專利名稱：抗urg4單抗雜交瘤細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及基因工程，特別是一個(gè)能穩(wěn)定分泌抗URG4單抗雜交瘤細(xì)胞(1A8)。
背景技術(shù)：
目前研究顯示，URG4是利用抑制消減雜交及全長聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增技術(shù)(RACE-PCR)克隆的一個(gè)可以被乙肝病毒X蛋白(HBx)上調(diào)的新基因，此基因全長3607個(gè)堿基對(duì)，編碼區(qū)為2769個(gè)堿基對(duì)，編碼由922個(gè)氨基酸組成、分子量為104KD的蛋白。
經(jīng)NIH人類基因組數(shù)據(jù)庫比較，定位在人類7號(hào)染色體。經(jīng)蛋白質(zhì)綜合信息庫分析(SWISS PR0T)，此蛋白具有一個(gè)穿膜螺旋(Transmembranehelices :336-353);三個(gè)核內(nèi)信號(hào)定位肽(Nuclear localization signals :PYRGKRN 380，PRPRDKR 821，PRDKRQL 823);一個(gè)ATP/GTP結(jié)合區(qū)(ATP/GTP binding site 690-697GVPGTGKS);和caspase修復(fù)成員6(caspase recruitment domain family 6)在88-461氨基酸之間有34%同源。最初研究表明此基因不僅可促進(jìn)細(xì)胞生長，還可促進(jìn)癌細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤性，為一新的癌基因[3]。作為HBx致癌過程中上調(diào)的新分子之一，近期研究發(fā)現(xiàn)用合成的URG4抗原肽檢測患者血清中的抗體(因URG4的單克隆抗體尚未制備)，聯(lián)合其它新克隆的分子對(duì)肝癌的早期診斷具有預(yù)測價(jià)值[5]。另有研究推測urg4因參與了胃癌的發(fā)展而可能成為胃癌治療的新靶點(diǎn)[4]。但其在惡性腫瘤形成過程中的具體作用機(jī)制有待更深入的研究以明確。
我們通過細(xì)胞雜交技術(shù)得到了能穩(wěn)定分泌抗URG4單抗的雜交瘤細(xì)胞株(1A8)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制作一種抗URG4單抗雜交瘤細(xì)胞，它能穩(wěn)定分泌抗URG4單抗的
雜交瘤細(xì)胞株(1A8)，進(jìn)一步研究URG4的功能，用于癌癥治療的研究。 本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種保藏號(hào)為CGMCCNO. 1908的雜交瘤細(xì)胞株。 所述的保藏號(hào)為CGMCCNO. 1908的雜交瘤細(xì)胞株用于分泌抗URG4單抗的雜交瘤細(xì)胞株。 所述的保藏號(hào)為CGMCCNO. 1908的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法是根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)(Lian Z，Liu J，Li L，Li X，Tufan NL，Clayton M，Wu MC，Wang HY，Arbuthnot P，Kew M，and Feitelson MA :Upregulated expression ofa unique gene by hepatitis B_antigenpromotes hepatocellular growth andtumorigenesis. Neoplasia 2003 ;5 :229-244.)中的多肽序列(PRPRDKRQLLDPPGDLSRC)，通過人工合成多肽如圖1所示，并將此多肽分別連接血藍(lán)蛋白(簡稱p印tide-KLH)或牛血清蛋白(簡稱p印tide-BSA)，并以連接血藍(lán)蛋白的多肽作為抗原免疫BALB/C小鼠，經(jīng)三次免疫后用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測被免疫小鼠尾靜脈，取血清效價(jià)大于l : 10000的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按小鼠淋巴細(xì)胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù)中(《細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第二章，金伯泉主編。第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，20Q2. ll，ISBN 7-81086-027-5)的方法用50%的聚乙二醇(分子量4000，PEG-4000)進(jìn)行融合；用含次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)選擇性培養(yǎng)液(HAT，購于SIGMA公司)加入含20%小牛血清的RPMI-1640 (購于HYCLONE公司)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，融合后三天開始出現(xiàn)融合細(xì)胞，以連接牛血清蛋白的多肽(p印tide-BSA)包被，通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)篩選；同時(shí)配合用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)，凡上述兩種方法陽性的雜交瘤細(xì)胞予保留，用有限稀釋法(參照《細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第二章，金伯泉主編。第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2002. ll，ISBN 7-81086-027-5)通過四次克隆化，最后獲得一株穩(wěn)定分泌抗URG4單克隆抗體的保藏號(hào)為CGMCCNO. 1908的雜交瘤細(xì)胞株，標(biāo)記為1A8。
本發(fā)明通過以URG4蛋白的多肽為免疫原，應(yīng)用現(xiàn)有的單克隆抗體制備技術(shù)(參照《細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第二章，金伯泉主編。第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2002. 11， ISBN7-81086-027-5)得到一株能穩(wěn)定分泌抗URG4單克隆抗體的保藏號(hào)為CGMCCNO. 1908雜交瘤細(xì)胞株(1A8)。應(yīng)用此株雜交瘤細(xì)胞以1乂106個(gè)/只的量腹腔注射預(yù)先用液體石蠟致敏的8-10周齡的BALB/C雌性小鼠，10-14天后采集腹水，以連接牛血清蛋白的多肽包被，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測腹水陽性，并用此腹水行蛋白質(zhì)印跡法證明其能識(shí)別變異的URG4蛋白，同時(shí)將此腹水用于行免疫組化證明其能識(shí)別自然的URG4蛋白。此株雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗為進(jìn)一步研究新基因URG4奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)擬進(jìn)一步研究此單抗的功能，以期能根據(jù)此單抗通過人工合成治療癌癥的抗人URG4蛋白的單抗片斷，達(dá)到擴(kuò)大臨床癌癥治療方法的目的。


下面結(jié)合實(shí)施例附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
圖1是URG4多肽質(zhì)譜圖； 圖2是用蛋白質(zhì)印跡法檢測URG4在不同細(xì)胞中的表達(dá)；
圖3是用免疫組化檢測URG4蛋白在胃癌組織中的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
l材料和儀器 1. 1細(xì)胞株、組織標(biāo)本和動(dòng)物 a.骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)引自第四軍醫(yī)大學(xué)免疫教研室。b.細(xì)胞系H印G2-Pc， H印G2-HBx，3T3，3T3-URG4， MKN28，本所保藏。 c.組織來源西京醫(yī)院2002-2004年手術(shù)病例，經(jīng)病理診斷。 d. BALB/c小鼠第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 1. 2主要試劑a.福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、HAT、HT、ABTS、PEG(分子量4000)、抗P-actin
單抗、焦碳酸二乙酯(DEPC)和溴化乙錠(EB) :Sigma公司； b. HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG :Percin公司； c. RPMI1640培養(yǎng)基HyClone公司； d.醋酸纖維膜(NC) :Hybond公司； e.小牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司； f.鼠單克隆抗體亞類分型試劑盒HyCult分司；
4
g.包被緩沖液(每500ml去離子水中加入0. 795g的碳酸鈉和1. 465g的碳酸氫
鈉組成，ra值為9.6。); h.底物緩沖液(每500ml去離子水中加入9. 2g的十二水磷酸氫二鈉和2. 55g的
檸檬酸組成，ra值為5.0。)； i. ABTS顯色液(每10ml底物緩沖液中加入5mg的ABTS和3%的雙氧水20ul組成。)； j. 1640培養(yǎng)液原液(每500ml去離子水中加入5. 2g的1640干粉、1. 7ul的二疏基乙醇和23. 83g的HEPES組成，氫氧化鈉調(diào)PH值7. 2。); k.不完全1640培養(yǎng)液(每500ml的1640培養(yǎng)液原液中加入7. 5%的碳酸氫鈉15ml組成。); 1.完全1640培養(yǎng)液(每80ml不完全1640培養(yǎng)液中加入20ml的小牛血清組成。)； m.抗體稀釋液(每100ml的PBS加入0. lg的BSA組成。)； n.洗滌緩沖液:(每100ml的PBS加入0. 5ml的Tween-20組成。);o. PEG配制液(每8. 9ml不完全1640培養(yǎng)液中加入lml的DMSO和O. lml的7. 5%
碳酸氫鈉組成。)；
1. 3主要儀器a. 二氧化碳培養(yǎng)箱Forma Scientific公司；
b.超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備儀器廠；
c.倒置顯微鏡01ympus公司；
d. 37°。恒溫水育箱余姚市東方電工儀器廠； e.聚笨乙烯塑料板(酶標(biāo)板)96孔、細(xì)胞培養(yǎng)板(96孔及24孔)NUNC公司； f.臺(tái)式高速離心機(jī)湖南湘雅儀器表廠 g.核酸蛋白檢測儀Shimadzu公司h.純水儀Milipore公司 i.微型垂直平板電泳槽Bio-Rad公司 j.電轉(zhuǎn)移儀Bio-Rad公司 2方法 2. 1細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞H印G2-Pc，H印G2-HBx，3T3，3T3-URG4，MKN28，培養(yǎng)于含10 %小牛血清的不完全1640培養(yǎng)液中，骨髓瘤細(xì)胞及雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)于完全1640培養(yǎng)液中，置于37°〇、5%的二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，隔天換液1次，3-4天傳代1次。 2. 2抗原制備根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)[1]中多肽序列(PRPRDKRQLLDPPGDLSRC)，通過人工合成多肽，并將此多肽分別連接血藍(lán)蛋白(簡稱p印tide-KLH)或牛血清蛋白(簡稱p印tide-BSA)，并以p印tide-KLH作為免疫抗原，以p印tide-BSA作為檢測抗原。(此部分
由西安華辰生物技術(shù)有限公司完成)
2. 3單克隆抗體的制備 單克隆抗體制備具體過程參照《細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第二章(金伯泉主編。第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2002. 11， ISBN 7-81086-027-5)進(jìn)行，具體分述如下:
2. 3. l小鼠免疫
5
以p印tide-KLH免疫BALB/c小鼠(4-8周齡，雌性)，具體步驟如下 a.第一次免疫p印tide-KLH 150ug/只，加等體積福氏完全佐劑充分混勻后以
lml/只皮下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠，O. 2ml/點(diǎn)；間隔3周。 b.第二次免疫劑量及途徑同上，此次加等體積福氏不完全佐劑，間隔3周。 c.第三次免疫劑量同上，不加佐劑，改用等體積的生理鹽水，腹腔注射BALB/c小
鼠；10天后取被免疫小鼠的尾靜脈血(采集后即置4t:冰箱過夜，次日以2000轉(zhuǎn)/分離心
10分鐘后留上清備用)以p印tide-BSA包被，通過ELISA測定血清效價(jià)。 d.第四次免疫劑量及途徑同第三次免疫，取血清效價(jià)大于l : 10000的小鼠于
融合前3天腹腔注射。 2. 3. 2ELISA法檢測被免疫小鼠血清效價(jià)流程 a.檢測前一天，用包被緩沖液稀釋p印tide-BSA至15ug/ml，加入酶聯(lián)免疫吸附板 中，每孔100ul，置4t:冰箱過夜; b.次日倒出已包被的酶聯(lián)板孔內(nèi)的液體，以洗滌緩沖液洗滌共3次，每次拍干；
c.分別加入用PBS行梯度稀釋的待檢血清(血清PBS分別為1 : 100 ;1 : IOOO ;
i : 2000 ;i : 4000 ;i : sooo;i : 16000)100ui/孑L以未免疫的BLAB/c小鼠的血清為陰 性對(duì)照，置37t:恒溫水浴箱i小時(shí)； d.倒出酶聯(lián)板孔內(nèi)的液體，以洗滌緩沖液洗滌共3次，每次拍干； e.每孔加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG抗體(用抗體稀釋液行1 : 5000的稀
釋)lOOul，，置37"恒溫水浴箱1小時(shí); f.倒出酶聯(lián)板孔內(nèi)的液體，以洗滌緩沖液洗滌共3次，每次拍干； g.顯色，每孔加入ABTS顯色液(現(xiàn)配現(xiàn)用)lOOul，置37。C恒溫水浴箱10-15分鐘。 h.結(jié)果判定于白色背景上，直接用肉眼觀察反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)， 陰性反應(yīng)為無色或極淺。 2. 3. 3飼養(yǎng)細(xì)胞的制備(融合前一天取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞) 采用6周齡的BALB/c雌性小鼠；拉頸處死，浸泡于75%酒精中消毒5分鐘，用無
菌剪刀剪開腹部皮膚以暴露腹膜，用無菌注射器每次注射8ml不完全1640培養(yǎng)液，反復(fù)沖
洗，吸出沖洗液放入50ml離心管中(共用約40ml)，以1300轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；棄上清后
以完全1640培養(yǎng)液重懸沉淀，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為lXl()S個(gè)/ml，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，lOOul/
孔，放入371\5%的二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 2. 3. 4細(xì)胞融合過程 a.觀察骨髓瘤細(xì)胞SP2/0狀態(tài)(要求在對(duì)數(shù)生長期最佳)，將配制好的45 % PEG 及20ml不完全1640培養(yǎng)液放入37t:細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)熱；(45% PEG的配制于融合前一天配 制好45 %的PEG置4t:冰箱備用，lg的PEG放入青霉素小瓶后置高壓鍋內(nèi)高壓滅菌后約得 液體0. 9ml，于其內(nèi)加入1. lml的PEG配制液即得45%的PEG); b.將SP2/0收集于50ml無菌離心管并計(jì)數(shù)(要求細(xì)胞總數(shù)為1乂106個(gè))，離心 1300轉(zhuǎn)/分，共7分鐘； c.準(zhǔn)備好無菌平皿、篩網(wǎng)、青霉素小瓶，拉頸處死已被四次免疫的BLAB/c小鼠，置 75%酒精中浸泡5分鐘；
d.無菌條件下取出被免疫小鼠脾臟放入青霉素小瓶中，用5ml不完全1640培養(yǎng)
液沖洗后即將脾臟移于篩網(wǎng)內(nèi)(此篩網(wǎng)置于平皿中)，加入約40ml不完全1640培養(yǎng)液，以
無菌的5ml玻璃注射器針芯研磨至脾臟為細(xì)末狀，取平皿中的研磨液于50ml無菌離心管中
(計(jì)數(shù)脾細(xì)胞，要求細(xì)胞總數(shù)為1 X 107個(gè))，離心1300轉(zhuǎn)/分，7分鐘； e.分別去除離心后的SP2/0的上清和脾細(xì)胞的上清，以不完1640培養(yǎng)液重懸兩種
細(xì)胞沉淀后將兩細(xì)胞混勻于同一個(gè)50ml無菌離心管中，離心1300轉(zhuǎn)/分，7分鐘； f.去除混合細(xì)胞的上清后，再次以不完1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，離心1300轉(zhuǎn)/
分，7分鐘； h.去除混合細(xì)胞上清后，保持離心管口向下，吸干殘留液體；
i.輕彈離心管底，使細(xì)胞沉淀略為松動(dòng)； j.于室溫下，30秒內(nèi)沿管壁加入預(yù)熱的45% PEG，輕輕攪拌后吸入lml吸管內(nèi)靜 置90秒; k.將吸管內(nèi)液體輕柔地打入離心管底，用預(yù)熱的不完全1640培養(yǎng)液終止吸lml 不完全1640培養(yǎng)液，2分鐘內(nèi)沿管壁加入；接著以每分鐘lml加入持續(xù)2分鐘，改為每分鐘 2ml持續(xù)2分鐘；再改為每分鐘4ml直到20ml預(yù)熱的不完全1640培養(yǎng)液加入完全，即離心 800轉(zhuǎn)/分，6分鐘; 1.棄上清，先用6ml的1640完全培養(yǎng)液輕輕混懸沉淀，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液至40ml左 右； m.將融合后的細(xì)胞懸液加入含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)，100ul/孔，置37t:、5X的二
氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。 2. 3. 5雜交瘤的選擇 融合24小時(shí)后開始加入選擇培養(yǎng)液，具體過程如下 a.融合24小時(shí)后，以HAT 1. 6ml及HT 0. 4ml加入20ml完全1640培養(yǎng)液中混勻， 加入96孔板內(nèi)，50ul/孔; b.隔2天后換液，將96孔板內(nèi)每孔吸出150ul后，加入擬換的完全1640培養(yǎng)液 (每60ml完全1640培養(yǎng)液中加入0. 6ml的HAT和0. 6ml的HT組成。)；
c.再隔2天后換液，將96孔板內(nèi)每孔吸出150ul后，加入擬換的完全1640培養(yǎng)液 (每60ml的完全1640培養(yǎng)液中加入1. 2ml的HT組成。)； d. 2天后ELISA法檢測雜交瘤上清檢測前一天，用包被緩沖液稀釋p印tide-BSA 至15ug/ml，加入酶聯(lián)免疫吸附板中，每孔100ul，置4t:冰箱過夜一用洗滌緩沖液洗滌包被 板共3次，每次拍干一分別加入96孔細(xì)胞板內(nèi)的上清，以未免疫的BLAB/c小鼠的血清為陰
性對(duì)照，以效佳大于i : 10000的小鼠的血清為陽性對(duì)照，置37t:恒溫水浴箱1小時(shí)一用洗
滌緩沖液洗滌包被板共3次，每次拍干一每孔加入HRP標(biāo)記的抗鼠IgG抗體100ul，以抗體
稀釋液稀釋為1 : 5000，置37度水浴箱1小時(shí)一用洗滌緩沖液洗滌包被板共3次，每次拍
干一顯色，每孔加入ABTS顯色液100ul，置37t:恒溫水浴箱10-15分鐘一結(jié)果判定于白色
背景上，直接用肉眼觀察反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺； f.標(biāo)記陽性孔，選用陽性孔內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行克隆化。 2. 3. 6雜交瘤的克隆化、擴(kuò)大培養(yǎng)及凍存 雜交瘤的克隆化采用有限稀釋法進(jìn)行，具體方法如下
a.制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液(脾細(xì)胞懸液)拉頸處死未免疫的BLCB/c小鼠，置75X酒 精中浸泡5分鐘；無菌條件下取出小鼠脾臟放入青霉素小瓶中，用5ml不完全1640培養(yǎng)液 沖洗后即將脾臟移于篩網(wǎng)內(nèi)(此篩網(wǎng)置于平皿中)，加入約20ml完全1640培養(yǎng)液，以無菌 的5ml玻璃注射器針芯研磨至脾臟為細(xì)末狀，取平皿中的研磨液于無菌坡璃瓶中，加入完 全1640培養(yǎng)液至80ml后再加入3. 2ml的HT混勻，將此混勻的懸液分別加入96孔細(xì)胞培 板內(nèi)，100ul/孔，每塊板的右下角的最后三孔(H10、H11、H12)不加飼養(yǎng)細(xì)胞懸液以備稀釋 用，將加好的板放入371\5%的二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱； b.將要克隆化的孔里的細(xì)胞懸浮(以200ul槍輕吹即可)并計(jì)數(shù)，將此細(xì)胞懸液 移于有飼養(yǎng)細(xì)胞的板中的稀釋孔H10中，從H10孔中取出20ul細(xì)胞懸液放入Hll孔中用完 全1640培養(yǎng)液做10倍稀釋，再從Hll孔中取出20ul放入H12孔中做10倍稀釋；
c.取H12孔中的細(xì)胞懸液用完全1640液稀釋至理論上為l個(gè)細(xì)胞/100ul，再將此 稀釋液分別滴入含有飼養(yǎng)細(xì)胞懸液的96孔板中(每孔稀釋后分滴為48孔)，每孔lOOul ; 置371\5%的二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)； d. 1周后標(biāo)記單克隆孔，以ELISA法(同前2. 5. 2. d)對(duì)單克隆孔的上清進(jìn)行檢
測，選陽性孔內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行下一次的克隆化，如此反復(fù)三次后得到能穩(wěn)定分泌單抗的雜交
瘤(進(jìn)行克隆化的一株細(xì)胞下一次克隆化的所有單克隆孔均為陽性)； f.選取陽性最強(qiáng)的單克隆孔中的細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔板中培養(yǎng)(1孔轉(zhuǎn)1孔)，3天后于
24孔板中分成2孔，再3天后分成4孔，再隔2天后將此4孔的細(xì)胞一并轉(zhuǎn)入50ml細(xì)胞培
養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。 g.雜交瘤細(xì)胞的凍存待50ml培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞鋪滿瓶底面積約70%時(shí)一將培養(yǎng) 瓶中的細(xì)胞用吸管砍打，使其完全懸浮，將細(xì)胞懸液移于50ml無菌離心管內(nèi)并計(jì)數(shù)，離心 1200轉(zhuǎn)/分，6分鐘一棄上清，以細(xì)胞凍存液(細(xì)胞凍存液成份50%小牛血清；40%不完 全1640培養(yǎng)液；10% DMSO)重懸沉淀，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為IX 107/L —分裝于凍存管，lml/支
—置4t:冰箱l小時(shí)一轉(zhuǎn)入-201:冰箱放置2小時(shí)一再轉(zhuǎn)入-7(rc冰箱過夜一次日將凍存的
細(xì)胞收藏于液氮缸內(nèi)。 2. 3. 7單克隆抗體的大量生產(chǎn) 取10只8-10周齡的BALB/c雌性小鼠先用液體石蠟0. 3ml/只腹腔注射預(yù)致敏，1 周后收集雜交瘤細(xì)胞以1 X 106個(gè)/只(等量生理鹽水稀釋成lml/只)的量腹腔注射上述 預(yù)致敏的小鼠，10-14天后觀察小鼠腹脹明顯、行動(dòng)遲緩、不思飲食且毛發(fā)錯(cuò)亂時(shí)即收集腹 水，拉頸處死小鼠，用干凈滴管將腹水吸入離心管中，離心2000轉(zhuǎn)/分，5分鐘，取中間液即 得含大量單克隆抗體的腹水，置4t:冰箱備用。
2.4單克隆抗體亞類的鑒定 采用鼠單克隆抗體亞類分型試劑盒，具體步驟參照其說明書如下 a.每lml包被液中加入9ml去離子水釋稀成擬用的每塊酶聯(lián)板的包被液，再向此
液體每10ml中加入100ul羊抗鼠免疫球蛋白； b.向96孔酶聯(lián)免疫吸附板中加入上一步配好的液體，100u1/孔，置4t:冰箱過 夜； c.次日倒出包被板孔內(nèi)的液體，用干毛巾將包被板拍干，再以洗滌緩沖液洗滌包 被板共3次，每次均用干毛巾拍干；
d.將封閉血清用PBS稀釋4倍后加入拍干的包被板內(nèi)，200ul/孔，置37。C恒溫水 浴箱1小時(shí)； e.倒出包被板孔內(nèi)的液體，以洗滌緩沖液洗滌包被板共3次，每次均用干毛巾拍 干； f.每孔加入待檢的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清50ul，以未免疫的BLAB/c的血清為陰 性對(duì)照，置37°。恒溫水浴箱1小時(shí)； g.倒出包被板孔內(nèi)的液體，以PBS洗滌包被板共3次，每次均用干毛巾拍干；
h.向待檢孔內(nèi)加入抗不同亞類抗體的血清各100ul/孔，再向陰性對(duì)照孔內(nèi)加入 PBS，飾1/孔，置37"恒溫水浴箱1小時(shí); i.倒出包被板孔內(nèi)的液體，以PBS洗滌包被板共3次，每次均用干毛巾拍干；
j.向每孔中加入稀釋好的已用過氧化物酶標(biāo)記的軛合物(用PBS稀釋4000倍)， 飾1/孔，置37"恒溫水浴箱1小時(shí); k.倒出包被板孔內(nèi)的液體，以PBS洗滌包被板共3次，每次均用干毛巾拍干； 1.顯色，每孔加入ABTS顯色液100ul，置37。C恒溫水浴箱10分鐘。 n.結(jié)果判定于白色背景上，直接用肉眼觀察反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，
陰性反應(yīng)為無色或極淺。 2. 5免疫組織化學(xué) 2. 5. l實(shí)驗(yàn)過程 a. 二甲苯及梯度酒精脫水； b. PBS洗共2次，5分鐘/次； c.加入3%的雙氧水，置室溫20分鐘； d. PBS洗共3次，5分鐘/次; e.濕盒預(yù)先在37t:中平衡30分鐘，加10%正常山羊血清封閉液37。C于濕盒20 分鐘； f.吸棄封閉液，勿洗，按i : 800加入新制備的單克隆抗體，濕盒中4t:過夜；
g. PBS洗共3次，5分鐘/次； h.加生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG， 37t:于濕盒中30分鐘； i. PBS洗共3次，5分鐘/次； j.滴加SP工作液，濕盒中37°C孵育30分鐘； k. PBS洗共3次，5分鐘/次; 1. DAB顯色，自來水反復(fù)沖洗中止反應(yīng)； m.蘇木精襯染； n.梯度酒精及二甲苯透明封片。 2. 5. 2結(jié)果判定 a.顯微鏡下觀察組織染色結(jié)果，參考文獻(xiàn)的方法，分別根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞 數(shù)比率給組織賦值 染色強(qiáng)度細(xì)胞膜、細(xì)胞漿呈淡棕色為弱陽性(l)，呈棕色為陽性(2)，深棕色為強(qiáng) 陽性(3)，無信號(hào)為陰性(0) 陽性細(xì)胞數(shù)比率無陽性細(xì)胞(0);陽性細(xì)胞比率<33% (Q.33分)；陽性細(xì)胞比
9率>33%，<67% (0.67);陽性細(xì)胞比率> 67-100% (1分)。 b.然后根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比率得分的乘積判定各標(biāo)本的染色得分。 2. 6蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting) 2.6. l細(xì)胞總蛋白的制備 a.收獲對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞約5X 106，并以0. 1MpH7. 4的冷PBS離心洗滌并重懸兩 次；b.以50ii 1細(xì)胞裂解液(含20mmol/l Tris base、 150mmol/l NaCl、l%NP40、 lmMEDTA、20mMNaF、lmMNa3V04、0. 1,1/lPMSF禾口 lmg/lAprotinin、 lmg/lLeup印tin)重懸 細(xì)胞并反復(fù)吹打3-5分鐘，混勻后4t:冰浴30分鐘；
c.于4。C離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘;
d.取上清作為細(xì)胞總蛋白，分裝后儲(chǔ)于-7(TC備用；
e.以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，測定樣品蛋白質(zhì)的濃度。 2.6. 2十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfat印olyacrylamide gel electropheresis， SDS-PAGE)
a.按照常規(guī)方法制備分離膠和積層膠； b.取一定量的蛋白質(zhì)樣品與等體積的2XSDS上樣緩沖液(100mmol/lTrisbase、
200,1/1 二硫蘇糖醇、4% SDS、0. 2溴芬蘭、20% Glycerol)混合，于IO(TC變性5分鐘; c.按照每泳道100ug加載于不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠樣品孔中； d.以恒壓50V(積層膠)/100V(分離膠)電泳至溴芬蘭抵達(dá)凝膠底邊； e.取出凝膠用于Western blotting。 2. 6. 3Western blotting a. SDS-PAGE凝膠經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖液(25mmol/lTris base、 192mmpl/lDlycin、20 %甲 醛)浸泡10-20分鐘; b.按照3張濾紙、凝膠、NC膜、3張濾紙的順序組裝盒式轉(zhuǎn)移塔，并將其以NC膜向 陽極的方向裝入轉(zhuǎn)移裝置； c.于室溫條件下，穩(wěn)流0. 8mA/cm2電轉(zhuǎn)移，時(shí)間90分鐘； d.用麗春紅染液對(duì)NC膜進(jìn)行染色，標(biāo)記筆標(biāo)記蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)量各條帶所在位 置，再用去離子水洗去麗春紅； e. NC膜經(jīng)10%脫脂奶粉于室溫封閉2小時(shí)； f.與稀釋于5%脫脂奶粉抗體(新制備的單克隆抗體1 : 1000，抗P-actin 1 : 5000)4 °C孵育過夜，TBST(10mmo1/1 Tris base、 150mmol/lNaCl、0. 05 % Tween20、 pH8. 0)搖洗4次X 15分鐘； g.與稀釋于4%脫脂奶粉的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG于室溫孵育4小時(shí)； h. TBST搖洗共4次，15分鐘/次； i.等量混合ECL顯色系統(tǒng)中A+B液，滴加至NC膜； j. X-ray膠片感光。 本發(fā)明說明書中所用的菌種是申請(qǐng)人在2007年1月11日在《中國微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物中心》保藏的用于分泌抗URG4單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分類命名為 雜交瘤細(xì)胞，它的保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)是CGMCCNO. 1908。
權(quán)利要求
抗URG4單抗雜交瘤細(xì)胞它是保藏號(hào)為CGMCCNO.1908的雜交瘤細(xì)胞株。F200810232136XC0000011.tif
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗URG4單抗雜交瘤細(xì)胞f. 1$。，其特征是所述的保藏號(hào) 為CGMCCNO. 1908的雜交瘤細(xì)胞株用于分泌抗URG4單抗的雜交瘤細(xì)胞株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的抗URG4單抗雜交瘤細(xì)胞!^il'- ，其特征是所述的保藏號(hào)為 CGMCCNO. 1908的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法是通過人工合成多肽，并將此多肽分別連接血 藍(lán)蛋白或牛血清蛋白，并以連接血藍(lán)蛋白的多肽作為為抗原免疫BALB/C小鼠，經(jīng)三次免疫 后，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測被免疫小鼠尾靜脈，取血清效價(jià)大于l : 10000的小鼠的脾細(xì) 胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按小鼠淋巴細(xì)胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù)中的方法用50%的聚乙二 醇進(jìn)行融合；用含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷選擇性培養(yǎng)液加入含20%小牛血清 的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，融合三天，以連接牛血清蛋白的多肽(p印tide-BSA)包被，通 過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)篩選；同時(shí)配合用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)，將上述兩 種方法陽性的雜交瘤細(xì)胞予保留，用有限稀釋法通過四次克隆化，最后獲得一株穩(wěn)定分泌 抗URG4單克隆抗體的保藏號(hào)為CGMCCNO. 1908的雜交瘤細(xì)胞株，標(biāo)記為1A8。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及基因工程，特別是一個(gè)能穩(wěn)定分泌抗URG4單抗雜交瘤細(xì)胞(1A8)，抗URG4單抗雜交瘤細(xì)胞(1A8)，它是保藏號(hào)為CGMCCNO.1908的雜交瘤細(xì)胞株；所述的保藏號(hào)為CGMCCNO.1908的雜交瘤細(xì)胞株用于分泌抗URG4單抗的雜交瘤細(xì)胞株。它能穩(wěn)定分泌抗URG4單抗的雜交瘤細(xì)胞株(1A8)，進(jìn)一步研究URG4的功能，用于癌癥治療的研究。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101735988SQ20081023213
公開日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2008年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日
發(fā)明者劉杰 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院