專(zhuān)利名稱(chēng)：：治療對(duì)tnf-alpha抑制劑應(yīng)答不充分的患者中的自身免疫病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用結(jié)合CD20等B細(xì)胞表面標(biāo)志的拮抗劑進(jìn)行的治療。具乳動(dòng)物對(duì)TNFa-抑制劑不充分應(yīng)答。
背景技術(shù)：
：淋巴細(xì)胞是骨髓造血過(guò)程中產(chǎn)生的多種白細(xì)胞的一種。存在兩種主要的、淋巴細(xì)胞群B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)和T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)。本文尤其對(duì)淋巴細(xì)胞中的B細(xì)胞有興趣。B細(xì)胞在骨髓中成熟，離開(kāi)骨髓時(shí)在其細(xì)胞表面表達(dá)與抗原結(jié)合的抗體。當(dāng)初始B(naiveBcell)細(xì)胞首次與特異于其膜結(jié)合抗體的抗原相遇時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始迅速分裂，其子代分化成記憶B細(xì)胞和稱(chēng)為"漿細(xì)胞，，的效應(yīng)細(xì)胞。記憶B細(xì)胞壽命很長(zhǎng)，并繼續(xù)表達(dá)與最初的親代細(xì)胞具有相同特異性的膜結(jié)合抗體。漿細(xì)胞不產(chǎn)生膜結(jié)合抗體，而是產(chǎn)生分泌型抗體，分泌型抗體是體液免疫的重要效應(yīng)分子。CD20抗原(也稱(chēng)人B淋巴細(xì)胞限制性分化抗原Bp35)是前B細(xì)胞和成熟B淋巴細(xì)胞上的疏水性跨膜蛋白，分子量大約35kD(Valentine&W.J!Oz纖264(19):11282-11287(1989);Einfeld"皿5。7(3):711畫(huà)717(1988))。該抗原也在90%以上的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)上表達(dá)(AndersonW別ood63(6):1424-1433(1984))，但在造血干細(xì)胞，原B細(xì)胞，正常漿細(xì)胞或其它正常組織中未發(fā)現(xiàn)(Tedder"a/.//mwwwo/.135(2):973-979(1985))。CD20在啟動(dòng)細(xì)胞周期和進(jìn)行分化的活化過(guò)程的早期階段起調(diào)節(jié)作用(Tedder等，同上)，并可能發(fā)揮釣離子通道的功能(Tedder/Ce〃.A'oc/zem.14D:195(1990))。由于CD20在B細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)，這一抗原可用作"靶向"這類(lèi)淋巴瘤的候選者。實(shí)質(zhì)上，這種靶向一般是給患者施用B細(xì)胞表面抗原CD20的特異性抗體。這些抗CD20抗體與正常和惡性B細(xì)胞(顯然是)二者的CD20抗原特異結(jié)合；與表面抗原CD20結(jié)合的抗體可引起腫瘤性B細(xì)胞的破壞和耗竭。此外，具有破壞該腫瘤的潛力的化學(xué)制劑或放射活性標(biāo)記可與抗CD20抗體偶聯(lián)，從而將這些制劑特異性"運(yùn)送"至肺瘤性B細(xì)胞。不管用什么方法，一個(gè)主要目的是破壞腫瘤；可根據(jù)所使用的具體抗CD20抗體確定具體方法，因此，靶向CD20抗原的現(xiàn)有方法很多。CD19是B細(xì)胞表面表達(dá)的另一種抗原。象CD20—樣，發(fā)現(xiàn)CD19在從干細(xì)胞階段到快要最終分化為漿細(xì)胞之前的整個(gè)分化過(guò)程中均位于細(xì)胞上(Nadler，L.丄，//zoc,//2:3-37andAppendix,Renlinga/,eds.(1986)bySpringerVerlag)。然而與CD20不同，與CD19結(jié)合的抗體引起CD19抗原的內(nèi)在化。在多種抗體中使用HD237-CD19抗體(也稱(chēng)B4抗體)可鑒定CD19抗原(KieselLewA:em/ai^seaw/z//，12:1119(1987》。CD19抗原存在于4-8%的外周血單核細(xì)胞及90%以上的分離自外周血、脾臟、淋巴結(jié)或扁桃體的B細(xì)胞表面。在外周血T細(xì)胞、單核細(xì)胞或粒細(xì)胞表面未^r出CD19。實(shí)際上，所有的非T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病(ALL),B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)和B細(xì)胞淋巴瘤均表達(dá)可被B4抗體檢測(cè)的CD19(Nadlerda/./Tmmwwo/.131:244(1983);andNadlerin尸rogr&wVol.XIIpp.187-206.Brown，E.ed.(1981)byGrune&Stratton,Inc)?，F(xiàn)已鑒定出由B細(xì)胞系的細(xì)胞所表達(dá)的能識(shí)別分化階段-特異性抗原的其它抗體。其中有抗CD21抗原的B2抗體；抗CD22抗原的B3抗體；抗CD10抗原的J5抗體(也稱(chēng)CALLA)。見(jiàn)1997年1月21日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利5,595,72l(Kaminski等)。rituximab(利妥希瑪，RITUXAN⑧)抗體是一種遺傳工程化鼠/人嵌合單克隆抗CD20抗體。Rituximab是在1998年4月7日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利5,736,137(Anderson等)中稱(chēng)為"C2B8"的抗體。RITUXAN⑧被指示用于治療復(fù)發(fā)或難治的早期(low-grade)或?yàn)V泡性、CD20陽(yáng)性、B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤。在體外對(duì)作用機(jī)制的研究顯示，RITUXAN⑧與人補(bǔ)體結(jié)合，并通過(guò)補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用(CDC)裂解淋巴樣B細(xì)胞系(Reff"a/.別ood83(2):435-445(1994))。此外，其在抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)的試驗(yàn)中有顯著活性。最近，RITUXAN⑧在氣標(biāo)胸腺嘧啶摻入實(shí)驗(yàn)中顯示抗增殖效應(yīng)并直接誘導(dǎo)凋亡，而其它抗CD19和抗CD20的抗體則不能(Maloney"a/,萬(wàn)/ood88(10):637a(1996))。在實(shí)驗(yàn)中觀察到RITUXAN⑧與化療和毒素有協(xié)同作用。尤其是，RITUXAN⑧使耐藥性人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系對(duì)阿霉素(doxorubicin),CDDP，VP-16，白喉毒素和蓖麻毒蛋白的細(xì)胞毒效應(yīng)敏感(Demidem&a/.Ca"cerC7zemof/zera;^i(3(i/o/7/zam2aceM"ca/s12(3):177-186(1997))。臨床前的體內(nèi)研究顯示，RITUXIMAB耗竭來(lái)源于食蟹猴(cynomolgus)外周血、淋巴結(jié)和骨髓的B細(xì)胞，推測(cè)是通過(guò)補(bǔ)體和細(xì)胞介導(dǎo)的過(guò)程(Reffda/.別ooc/83(2):435-445(1994))。涉及CD20抗體的專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)包括，美國(guó)專(zhuān)利5,776,456,5,736,137,6,399,061和5,843,439，以及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US2002/0197255A1和US2003/0021781A1(Andersonetal,);美國(guó)專(zhuān)利6，455，043B，WO00/09160(Grillo隱Lopez,A.);WO00/27428(Grillo-LopezandWhite);WO00/27433(Grillo-LopezandLeonard);WO00/44788(Braslawsky"a/.);WOO1/10462(Rastetter,W.);WOOl/10461(RastetterandWhite);WO01/10460(WhiteandGrillo-Lopez);美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US2002/0006404，WO02/04021(HannaandHariharan);美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US2002/0012665Al，WOO1/74388(Hanna，N.);美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US2002/0009444A1和WO01/80884(Grillo-Lopez，A.);WO01/97858(White,C.);美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US2002/0128488A1，WO02/34790(Reff,M.);WO02/060955(Braslawsky"a/.);W02/096948(Braslawskyetal.);W002/079255(ReffandDavies);美國(guó)專(zhuān)利6,171，586B1，andW098/56418(Lametal.);W098/58964(Raju，S.);W099/22764(Raju，S.);W099/51642，美國(guó)專(zhuān)利6，194，551B1，美國(guó)專(zhuān)利6,242，195B1,美國(guó)專(zhuān)利6,528,624B1和美國(guó)專(zhuān)利6,538,124(Idusogieetal.);WO00/42072(Presta,L.);WO00/67796(Curdetal.);WO01/03734(Grillo-Lopezetal,);美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US2002/0004587A1和WO01/77342(MillerandPresta);美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US2002/0197256(G謂al，I.);美國(guó)專(zhuān)利6,090，365B1，6,287，537B1,6,015,542，5,843,398和5,595,721，(Kaminskietal.);美國(guó)專(zhuān)利5,500,362,5，677，180,5,721,108和6,120,767(Robinsonetal.);美國(guó)專(zhuān)利6,楊,391B1(Raubitschek"a/.」；美國(guó)專(zhuān)利6,224，866B1,WO00/20864(Barbera畫(huà)Guillem，E.);WO01/13945(Barbem-Guillem,E.);WO00/67795(Goldenberg);WO00/74718(GoldenbergandHansen);WO00/76542(Golayetal.);WO01A72333(WolinandRosenblatt);美國(guó)專(zhuān)利6，368，596B1(Ghetieetal.);美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US2002/0041847A1,(Goldenberg,D.);美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US2003/0026801A1(WeinerandHartmann);WO02/102312(Engleman，E.)，它們都引入本文作參考。還參見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利5,849,898和歐州專(zhuān)利申請(qǐng)330,191(Seedetal.);美國(guó)專(zhuān)利4,861,579和EP332，865A2(MeyerandWeiss);WO95/03770(Bhatetal.)。涉及用Rituximab進(jìn)行的治療的出版物包括PerottaandAbuel"ResponseofchronicrelapsingITPof10yearsdurationtoRituximab"Abstract#336010(1)(part1-2):p.88B(1998);Stashi&"Rituximabchimericanti-CD20monoclonalantibodytreatmentforadultswithchronicidopathicthrombocytopenicpurpura"98(4):952-957(2001);Matthews,R."MedicalHeretics"iVevv5Wew他f(7April,2001);LeandroWa/."Clinicaloutcomein22patientswithrheumatoidarthritistreatedwithBlymphocytedepletion"i/2e應(yīng)61:833-888(2002》LeandroWa/."Lymphocytedepletioninthrumatoidarthritis:earlyevidenceforsafety,efficacyanddoseresponse.JW/zn.f/sawd7/zewma^sm44(9):S370(2001);Leandroa/."AnopenstudyofBlymphocytedepletioninsystemiclupuserythematosus",爿W/ntoc&7/zew漏tow46(1》2673-2677(2002);EdwardsandCambridge"SustainedimprovementinrheumatoidarthritisfollowingaprotocoldesignedtodepleteBlymphocytes"臉,to/ogy40:205-211(2001);EdwardsWa/."B-lymphocytedepletiontherapyinrheumatoidarthritisandotherautoimmunedisorders"Soc.Trara.30(4):824-828(2002);Edwardsda/."EfficacyandsafetyofRituximab,aB-celltargetedchimericmonoclonalantibody:Arandomized,placebocontrolledtrialinpatientswithrheumatoidarthritis.爿W/zn'"si/zewm加,s附46(9):SI97(2002);LevineandPestronk"IgMantibody-relatedpolyneuropathies:B-celldepletionchemotherapyusingRituximab"TVewra/ogy52:1701-1704(1999);DeVita"a/."EfficacyofselectiveBcellblockadeinthetreatmentofrheumatoidarthritis"^W/2函&朋e,46:2029-2033(2002);Hidashidaefa/."TreatmentofDMARD-Refractoryrheumatoidarthritiswithrituximab."Presentedatthe^w"w"/5We油ycMeeri"go/爿膨n'cawCo〃egeo/i/2e謂她/0gy;Oct24-29;NeOrleans,LA2002;Tuscano,J."SuccessfultreatmentofInfliximab-refractoryrheumatoidarthritiswithrituximab"Presentedatthej朋wa/5We油ycMe幼'"go/f/zeJwen.ca"Co〃egeo/臉訓(xùn)ato/ogy;Oct24-29;NewOrleans,LA2002。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種自身免疫病，其病因?qū)W目前尚不清楚。大多數(shù)RA患者病程為慢性，即使接受治療，也可能導(dǎo)致進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞()、畸形(deformity)、殘疾(disability)、甚至過(guò)早死亡。每年門(mén)診病人中超過(guò)9百萬(wàn)，住院病人中超過(guò)250,000都是RA引起的。RA治療的目的是阻止或控制關(guān)節(jié)損傷、阻止功能喪失以及減少疼痛。最初的RA治療通常涉及施用一或多種以下藥物非類(lèi)固醇抗炎藥(NSAID)、糖皮質(zhì)激素(經(jīng)由關(guān)節(jié)注射給藥)、以及低劑量的強(qiáng)的松。參見(jiàn)"Guidelinesforthemanagementofrheumatoidarthritis"JwAn'fec&朋e,afew46(2):328-346(February,2002)。大多數(shù)新近被診斷為RA的患者都在診斷后的3個(gè)月內(nèi)根據(jù)其具體病情而應(yīng)用的抗風(fēng)濕藥(DMARD)進(jìn)行治療。常用于RA的DMARD是，羥氯會(huì)(hydroxycloroquine)，柳氮石黃胺嗜口定(sulfasalazine),氨曱蟲(chóng)菜p令(methotrexate),來(lái)氟洛米(leflunomide),etanercept，infliximab(英夫單抗)(外力。口服和皮下氨曱蝶呤)，硫唑噪呤(azathioprine)，D-青霉胺，金(口服)，金(肌肉)，米諾環(huán)素(minocycline),環(huán)孢菌素(cyclosporine)，葡萄球菌蛋白A免疫吸附。由于機(jī)體在患RA期間產(chǎn)生腫瘤壞死因子alpha(TNFa),因此TNFa抑制劑也被用于治療這種疾病。Etanercept(ENBREL⑧)是在美國(guó)被批準(zhǔn)用于治療活動(dòng)性RA的一種注射用藥。Etanercept與TNFa結(jié)合，將大多數(shù)TNFa從關(guān)節(jié)和血液中除去，從而阻止TNFa促進(jìn)炎癥或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的其它癥狀。Etanercept是一種"免疫粘附素"融合蛋白，由人75kD(p75)腫瘤壞死因子受體(TNFR)的胞外配體結(jié)合部分與人IgGl的Fc部分相連而構(gòu)成。這種藥物有一些副作用，包括嚴(yán)重的感染和敗血癥(sepsis)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病如多發(fā)性硬化(MS)。參見(jiàn)，如www.remicade-infliximab.com/pages/enbrel_embrel.html。Infliximab以商標(biāo)名REMICADE⑧進(jìn)行銷(xiāo)售，它是一種免疫抑制藥，用于治療RA和克恩氏病。Infliximab是一種嵌合單克隆抗體，它結(jié)合TNFa,并通過(guò)耙向并結(jié)合引起炎癥的TNFa而減弱體內(nèi)的炎癥。Infliximab與心衰之類(lèi)的致命性感染、結(jié)核之類(lèi)的感染、以及導(dǎo)致MS的脫髓鞘疾病有關(guān)。2002年12月，AbbottLaboratories經(jīng)FDA批準(zhǔn)銷(xiāo)售adalimumab(HUMIRATM)，這種藥以前被稱(chēng)為D2E7。Adalimumab是一種結(jié)合TNFa的人單克隆抗體，它被批準(zhǔn)用于減少中度至重度活動(dòng)性RA成年患者的指征和癥狀并抑制結(jié)構(gòu)損傷的進(jìn)展，這些患者對(duì)于一或多種傳統(tǒng)的疾病適應(yīng)性DMARD應(yīng)答不足。發(fā)明概述本發(fā)明第一方面提供了一種治療哺乳動(dòng)物自身免疫病的方法，所述動(dòng)物對(duì)TNFa-抑制劑的應(yīng)答不充分，所述方法包括給該哺乳動(dòng)物施用治療有效量的與B細(xì)胞表面標(biāo)志結(jié)合的拮抗劑。例如，本發(fā)明提供了治療哺乳動(dòng)物類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，所述動(dòng)物對(duì)TNFa-抑制劑的應(yīng)答不充分，所述方法包括給該哺乳動(dòng)物施用治療有效量的結(jié)合CD20的抗體。本發(fā)明還涉及減少疾病的負(fù)面效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述疾病選自感染、心衰和脫髓鞘，所述方法包括給患有自身免疫病的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的與B細(xì)胞表面標(biāo)志結(jié)合的拮抗劑。優(yōu)選實(shí)施方案詳述I.定義為了本發(fā)明的目的，"腫瘤壞死因子alpha(TNFa)"是指，包含Pennica"a/.，A^"w,312:721(1984)orAggarwal"a/.，《/BC，260:2345(1985)中所述氨基酸序列的人TNFa分子。"TNFa抑制劑"在本文中是指，在一定程度上抑制TNFa的生物學(xué)功能的制劑，它通過(guò)通過(guò)結(jié)合TNFa和中和其活性來(lái)進(jìn)行抑制。本文具體涉及的TNF抑制劑的實(shí)例是Etanercept(ENBREL),Infliximab(REMICADE⑧)和Adalimumab(HUMIRATM)。術(shù)語(yǔ)"對(duì)TNFa-抑制劑應(yīng)答不充分"是指，由于毒性和/或不充分的效力，致使對(duì)在先或當(dāng)前的TNFa-抑制劑治療應(yīng)答不充分。這種不充分應(yīng)答可以由臨床醫(yī)師在治療目標(biāo)疾病期間進(jìn)行評(píng)估。哺乳動(dòng)物遭受在先或當(dāng)前的TNFa-抑制劑治療所引起的"毒性"時(shí)，遭受其一或多種副作用，如感染(尤其是嚴(yán)重感染)、充血性心衰(congestiveheartfailure)、脫髓鞘(demyelination)(導(dǎo)致多發(fā)性硬化)、超敏反應(yīng)、神經(jīng)學(xué)事件(neurologicevents)、自身免疫(autoimmunity)、非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin，slymphoma),結(jié)核(TB)、自身抗體等。接受"不充分效力"的哺乳動(dòng)物在在先或當(dāng)前的TNFa-抑制劑治療之后繼續(xù)患有活躍的疾病。例如，患者在TNFa-抑制劑治療1個(gè)月或3個(gè)月之后可能具有活躍的疾病。"降低副作用的風(fēng)險(xiǎn)"是指，將采用與B細(xì)胞表面標(biāo)志結(jié)合的拮抗劑進(jìn)行的治療引起副作用的風(fēng)險(xiǎn)降低至比TNFa-抑制劑治療所見(jiàn)更低的程度。這類(lèi)副作用包括感染(尤其是嚴(yán)重感染)、心衰和脫髓鞘(多發(fā)性硬化)等。"B細(xì)胞表面標(biāo)志"在本文中是指，表達(dá)在B細(xì)胞表面，可作為與之結(jié)合的拮抗劑的靶的抗原。B細(xì)胞表面標(biāo)志的實(shí)例包括CDIO，CD19，CD20,CD21，CD22，CD23，CD24，CD37,CD40，CD53，CD72,CD73，CD74，CDw75，CDw76,CD77,CDw78，CD79a,CD79b,CD80,CD81，CD82，CD83，CDw84，CD85和CD86白細(xì)胞表面標(biāo)志。特別有興趣的B細(xì)胞表面標(biāo)志是優(yōu)先表達(dá)在哺乳動(dòng)物B細(xì)胞表面而不是其它非B細(xì)胞組織表面，并且在前B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞上都可表達(dá)的一種標(biāo)志。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述標(biāo)志，如CD19或CD20,是在B細(xì)胞系由干細(xì)胞階段到最終分化至漿細(xì)胞之前的整個(gè)分化階段在B細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的一種標(biāo)志。本文優(yōu)選的B細(xì)胞表面標(biāo)志是CD20。"CD20，，抗原是35kDa的非糖基化磷蛋白，其可在90%以上來(lái)自外周血或淋巴器官的B細(xì)胞表面找到。CD20在早期前B細(xì)胞發(fā)育階段表達(dá)，并將表達(dá)維持到漿細(xì)胞分化階段。CD20在正常B細(xì)胞和惡性B細(xì)胞上均可發(fā)現(xiàn)。文獻(xiàn)中CD20亦稱(chēng)為"B淋巴細(xì)胞限制性抗原"或"Bp35"。例如CD20抗原在Clark"a/.iWA^OS々82:1766(1985)中有介紹。"自身免疫病，，在本文中是指因個(gè)體的自身組織引起并且針對(duì)自身組織的疾病。自身免疫病的實(shí)例包括但不限于，關(guān)節(jié)炎(arthritis)(類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis),幼年類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(juvenilerheumatoidarthritis),骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis),4艮屑病關(guān)節(jié)炎(psoriaticarthritis),4艮屑病(psoriasis),皮炎(dermatitis),多肌炎(polymyositis)/皮肌炎(dermatomyositis)，中毒性表皮壞死+>解癥(toxicepidermalnecrolysis),系統(tǒng)性石更皮病和系統(tǒng)性硬化(systemicsclerodermaandsclerosis),與炎性腸疾病有關(guān)的反應(yīng)(responsesassociatedwithinflammatoryboweldisease),克恩氏病(Crohn'sdisease),潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis),呼吸窘迫綜合征(respiratorydistresssyndrome),成人呼吸窘迫綜合4正(adultrespiratorydistresssyndrome,ARDS),腦膜炎(meningitis),月鹵炎(encephalitis),葡萄膜炎(uveitis)，結(jié)腸炎(colitis)，腎小球腎炎(glomerulonephritis),變態(tài)反應(yīng)疾病(allergicconditions),濕滲(eczema),哮喘(asthma),與T細(xì)胞浸潤(rùn)和慢性炎癥性應(yīng)答有關(guān)的情況(conditionsinvolvinginfiltrationofTcellsandchronicinflammatoryresponses),動(dòng)樂(lè)1<"辣虧才羊硬化(atherosclerosis),自身免疫性心肌炎(autoimmunemyocarditis),白細(xì)胞粘附缺陷(leukocyteadhesiondeficiency),系統(tǒng)性紅斑《良齊(systemiclupuserythematosus,SLE)，幼年型糖尿病(juvenileonsetdiabetes),多發(fā)性硬化(multiplesclerosis),變應(yīng)'〖生腦脊骨逸炎(allergicencephalomyelitis),與纟田月包因子和T細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏反應(yīng)相伴的免疫應(yīng)答(immuneresponsesassociatedwithacuteanddelayedhypersensitivitymediatedbycytokinesandT-lymphocytes)，結(jié)#亥(tuberculosis),結(jié)節(jié)病(sarcoidosis),肉芽月中病(granulomatosis)包括韋格納肉芽月中病(Wegener'sgranulomatosis),粒細(xì)胞缺乏(agranulocytosis),脈管炎(vasculitis)(包括ANCA),再生障礙性貧血(aplasticanemia),戴畫(huà)布貧血(DiamondBlackfananemia),免疫溶血'l"生貧血(immunehemolyticanemia)包括自身免疫溶血性貧血(autoimmunehemolyticanemia,AIHA)，惡性貧血(perniciousanemia),純紅細(xì)胞再生障礙(pureredcellaplasia,PRCA),因子VIII缺陷(FactorVIIIdeficiency),血友病A(hemophiliaA),自身免疫性中性粒細(xì)胞減少癥(autoimmuneneutropenia),全血細(xì)胞減少癥(pancytopenia),白細(xì)胞減少(leucopenia)，與白細(xì)胞滲出有關(guān)的疾病(diseasesinvolvingleukocytediapedesis)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎癥性疾病，多器官損傷綜合征(multipleorganinjurysyndrome),mysatheniagravis,抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，抗-腎d、球基底膜疾病(anti-glomerularbasementmembranedisease),^元石壽月旨4元體纟宗合4i(anti-phospholipidantibodysyndrome),變態(tài)反應(yīng)性神經(jīng)炎(allergicneuritis),Bechet疾病，Castleman綜合4正，Goodpasture綜合征，蘭"尹肌無(wú)力綜合4i(Lambert-EatonMyasthenicSyndrome),Reynaud綜合征，干燥綜合征(Sjorgen'ssyndrome),斯-約綜合征(Stevens-Johnsonsyndrome),實(shí)體器官移植排斥(solidorgantransplantrejection),牙多才直物^t宿主疾病(graftversushostdisease,GVHD)，天皰疳才羊大皰(pemphigoidbullous),天皰掩(pemphigus),自身免疫性多內(nèi)分泌腺病(autoimmunepolyendocrinopathies)，賴(lài)特爾病(Reiter'sdisease),僵人綜合征(stiff-mansyndrome),巨細(xì)胞動(dòng)脈炎(giantcellarteritis),免疫復(fù)合物腎炎(immunecomplexnephritis),IgA腎病(nephropathy),IgM多發(fā)性神經(jīng)病(polyneuropathies)或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病，特發(fā)性血小板減少性紫癲(idiopathicthrombocytopenicpurpura,ITP)，血才全斗生血小4反;咸少'l"生紫癲(thromboticthrobocytopenicpurpura,TTP),自身免疫性血小板減少(autoimmunethrombocytopenia),睪丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎(includingautoimuneorchitisandoophoritis),原發(fā)性曱狀腺功能減退(primaryhypothyroidism);自身免疫性?xún)?nèi)分泌病包括自身免疫性曱狀腺炎(autoimmunethyroiditis),l曼性曱狀A(yù)泉炎(chronicthyroiditis)(橋本曱狀腺炎(Hashimoto'sThyroiditis)),亞急性淋巴細(xì)胞性曱狀腺炎(subacutethyroiditis),特發(fā)性曱狀腺功能減退(idiopathichypothyroidism),艾迪生病(Addison'sdisease),格雷夫斯病(Grave'sdisease),自身免疫性多腺體綜合征(autoimmunepolyglandularsyndromes)或多腺體內(nèi)分泌病綜合征(polyglandularendocrinopathysyndromes),I型糖尿病也稱(chēng)胰島素依賴(lài)性糖尿病(IDDM)和希恩綜合征(Sheehan，ssyndrome);自身免疫性肝炎(autoimmunehepatitis),、淋巴樣間質(zhì)性肺炎(lymphoidinterstitialpneumonitis)(HIV)，閉塞性細(xì)支氣管炎(bronchiolitisobliterans)(非-移植型(non-transplant))vsNSIP，吉-巴綜合征(Guillain-Barre，syndrome),大血管血管炎(largevesselvasculitis)(包括風(fēng)濕性多肌痛(polymyalgiarheumatica)和巨細(xì)胞(高安(Takayasu，s))動(dòng)脈炎),中血管血管炎(mediumvesselvasculitis)(包括川崎病(Kawasaki，sdisease)和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎(polyarteritisnodosa)),強(qiáng)直性脊推炎(ankylosingspondylitis),貝格爾病(Berger，sdisease)(IgA腎病)，急進(jìn)性腎小球腎炎(rapidlyprogressiveglomerulonephritis),原發(fā)性膽汁性肝石更化(primarybiliarycirrhosis),乳糜瀉(Celiacsprue)(l夫質(zhì)性腸病(glutenenteropathy)),冷J求蛋白血癥(cryoglobulinemia),肌萎縮'l"生脊髓4貝寸索石更4b(amyotrophiclateralsclerosis,ALS)，冠狀動(dòng)脈病(coronaryarterydisease)等。"拮抗劑"是通過(guò)與B細(xì)胞表面標(biāo)志結(jié)合能破壞或耗竭哺乳動(dòng)物中的B或多種功能的分子。拮抗劑優(yōu)選能耗竭所治療的哺乳動(dòng)物中的B細(xì)胞(即降低循環(huán)B細(xì)胞水平)。這種耗竭可通過(guò)多種機(jī)制獲得，如抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用(CDC)，對(duì)B細(xì)胞增殖的抑制和/或?qū)細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)(即通過(guò)凋亡)。本發(fā)明的拮抗劑包括與B細(xì)胞標(biāo)志結(jié)合的抗體、合成序列肽或天然序列肽以及小分子拮抗劑，可任選偶聯(lián)或融合于細(xì)胞毒制劑。優(yōu)選的拮抗劑包含抗體。"抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用"和"ADCC，，是指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒細(xì)胞(如自然殺傷(NK)細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，和巨噬細(xì)胞)識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，并隨后引起靶細(xì)胞的裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞即NK細(xì)胞僅表達(dá)FcyRIII,而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI,FcyRII和FcyRIII。FcR在造血細(xì)胞上的表達(dá)總結(jié)在RavetchandKinet,^"m/./mmw"o/9:457-92(1991)第464頁(yè)的表3中。為評(píng)估目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC試驗(yàn)，如美國(guó)專(zhuān)利5,500,362或5,821,337中所述。這類(lèi)試驗(yàn)中有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞。或者，或另外，目的分子的ADCC活性可在體內(nèi)評(píng)估，例如在ClynesiWAS(T/S力95:652-656(1998)公開(kāi)的動(dòng)物模型中評(píng)估。"人效應(yīng)細(xì)胞"是表達(dá)一種或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)物功能的白細(xì)胞。優(yōu)選所述細(xì)胞至少表達(dá)FcyRIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)物的功能。例如可介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞包括人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，自然殺傷(NK)細(xì)胞，單核細(xì)胞，細(xì)胞毒T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；其中優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"Fc受體"或"FcR"用于描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是人FcR的天然序列。而且，優(yōu)選的FcR是與IgG抗體結(jié)合的受體(y受體)，其包括FcyRI、FcyRII和FcyRIII亞型，和這些受體的等位基因變體以及另路剪接形式。FcyRn受體包括FcyRIIA("活化型受體")和FcyRIIB("抑制型受體")，二者的氨基酸序列相似，主要區(qū)別在其胞漿結(jié)構(gòu)域?；罨褪荏wFqRIIA在其胞漿結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制型受體FcyRIIB在其胞漿結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(見(jiàn)Dagron,y^2m/./www"o/.15:203-234(1997))。在RavetchandKinet，j聽(tīng).iev./畫(huà),/9:457-92(1991》Capelda/"7m應(yīng)womefWs4:25-34(1994);deHaasefa/"J丄a6.C7/w.126:330-41(1995)中對(duì)FcR進(jìn)行了綜述。其它FcR,包括將來(lái)被確定的，均被包含在本文術(shù)語(yǔ)"FcR"中。該術(shù)語(yǔ)也包括新生兒受體(neonatalreceptor)FcRn,其負(fù)責(zé)將母體的IgG轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒(Guyer"a/.,//mmw"o/.117:587(1976)andKimWa/"http://mmwwo/.24:249(1994))。"補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用"或"CDC"是指分子在補(bǔ)體存在時(shí)裂解標(biāo)靶的能力。補(bǔ)體活化途徑由補(bǔ)體系統(tǒng)第一個(gè)成分(Clq)結(jié)合至一個(gè)與關(guān)聯(lián)抗原(cognateantigen)形成復(fù)合物的分子(如抗體)來(lái)啟動(dòng)。為評(píng)價(jià)補(bǔ)體活化，可如Gazzano-Santoro"a/"http://扁wwo/.M^oA202:163(1996)所述進(jìn)行CDC試驗(yàn)。"生長(zhǎng)抑制"拮抗劑是指那些阻止或減少與該拮抗劑結(jié)合之抗原的表達(dá)細(xì)胞增殖的拮抗劑。例如所述拮抗劑可在體內(nèi)和/或體外阻止或減少B細(xì)胞的增殖。"誘導(dǎo)凋亡"的拮抗劑是指那些可誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡，例如B細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的拮抗劑，所述程序性細(xì)胞死亡可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)凋亡試驗(yàn)確定，所述試驗(yàn)如annexinV的結(jié)合，DNA片段化，細(xì)胞皺縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹，細(xì)胞碎裂，和/或膜泡(稱(chēng)為凋亡小體)形成。這里的術(shù)語(yǔ)"抗體"用其最廣泛的意義，尤其包含完整的單克隆抗體，多克隆抗體，由至少兩個(gè)完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，以及任何抗體片段，只要它們能顯示所需生物學(xué)活性。"抗體片段"包括完整抗體的一部分，優(yōu)選包括抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的實(shí)例包括Fab，F(xiàn)ab，，F(xiàn)(ab，)2,和Fv片段；二價(jià)抗體；線性化抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段構(gòu)成的多特異性抗體。"天然抗體"通常是約150,000道爾頓的異源四聚體糖蛋白，由兩個(gè)相同的輕鏈(L)和兩個(gè)相同的重鏈(H)構(gòu)成。每條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，免疫球蛋白不同種型的重鏈中二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈還具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每個(gè)重鏈在其一個(gè)端有可變區(qū)(Va),緊接著多個(gè)恒定區(qū)。每個(gè)輕鏈一端有可變區(qū)(VJ,而另一端有恒定區(qū)；輕鏈恒定區(qū)與重鏈第一恒定區(qū)并列，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)并列。認(rèn)為輕鏈和重鏈的可變區(qū)有特定氨基酸形成一個(gè)界面。術(shù)語(yǔ)"可變的"是指不同抗體的可變區(qū)特定部分的序列差異很大，且這些部分在每種抗體與其特定抗原的結(jié)合和特異性中有用。然而在抗體整個(gè)可變區(qū)中可變性的分布并不均等。它集中在輕鏈和重鏈可變區(qū)的三個(gè)被稱(chēng)為高變區(qū)的節(jié)段中?？勺儏^(qū)的更高度保守部分被稱(chēng)為框架區(qū)(FR)。天然輕鏈和重鏈的可變區(qū)分別包含四個(gè)FR，它們大多采用P折疊構(gòu)象，通過(guò)三個(gè)高變區(qū)相連，這些高變區(qū)與(3折疊結(jié)構(gòu)形成環(huán)狀，有時(shí)形成部分環(huán)狀。每條鏈的高變區(qū)通過(guò)FR連接至十分接近，并與其他鏈的高變區(qū)共同形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)Kabatef"/.,5^we"ceso/戶(hù)rafe/"so//m,"o/og/ca//"femst,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體對(duì)抗原的結(jié)合，但顯示多種效應(yīng)功能，如使抗體參與抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)。抗體經(jīng)木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個(gè)相同的稱(chēng)為"Fab"的抗原結(jié)合片段和一個(gè)殘余"Fc"片段，每個(gè)Fab片段具有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，F(xiàn)c的名稱(chēng)反映了其容易形成結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)F(ab，)2片段，它有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并仍能與抗原交叉結(jié)合。"Fv"是最小抗體片段，包含一個(gè)完整的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)。這個(gè)區(qū)域是由一條重鏈和一個(gè)輕鏈可變區(qū)緊密、非共價(jià)結(jié)合成的二聚體。在Vh-Vl二聚體表面，每個(gè)可變區(qū)的三個(gè)高變區(qū)在構(gòu)型上相互作用，從而限定一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)高變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特性。但即使單個(gè)可變區(qū)(或Fv中僅包含三個(gè)抗原特異性高變區(qū)的那一半)也能識(shí)別并結(jié)合抗原，只是比完整結(jié)合位點(diǎn)的親和力低。Fab片段還包含輕鏈恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)。Fab'不同于Fab片段之處在于，其重鏈CHI結(jié)構(gòu)域的羧基端添加了數(shù)個(gè)殘基，其中包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一或多個(gè)半胱氨酸。本文中Fab，-SH指一種Fab，，其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基有至少一個(gè)游離巰基。F(ab，)2抗體片段最初是作為Fab，片段對(duì)且它們之間有鉸鏈區(qū)半胱氨酸的形式產(chǎn)生的。抗體片段的其它化學(xué)連接也是已知的。脊推動(dòng)物任何物種的抗體(免疫球蛋白)的"輕鏈"可以是兩種完全不同的型(k和x)之一，型別區(qū)分的依據(jù)是其恒定區(qū)氨基酸序列?？贵w依據(jù)其重鏈恒定區(qū)氨基酸序列分為不同的類(lèi)。完整抗體有五大類(lèi)IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中幾種能進(jìn)一步分為亞型(同種型)，例如IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同類(lèi)抗體的重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域分別被稱(chēng)為a，5，s，y和P。免疫球蛋白不同類(lèi)的亞單位和三維構(gòu)型是已知的。"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包括抗體的Vh和V^結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域存在于單個(gè)多肽鏈上。優(yōu)選Fv多肽在Vh和Vt結(jié)構(gòu)域之間還包含一個(gè)多肽接頭，它能使scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述見(jiàn)Pliickthun，7Tze尸/zarmaco/ogvo/Mowoc/owa/i4w"6o6/es，vol.113，RosenburgandMooreeds.，Springer畫(huà)Verlag，NewYork,pp.269-315(1994)。術(shù)語(yǔ)"二價(jià)抗體(diabodies)"是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小分子抗體片段，這些片段在一條多肽鏈(VH-VO上含有相連的一個(gè)重鏈可變區(qū)(Vh)和一個(gè)輕鏈可變區(qū)(VJ。利用一種非常短的接頭，其使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域無(wú)法配對(duì)，不得不與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)二價(jià)抗體的更詳細(xì)描述可參見(jiàn)EP404,097;WO93/11161;Hollingerda/"淑/.固，90:6444-6448(1993》本文中術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"指從實(shí)質(zhì)上均一的抗體群獲得的抗體，即包含該群體的單個(gè)抗體除了可能自然發(fā)生的很少量突變以外都相同。單克隆抗體均以高度特異性直接針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。此外，與通常包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的傳統(tǒng)(多克隆)抗體制劑相比，每種單克隆抗體直接針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。單克隆抗體除了具有特異性，其優(yōu)勢(shì)還在于，它們是通過(guò)雜交瘤培養(yǎng)而合成的，無(wú)其它免疫球蛋白的污染。修飾語(yǔ)"單克隆的"指抗體獲自實(shí)質(zhì)上均一的抗體群的特征，不應(yīng)理解為限定由任何具體方法產(chǎn)生抗體。例如根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以用由Kohlerdg/.，Atoww,256:495(1975)首次描述的雜交瘤方法來(lái)制備，或用重組DNA法(如美國(guó)專(zhuān)利4，816,567)來(lái)制備。"單克隆抗體"還可以!是用Clackson"a/.，A^ww,352:624-628(1991)andMarksWJMo/.Ao/.,222:581-597(1991)所述技術(shù)從噬菌體抗體庫(kù)中分離得到。本文中單克隆抗體具體包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，只要它們展示所需生物學(xué)活性，其中所述嵌合抗體中重鏈和/或輕鏈的一部分等同于或同源于來(lái)自特定物種的抗體或?qū)儆谔囟贵w類(lèi)或亞類(lèi)的抗體的相應(yīng)序列，鏈的其余部分等同于或同源于來(lái)自其它物種的抗體或?qū)儆诹硪豢贵w類(lèi)或亞類(lèi)的抗體的相應(yīng)序歹'(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,816,567;Morrison&A^/.Jcad5W.OSL4，81:6851-6855(1984))。本文的目標(biāo)嵌合抗體包括"靈長(zhǎng)類(lèi)化(primatized)"抗體，其包含源于非人靈長(zhǎng)類(lèi)可變區(qū)的抗原結(jié)合序列(如OldWorldMonkey,如狒狒,獼猴(rhesus)或恒河猴(cynomolgusmonkey))和人的恒定區(qū)序列(美國(guó)專(zhuān)利5,693,780)。"人源化，，形式的非人(如鼠)抗體是包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。在多數(shù)情況下，人源化抗體是下述人免疫球蛋白(受者(recipient)抗體)，其中受者的高變區(qū)殘基被非人物種如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類(lèi)(供者(donor)抗體)的具有所需特異性、親和力和能力(capacity)的高變區(qū)的殘基取代。在一些例子中，人免疫球蛋白框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。而且人源化抗體可包含未在受者抗體或供者抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基。這些修飾旨在進(jìn)一步細(xì)化抗體的功能。一般情況下，人源化抗體基本上包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變區(qū)的全部，其中所有或基本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有FR是人的免疫球蛋白序列中的那些。人源化抗體任選還包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)、通常為人免疫球蛋白的至少一部分。詳見(jiàn)Jones&a/.,Atow321:522-525(1986);RiechmamidiVafwre332:323-329(1988);andPresta,Cwr.<S^w".B/o/.2:593-596(1992)。本文中術(shù)語(yǔ)"高變區(qū)"是指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)含有"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區(qū)的殘基24-34(Ll)，50-56(L2)和89-97(L3),重鏈可變區(qū)的殘基31-35(H1),50-65(H2)和95-102(H3);Kabat&a/"5^wewceso/尸rafe/似o/7m聽(tīng)wo/og/ca/5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD.(1991)),和/或"高變環(huán)"的殘基(例如輕鏈可變區(qū)的殘基26-32(Ll)，50-52(L2)和91-96(L3)，重鏈可變區(qū)的殘基26-32(Hl),53-55(H2)和96-101(H3);ChothiaandLeskJMo/.所o/.196:901-917(1987))。"框架區(qū)"或"FR"殘基是除本文所定義的高變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。"結(jié)合，，目的抗原如B細(xì)胞表面標(biāo)志的拮抗劑是下述拮抗劑，其能以與CD20抗原結(jié)合的抗體有"C2B8"，現(xiàn)在被稱(chēng)為"rituximab"("RITUXAN⑧,，)(美國(guó)專(zhuān)利5,736,137，引入作為參考)；釔-[90]-標(biāo)記的2B8鼠抗體"Y2B8"(美國(guó)專(zhuān)利5,736,137，引入作為參考)；任選用1311標(biāo)記鼠IgG2a"B1"產(chǎn)生"131I-B1"抗體(BEXXARW)(美國(guó)專(zhuān)利5,595,721,引入作為參考)；鼠單克隆抗體"IF5"(Press等Blood69(2)):584-591(1987));"嵌合2H7，，抗體(美國(guó)專(zhuān)利5,677,180,引入作為參考)；"人源化2H7vl6"(見(jiàn)下文);huMax-CD20(Genmab，Denmark);AME-133(AppliedMolecularEvolution);和可從InternationalLeukocyteTypingWorkshop獲得的單克隆抗體L27，G28陽(yáng)2，93-1B3,B-Cl或NU-B2(Valentineaa/"在丄ez^oc;^e^p/"gIII—書(shū)中(McMichael,Ed"p.440，OxfordUniversityPress(1987))。與CD19抗原結(jié)合的抗體包括Hekman"a/.Ca"cer/wmw"o/.7wmwwof/2^t32:364-372(1991)和Vlasvelda/.CawcerTmmwwo/./mmz/wof/zeK40:37-47(1995)中所述抗CD19抗體；和在Kiesel"a/.丄ewA:em/a"esewc/z//，12:1119(1987)中所述B4抗體。本文中術(shù)語(yǔ)"rituximab"或"RITUXAN"指經(jīng)遺傳工程改造的、針對(duì)CD20抗原的嵌合鼠/人單克隆抗體，在美國(guó)專(zhuān)利5，736,137(引入作為參考)中命名為"C2B8"。該抗體是含小鼠輕鏈和重鏈可變區(qū)序列及人的恒定區(qū)序列的IgGlk型免疫球蛋白。Rituximab結(jié)合CD20的親和力為約8.0nM。僅僅為了本文的目的，"人源化2H7vl6，，是指包含下述輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)序列的抗體。hu2H7v16的輕鏈可變區(qū)GTKVEIKR(SEQIDNO:1)hu2H7v16的重鏈可變區(qū)WVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQ畫(huà)SLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:2)優(yōu)選的人源化2H7v16包含輕鏈氨基酸序列YAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:3);以及重鏈氨基酸序列FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKSLSLSPGK(SEQIDNO:4)。"分離，，的拮抗劑是已經(jīng)從其自然環(huán)境組分中鑒定并分離和/或回收的拮抗劑。其自然環(huán)境中的污染成分有，可干擾該拮抗劑的診斷和治療應(yīng)用的礦物質(zhì)，可能還包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該拮抗劑的純度應(yīng)達(dá)到(1)經(jīng)Lowery法確定的拮抗劑重量的95%以上，最優(yōu)選所述重量的99%以上，(2)足以獲得用旋轉(zhuǎn)杯狀(spi皿ingcup)序列分析儀所測(cè)至少15個(gè)殘基的N端或內(nèi)部氨基酸序列，(3)通過(guò)還原或非還原條件下的SDS-PAGE以及考馬斯亮藍(lán)染色、優(yōu)選銀染所證實(shí)的均質(zhì)性。分離的拮抗劑包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位拮抗劑，因?yàn)樵撧卓箘┑淖匀画h(huán)境中的至少一種組分已不存在。一般情況下分離的拮抗劑可通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備。需要治療的"哺乳動(dòng)物，，是指歸為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人、家畜和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，以及動(dòng)物園里的動(dòng)物、參與運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目的動(dòng)物或?qū)櫸锶绻贰ⅠR、貓、牛等。優(yōu)選所述哺乳動(dòng)物為人類(lèi)。"治療，，是指治療方法和預(yù)防措施。需要治療者包括已經(jīng)患病者，以及需要對(duì)疾病進(jìn)行預(yù)防者。因此，哺乳動(dòng)物可能被診斷為已患病或?qū)λ黾膊∫赘小?治療有效量，，是指能有效阻止，改善或治療目標(biāo)自身免疫病的拮抗劑的量。本文用于輔助治療的術(shù)語(yǔ)"免疫抑制劑"是指能抑制或掩蔽所治哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。這將包括能抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生、下調(diào)或抑制自身抗原的表達(dá)，或掩蔽MHC抗原的物質(zhì)。這類(lèi)制劑的例子包括，2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,665,077，其全文引入本文作參考)；非類(lèi)固醇抗炎藥(NSAIDs);石克唑嘌呤(azathioprine);環(huán)確酰胺(cyclophosphamide);溴麥角環(huán)肽(bromocryptine);達(dá)那哇(danazol);氨苯石風(fēng)(dapsone);戊二醛(它們掩蓋MHC抗原，如美國(guó)專(zhuān)利4,120,649所述)；抗MHC抗原和MHC片段的抗獨(dú)特型抗體；環(huán)孢菌素A();類(lèi)固醇如糖皮質(zhì)激素，例如強(qiáng)的松(prednisone),曱基強(qiáng)的松龍(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone);氨曱蟲(chóng)萊呤(methotrexate)(口月良或皮下)；輕氯會(huì)(hydroxycloroquine);柳氮磺胺嘧啶(sulfasalazine);leflunomide;細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑包括抗IFN-y，-卩或-a抗體,抗TNF-a抗體(infliximab或adalimumab)，抗TNF-a免疫粘附素(etanercept)，抗TNF-卩抗體，抗IL-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CDlla和抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細(xì)胞球蛋白；pan-T抗體，優(yōu)選抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；包含LFA-3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可溶性肽(W090/08187,公開(kāi)于7/26/90);鏈激酶(streptokinase);TGF-P;鏈道酶(streptodornase);源于宿主的RNA或DNA;FK506;RS-61443;脫氧精胍菌素(deoxyspergualin);雷帕霉素(rapamycin);T細(xì)胞受體(Cohen"a/.,U.S.Pat.No.5,114,721);T細(xì)胞受體片段(Offner"a/"Sc/e"ce，251:430-432(1991);WO90/11294;Ianeway，Ato"，341:482(1989);WO91/01133);和T細(xì)胞受體抗體(EP340，109)例如T10B9。本文中術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞毒制劑"是指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)旨在包括放射性核素(例如At211，I131，I125,Y90,Re186,Re188，Sm153，Bi212,P"和Lu的放射性同位素)，化療劑，毒素如小分子毒素或細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶活性毒素，或它們的片段。"化療劑"是在腫瘤治療中使用的化學(xué)化合物?；焺?shí)例包括烷化劑，如噻替哌(thiotepa)和環(huán)膦酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM);烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和。底泊舒凡(piposulfan);(aziridine)如苯并多巴(benzodopa),卡波醌(carboquone)，美妥替派(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa);氮丙咬和methylamelamine包括六曱蜜胺(altretamine)，三亞胺。秦(triethylenemelamine),三亞乙基石粦酰胺(trietylenephosphoramide),三亞乙基石克4戈石壽酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羥曱基蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥(nitrogenmustards)長(zhǎng)口苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlomaphazine)，膽磷酰胺(cholophosphamide),雌氮芥(estramustine)，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride);左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan),新氮芥(novembichin),膽甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)，？^龍苯芥(prednimustine),曲石粦胺(trofosfamide),尿。密卩定氮芥(uracilmustard);亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，3畐莫司汀(fotemustine),洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine),雷莫司汀(ranimustine);^元生素長(zhǎng)口阿克^立霉素(aclacinomysins),放線菌素(actinomycin)，authramycin,重氮絲氛酸(azaserine)，博來(lái)霉素(bleomycins)，》文線菌素C(cactinomycin)，力口利車(chē)霉素(calicheamicin)，carabicin,洋紅霉素(chromomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素(chromomycins)，放線菌素D(dactinomycin)，道諾紅菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin),表阿霉素(epirubicin),依索比星(esorubicin),伊達(dá)比星(idarubicin),發(fā)波霉素(marcellomycin)，絲裂霉素(mitomycins),霉酚酸(mycophenolicacid),諾力口霉素(nogalamycin)，橄欖霉素(olivomycin),培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin,口票呤霉素(puromycin)，三鐵阿霉素(quelamycin),羅多比星(rodorubicin),鏈黑菌素(streptonigrin);鏈脲霉素(streptozocin)，殺結(jié)核菌素(tubercidin),烏苯美司(ubenimex)，凈司j也丁(zinostatin),佐柔比星(zorubicin);抗代謝藥如氨曱蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類(lèi)似物如二曱葉酸(denopterin)，氨曱蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin),三曱曲沙(trimetrexate);嘌呤類(lèi)似物氟達(dá)拉濱(fludarabine)，6-巰基。票呤，硫咪噪呤(thiamiprine)，硫鳥(niǎo)噤呤(thioguanine);嘧，定類(lèi)似物如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofUr)，阿糖胞苷(cytarabine),雙脫氧尿苦(dideoxyuridine)，doxifluridine，依諾他濱(enocitabine)，氟尿香(floxuridine),5-FU;雄激素類(lèi)如二曱睪酮(calusterone),丙酸曱雄烷酮(dromostanolongpropionate)，環(huán)石充#醇(epitiostanol)，美#氛(mepitiostane)，睪內(nèi)酉旨(testolactone);抗腎上腺類(lèi)如氨魯米特(aminoglutethimide),鄰氯苯對(duì)氯苯二氯乙烷(mitotane)，曲洛司坦(trilostane);葉酸補(bǔ)充劑如frolinicacid;醋葡內(nèi)酉旨(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);安吖咬(amsacrine);bestrabucil;比生群(biasntrene);依達(dá)曲沙(edatraxate);defofamine;秋水仙胺(demecolcine);地吖醌(diaziquone);elfornithine;依牙'J醋銨(elliptiniumacetate);依4乇格魯(etoglucid);硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan);氯尼達(dá)明(lonidamine);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫派達(dá)醇(mopidamol);硝吹旦(nitracrine);噴司4也丁(pintostatin);phenamet;p比柔比星(pirarubicin);鬼臼樹(shù)酸(podophyllinicacid);2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine);PSK;雷佐生(razoxane);西索菲蘭(sizofimn);鍺螺胺(spirogermanium);纟田交鏈孢菌酮酸(tenuazonicacid);三亞胺醌(triaziquone);2,2',2"-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine);烏拉坦(urethan);長(zhǎng)春石咸酰胺(vindesine);達(dá)卡巴噢(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol);溴丙p底。秦(pipobroman);gacytosine;阿伯津唐苦("Ara-C");環(huán)磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa);紫杉醇樣物質(zhì)(taxoid),如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL,Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,NJ)和紫杉萜(doxetaxel)(TAXOTERE⑧，Rhone-PoulencRorer，Antony,France);苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine);6-硫代鳥(niǎo)嘌呤；巰基嘌呤；氨曱蝶呤；鉑類(lèi)似物如順鉑和卡鉑；長(zhǎng)春花堿(vinblastine);柏；依托泊戒(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);絲裂霉素C(mitomycinC);米托蒽醌；長(zhǎng)春4斤石威(vincristine);長(zhǎng)春瑞賓(vinorelbine);navelbine;novantrone;替尼泊戒(teniposide);柔紅霉素(daunomycin);氛基蝶吟(aminopterin);xeloda;伊拜膦酸鹽(ibandronate);CPT-11;拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥(niǎo)氨酸(DMFO);維曱酸(retinoicacid);esperamicins;卡培4也濱(capecitabine);以及上述任何物質(zhì)的可藥用鹽，酸或衍生物。此定義還包括能調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素制劑，如抗雌激素制劑包括他莫昔芬(tamoxifen),雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制劑4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene),keoxifene,LY117018，奧那司酮(onapristone)，和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素制劑如氟他氨(flutamide)，尼魯米特(nilutamide),bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);和上述任何物質(zhì)的可藥用鹽，酸或衍生物。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞因子"是一般性術(shù)語(yǔ)，指由一個(gè)細(xì)胞群釋放的對(duì)另一個(gè)細(xì)胞群起細(xì)胞間介質(zhì)作用的蛋白。此種細(xì)胞因子的實(shí)例是淋巴因子，單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。這些細(xì)胞因子包括生長(zhǎng)激素，如人生長(zhǎng)激素，N-曱二磺酰(methionyl)人生長(zhǎng)激素，和牛生長(zhǎng)激素；曱狀旁腺素；曱狀腺素；胰島素；前胰島素；松馳素；前松馳素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，曱狀腺刺激素(TSH),促黃體(生成)激素(LH);肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；催乳激素；胎盤(pán)催乳素(placentallactogen);腫瘤壞死因子-a和P;苗勒氏管抑制物質(zhì)(mullerian-inhibitingsubstance);小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；苯丙酸諾龍(activin);血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長(zhǎng)因子如NGF-p;血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)如TGF-a和TGF-p;胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II;促紅細(xì)胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子(osteoinductivefactors);干擾素如干擾素-a,-卩，-y;集落刺激因子(CSF)如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF);粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF);粒細(xì)胞-CSF(G畫(huà)CSF);白細(xì)胞介素(IL)如IL-l,IL-la,IL-2，IL-3,IL-4，IL-5，IL-6，IL-7,IL-8，IL-9,IL-11,IL-12,IL-15;腫瘤壞死因子如TNF-a或TNF-|3，和其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。本文中術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括來(lái)自天然來(lái)源的蛋白或來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白以及天然序列細(xì)胞因子的生物活性等效物。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)"前體藥物"是指藥物活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，其相對(duì)于親本藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用較小且可酶促活化或被轉(zhuǎn)二換成更具活性的親本形式。例見(jiàn)Wilman，"ProdrugsinCancerChemotherapy"B/oc/zew/ca/5bc/e(y7ha7wac"ows，14，pp.375-382，615thMeetingBelfast(1986)和Stellae/1a/.,"Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery,"D/m:^/Z>wgZ)e//v^>>,Borchardtd(ed.),pp.247-267,HumanaPress(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括，但不限于含有磷酸鹽的前體藥物，含有硫代磷酸鹽的前體藥物，含有硫酸鹽的前體藥物，含有肽的前體藥物，D-氨基酸修飾的前體藥物，糖基化的前體藥物，含有|3-內(nèi)酰胺的前體藥物，任選含有取代的苯氧乙酰胺的前體藥物或任選含有取代的苯基乙酰胺的前體藥物，可轉(zhuǎn)化為更具細(xì)胞毒活性的游離藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明所用前體藥物形式的細(xì)胞毒藥物包括，但不限于上述化療劑。"脂質(zhì)體"是由能向哺乳動(dòng)物有效運(yùn)送藥物(如本文所公開(kāi)的拮抗劑，和，任選地，化療劑)的各類(lèi)脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑組成的小分子載體。通常將脂質(zhì)體成分安排為一種雙層形式，其類(lèi)似于生物膜的脂質(zhì)排列。II.拮抗劑的制備本發(fā)明的方法和制品使用，或摻入了一種能結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)志的拮抗劑。相應(yīng)地，本文還描述了產(chǎn)生這類(lèi)拮抗劑的方法。用于產(chǎn)生或篩選拮抗劑的B細(xì)胞表面標(biāo)志可以是，如抗原的可溶形式或其一部分，包括所需表位?；蛘撸蛉芜x，在表面表達(dá)所述B細(xì)胞表面標(biāo)志的細(xì)胞可用于產(chǎn)生或篩選拮抗劑?？捎糜诋a(chǎn)生拮抗劑的其它形式的B細(xì)胞表面標(biāo)志為本領(lǐng)域所顯而易見(jiàn)，優(yōu)選為CD20抗原。雖然優(yōu)選的拮抗劑是抗體，但除抗體以外的其它拮抗劑也包括在此。例如，拮抗劑可含有任選融合至或偶聯(lián)于細(xì)胞毒制劑(如本文所公開(kāi)的那些)的小分子?？稍谛》肿游膸?kù)中篩選本文的目標(biāo)B細(xì)胞表面標(biāo)志，以便鑒定能與該抗原結(jié)合的小分子。還可進(jìn)一步篩選小分子的拮抗特性和/或使其與細(xì)胞毒制劑偶聯(lián)。拮抗劑也可以是經(jīng)合理設(shè)計(jì)或噬菌體展示(例見(jiàn)WO98/35036,1998年8月13日公開(kāi))而產(chǎn)生的肽。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所選的分子可以是"CDR類(lèi)似物"或基于抗體CDR而設(shè)計(jì)的抗體類(lèi)似物。盡管所述肽本身可能就有拮抗性，但任選將此肽與細(xì)胞毒制劑融合，以便添加或增強(qiáng)此肽的拮抗性。以下為本發(fā)明所用抗體拮抗劑的制備技術(shù)舉例。(T)多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選通過(guò)多次給動(dòng)物皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑而產(chǎn)生。將所述相關(guān)抗原與針對(duì)所免疫的物種具有免疫原性的蛋白(如匙孔血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemocyanin)、血清白蛋白、牛曱狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)用雙功能試劑或衍生試劑，如馬來(lái)酰亞氨苯曱?；虼牾啺孵?通過(guò)半胱氨酸殘基結(jié)合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴(lài)氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R'NONR(R和W是不同烷基)，進(jìn)行偶聯(lián)是有效的。用所述抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫動(dòng)物，方法是，將100嗎或5嗎蛋白或偶聯(lián)物(分別針對(duì)兔或鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混合，在多位點(diǎn)皮內(nèi)注射該溶液。l個(gè)月后，多位點(diǎn)皮內(nèi)注射起始量的1/5-1/10的肽或與弗氏完全佐劑的偶聯(lián)物來(lái)加強(qiáng)免疫。7-14天后，對(duì)動(dòng)物采血，測(cè)定血清中的抗體效價(jià)。對(duì)動(dòng)物的加強(qiáng)免疫直到效價(jià)達(dá)到平臺(tái)期為止。優(yōu)選給動(dòng)物加強(qiáng)注射相同抗原的偶聯(lián)物，但也可以是偶聯(lián)至不同蛋白和/或通過(guò)不同的交聯(lián)劑偶聯(lián)的偶聯(lián)物。偶聯(lián)物還可以是重組細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的融合蛋白。此外，可用明礬等聚集劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答。(ii)單克隆抗體單克隆抗體來(lái)自基本均一的抗體群，即該群體中的每個(gè)抗體除了可能的很小量天然突變外都相同。因此，修飾詞"單克隆"指所述抗體的并非不同抗體混合物的特性。例如，單克隆抗體可用由Kohler"a/.，A^ww，256:495(1975)首次描述的雜交瘤技術(shù)制備，或用重組DNA方法制備(美國(guó)專(zhuān)利4,816,567)。在雜交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它適合的宿主動(dòng)物如倉(cāng)鼠，以激發(fā)那些產(chǎn)生或能產(chǎn)生與用于免疫之蛋白特異性結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞。另外，可體外免疫淋巴細(xì)胞。然后用適當(dāng)融合劑，如聚乙二醇，使淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，Mo"oc/o"a/爿""6od/w/W"一Z&s1aw/尸rac"'ce,pp.59-103(AcademicPress,1986》。將如此制備的雜交瘤細(xì)胞接種至適當(dāng)培養(yǎng)基中并培養(yǎng)，優(yōu)選該培養(yǎng)基含有一或多種能抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃喋呤鳥(niǎo)噤呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤培養(yǎng)基通常將包含次黃噤呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。優(yōu)選骨髓瘤細(xì)胞是那些能有效融合、支持所選抗體生成細(xì)胞以穩(wěn)定的高水平產(chǎn)生抗體，并對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基等類(lèi)似培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，如由SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego，CaliforniaUSA提供的MOPC-21和MPC-ll小鼠腫瘤細(xì)胞和由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville,MarylandUSA提供的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞。也有報(bào)道稱(chēng)人骨髓瘤以及小鼠-人異質(zhì)性骨髓瘤細(xì)胞系可用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，/mmw"o/"133:3001(1984);BrodeurWa/"Mowoc/om/^4油'6o辦尸ra血c",ow7^c/2"—JpWcaf/om1,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987》?？稍诤猩L(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中分析直接針對(duì)所述抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合試驗(yàn)，如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)來(lái)分析。單克隆4元體的結(jié)合親和力可通過(guò)如MunsonW5/oc/2em.，107:220(1980)所述Scatchard分析來(lái)測(cè)定。一旦鑒定出能產(chǎn)生具有所需特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，將這些克隆通過(guò)有限稀釋法進(jìn)一步克隆并用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding，Mowoc/cwa/J油力od/w尸n'"cz》/asPracf/ce，pp.59-103(AcademicPress,1986))。適于此目的的培養(yǎng)基包括如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可作為腹水中腫瘤的形式在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)。由亞克隆分泌的單克隆抗體可用常規(guī)免疫球蛋白純化方法如蛋白-A-Sepharose、輕基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養(yǎng)基、腹水或血清中分離。編碼單克隆抗體的DNA可用常規(guī)方法很容易的分離和測(cè)序(如利用能與編碼小鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞是這類(lèi)DNA的優(yōu)選來(lái)源。DNA分離后，可將其插入表達(dá)載體中，然后用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞、猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，以便在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。編碼抗體的DNA在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述包括Skerra"a/.,Cwr.Z"/mmwwo/"5:256-262(1993)andPliickthun,7wmwwo/.7ev&,130:151-188(1992)。在另一實(shí)施方案中，可從抗體噬菌體文庫(kù)分離抗體或抗體片段，所述文庫(kù)可以采用McCafferty&a/.，Wa加"，348:552-554(1990)描述的技術(shù)制備。Clackson""/.,淑,，352:624-628(1991)和Marksefa/"/Mo/.B/o/"222:581-597(1991)分別描述了用噬菌體文庫(kù)分離鼠和人的抗體。后來(lái)的文獻(xiàn)描述了通過(guò)鏈改組制備高親和力(nM范圍)的人型抗體(MarksW5/o/rec/z"o/ogv,10:779-783(1992))，以及用于構(gòu)建大規(guī)模噬菌體文庫(kù)的組合感染和體內(nèi)重組方法(Waterhouseefa/"^c/<*.及&s"21:2265-2266(1993))。因此，這些技術(shù)都可取代傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)來(lái)分離克隆抗體。DNA也可通過(guò)用人類(lèi)重鏈和輕鏈的恒定區(qū)編碼序列取代小鼠同源序列來(lái)修飾(美國(guó)專(zhuān)利4,816,567;Morrison,"戶(hù)rac.扁5W.園，81:6851(1984)),或通過(guò)將非免疫J求蛋白多肽的全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價(jià)結(jié)合來(lái)修飾。通常用所述非免疫球蛋白多肽取代抗體恒定區(qū)，或取代抗體上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)的可變區(qū)，形成二價(jià)嵌合抗體，其中一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)特異于一種抗原而另一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)特異于另一種抗原。(iii)人源化抗體本領(lǐng)域已有關(guān)于人源化非人類(lèi)抗體的制備方法的描述。優(yōu)選人源化抗體中已導(dǎo)入一或多個(gè)源自非人類(lèi)的氨基酸殘基。這些非人類(lèi)氨基酸殘基常稱(chēng)為"引進(jìn)的，，殘基，它們通常來(lái)自"引進(jìn)的"可變區(qū)。人源化過(guò)程基本如Winter及其同事(JonesWa/"Atowe,321:522-525(1986);Riechmannefa/"A^ww,332:323-327(1988);Verhoeyen"a/"Sc/e"ce，239:1534-1536(1988))所述，用高變區(qū)序列取代人類(lèi)抗體的相應(yīng)序列來(lái)進(jìn)行。因此，這樣的"人源化"抗體是嵌合抗體(美國(guó)專(zhuān)利4,816,567),其中完整人類(lèi)可變區(qū)的很少一部分被非人類(lèi)物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中高變區(qū)殘基且可能有部分FR殘基被嚙齒類(lèi)抗體中類(lèi)似位點(diǎn)的殘基取代。對(duì)用于制備人源化抗體的人類(lèi)可變區(qū)包括重鏈和輕鏈進(jìn)行的選擇，對(duì)降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂"最適應(yīng)，，方法，針對(duì)已知人類(lèi)可變區(qū)序列的整個(gè)文庫(kù)篩選嚙齒類(lèi)抗體可變區(qū)序列。將與嚙齒類(lèi)的序列最相似的人類(lèi)序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims"a/.,//mmw"o/.，151:2296(1993);Chothia"a/.，J!Mo/.所o/.，196:901(1987))。另一種方法是用人類(lèi)輕鏈或重鏈特定亞型的所有抗體的共有序列作為特定框架區(qū)。相同的框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter"a/.，A^/.Jcad5W.t/W,89:4285(1992);PrestaW"/"http://畫(huà)畫(huà)/.，151:2623(1993》。更重要的是，將抗體人源化后保留了對(duì)抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達(dá)到此目的，在一種優(yōu)選方法中，通過(guò)用親本序列和人源化體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象的計(jì)算機(jī)程序。通過(guò)觀察這些展示結(jié)果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基，通過(guò)這種方法，可從受者和引進(jìn)序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質(zhì)，如對(duì)靶抗原的親和力增加?？傊?，高變區(qū)殘基直接并且最主要涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。(iv)人類(lèi)抗體除了進(jìn)行人源化以外還可制備人類(lèi)抗體。例如現(xiàn)在已能產(chǎn)生如下轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)，它們通過(guò)免疫能產(chǎn)生人類(lèi)抗體的所有成分而不產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白。例如，有報(bào)道稱(chēng)，嵌合及種系(germ-line)突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(Jh)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源抗體的產(chǎn)生被完全抑制。將人類(lèi)種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這類(lèi)種系突變小鼠中將導(dǎo)致因抗原攻擊而誘導(dǎo)人類(lèi)的抗體產(chǎn)生。見(jiàn)Jakobovits"a/.,A^/.5W.t/iS^，90:2551(1993);Jakobovitsefa/"iVa/wre，362:255-258(1993);Bruggermannefa/"J^ar/w/m/"a，7:33(1993);和美國(guó)專(zhuān)利5591669，5589369和5545807。或者，可用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty"A^w"348:552-553(1990))從未免疫供者的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因的所有組成而體外產(chǎn)生人類(lèi)抗體和抗體片段。依據(jù)此技術(shù)，將抗體V區(qū)基因克隆在與絲狀噬菌體(如M13或fd)主要或次要衣殼蛋白基因相同的框架內(nèi)，并在噬菌體顆粒的表面展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，根據(jù)抗體的功能特點(diǎn)進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致對(duì)顯示這些性質(zhì)的抗體的編碼基因進(jìn)行選擇。因此，噬菌體模仿了B細(xì)胞的部分特點(diǎn)。噬菌體展示可以以多種形式進(jìn)4?。贿@些綜述見(jiàn)Johnson,KevinS.andChiswell，DavidJ.，Cwrewf(9;/m'o"/"5^w"wra/5/o/ogv3:564-571(1993)?？墒褂肰基因片段的多個(gè)來(lái)源進(jìn)行噬菌體展示。Clackson"Atow"，352,624-628(1991)從免疫小鼠脾臟來(lái)源的V基因的隨機(jī)組合小文庫(kù)中分離了抗-惡唑酮抗體的一個(gè)多樣性陣列?？苫救鏜arks"a/.,/Mo/.B/o/.222:581-597(1991)，orGriffith"￡M^9/12:725-734(1993)所述構(gòu)建未免疫人類(lèi)供者的V基因所有組成，并分離針對(duì)抗原多樣性陣列(包括自身抗原)的抗體。亦參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5565332和5573905。人類(lèi)抗體也可通過(guò)體外激活的B細(xì)胞而產(chǎn)生(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,567,610和5,229,275)。(v)抗體片段已開(kāi)發(fā)了生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，這些片段通過(guò)對(duì)完整抗體的蛋白7jC解'I"生消M匕獲4尋(見(jiàn)Morimotoa/.，Jow"a/o/Bz'oc/zew/c"/aw/5/—戸WMe決oA24:107-117(1992)和Bre腿nWa/"5W置e，229:81(1985))。但現(xiàn)在可直接通過(guò)重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生這些片段。例如，可從上述抗體噬菌體庫(kù)分離抗體片段。另外，可從大腸桿菌直接回收Fab，-SH片段，并經(jīng)化學(xué)連接形成F(ab，)2片段(Carter等，生物/技術(shù)10:163-167(1992))。依據(jù)另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)中分離F(ab，)2片段。其它產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。在其它實(shí)施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見(jiàn)W093/16185;美國(guó)專(zhuān)利5,571,894;和美國(guó)專(zhuān)利5,587,458?？贵w片段也可以是"線性化抗體"，如美國(guó)專(zhuān)利5,641,870所述。這類(lèi)線性化抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。(vi)雙特異性抗體雙特異性抗體是具有針對(duì)至少兩種不同表位的結(jié)合特異性的抗體。如雙特異性抗體可以與B細(xì)胞表面標(biāo)志物的兩種不同表位結(jié)合。其它這類(lèi)抗體可以結(jié)合第一個(gè)B細(xì)胞表面標(biāo)志并再結(jié)合第二個(gè)B細(xì)胞表面標(biāo)志?；蛘撸蓪⒖笲細(xì)胞標(biāo)志物的結(jié)合臂與結(jié)合白細(xì)胞上引發(fā)分子的臂結(jié)合，從而集中針對(duì)B細(xì)胞的細(xì)胞防御機(jī)制，所述引發(fā)分子如T細(xì)胞受體分子(CD2或CD3)，或IgGFc受體(FcYR)如FcYRI(CD64)、FcYRII(CD32)和FcYRm(CD16)。雙特異性抗體還可用于將細(xì)胞毒制劑定位至B細(xì)胞。這些抗體具有B細(xì)胞標(biāo)志物結(jié)合臂和結(jié)合細(xì)胞毒制劑(例如皂草素，抗INF-a，長(zhǎng)春花生物堿，蓖麻毒蛋白A鏈，氨曱蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(如F(ab，)2雙特異性抗體)。制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。完整雙特異性抗體的傳統(tǒng)制備方法是基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中這兩條鏈具有不同特異性(MillsteinWa/.,A^rt/w,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機(jī)分配，這些雜交瘤(quadroma)可能產(chǎn)生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。對(duì)所述正確分子的純化(通常通過(guò)親和層析步驟來(lái)進(jìn)行)非常復(fù)雜，且產(chǎn)量很低。類(lèi)似的方法見(jiàn)WO93/08829和Traunecker^a/.,五M5(9J"10:3655-3659(1991)。依據(jù)另一種方法，可將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)的至少一部分、CH2及CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結(jié)合所需位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)出現(xiàn)在至少在一種融合中。可將編碼免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時(shí)，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染至適當(dāng)宿主生物。這使得在使用非等比的三種多肽鏈進(jìn)行構(gòu)建的實(shí)施方案中，能夠較靈活地調(diào)整三種多肽片段的相互比例，以獲得最佳產(chǎn)量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達(dá)而獲得高產(chǎn)時(shí)或所述比例無(wú)特別意義時(shí)，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達(dá)載體。在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的帶有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。已發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)有利于從非必要免疫球蛋白鏈的混合中分離出所需雙特異性化合物，因?yàn)橹挥性撾p特異性分子的一半上存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開(kāi)于WO94/04690中。制備雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，見(jiàn)Suresh""/.，Mef/zo(is五"2^mo/ogy，121:210(1986)。根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利5,731,168所述的另一種方法，可改造一對(duì)抗體分子之間的界面，使得從重組細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的異源二聚體的百分比最大。優(yōu)選的界面包括抗體恒定區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在該方法中，源于第一抗體分子界面上的一條或多條氨基酸小側(cè)鏈被較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側(cè)鏈大小相同或相近的互補(bǔ)"溝"可通過(guò)將氨基酸大側(cè)鏈用小側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這使得異二聚體的產(chǎn)量比不想要的終產(chǎn)物如同型二聚體的高。雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或"異源偶聯(lián)的"抗體。例如，可使異源偶聯(lián)物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶聯(lián)，使另一抗體與生物素偶聯(lián)。有4676980)，也可用于治療HIV感染(W091/00360，WO92/200373,EP03089)。異源偶聯(lián)抗體可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)慕宦?lián)方法制備。適當(dāng)?shù)慕宦?lián)制劑和多種交聯(lián)技術(shù)為本領(lǐng)域已知，可在美國(guó)專(zhuān)利4676980號(hào)中獲得。從抗體片段制備雙特異性抗體的技術(shù)已有文獻(xiàn)。例如，雙特異性抗體可利用化學(xué)連接制備。BrennanWa/.，5We"ce，229:81(1985)中描述了將完整抗體經(jīng)蛋白水解制備F(ab')2片段的方法。這些片段在二巰基復(fù)合劑亞砷酸鈉存在時(shí)被還原，從而穩(wěn)定相鄰的巰基，并阻止分子間二硫鍵的形成。生成的Fab'片段被轉(zhuǎn)化為硫硝基苯曱酸鹽(TNB)衍生物。其中一種Fab'-TNB衍生物經(jīng)巰基乙胺還原成Fab'-硫醇，再與等分子量的其它Fab'-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產(chǎn)生的雙特異性抗體可作為酶的選擇性固相化中所用的試劑。近期的進(jìn)展促進(jìn)了Fab'-SH片段從大腸桿菌的直接回收，該片段可經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。ShalabyW"/.,/MW.，175:217-225(1992)中描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab')2分子的產(chǎn)生。每一Fab'片段分別從大腸桿菌中分泌出來(lái)，體外直接化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。如此制備的雙特異性抗體能與過(guò)表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞結(jié)合，還能引發(fā)人類(lèi)細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞對(duì)人乳腺腫瘤細(xì)胞的裂解活性。直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)中制備并分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelny"a/.,//ww""o/.,148(5):1547-1553(1992)。將來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab'部分通過(guò)基因融合而連接。使抗體的同型二聚體在鉸鏈區(qū)被還原成單體，然后被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用于制備抗體同型二聚體。由HollingeraTVoc.Ato/.^cad5W.UiSA90:6444-6448(1993)描述的"二價(jià)抗體"技術(shù)提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有重鏈可變區(qū)(Vh)，其通過(guò)接頭與輕鏈可變區(qū)(Vl)相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間無(wú)法配對(duì)。因此，同一片段上的Vh和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一片段上的互補(bǔ)Vl和Vh結(jié)枸域配對(duì)，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。此外還報(bào)道了另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來(lái)制備雙特異性抗體的策略。見(jiàn)Gruber"a/.,//附/w""o/.，152:5368(1994)。還考慮了二價(jià)以上的抗體。如可制備三特異性抗體。TuttWa/./畫(huà),/.147:60(1991)。m.偶聯(lián)以及對(duì)拮抗劑的其它修飾本文方法中用到或制品中包括的拮抗劑可任選與細(xì)胞毒制劑偶聯(lián)。可用于制備這些拮抗劑-細(xì)胞毒制劑偶聯(lián)物的化療劑如上述。本文還涉及拮抗劑與一或多種小分子毒素，如加利車(chē)霉素(calicheamicin)，美登素(maytansine)(美國(guó)專(zhuān)利5,208,020),單端孢霉烯(trichothene)，CC1065的偶聯(lián)物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使拮抗劑與一或多個(gè)美登素分子偶聯(lián)(如每個(gè)拮抗劑分子與約l-10個(gè)美登素分子偶聯(lián))。美登素可轉(zhuǎn)化成May-SS-Me,然后還原成May-SH3，并與修飾過(guò)的拮抗劑反應(yīng)(Chari"a/.Ca"cer/e化orc/752:127-131(1992))產(chǎn)生美登木素生物堿(maytansinoid)-拮抗劑偶聯(lián)物。另外，拮抗劑可以與一或多個(gè)加利車(chē)霉素分子結(jié)合。加利車(chē)霉素家族的抗生素能在亞pM濃度水平產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂?？墒褂玫募永?chē)霉素結(jié)構(gòu)類(lèi)似物包括，但不限于y/、ct21、ci31、N-乙酰基,1、PSAG以及e、(Hinmana/.Ca"ceriesearc/z53:3336-3342(1993)和LodeefCa"ceri&sea/r/z58:2925-2928(1998》。可以應(yīng)用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來(lái)自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、oc-帚曲毒素、油桐(J/ewHtes/oni")蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(尸/^o/aca^weWca"a)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momorafcac/zara"to)抑制因子、麻瘋樹(shù)毒蛋白、巴豆毒蛋白、月巴皂草(sopaowan'aq^c/"ato)4中制劑，白初于毒素，米4乇菌素(mitogellin)、局卩艮曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。例見(jiàn)1993年10月28日公開(kāi)的W093/21232。本發(fā)明還涉及與具有核裂解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶如脫氧核糖核酸酶；DNase)偶聯(lián)的拮抗劑。多種放射性同位素可用于制備放射性偶聯(lián)的拮抗劑，實(shí)例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32以及Lu的放射性同位素。拮抗劑與細(xì)胞毒制劑的偶聯(lián)物可通過(guò)多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑來(lái)連接，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N.馬來(lái)酰亞氨曱基)環(huán)己烷-l-羧酸酯，iminothiolane(IT)，亞氨酸酯的雙功能衍生物(如亞氨基己二酸二曱酯鹽酸鹽)，活性酯類(lèi)(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(lèi)(如戊二醛(glutareldehyde))，雙-疊氮化合物(如雙(對(duì)-疊氮基苯曱酰基)己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對(duì)-重氮苯曱酰基)-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta"a/.6We"ce238:1098(1987)所述制備。C"標(biāo)記的l-異硫氰酸苯曱基-3-曱基二亞乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯(lián)至拮抗劑的偶聯(lián)劑之一。見(jiàn)W094/11026。這種接頭可能是有利于細(xì)胞毒藥物在細(xì)胞內(nèi)釋放的"可斷開(kāi)的接頭"。例如，可使用酸不穩(wěn)定型接頭，肽酶敏感型接頭，二曱基接頭或含二硫鍵的接頭(Chari"a/.Ca"cw/e涯/r/z52:127-131(1992》?；蛘?，可通過(guò)重組技術(shù)或肽合成來(lái)獲得拮抗劑與細(xì)胞毒制劑的融合蛋白。在另一實(shí)施方案中，拮抗劑可與腫瘤預(yù)靶向中應(yīng)用的"受體"(如鏈霉抗生物素蛋白)偶聯(lián)，將該拮抗劑-受體偶聯(lián)物給予患者，之后用清除劑除去循環(huán)中未結(jié)合的偶聯(lián)物，再給予已偶聯(lián)了細(xì)胞毒制劑(如放射性核苷酸)的"配體"(如抗生物素蛋白)。本發(fā)明的拮抗劑還可與前體藥物活化酶相結(jié)合，該酶可以將前體藥物(如肽基化療劑，見(jiàn)WO81/01145)轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥物。見(jiàn)WO88/07378和美國(guó)專(zhuān)利4,975,278。這些偶聯(lián)物中的酶組分包括能作用于前體藥物使其轉(zhuǎn)化為活性更強(qiáng)的細(xì)胞毒形式的任何酶。本發(fā)明的方法中用到的酶包括，但不限于，能將含磷酸基的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酶；可將含硫酸基的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳香基硫酸酯酶；將無(wú)毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥物，如5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；能將含肽的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的蛋白酶，如沙雷氏菌屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)等；可轉(zhuǎn)化含D-氨基酸取代基的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；能將糖基化前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的碳水化合物裂解酶類(lèi)如p-半乳糖苦酶和神經(jīng)氨酸酶；能將p-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的卩-內(nèi)酰胺酶；能在藥物中的氨基氮處分別用苯氧乙酰基或苯乙?；D(zhuǎn)化而使藥物游離的青霉素酰胺酶如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶?；蛘撸捎帽绢I(lǐng)域稱(chēng)為"抗體酶"的具有酶活性的抗體，將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離的活性藥物(見(jiàn)Massey，A^ww328:457-458(1987))。可如本文所述制備拮抗劑-抗體酶偶聯(lián)物以便將抗體酶運(yùn)送至腫瘤細(xì)胞群。本發(fā)明的酶可通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)，如上述異源雙功能交聯(lián)試劑的使用而與拮抗劑共價(jià)結(jié)合。或者，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的DNA重組技術(shù)(如Neuberger"a/"A^we,312:604-608(1984))構(gòu)建含至少本發(fā)明拮抗劑的抗原結(jié)合區(qū)的融合蛋白，所述拮抗劑與本發(fā)明酶的至少一個(gè)功能活性部分連接。本文還涉及對(duì)拮抗劑的其它修飾。例如，拮抗劑可與一種非蛋白多聚物，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯(polyoxyalkylene)、或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物交聯(lián)。本文公開(kāi)的拮抗劑還可配成脂質(zhì)體。含拮抗劑的脂質(zhì)體可通過(guò)本領(lǐng)域已知方法制備，如Epstein""/.,尸rac.編.^cad5W.腦，82:3688(1985);Hwang"a/"尸rac.A^/灰flc/.77:4030(1980);美國(guó)專(zhuān)利4,485,045和4,544,545及1997年10月23日公開(kāi)的W097/38731。在美國(guó)專(zhuān)利5,013,566中公開(kāi)了循環(huán)壽命增加了的脂質(zhì)體。特別有效的脂質(zhì)體可利用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物經(jīng)反相蒸發(fā)法產(chǎn)生。脂質(zhì)體通過(guò)一定孔徑大小的濾膜而擠出后獲得具有所需直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明抗體的Fab，片段可如Martinda/.>/所o/.C7^肌257:286-288(1982)所述，經(jīng)二石克化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)?？扇芜x在所述脂質(zhì)體中包含一種化療制劑。見(jiàn)Gabizone//編'麵/Ga騰〃組81(19)1484(1989)。本發(fā)明還涉及對(duì)本文所述蛋白質(zhì)或肽類(lèi)拮抗劑的氨基酸序列修飾。例如，可預(yù)期改進(jìn)拮抗劑的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性。拮抗劑的氨基酸序列變體可通過(guò)在拮抗劑核酸中導(dǎo)入適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖?，或通過(guò)肽合成法來(lái)制備。所述修飾包括，如該拮抗劑的氨基酸序列中的殘基缺失，和/或插入和/或取代。可對(duì)缺失、插入、和取代進(jìn)行任意組合以獲得最終構(gòu)建體，只要該最終構(gòu)建體具有所需特性。氨基酸的變化還可改變拮抗劑的翻譯后加工，如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。一種鑒別拮抗劑中處于誘變優(yōu)選位置的特定殘基或區(qū)域的有效方法是CunninghamandWells5We"ce，244:1081-1085(1989)所述的"丙氨酸掃描誘變"。這里，鑒定一個(gè)殘基或一組靶殘基(例如，帶電的殘基如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負(fù)電的氨基酸取代(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影響氨基酸與抗原的相互作用。那些證實(shí)對(duì)取代具有功能敏感性的氨基酸位置通過(guò)在取代點(diǎn)引入進(jìn)一步的或其他的變體而改進(jìn)。故，盡管引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，但突變本身不必是預(yù)定的。例如，為分析在指定位點(diǎn)處突變的作用，在所述靶密碼子或區(qū)域?qū)嵭斜彼釖呙杌螂S機(jī)誘變，并篩選所表達(dá)的具有預(yù)期活性的拮4元?jiǎng)┳凅w。氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的融合(其長(zhǎng)度從一個(gè)殘基至包括100個(gè)或更多殘基的多肽)，以及序列內(nèi)單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的插入。末端插入的例子包括帶有N-末端曱疏氨酰殘基的拮抗劑或與細(xì)胞毒性多肽融合的拮抗劑。拮抗劑分子的其它插入變體包括在酶或多肽的拮抗劑的N-或C-末端進(jìn)行融合，以增加拮抗劑在血清中的半衰期。另一類(lèi)變體是氨基酸取代變體。這些變體使拮抗劑分子中至少一個(gè)氨基酸殘基被不同殘基取代。抗體拮抗劑分子中最有興趣進(jìn)行取代誘變的位點(diǎn)包括高變區(qū)，也可以改變FR。保守取代見(jiàn)表l的"優(yōu)先取代"欄。如果這些取代引起生物學(xué)活性的改變，則可引入表l中"取代舉例"欄的更實(shí)質(zhì)性改變，或進(jìn)一步在下文的氨基酸分類(lèi)中所述的更實(shí)質(zhì)性改變，并篩選產(chǎn)物。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>對(duì)拮抗劑的生物學(xué)特性的實(shí)質(zhì)性修改可通過(guò)選擇性取代來(lái)完成，所述取代的效應(yīng)在維持(a)取代區(qū)多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如折疊結(jié)構(gòu)或螺旋構(gòu)象，(b)該分子靶位點(diǎn)的電荷或疏水性，(c)側(cè)鏈的大小這幾方面有顯著差異。天然殘基根據(jù)共有的側(cè)鏈特性可分為(1)疏水性正亮氨酸，曱硫氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸異亮氨酸(2)中性親水半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸(4)石咸性天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴(lài)氨酸，精氨酸(5)影響側(cè)鏈定向的殘基甘氨酸，脯氨酸(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。非保守取代將限定上述某一類(lèi)的成員被另一類(lèi)取代。與維持拮抗劑正確構(gòu)象有關(guān)的任何半胱氨酸殘基也可被取代，如被絲氨酸取代，以提高該分子的氧化穩(wěn)定性，并阻止異常交聯(lián)。相反，可在拮抗劑中添加半胱氨酸連接以提高其穩(wěn)定性(特別當(dāng)拮抗劑為抗體片段如FV片,史時(shí))。取代變體的特別優(yōu)選類(lèi)型包括取代親本抗體高變區(qū)的一或多個(gè)殘基。通常，所選用于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的變體相對(duì)于其親本抗體應(yīng)具有改進(jìn)的生物學(xué)活性。產(chǎn)生這種取代變體的一個(gè)方便方法是利用了噬菌體展示的親和力成熟。筒單地說(shuō)，使高變區(qū)的幾個(gè)位點(diǎn)(如6-7個(gè)位點(diǎn))突變以便在每一位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。這樣產(chǎn)生的抗體變體以單價(jià)形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，其為與每個(gè)顆粒內(nèi)包裝的M13基因III產(chǎn)物的融合體。然后篩選噬菌體展示的變體是否具有本文所述生物學(xué)活性(如結(jié)合親和力)。為了鑒定備選的高變區(qū)修飾位點(diǎn)，可通過(guò)丙氨酸掃描誘變來(lái)鑒定對(duì)抗原結(jié)合作出主要貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基。此外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以確定抗原與抗體之間的接觸點(diǎn)也較有利。這些接觸殘基及其鄰近殘基是根據(jù)本文所述技術(shù)進(jìn)行取代的候選位點(diǎn)。一旦產(chǎn)生這樣的變體，如本文所述對(duì)它們?nèi)窟M(jìn)行篩選，選出在一或多個(gè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中具有優(yōu)勢(shì)特性的抗體以便進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。拮抗劑的另一種氨基酸變體改變了拮抗劑原來(lái)的糖基化模式。所謂改變就是去掉拮抗劑中的一或多個(gè)碳水化合物部分，和/或添加一或多個(gè)原本不存在于該拮抗劑中的糖基化位點(diǎn)。多肽的糖基化通常為N-連接或O-連接。N-連接指將碳水化合物部分與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈相連。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中x是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使碳水化合物部分與天冬酰胺側(cè)鏈酶促相連的識(shí)別序列。因此，多肽中存在上述任一種三肽序列都可產(chǎn)生潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接糖基化指將N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附著于羥基氨基酸，主要是絲氨酸、蘇氨酸，但也可用5-羥脯氨酸和5-羥賴(lài)氨酸。在拮抗劑分子中添加糖基化位點(diǎn)可通過(guò)改變氨基酸序列，使其包含一或多個(gè)上述三肽序列(在添加N-連接糖基化位點(diǎn)的情況下)而實(shí)現(xiàn)。這種改變也可通過(guò)在原始的拮抗劑序列中添加或取代一或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來(lái)實(shí)現(xiàn)(在添加O-連接的情況下)。編碼拮抗劑的氨基酸序列變體的核酸分子由本領(lǐng)域已知的各種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來(lái)源分離(在天然氨基酸序列變體的情況下)，或通過(guò)對(duì)早期制備的拮抗劑變體或未變異的拮抗劑進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變，PCR誘變和盒式誘變來(lái)制備。也可預(yù)期修飾拮抗劑的效應(yīng)物功能，如以此增強(qiáng)拮抗劑的抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒作用(CDC)。這可以通過(guò)在抗體拮抗劑Fc區(qū)引入一或多個(gè)氨基酸取代而獲得。此外，可在Fc區(qū)引入半胱氨酸殘基，使得在此區(qū)形成鏈間二硫鍵。由此產(chǎn)生的同型二聚體抗體可提高內(nèi)在化能力和/或增強(qiáng)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用和ADCC。見(jiàn)CaronWa/"/~Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.//畫(huà)畫(huà)/.148:2918-2922(1992)。具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同型二聚體抗體也可用Wolffe/a/.Owcw7^"^"c/z53:2560-2565(1993)所述異源雙功能交聯(lián)劑制備。或者，可通過(guò)工程改造產(chǎn)生具有雙Fc區(qū)并因此具有增強(qiáng)的補(bǔ)體裂解效應(yīng)及ADCC能力的4元體。見(jiàn)Stevensonefa/.Jwri-Cawcer￡>n<gD&s/gw3:219-230(1989)。為了提高拮抗劑的血清半衰期，一種方法是在拮抗劑(尤其抗體片段)上摻入補(bǔ)救受體結(jié)合表位，如美國(guó)專(zhuān)利5，739，277所述。本文中術(shù)語(yǔ)"補(bǔ)救受體結(jié)合表位"是指IgG(例如IgG"IgG2、IgG3、或IgG4)Fc區(qū)中負(fù)責(zé)延長(zhǎng)該IgG分子的體內(nèi)血清半衰期的表位。IV.藥用配制劑根據(jù)本發(fā)明使用的拮抗劑的藥用配制劑通過(guò)將具有所需純度的拮抗劑與4壬選的藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(及e脂'"gtow's尸/z"rworceM"cfl/Sc/ewc&y16thedition,Osol,A.Ed.(1980))混合而制備，然后以?xún)龈蓜┗蚝畡┑男问奖４?。可藥用載體、賦形劑、穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度下對(duì)受者無(wú)毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和曱硫氨酸；保存劑(例如十八烷基二甲基千基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化千烷銨(benzalkoniumchloride),苯索氯銨；酚、丁醇或苯曱醇；烷基對(duì)羥基苯曱酸酯如曱基或丙基對(duì)羥基苯曱酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少于IO個(gè)殘基)；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴(lài)氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA;糖類(lèi)如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如鋅-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如吐溫TM，PLURONICS或聚乙二醇(PEG)?？笴D20抗體配制劑的實(shí)例如W098/56418所述，其已引入本文作為參考。其描述了一種液體多劑量配制劑，該配制劑包含40mg/mlrituximab,25mM乙酸，150mM海藻糖，0.9%苯曱醇，0.02%聚山梨酸酯(polysorbate)20，pH5.0,在2-8。C至少可保存2年。另一種抗CD20目標(biāo)配制劑在9.0mg/ml氯化鈉，7.35mg/ml二水檸檬酸鈉，0.7mg/ml聚山梨酸酯80,注射用無(wú)菌水，pH6.5中包含10mg/mlrituximab。適于皮下給藥的凍干劑見(jiàn)WO97/04801所述。這種凍干劑可用適當(dāng)稀釋劑重新恢復(fù)至高蛋白濃度，所重建的配制劑可皮下給藥至這里所治療的哺乳動(dòng)物。所述配制劑還可根據(jù)所治療的具體情況而包含一種以上活性成分，優(yōu)選具有互補(bǔ)活性但相互無(wú)負(fù)面影響的那些。例如，優(yōu)選還提供細(xì)胞毒制劑，化療劑，細(xì)胞因子或免疫抑配制劑(如作用于T細(xì)胞的那些，如環(huán)孢菌素或結(jié)合T細(xì)胞的抗體，如結(jié)合LFA-1的抗體)。所述其它試劑的有效量取決于該配制劑中拮抗劑的量，疾病或病癥或治療的類(lèi)型，及上述其它因素。通常應(yīng)用上文所述劑量和給藥方式，或迄今所用劑量的約1-99%?；钚苑肿右部扇菁{在微膠嚢中，或容納在膠體性質(zhì)的藥物運(yùn)送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體，白蛋白小球體，微乳劑，納米顆粒及納米膠嚢)中，或者容納在大乳劑(macroemulsions)中，所述樣(膠嚢可以通過(guò)諸如凝聚(coacervation)技術(shù)或界面聚合作用來(lái)制備，例子分別有羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚-(異丁烯酸曱酉旨)微股嚢。這些技術(shù)見(jiàn)Aew/"gfow's尸/zormacei^/ca/Sc/e"c&s16thedition:Osol,A.Ed.(1980)。也可制備控釋配制劑?？蒯屌渲苿┑倪m當(dāng)實(shí)例包括含有拮抗劑的固態(tài)疏水聚合物的半通透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為具有一定形狀的制品，如膜或微膠嚢?？蒯屌渲苿?shí)例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國(guó)專(zhuān)利3,773,919)，L-谷氨酸與y乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮丙瑞林乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。用于體內(nèi)給藥的配制劑必須是無(wú)菌的。這可以通過(guò)除菌濾膜過(guò)濾而輕易實(shí)現(xiàn)。V.用拮抗劑進(jìn)行治療本發(fā)明涉及對(duì)患有或易患自身免疫病的哺乳動(dòng)物群體，尤其是人的群體進(jìn)行的治療，所述自身免疫病對(duì)在先的或目前的TNFa-抑制劑治療具有不充分的應(yīng)答。一般而言，本文所述需要治療的哺乳動(dòng)物，在經(jīng)過(guò)一或多種TNFa-抑制劑如Etanercept(ENBREL),Infliximab(REMICADE⑧)或Adalimumab(HUMIRAtm)的一或多種治療后，被鑒定為由于毒性作用和/或不充分的效力，對(duì)在先或目前的TNFa-抑制劑治療不能充分應(yīng)答。但本發(fā)明不限于用這類(lèi)TNFa-抑制劑進(jìn)行的在先治療步驟；例如，病人在用TNFa-抑制劑進(jìn)行治療之前可能就被認(rèn)為易于經(jīng)受該抑制劑的毒性，例如心臟毒性，或者病人可能被確認(rèn)為不太可能對(duì)TNFa-抑制劑治療產(chǎn)生應(yīng)答者。本文所要治療的多種自身免疫病在以上章節(jié)中定義。本文優(yōu)選的適應(yīng)癥是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病關(guān)節(jié)炎，或克恩氏病?？傮w而言，本文所述接受治療的哺乳動(dòng)物并未患有B細(xì)胞惡性病(B-cellmalignancy)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述治療方法減少于TNFa-抑制劑治療有關(guān)的不良副作用(如感染，心衰和脫髓鞘)。含有與B細(xì)胞表面抗原結(jié)合的拮抗劑的組合物可根據(jù)常規(guī)醫(yī)療實(shí)踐進(jìn)行配制、分劑量、并給藥。其中應(yīng)考慮的因素包括所治療的具體疾病或紊亂，所治療的具體哺乳動(dòng)物，具體患者的臨床狀況，疾病或紊亂的病因，藥物的給藥部位，給藥方法，給藥時(shí)間表，和醫(yī)務(wù)人員已知的其它因素。拮抗劑的治療有效量將參考上述因素而給予。作為常規(guī)建議，胃腸道外途徑每次給予拮抗劑的治療有效量的范圍是每天約0.1-20mg/kg患者體重，拮抗劑通常的起始劑量為約2-10mg/kg。優(yōu)選的拮抗劑是抗體，如不與細(xì)胞毒制劑偶聯(lián)的RITUXAN。例如，非偶聯(lián)型抗體的適當(dāng)劑量可以是約20mg/m、約1000mg/m2。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗體劑量不同于目前推薦的RITUXAN。例如，可給予患者一或多劑抗體，每劑基本上少于375mg/m2，例如為約20mg/m、約250mg/m2，如約50mg/m2-約200mg/m2。劑量方案例如可以包括375mg/m2每周x4;或1000mgx2(例如，在第1和15曰)。此外，可給藥一或多劑起始劑量的抗體，然后給藥一或多劑后續(xù)劑量的抗體，其中所述后續(xù)劑量中mg/n^抗體劑量高于起始劑量中mg/m2抗體劑量。例如，起始劑量為約20mg/m2-約250mg/m2(如約50mg/m2-約200mg/m2)，而后續(xù)劑量了為約250mg/m2-約1000mg/m2。但如上所述，應(yīng)在多種治療中謹(jǐn)慎考慮拮抗劑的這些建議劑量。其結(jié)果是選擇適當(dāng)劑量和給藥時(shí)間表的關(guān)鍵因素，如上所示。例如治療進(jìn)行性疾病和急性疾病可能需要相對(duì)較高的起始劑量。為針對(duì)疾病或紊亂獲得最有效的結(jié)果，應(yīng)盡可能在接近于疾病或紊亂的首次癥狀、診斷、表現(xiàn)、或發(fā)生時(shí)或在疾病或紊亂緩解期間給予拮抗劑。拮抗劑可通過(guò)任何適當(dāng)方式給藥，包括胃腸道外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、和鼻內(nèi)途徑，如需進(jìn)行局部免疫抑制治療，可在病損內(nèi)給藥。胃腸道外輸注包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、或皮下給藥。此外，拮抗劑適于經(jīng)脈沖輸注給藥，如，使用劑量遞減的拮抗劑輸注。優(yōu)選經(jīng)注射給藥，最優(yōu)選靜脈注射或皮下注射，其取決于給藥是短期的還是長(zhǎng)期的。可與本文拮抗劑一起給予其它化合物，如細(xì)胞毒制劑、化療劑、免疫抑制劑和/或細(xì)胞因子。聯(lián)合給藥包括同時(shí)給藥分開(kāi)的配制劑或單一可藥用制劑，還包括以任何順序連續(xù)給藥，其中優(yōu)選有一段時(shí)間使兩種(或所有)活性制劑同時(shí)發(fā)揮它們的生物學(xué)活性。對(duì)于RA,以及其它自身免疫病，可以將所述拮抗劑(如CD20抗體)與任一種或多種以下藥物聯(lián)合應(yīng)用根據(jù)具體病情使用的抗風(fēng)濕藥(DMARD)，如羥氯喹，柳氮磺胺嘧啶，氨曱蝶呤，來(lái)氟洛米，硫唑噤呤，D-青霉胺，金(口服)，金(肌肉)，米諾環(huán)素，環(huán)孢菌素，葡萄球菌蛋白A免疫吸附；靜脈免疫球蛋白(IVIG);非類(lèi)固醇抗炎藥(NSAID);糖皮質(zhì)激素(經(jīng)由關(guān)節(jié)注射給藥)；皮質(zhì)類(lèi)固醇(corticosteroid)(如甲基強(qiáng)的松龍和/或強(qiáng)的+>);葉酸等。優(yōu)選地，在用CD20拮抗劑進(jìn)行治療期間不對(duì)該哺乳動(dòng)物給藥TNFa-抑制劑。除了向患者給藥蛋白拮抗劑，本申請(qǐng)還考慮通過(guò)基因治療給藥拮抗劑。這類(lèi)編碼拮抗劑的核酸的給藥以"給予有效治療劑量的拮抗劑"的表達(dá)形式包括在內(nèi)。例見(jiàn)1996年3月14日公開(kāi)的WO96/07321,其涉及利用基因治療產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)抗體。有兩種主要方法可將核酸(任選包含在載體中)引入患者細(xì)胞；體內(nèi)和回體Oxv/w)。體內(nèi)運(yùn)送核酸指直接給病人注射，通常注射至需要拮抗劑的位點(diǎn)?；伢w治療是將患者細(xì)胞取出，將核酸引入這些分離的細(xì)胞，然后將這些已改變的細(xì)胞直接給予患者或裝入多孔膜中再植入患者體內(nèi)(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4，892，538和5，283，187)。有多種技術(shù)可用于將核酸引入活細(xì)胞?？筛鶕?jù)是將核酸轉(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)的細(xì)胞，還是轉(zhuǎn)移至目標(biāo)宿主的體內(nèi)細(xì)胞而使用不同方法。適于將核酸轉(zhuǎn)移至體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)有脂質(zhì)體的應(yīng)用、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸鉀沉淀法等。常用于回體運(yùn)送基因的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。目前優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(如腺病毒，單純皰滲病毒I型或腺伴隨病毒)和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(可用于基因的脂質(zhì)介導(dǎo)型轉(zhuǎn)移的有效脂質(zhì)有DOTMA，DOPE和DC-Chol)。某些情況下，希望提供一種帶有能耙向耙細(xì)胞的試劑(如特異于細(xì)胞表面膜蛋白或耙細(xì)胞的抗體，針對(duì)靶細(xì)胞表面受體的配體，等)的核酸來(lái)源。當(dāng)使用脂質(zhì)體時(shí)，可使用能結(jié)合胞吞作用相關(guān)性細(xì)胞表面膜蛋白的蛋白來(lái)靶向和/或促進(jìn)對(duì)下述蛋白的吸收，所述蛋白如對(duì)特定細(xì)胞類(lèi)型具有向性的衣殼蛋白或其片段，在循環(huán)中進(jìn)行內(nèi)在化的蛋白的抗體，靶向細(xì)胞內(nèi)定位和提高細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋白。受體介導(dǎo)型胞吞作用的技術(shù)見(jiàn)Wu&a/.,J!5/o/.C/2e附.262:4429-4432(1987);Wagner"a/.，尸rac.A^/.5W.87:3410-3414(1990)。有關(guān)目前已知的基因制備和基因治療方案的綜述見(jiàn)AndersonWa/.，Sc/e"ce256:808-813(1992)。亦參見(jiàn)WO93/25673以及其中引用的文獻(xiàn)。本發(fā)明的進(jìn)一步細(xì)節(jié)將通過(guò)以下非限制性實(shí)施例進(jìn)行舉例說(shuō)明。本說(shuō)明書(shū)中所有引用文獻(xiàn)的內(nèi)容都引入本文作為參考。實(shí)施例1對(duì)于患有活動(dòng)性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、且對(duì)一或多種TNFa-抑制劑治療具有不充分應(yīng)答的患者，用結(jié)合B細(xì)胞表面抗原CD20的抗體進(jìn)行治療。本實(shí)施例的治療候選者包括那些由于毒性或不充分的效力對(duì)在先或目前的etanercept，infliximab和/或adalimumab治療(etanercept以每周兩次25mg的劑量治療^3個(gè)月，或至少4次輸注^3mg/kg水平的infliximab)具有不充分應(yīng)答的患者?；颊呖梢裕诤Y查和隨機(jī)檢查(screeningandrandomization)中具有^8的腫脹關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)(swollenjointcount,SJC)(66關(guān)節(jié)計(jì)數(shù))、以及^8的觸痛關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)(tenderjointcount,TJC)28(68關(guān)節(jié)計(jì)數(shù))；CRP21.5mg/dl(15mg/L)或ESR^28mm/h;和/或至少一個(gè)關(guān)節(jié)具有確定的因類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的侵蝕的放射影像學(xué)證據(jù)，如中心觀察點(diǎn)(centralreadingsite,手、腕或足部的任何可以考慮的關(guān)節(jié)，除了手部的DIP關(guān)節(jié)以外)所測(cè)定的那樣。用于治療的CD20抗體可以是Rituximab(從Genentech，Inc.購(gòu)買(mǎi))或人源化2H7vl6?；颊哂弥委熡行Я康腃D20抗體進(jìn)行治療，所述有效量例如是在第1和第15日l(shuí)OOOmgi.v.,或者是375mg/m2i.v.每周x4?；颊哌€可以伴隨接受MTX(10-25mg/口服每周(p.o.)或非胃腸道)與皮質(zhì)類(lèi)固醇方案的聯(lián)合，所述皮質(zhì)類(lèi)固醇方案是甲基強(qiáng)的松龍100mgi.v.30分鐘，接著輸注CD20抗體，在第2-7日和強(qiáng)的松60mgp.0.,在第8-14日30mgp.o.，在第16日返回到基線劑量?；颊哌€可以接受葉酸(5mg/周)，其為一次性服用的單一劑量或分每日服用的劑量?；颊哌€可以選擇在整個(gè)治療期間持續(xù)接受任何底數(shù)(background)皮質(zhì)類(lèi)固醇(S10mg/d強(qiáng)的松或等效物)。初級(jí)終點(diǎn)(primaryendpoint)可以是，利用比較組間差另'J的Cochran-Mantel-Haenszel(CMH)檢驗(yàn)確定的在第24周出現(xiàn)ACR20應(yīng)答的患者的比例，該比例#4居類(lèi)風(fēng)濕因子和區(qū)域進(jìn)行調(diào)整。潛在的二級(jí)終點(diǎn)(Potentialsecondaryendpoint)包才舌1.在第24周出現(xiàn)ACR50和70應(yīng)答的患者的比例。這些可以按照關(guān)于初級(jí)終點(diǎn)的具體描述進(jìn)行分析。2.從篩查到第24周的疾病活動(dòng)性評(píng)分(DiseaseActivityScore,DAS)的變化。這些可以用ANOVA模型評(píng)估，將基線DAS,類(lèi)風(fēng)濕因子，以及治療作為該模型中的條件(term)。3.在第24周的分類(lèi)DAS應(yīng)答者(CategoricalDASresponder)(EULAR應(yīng)答)。這些可以用根據(jù)類(lèi)風(fēng)濕因子進(jìn)行調(diào)整后的CMH檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。4.自篩查開(kāi)始的ACR核心組(ACRcoreset)(SJC，TJC,患者和醫(yī)師的全方位評(píng)估(globalassessments),HAQ，疼痛，CRP，和ESR)變化。可以記錄這些參lt的描述統(tǒng)計(jì)值(Descriptivestatistics)，5.自篩查開(kāi)始的SF-36變化?？梢杂涗?個(gè)功能域分值(domainscores)以及智力和體力成分分值(thementalandphysicalcomponentscores)的描述統(tǒng)計(jì)值。此外，還可以對(duì)智力和體力成分分值進(jìn)行進(jìn)一步分類(lèi)和分析。6.適應(yīng)性Sharp放射影像學(xué)總分值(modifiedSharpradiographictotalscore),侵蝕分值(erosionscore),和關(guān)節(jié)空間狹窄分值(jointspacenarrowingscore)的變化。這些可以根據(jù)需要用連續(xù)或分類(lèi)方法學(xué)進(jìn)行分析。探索性終點(diǎn)和分析(Exploratoryendpointsandanalysis)可以涉及ACR(20/50/70和ACRn)以及i第8，12，16,20,24周和以后的DAS應(yīng)答變化，可以視具體情況，用二元(binary)或持續(xù)重復(fù)性測(cè)量模型評(píng)估。探索性放射影像分析包括無(wú)侵蝕進(jìn)展的患者的比例可以在第24周及以后進(jìn)行評(píng)估。其它探索性終點(diǎn)(例如完全臨床應(yīng)答，無(wú)疾病階段)可以進(jìn)行描述性分析，將其作為延長(zhǎng)的觀察階,更(theextendedobservationperiod)的一個(gè)部分。自篩查開(kāi)始的FACIT-F疲勞(fatigue)變化可以用描述統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行分析。在上述不充分應(yīng)答TNFa抑制劑治療的患者中用CD20抗體進(jìn)行的RA治療，將導(dǎo)致基于上述任何一或多種終點(diǎn)的有益臨床應(yīng)答。序列表<110〉健泰科生物4支術(shù)公司(GENENTECH,INC.)<120>治療對(duì)TNF-ALPHA抑制劑應(yīng)答不充分的患者中的自身免疫病<130>P2027R1PCT<140>PCT/US2004/010509<141>2004-04-06<150>US60/461,481<151>2003-04-09<160>4<210>1<211〉107<212>PRT<213>人工序列<220><223〉人源化的序列<400>1AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerVal151015GlyAspArgValThrlieThrCysArgAlaSerSerSerValSer202530TyrMetHisTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysPro354045LeulieTyrAlaProSerAsnIxuAlaSerGlyValProSerArg505560PheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSer657075SerLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinTrp808590SerPheAsnProProThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulie95100105LysArg<210>2<211>122<212>PRT<213>人工序列<220><223〉人源化的序列<400>2GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGly151015GlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThr202530SerTyrAsnMetHisTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeu354045GluTrpValGlyAlalieTyrProGlyAsnGlyAspThrSerTyrAsnGinLysLysAsnThrThrAlaValTyrTrpTyrSerSer50PheLys65LeuTyr80TyrTyr95PheAsp110<210>3<211>213<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化的序列<400>3Asplie1GlyAspTyrMetLeuliePheSerSerLeuSerPheLysArgAspGluAsnAsnAsnAlaAspSerSerLysThrHisGinArgHisTyrGlyGinAsnThrGinPheLeuLysAlaGinMetValTrpAlaSerProProValLeuTyrGinAspAspGlyGlyLeuCysValThrThr20Tyr35Pro50Gly65Glu80Pro95Ala110Lys125Pro140Ser155Ser170Tyr185Leu200ArgPheGinMetAlaArgTrpGlyGinlieGinSerSerAspThrAlaSerArgGlyThrGluSerThrAsnValGinSerProThrCysGinLysAsnLeuGlyThrPheAlaPheGlyProSerGlyThrGluAlaAsnSerTyrSerLysHisSerPro55lie70Ser85Val100Gly115SerArgProAlaAspThrGinValAlaLysGinLeuLysValSer10Ala25Gly40Ser55Phe70Tyr85Gly100Phe115Ser130Val145Glu160Ser175Val190Thr205SerLeuTyrThrValAspArgAlaTyrSerLeuValLeuSerLysGlyThrTyrThrlieValGinSerSerTyrLysLysGluAsnThrSerAlaSerSerAlaProValProLeuThrCysGinLysValPheProValCysTrpLysValThrThrLeuAlaCysSerPhe60Ser75Asp90Ser105Val120SerValLysSerlieGinGluProLeuValGluThrGluAsnVal15Ser30Pro45Arg60Ser75Trp90lie105Ser120Leu135Asp150Gin165Leu180Val195Arg210GlyGluCys<210>4<211>452<212〉PRT<213〉人工序列<220><223>人源化的序列<400>4GluVal1GlySerSerTyrGluTrpAsnGinLysAsnThrAlaTyrTrpSerSerSerSerValLysGlyAlaSerSerSerSerProSerAspLysGlyGlyLeuMetValSerGinLeuAsnValLysThrValTyrAlaLysAspLeuGlyLeuAsnThrProlieHisLeuArgMetGlyPheLeuTyrPheSerSerTyrThrLeuGlyThrHisSerSerGluValLeu20His35Ala50Lys65Tyr80Tyr95Asp110Thr125Thr140Phe155Ser170Tyr185Thr200Lys215Thr230Val245人rg260Asp275GluSerTrplieGlyLeuCysValLysSerProGlySerGinValCysPheThrProSerCysValTyrArgGinAlaTrpGlyGlyGluValLeuThrAspProLeuProGluGlyAlaArgProPheMetArgGlyProGlyProHisSerTyrLysProPheGluValGlyAlaGinGlyThrAsnValGinSerThrValThrSerlieLysCysProValLysGly10Ser25Ala40Asn55lie70Ser85Val100Gly115Val130Ala145Thr160Phe175Val190Cys205Val220Pro235Pro250Thr265Phe280LeuGlyProGlySerLeuTyrThrPheAlaValProValAsnGluAlaLysCysAsnValTyrGlyAspValArgTyrLeuProLeuSerAlaThrValProProProValTrpGinThrLysThrAspAlaSerValLeuGlyTrpValValAsnLysGluLysValTyrProPheGlySerLysGluAsnThrAlaCysAsnLeuProHisSerLeuAspValValGly15Thr30Leu45Tyr60Ser75Asp90Ser105Val120Pro135lxu150Ser165Gin180Ser195Lys210Cys225Leu240Thr255Asp270Asp285GlyValGluTyrAsnSerGinAspTrpLysAlaLeuGlyGinProGluGluMetGlyPheTyrGinProGluAspGlySerArgTrpGinAlaIxuHisGlyLysValThrLeuProArgThrProAsnPheGinAsnHis290Tyr305Asn320Ala335Glu350Lys365Ser380Asn395Phe410Gly425His440AsnArgGlyProProAsnAspTyrLeuAsnTyrAlaValLyslieGinGinlieLysTyrValThrLysValGluGluValValAlaThrSerPheGinThrSerTyrLysTyrSerValThrLysSerLysLys295Val310Lys325Thr340Thr355Leu370Glu385Pro400Leu415Cys430Ser445ProLeuCyslieIxuThrTrpProThrSerLeuArgThrLysSerProCysGluValValValSerGluValValLysProLeuSerLeuAspMetLeuGluGin300LeuHis315SerAsn330AlaLys345SerArg'360ValLys375AsnGly390AspSer405LysSer420HisGlu435SerPro450權(quán)利要求1.治療對(duì)TNFα-抑制劑應(yīng)答不充分的哺乳動(dòng)物中的自身免疫病的方法，包括給該哺乳動(dòng)物施用治療有效量的與B細(xì)胞表面標(biāo)志結(jié)合的拮抗劑。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述B細(xì)胞表面標(biāo)志選自CD10，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD37，CD40，CD53，CD72，CD73，CD74，CDw75，CDw76，CD77，CDw78，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CDw84，CD85或CD86。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述B細(xì)胞表面標(biāo)志選自CDIO，CD19，CD20,CD21，CD22，CD23，CD24,CD37,CD40，CD53,CD72,CD73,CD74,CDw75,CDw76,CD77,CDw78，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83,CDw84，CD85或CD86。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述拮抗劑包含抗體。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗體結(jié)合CD20。5.權(quán)利要求l的方法，其中所述自身免疫病選自關(guān)節(jié)炎,類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，幼年類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，銀屑病關(guān)節(jié)炎，銀屑病，皮炎，多肌炎/皮肌炎，中毒性表皮壞死松解癥，系統(tǒng)性硬皮病和硬化，與炎性腸疾病有關(guān)的反應(yīng)，克恩氏病，潰瘍性結(jié)腸炎，呼吸窘迫綜合征，成人呼吸窘迫綜合征(ARDS),腦膜炎，腦炎，葡萄膜炎，結(jié)腸炎，腎小球腎炎，變態(tài)反應(yīng)疾病，濕滲，哮喘，與T細(xì)胞浸潤(rùn)和慢性炎癥性應(yīng)答有關(guān)的情況，動(dòng)脈粥樣硬化，自身免疫性心肌炎，白細(xì)胞粘附缺陷，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，幼年型糖尿病，多發(fā)性硬化，變應(yīng)性腦脊髓炎，與細(xì)胞因子和T細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏反應(yīng)相伴的免疫應(yīng)答，結(jié)核，結(jié)節(jié)病，肉芽腫病包括韋格納肉芽胂病，粒細(xì)胞缺乏，脈管炎(包括ANCA),再生障礙性貧血，戴-布貧血，免疫溶血性貧血包括自身免疫溶血性貧血(AIHA)，惡性貧血，純紅細(xì)胞再生障礙(PRCA)，因子VIII缺陷，血友病A,自身免疫性中性粒細(xì)胞減少癥，全血細(xì)胞減少癥，白細(xì)胞減少，與白細(xì)胞滲出有關(guān)的疾病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎癥性疾病，多器官損傷綜合征，mysatheniagravis,抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，抗-腎小球基底膜疾病，抗磷脂抗體綜合征，變態(tài)反應(yīng)性神經(jīng)炎，Bechet疾病，Castleman綜合征，Goodpasture綜合征，蘭-伊肌無(wú)力綜合征，Reynaud綜合征，干燥綜合征，斯-約綜合征，實(shí)體器官移植排斥，移植物抗宿主疾病(GVHD),天皰癡樣大皰，天皰瘡，自身免疫性多內(nèi)分泌腺病，賴(lài)特爾病，僵人綜合征，巨細(xì)胞動(dòng)脈炎，免疫復(fù)合物腎炎，IgA腎病，IgM多發(fā)性神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病，特發(fā)性血小板減少性紫癲(ITP)，血栓性血小板減少性紫癲(TTP),自身免疫性血小板減少，睪丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎，原發(fā)性曱狀腺功能減退；自身免疫性?xún)?nèi)分泌病包括自身免疫性曱狀腺炎，慢性曱狀腺炎(橋本曱狀腺炎)，亞急性淋巴細(xì)胞性曱狀腺炎，特發(fā)性曱狀腺功能減退，艾迪生病，格雷夫斯病，自身免疫性多腺體綜合征或多腺體內(nèi)分泌病綜合征，I型糖尿病也稱(chēng)胰島素依賴(lài)性糖尿病(IDDM)和希恩綜合征；自身免疫性肝炎，淋巴樣間質(zhì)性肺炎(HIV):閉塞性細(xì)支氣管炎(非-移植型)vsNSIP,吉-巴綜合征，大血管血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細(xì)胞(高安)動(dòng)脈炎)，中血管血管炎(包括川崎病和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎)，強(qiáng)直性脊推炎，貝格爾病(IgA腎病)，急進(jìn)性腎小球腎炎，原發(fā)性膽汁性肝硬化，乳糜瀉(麩質(zhì)性腸病)，冷球蛋白血癥，肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(ALS)，冠狀動(dòng)脈病。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。7.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗體未與細(xì)胞毒制劑偶聯(lián)。8.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗體包含利妥?，敗?.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗體包含含有SEQIDNo1和2所示可變區(qū)的人源化2H7v16。10.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗體與細(xì)胞毒制劑偶聯(lián)。11.權(quán)利要求l的方法，其基本就是給該哺乳動(dòng)物施用所述拮抗劑。的方法，包括給該哺乳動(dòng)物施用治療有效量的與CD20結(jié)合的抗體。12.13.降低疾病負(fù)面效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述疾病選自感染、心衰或脫髓鞘，所述方法包括給患有自身免疫病的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的與B細(xì)胞表面標(biāo)志結(jié)合的拮抗劑。全文摘要本申請(qǐng)描述了用結(jié)合CD20等B細(xì)胞表面標(biāo)志的拮抗劑進(jìn)行的治療。具體地，本申請(qǐng)描述了用這種拮抗劑治療哺乳動(dòng)物自身免疫病的用途，所述哺乳動(dòng)物對(duì)TNFα-抑制劑的應(yīng)答不充分。文檔編號(hào)C07K16/28GK101371924SQ20081016565公開(kāi)日2009年2月25日申請(qǐng)日期2004年4月6日優(yōu)先權(quán)日2003年4月9日發(fā)明者馬克·本尤尼斯申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司