diào)至酸性pH。沉淀形成并通過真空過濾收集沉淀。得到固體形式的(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酸。ES-MS288.0[M+H]+；單峰，位于tR＝3.00分鐘(系統(tǒng)1)。
步驟3.2(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酸乙酯 其按照類似于步驟1.2所述的方法來獲得，但是使用[4-(3-氨基-吡啶-2-基氨基)-2-氯-苯基]-乙酸乙酯代替[4-(3-氨基-吡啶-2-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯作為原料。ES-MS316.1[M+H]+；單峰，位于tR＝4.24分鐘(系統(tǒng)1)；Rf＝0.16(己烷/EtOAc，1∶1)。
步驟3.3[4-(3-氨基-吡啶-2-基氨基)-2-氯-苯基]-乙酸乙酯 其按照類似于步驟1.3所述的方法來獲得，但是使用[2-氯-4-(3-硝基-吡啶-2-基氨基)-苯基]-乙酸乙酯代替[4-(3-硝基-吡啶-2-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯作為原料，以EtOH代替MeOH作為溶劑，并在室溫下攪拌反應(yīng)混合物22小時代替4小時。ES-MS306.1[M+H]+；單峰，位于tR＝3.06分鐘(系統(tǒng)1)；Rf＝0.16(己烷/EtOAc，1∶1)。
步驟3.4[2-氯-4-(3-硝基-吡啶-2-基氨基)-苯基]-乙酸乙酯 將0.600g的2-氯-3-硝基-吡啶(Aldrich)和0.800g的(4-氨基-2-氯-苯基)-乙酸乙酯(參見WO 97/21665)在20ml的EtOH/二噁烷(1∶1，v/v)中的混合物攪拌并回流72小時。將所得混合物冷卻至室溫并真空濃縮。所得濃縮物經(jīng)硅膠柱色譜純化。得到固體，將其用Et2O研磨。得到固體形式的[2-氯-4-(3-硝基-吡啶-2-基氨基)-苯基]-乙酸乙酯。ES-MS336.0[M+H]+；單峰，位于tR＝5.59分鐘(系統(tǒng)1)；Rf＝0.39(己烷/EtOAc，7∶3)。
參考實施例4N-(4-二乙基氨基甲基-3-三氟甲基-苯基)-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-乙酰胺
其按照類似于參考實施例1所述的方法來獲得，但是使用(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-乙酸代替(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酸和4-二乙基氨基甲基-3-三氟甲基-苯基胺(在WO2005/051366中公開)代替3’-溴-2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基胺作為原料。ES-MS496.0[M+H]+；tR＝3.31分鐘(系統(tǒng)1)；Rf＝0.43(CH2Cl2/MeOH，95∶5+0.1％NH3aq)。
步驟4.1(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-乙酸 其按照類似于參考實施例2的步驟2.1的方法B所述的方法來獲得，但是使用(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-乙酸甲酯代替(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-乙酸甲酯。ES-MS268.1[M+H]+；tR＝2.59分鐘(系統(tǒng)1)。
步驟4.2(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-乙酸甲酯 在150℃下將1.92g的[4-(3-氨基-吡啶-2-基氨基)-2-甲基-苯基]-乙酸甲酯和30ml原甲酸三乙酯的混合物攪拌3小時。將所得混合物冷卻至室溫并真空濃縮。得到4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-乙酸甲酯。ES-MS282.1[M+H]+；tR＝3.39分鐘(系統(tǒng)1)。
步驟4.3[4-(3-氨基-吡啶-2-基氨基)-2-甲基-苯基]-乙酸甲酯 將2.2g的[2-甲基-4-(3-硝基-吡啶-2-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯和220mg阮內(nèi)鎳的混懸液于室溫下在氫氣中攪拌6.5小時。將所得混合物經(jīng)硅藻土層過濾并濃縮。得到[4-(3-氨基-吡啶-2-基氨基)-2-甲基-苯基]-乙酸甲酯。ES-MS272.1[M+H]+；tR＝2.53分鐘(系統(tǒng)1)。
步驟4.4[2-甲基-4-(3-硝基-吡啶-2-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯 在100℃下將1.5g的2-氯-3-硝基-吡啶、3.39g的(4-氨基-2-甲基-苯基)-乙酸甲酯和6.9ml HCl在二噁烷中的4N溶液在30ml的MeOH/二噁烷(1∶1，v/v)中的混合物攪拌54小時。將所得混合物冷卻至室溫并真空濃縮。將所得濃縮物溶于EtOAc中，用飽和NaHCO3水溶液洗滌所得混合物，干燥(Na2SO4)，過濾并濃縮。所得濃縮物經(jīng)硅膠柱色譜純化。得到[2-甲基-4-(3-硝基-吡啶-2-基氨基)-苯基]-乙酸甲酯。ES-MS302.1[M+H]+；tR＝4.79分鐘(系統(tǒng)1)；Rf＝0.43(CH2Cl2)。
按照類似于參考實施例所述的方法，但是使用適宜的原料，得到下式的化合物，
其中X、R2和Q如下表1中所定義。分析數(shù)據(jù)也在表1中列出。









原料 3-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基胺 用于制備實施例5的化合物，可以通過與WO 2006000420中所述類似的方法獲得。API-ES-MS206.2。
4-(4-異丙基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯基胺 用于制備實施例6的化合物，可以通過與WO2005051366中所述類似的方法獲得。
4-(1-甲基-哌啶-4-基甲基-3-三氟甲基-苯基胺 用于制備實施例7的化合物。
在室溫下將6.95g的4-(1-甲基-哌啶-4-亞基甲基)-3-三氟甲基-苯基胺和2.1g鈀/碳在150ml的EtOH中的混合物在氫氣中攪拌45小時。將所得混合物經(jīng)硅藻土過濾并濃縮。所得濃縮物經(jīng)硅膠柱色譜純化(CH2Cl2/MeOH/NH3aq，91∶8∶1)。得到固體形式的4-(1-甲基-哌啶-4-基甲基-3-三氟甲基-苯基胺ES-MS273.1[M+H]+；tR＝1.40分鐘(系統(tǒng)1)；Rf＝0.33(CH2Cl2/MeOH/NH3aq，91∶8∶1)。
4-(1-甲基-哌啶-4-亞基甲基)-3-三氟甲基-苯基胺 用于制備實施例7的化合物。
在氬氣中將2.4g NaH(在礦物油中60％的分散液)加入11.15g的[4-(2，2，2-三氟-乙酰氨基)-2-三氟甲基-芐基]-膦酸二乙酯在250ml的THF中的冷卻(5℃)溶液中，并將所得混合物在5℃下攪拌。向所得混合物中加入3.7ml的1-甲基-4-哌啶酮。將所得混合物加溫至室溫并攪拌20小時。向所得混合物中加入1.0ml的1-甲基-4-哌啶酮并攪拌所得混合物4小時。向所得混合物中加入800mg NaH(在礦物油中60％的分散液)，將所得混合物攪拌2小時，并且再加入800mg NaH(在礦物油中60％的分散液)。將所得混合物在室溫下攪拌過夜，通過加入50ml水來猝滅反應(yīng)。在室溫下攪拌所得混合物24小時，濃縮，用EtOAc和H2O稀釋，并用EtOAc萃取。用鹽水洗滌所得有機相，干燥(Na2SO4)，過濾并濃縮。所得濃縮物經(jīng)硅膠柱色譜純化(CH2Cl2/MeOH/NH3aq，89∶10∶1)。得到油形式的4-(1-甲基-哌啶-4-亞基甲基)-3-三氟甲基-苯基胺。ES-MS271.1[M+H]+；tR＝1.82分鐘(系統(tǒng)1)；Rf＝0.32(CH2Cl2/MeOH/NH3aq，89∶10∶1)。
[4-(2，2，2-三氟-乙酰氨基)-2-三氟甲基-芐基]-膦酸二乙酯 用于制備實施例7的化合物。
將6ml亞磷酸三乙酯加入10g的N-(4-溴甲基-3-三氟甲基-苯基)-2，2，2-三氟-乙酰胺(可按照WO 2005051366的方法獲得)在60ml甲苯的混懸液中。將所得混合物回流攪拌18小時，冷卻至室溫并濃縮。將所得濃縮物在Et2O中研磨。得到固體形式的[4-(2，2，2-三氟-乙酰氨基)-2-三氟甲基-芐基]-膦酸二乙酯ES-MS406.0[M-H]-；tR＝4.41分鐘(系統(tǒng)1)。
4-二乙基氨基甲基-3-三氟甲基-苯基胺 用于制備實施例8和10的化合物，可以通過與WO2005051366中所述類似的方法獲得。
4-吡咯烷-1-基甲基-3-三氟甲基-苯基胺 用于制備實施例9和11的化合物，可以通過與WO2006034833中所述類似的方法獲得。
3-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯基胺 用于制備實施例12、26和29的化合物，可以通過與WO2003099771中所述類似的方法獲得。
3-二乙基氨基甲基-5-三氟甲基-苯基胺 用于制備實施例13和14的化合物，可以通過與WO2005051366中所述類似的方法獲得。
4-(1-乙基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基胺 用于制備實施例15的化合物，可以通過與4-(1-甲基-哌啶-4-基甲基-3-三氟甲基-苯基胺所述類似的方法獲得，但是使用合適的原料。ES-MS287.1[M+H]+；tR＝1.59分鐘(系統(tǒng)1)；Rf＝0.37(CH2Cl2/MeOH/NH3aq，89∶10∶1)。
4-(1-異丙基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基胺 用于制備實施例18的化合物，可以通過與4-(1-甲基-哌啶-4-基甲基-3-三氟甲基-苯基胺所述類似的方法獲得，但是使用合適的原料。ES-MS301.2[M+H]+；tR＝1.97分鐘(系統(tǒng)1)。
3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基胺 用于制備實施例23、24、27和28的化合物，可以通過與WO2004005281中所述類似的方法獲得。
3-(4-甲基-哌嗪-1-基)-5-三氟甲基-苯基胺 用于制備實施例25的化合物，可以通過與WO2005051366中所述類似的方法獲得。
N-(2-二甲基氨基-乙基)-N-甲基-5-三氟甲基-苯-1，3-二胺 用于制備實施例31的化合物，可以通過如WO2004005281中所述用于制備3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基胺類似的方法獲得，但是使用合適的原料。ES-MS262.3[M+H]+；tR＝1.74分鐘。
4-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-3-三氟甲基-苯基胺 用于制備實施例35-38的化合物，可以通過與WO2005051366中所述類似的方法獲得。
N-甲基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-5-三氟甲基-苯-1，3-二胺 用于制備實施例39-42的化合物，可以通過如WO2004005281中所述用于制備3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基胺類似的方法獲得，但是使用合適的原料。ES-MS288.2[M+H]+；tR＝1.76分鐘。
3-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-5-三氟甲基-苯基胺 用于制備實施例43-46的化合物，可以通過如WO2004005281中所述用于制備3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基胺類似的方法獲得，但是使用1-甲基-哌啶-4-醇。ES-MS275.2[M+H]+；tR＝2.41分鐘。
實施例A 膠囊劑 按照標準方法，制備以下成分的膠囊劑，其包含100mg的實施例1-46中的任意一種化合物作為活性成分 組分 活性成分 100mg Avicel200mg PVPPXL15mg Aerosil 2mg 硬脂酸鎂 1.5mg -------------------- 318.5mg 通過將各成分混合并將它們填充到1號硬明膠膠囊中來完成制備。
權(quán)利要求
1.式I的化合物，
其中
(i)R1和R2各自獨立地選自氫、鹵素和C1-C7-烷基；
如果Z是N則R3不存在，或者如果Z是C(碳)則R3是氫、未取代的或取代的芳基或未取代的或取代的雜環(huán)基；
X是N(氮)或CH(被氫取代的碳)，
Y是CH或N，
Z是C或N，且
Q是式A的基團
其中
(a)R4是氫、鹵素、未取代或取代的氨基、未取代或取代的芳基、通過氮以外的環(huán)原子結(jié)合的未取代或取代的雜環(huán)基、未取代或取代的環(huán)烷基、未取代或取代的烷基、未取代或取代的鏈烯基或未取代或取代的炔基；
R5是1-甲基-哌啶-4-基氧基、1-甲基-哌啶-4-基、2-二甲基氨基-乙基或4-乙基-哌嗪-1-基；且
R6是氫、未取代或取代的環(huán)烷基或者未取代或(優(yōu)選)取代的烷基；或
(b)R4是1-甲基-哌啶-4-基甲基、1-乙基-哌啶-4-基甲基、1-甲基-哌啶-4-基氧基或1-異丙基-哌啶-4-基甲基；
R5是氫、未取代或取代的烷基、未取代或取代的氨基、未取代或取代的芳基或未取代或取代的雜環(huán)基；且
R6是氫、未取代或取代的環(huán)烷基或未取代或(優(yōu)選)取代的烷基；
其中式(A)中的星號＊表示該部分與式I中酰胺基團的NH通過該鍵相結(jié)合；且
R9和R10各自獨立地選自氫、羥基和C1-C7-烷基；或者
R9和R10一起表示氧代；或者
R1和R9一起形成-C(O)-CH2-或-CH2-CH2-，R2選自氫、鹵素和C1-C7-烷基，且R10表示氫；或
(ii)所述化合物選自
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[4-(4-異丙基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-(4-二乙基氨基甲基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺)，
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-(4-吡咯烷-1-基甲基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺，
2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-(4-二乙基氨基甲基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺，
2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-(4-吡咯烷-1-基甲基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺，
N-[3-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯基]-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酰胺，
N-(3-二乙基氨基甲基-5-三氟甲基-苯基)-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酰胺，
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-(3-二乙基氨基甲基-5-三氟甲基-苯基)-乙酰胺
2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-[3-(4-甲基-哌嗪-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
N-[3-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯基]-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-乙酰胺，
2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[3-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，和
2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺。
2.如權(quán)利要求1所述的式I化合物，其選自
N-[3-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基]-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酰胺，
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[4-(4-異丙基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-(4-二乙基氨基甲基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺)，
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-(4-吡咯烷-1-基甲基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺
2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-(4-二乙基氨基甲基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺，
2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-(4-吡咯烷-1-基甲基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺，
N-[3-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯基]-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酰胺，
N-(3-二乙基氨基甲基-5-三氟甲基-苯基)-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酰胺，
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-(3-二乙基氨基甲基-5-三氟甲基-苯基)-乙酰胺，
N-[4-(1-乙基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酰胺，
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[4-(1-乙基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[4-(1-乙基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[4-(1-異丙基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[4-(1-異丙基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[4-(1-異丙基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-[3-(4-甲基-哌嗪-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
N-[3-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯基]-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-乙酰胺，
2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[3-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-{3-[(2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基]-5-三氟甲基-苯基}-乙酰胺，
N-{3-[(2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基]-5-三氟甲基-苯基}-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-乙酰胺，
N-{3-[(2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基]-5-三氟甲基-苯基}-2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-乙酰胺，
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-{3-[(2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基]-5-三氟甲基-苯基}-乙酰胺，
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[4-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-3-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-{3-[甲基-(1-甲基-哌啶-4-基)-氨基]-5-三氟甲基-苯基}-乙酰胺，
2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-{3-[甲基-(1-甲基-哌啶-4-基)-氨基]-5-三氟甲基-苯基}-乙酰胺，
2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-{3-[甲基-(1-甲基-哌啶-4-基)-氨基]-5-三氟甲基-苯基}-乙酰胺，
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-{3-[甲基-(1-甲基-哌啶-4-基)-氨基]-5-三氟甲基-苯基}-乙酰胺，
2-(2-氯-4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[3-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-2-甲基-苯基)-N-[3-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，
2-(4-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-苯基)-N-[3-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺，和
2-(4-苯并咪唑-1-基-苯基)-N-[3-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-5-三氟甲基-苯基]-乙酰胺。
3.鹽形式的如權(quán)利要求1或2的任意一項所述的化合物。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項所述的化合物，其用作藥物。
5.藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1-3中任意一項所述的化合物以及至少一種可藥用的賦形劑。
6.如權(quán)利要求1-3中任意一項所述的化合物，其用于治療由蛋白激酶活性介導(dǎo)的病癥。
7.治療由蛋白激酶活性介導(dǎo)的病癥的方法，該方法包括向需要此類治療的個體施用治療有效量的本發(fā)明化合物。
8.如權(quán)利要求1-3中任意一項所述的化合物在制備治療由蛋白激酶活性介導(dǎo)的病癥的藥物中的用途。
9.如權(quán)利要求1-3中任意一項所述的化合物與至少一種第二藥物的組合。
10.如權(quán)利要求9所述的組合，其用于如權(quán)利要求4、6、7或8中任意一項所述的用途。
全文摘要
式(I)的化合物，其中基團R1、R2、R3、R9、R10和Q以及X、Y和Z如說明書中所定義，它們的鹽；它們的用途、使用方法、它們的制備方法、包含它們的藥物組合物、它們與第二藥物的組合及其用途等。所述化合物是蛋白激酶抑制劑，可以用于治療由蛋白激酶抑制劑調(diào)節(jié)的疾病，例如用于治療多種增殖性疾病。
文檔編號C07D235/06GK101558068SQ200780046430
公開日2009年10月14日 申請日期2007年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月16日
發(fā)明者P·菲雷, V·瓜格納諾 申請人:諾瓦提斯公司