專利名稱：生產(chǎn)促卵泡激素的細(xì)胞克隆的制作方法
生產(chǎn)促卵泡激素的細(xì)胞克隆 本發(fā)明涉及含有分別編碼人促卵泡激素(FSH)的a鏈和|3鏈的核酸序列的核酸 分子，同野生型的人促卵泡激素相比，對(duì)核酸序列在CHO細(xì)胞中的密碼子使用進(jìn)行了修飾。
本發(fā)明還涉及含有這樣的核酸序列的重組核酸分子、內(nèi)含這樣的重組核酸分子的 宿主細(xì)胞，以及它們?cè)谌舜俾雅菁に氐纳a(chǎn)中的用途。 最后本發(fā)明也涉及了在無血清的情況下將本發(fā)明的重組核酸分子轉(zhuǎn)染入懸浮培 養(yǎng)的細(xì)胞，從而制造出表達(dá)人促卵泡激素的宿主細(xì)胞的方法。 促卵泡激素是由垂體前葉的促性腺細(xì)胞制造并釋放到循環(huán)系統(tǒng)。促卵泡激素與黃 體生成素(LH) —起作用控制女性卵母細(xì)胞的成熟和男性精子的產(chǎn)生。促卵泡激素和黃體 生成素都屬于異二聚體糖蛋白家族，其由獨(dú)立的基因分別編碼的兩條非共價(jià)連接的a鏈 和P鏈形成。FSH和LH的a鏈的氨基酸序列是相同的，但P鏈的氨基酸序列是不同的。 a鏈和13鏈都是糖基化的。促卵泡激素的a鏈的兩個(gè)潛在的天冬氨酰胺連接的糖基化位 點(diǎn)，分別在52和78的位置，而13鏈的兩個(gè)潛在的天冬氨酰胺連接的糖基化位點(diǎn)則分別在 7和24的位置(Olijve等(1996)Mol. Hum. R印rod. 2 (5) :371-382)。 人促卵泡激素用來治療不孕(unovulation)的女性，剌激多卵泡發(fā)育(超數(shù)排卵) 和用于輔助受孕的制劑，如IVF， GIFT或ZIFT。而且人促卵泡激素用來剌激患有低水平或 者缺乏促卵泡激素的產(chǎn)生的女性的卵泡成熟、和剌激先天或者后天性患有低促性腺素性功 能減退癥的男性的精子發(fā)生。 最初醫(yī)學(xué)使用的促卵泡激素是從人絕經(jīng)期后的尿液中提純的。但是這種提純的促 卵泡激素有缺陷，內(nèi)有黃體生成素和其它人源蛋白的污染。而且這種天然來源的使用暗示 了有限的產(chǎn)品可用性和一致性。 隨著DNA重組技術(shù)的出現(xiàn)，使得通過將編碼a鏈和|3鏈的核酸序列轉(zhuǎn)染入培養(yǎng) 細(xì)胞來生產(chǎn)人促卵泡激素成為可能。編碼a鏈和P鏈的DNA序列和生產(chǎn)重組的人促卵泡 激素的方法已經(jīng)公開，比如在W0 88/10270， W086/04589和EP 0 735 139中。目前德國市場(chǎng)上有兩種市售的重組人促卵泡激素產(chǎn)品，即G0NAL-F⑧和
111^0(^@，它們都是通過在^0細(xì)胞中表達(dá)編碼野生的a鏈和|3鏈的DNA來生產(chǎn)的。
但是仍舊需要優(yōu)化促卵泡激素鏈的表達(dá)從而對(duì)一定數(shù)目的細(xì)胞而言，提高促卵泡 激素的產(chǎn)量和表達(dá)率。因此本發(fā)明要解決的一個(gè)問題就是提供核酸序列和重組核酸分子， 使得重組人促卵泡激素能夠在真核細(xì)胞中大量產(chǎn)生。 根據(jù)本發(fā)明，這樣的及另外的問題都已由獨(dú)立權(quán)利要求的特征解決。
有利方案在從屬權(quán)利要求中定義。 根據(jù)本發(fā)明，含有修飾的編碼人促卵泡激素的a鏈和|3鏈的核酸序列的核酸分 子經(jīng)修改已適應(yīng)中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的密碼子使用，該核酸分子用于轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后 引起了促卵泡激素在轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中的產(chǎn)量顯著性增加。 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"促卵泡激素產(chǎn)量增加"指的是這樣的情況，一旦把修 飾的核酸序列表達(dá)在宿主細(xì)胞中，與把有同樣的氨基酸序列的非修飾的編碼促卵泡激素的 核酸序列在相似的條件下(比如具有可比較的轉(zhuǎn)染過程和可比較的表達(dá)載體等等)表達(dá)在
3同一類型的宿主細(xì)胞中相比，有更高產(chǎn)量的促卵泡激素在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。 遺傳密碼是冗余的，20個(gè)氨基酸由61個(gè)三聯(lián)體密碼子編碼。因此，這20個(gè)蛋白
質(zhì)氨基酸中的大多數(shù)是由幾種堿基三聯(lián)體(密碼子)編碼的。編碼某一特定的氨基酸的密
碼子在某一特定的生物體內(nèi)的使用頻率并不相同，但是有使用頻繁的偏愛密碼子和較少使
用的稀有密碼子。人們認(rèn)為所述密碼子使用不同來自選擇性的進(jìn)化壓力，尤其是翻譯效率。
稀有密碼子的翻譯效率低的原因可能是相對(duì)應(yīng)的氨酰tRNA的庫被清空，不再能用來合成
蛋白質(zhì)。 而且不同的生物體偏愛不同的密碼子。于是，例如源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的重組DNA 在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)往往達(dá)不到最佳狀態(tài)。因此把稀有密碼子替換為高頻使用的密碼 子在一些情況下能增強(qiáng)表達(dá)。 對(duì)許多生物體來說，大量基因的DNA序列是已知的，并有從中可以得到特定的密 碼子在各個(gè)生物體中的使用頻率的表格。使用這樣的表格，蛋白質(zhì)序列可以相對(duì)準(zhǔn)確地反 向翻譯成含有對(duì)于蛋白質(zhì)中的不同氨基酸在各個(gè)生物體中的偏愛密碼子的DNA序列。密碼 子使用的表格尤其會(huì)統(tǒng)下列網(wǎng)址中找到http:〃www. kazusa. or. jp/codon/index. html ; 或者h(yuǎn)ttp://www. entelechon. com/index, php 7 id = tools/index。 也有可利用的程序進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的逆向翻譯，比如把人促卵泡激素的a鏈和 P鏈的蛋白質(zhì)序列逆向翻譯成簡(jiǎn)并DNA序列，例如http:〃www. entelechon. com/eng/ backtranslation. html。 術(shù)語"核酸序列"在本發(fā)明中的目的涉及任何編碼肽、蛋白質(zhì)等多肽的核酸分子。 這些核酸分子可能是由DNA， RNA或其相關(guān)的類似物組成。但優(yōu)選由DNA組成的核酸分子。
本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地意識(shí)到初始核苷酸序列的修飾描述了關(guān)于密碼子使用的 優(yōu)化過程。 比如說如果外源的野生型的酶的編碼序列調(diào)整為CH0細(xì)胞的密碼子使用，那么引 進(jìn)的變化很容易通過比較修飾的序列和初始序列得到鑒定(見圖la和lb)。而且這兩個(gè)序 列都編碼相同的氨基酸序列。人促卵泡激素的a鏈的氨基酸序列在SEQ ID No. 5中描述， 人促卵泡激素的P鏈的氨基酸序列在SEQ ID No. 6中描述。這些氨基酸序列對(duì)應(yīng)人促卵 泡激素的a鏈和P鏈的野生型氨基酸序列，如EMBL數(shù)據(jù)庫里登錄號(hào)為J 00152、 NCBI庫 里登錄號(hào)為NM_000510所保藏的。 就人促卵泡激素的a鏈而言，初始核酸序列列在SEQ ID No. 3，而人促卵泡激素的 P鏈的初始核酸序列列在SEQ ID No. 4。 根據(jù)本發(fā)明，相對(duì)于初始序列，編碼人促卵泡激素a鏈的核酸序列在CHO細(xì)胞中 的密碼子方面的修飾發(fā)生在至少30個(gè)位置，優(yōu)選至少40個(gè)位置，尤其優(yōu)選至少50個(gè)位置， 還尤其優(yōu)選至少60或70個(gè)位置，最優(yōu)選至少75個(gè)位置。 而且根據(jù)本發(fā)明，相對(duì)于初始序列，編碼人促卵泡激素13鏈的核酸序列在CH0細(xì) 胞中的密碼子方面的修飾至少發(fā)生在25個(gè)位置，優(yōu)選至少30個(gè)位置，更優(yōu)選至少40個(gè)位 置，尤其優(yōu)選至少50個(gè)位置，還尤其優(yōu)選至少60個(gè)位置，最優(yōu)選至少65個(gè)位置。
最優(yōu)選這樣的修飾的編碼人促卵泡激素的13鏈的核酸序列是SEQ IDNo. 1中給出 的核酸序列的編碼區(qū)，或者這段核酸序列整個(gè)編碼區(qū)與SEQ IDNo. l中給出的核酸序列的編 碼區(qū)有至少90 % ，優(yōu)選至少92 %或者94 % ，尤其優(yōu)選至少96 %或者98 % ，最優(yōu)選至少99 %相同。在SEQ ID No. 1中編碼區(qū)始于核苷酸56，一直延伸到核苷酸442。
最優(yōu)選優(yōu)化的編碼人促卵泡激素a鏈的核酸序列是SEQ ID No.2中給出的核酸 序列的編碼區(qū)，或者這段核酸序列整個(gè)編碼區(qū)與SEQ ID No.2中給出的核酸序列的編碼區(qū) 有至少85 % ，優(yōu)選至少87 %或者90 % ，尤其優(yōu)選至少92 %或者94 % ，最優(yōu)選至少96 % 、 98%或者99%相同。在SEQ ID No. 2中編碼區(qū)始于核苷酸19， 一直延伸到核苷酸366。
術(shù)語"未修飾的核酸序列"、"野生型的核酸序列"或者"初始核酸序列"在本發(fā)明 中的目的是指意欲用于(過)表達(dá)在宿主細(xì)胞且沒有調(diào)整以適應(yīng)宿主細(xì)胞的密碼子使用的 核酸序列，而是編碼蛋白的實(shí)際野生型核酸序列。 術(shù)語"修飾的核酸序列"或者"優(yōu)化的核酸序列"在本發(fā)明中的目的是指意欲表達(dá) 在宿主細(xì)胞中，其已經(jīng)將未修飾的/初始的核酸序列加以調(diào)整以適應(yīng)宿主細(xì)胞的密碼子使 用的核酸序列。修飾的或者優(yōu)化的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)與未修飾的序列編碼的蛋白質(zhì)的 氨基酸序列相同。 序列的同一性是由許多基于不同算法的程序決定的。在這方面Needleman和 Wunsch的或者Smith和Waterman的算法取得了尤其可信的結(jié)果。就序列比對(duì)而言，使用 的程序?yàn)镻ileUp(Feng和Doolittle (1987) J. Mol. Evolution 25 :351-360 ;Higgins等 (1989) CABI0S5 :151-153)或者G即和Best Fit程序(Needleman和Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 :443-453， Smith和Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2 :482-489)，其包含在了 GCG 軟件包中(GeneticsComputer Group, 575 Science Drive, Madison， Wisconsin, USA)。
本文給出的以百分比表示的序列同一性的值是由程序G即用以下設(shè)置在整個(gè)序 列區(qū)域決定的空位權(quán)重50，長(zhǎng)度權(quán)重30，平均匹配10， 000和平均錯(cuò)配0. 000。除非特 別提到，剛才說的設(shè)置用作序列比較的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置。 無意受假設(shè)限制，假定密碼子優(yōu)化的DNA序列允許更有效的翻譯，其形成的mRNA 在細(xì)胞里可能有更長(zhǎng)的半衰期，因此可更頻繁地被用于翻譯。 本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟悉這樣的技術(shù)，其能將初始的核酸序列改變成修飾的核酸 序列，該修飾的核酸序列用不同的密碼子使用編碼有相同氨基酸的多肽。比如這可以通過 基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的基因突變技術(shù)，通過眾所周知的克隆過程，通過化學(xué)合成等等來實(shí) 現(xiàn)。 另外本發(fā)明的目的是包含編碼人促卵泡激素13鏈的修飾的核酸序列的重組核 酸分子，其中修飾的核酸序列選自根據(jù)SEQ ID No. 1中的核苷酸序列的編碼區(qū)、與SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列編碼區(qū)的同一性為至少90%的核苷酸序列，而且其中修飾的核 酸序列是宿主細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子所控制的。 術(shù)語"宿主細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子"是指在重組核酸分子中的啟動(dòng)子，它能使核酸 序列在期望其表達(dá)的宿主細(xì)胞中表達(dá)。啟動(dòng)子的活性通常是由轉(zhuǎn)錄因子的存在決定的，轉(zhuǎn) 錄因子能與啟動(dòng)子相結(jié)合從而激活轉(zhuǎn)錄。 適合核酸序列在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子被本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括病 毒啟動(dòng)子，像CMV、 SV40、HTLV或者腺病毒主要晚期啟動(dòng)子和其它啟動(dòng)子，比如EF_1 a啟動(dòng) 子或者UbC啟動(dòng)子。 術(shù)語"宿主細(xì)胞"在本發(fā)明中的目的是指任何普遍用于表達(dá)的細(xì)胞，即轉(zhuǎn)錄和翻譯 核酸序列以生成多肽之類的產(chǎn)物。術(shù)語"宿主細(xì)胞"或者"生物體"尤其是指與原核生物、
5低等的真核生物、植物、昆蟲細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。宿主細(xì)胞優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì) 胞，更優(yōu)選嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞，甚至更優(yōu)選與CH0細(xì)胞的密碼子使用類似的嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞， 最優(yōu)選宿主細(xì)胞為CH0細(xì)胞。 用于表達(dá)修飾的序列和生產(chǎn)重組人促卵泡激素的宿主CHO細(xì)胞系衍生于CH0-K1 細(xì)胞系，缺乏二氫葉酸還原酶(dhfr)活性。細(xì)胞系是從DSMZ(目錄號(hào)ACC 126)獲得，適 應(yīng)懸浮和無血清培養(yǎng)的條件。 含有包含編碼人促卵泡激素13鏈的第一優(yōu)化核酸序列和編碼人促卵泡激素 a鏈的第二優(yōu)化核酸序列的重組核酸分子的CH0細(xì)胞系于2007年3月28日保藏在 Braunschweig的DSMZ，保藏號(hào)是DSM ACC2833。 術(shù)語"重組核酸分子"在本發(fā)明中的含義是指包括各種能夠被導(dǎo)入宿主細(xì)胞并影 響重組核酸分子內(nèi)含的核酸序列表達(dá)的核酸分子。該術(shù)語特別包括質(zhì)粒載體和病毒載體， 比如腺病毒、慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，但優(yōu)選質(zhì)粒載體。 可用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)蛋白的適合的質(zhì)粒載體的例子已被大家所 熟知，包括pCI載體系列、pSI (Promega) 、 pcDNA 載體、pCEP4、 pREP4、 pSHOOTER 、 pZeoSV2 (Invitrogen) 、 pBlast、 pMono、 pSELECT、 pVITRO和pVIVO (Invitrogen)。除了要表 達(dá)的啟動(dòng)子和核酸序列，重組的核酸分子通常還包括其它功能性的元件，比如多聚腺苷酸 序列，用來識(shí)別轉(zhuǎn)化陽性的原核和/或真核細(xì)胞的原核和/或真核細(xì)胞選擇性的基因，以及 復(fù)制起始點(diǎn)。專家知道他要為某個(gè)具體的目的而選擇哪一個(gè)元件，以及哪一個(gè)質(zhì)粒載體適 合在某個(gè)具體的宿主細(xì)胞中表達(dá)某個(gè)具體的核酸序列。 包含本發(fā)明的核酸序列的重組核酸分子可以通過文獻(xiàn)中描述的標(biāo)準(zhǔn)的分子生物 學(xué)的方法獲得，比如Sambrook禾口Russell (2001)Molecularcloning_a laboratory manual, 第三片反，Cold Spring Harbour LaboratoryPress， Cold Spring Harbour, NY， USA.
本發(fā)明中的重組核酸分子優(yōu)選包含編碼人促卵泡激素的13鏈的修飾核酸序列和 編碼人促卵泡激素的a鏈的核酸序列。 編碼人促卵泡激素的a鏈的核酸序列選自編碼人促卵泡激素的a鏈的優(yōu)化核酸 序列中，而該優(yōu)化核酸序列選自SEQ ID No. 2中顯示的核酸序列的編碼區(qū)，與SEQ ID No. 2 中描述的核酸序列的編碼區(qū)至少有85%的序列同一性的核酸序列，SEQ ID No.3中描述的 未修飾的核酸序列的編碼區(qū)，與SEQ ID No.3中描述的核酸序列的編碼區(qū)至少有70%的序 列同一性的的核酸序列。 編碼人促卵泡激素a鏈的核酸序列可能與編碼人促卵泡激素13鏈的核酸序列在 相同的啟動(dòng)子的控制下，比如通過內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，或者是在獨(dú)立的啟動(dòng)子的控 制下。優(yōu)選把編碼人促卵泡激素a鏈的核酸序列放在獨(dú)立的啟動(dòng)子的控制下。更優(yōu)選把 編碼優(yōu)化的人促卵泡激素P鏈的核酸序列放在SV40啟動(dòng)子的控制下，把編碼人促卵泡激 素a鏈的核酸序列放在CMV啟動(dòng)子的控制下。最優(yōu)選本發(fā)明中的重組核酸分子有SEQ ID No.7中描述的核酸序列。 另外本發(fā)明涉及的宿主細(xì)胞內(nèi)含含有編碼人促卵泡激素13鏈的優(yōu)化核酸序列的 重組核酸分子，該重組核酸分子還含有編碼人促卵泡激素a鏈的核酸序列，且該編碼人促 卵泡激素a鏈的核酸序列選自修飾的核酸序列，其選自SEQ ID No.2中的核苷酸序列的編 碼區(qū)，與SEQ ID No.2中的核苷酸序列的編碼區(qū)有至少85X的序列同一性的核苷酸序列，SEQ ID No. 3中的未修飾的核酸序列的編碼區(qū)，與SEQ ID No. 3中的核酸序列的編碼區(qū)有至 少70%的序列同一性的核酸序列。 編碼人促卵泡激素a鏈的核酸序列可能與編碼人促卵泡激素13鏈的優(yōu)化核酸序 列存在同一個(gè)重組核酸分子中，或者可以在獨(dú)立的重組核酸分子中被導(dǎo)入宿主細(xì)胞。優(yōu)選 編碼人促卵泡激素a鏈的核酸序列與編碼人促卵泡激素13鏈的優(yōu)化核酸序列存在于同一 個(gè)重組核酸分子中。 宿主細(xì)胞可以從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的系統(tǒng)中選出，比如NIH3T3細(xì)胞、CH0細(xì)胞、 COS細(xì)胞、293細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞、BHK細(xì)胞和Hela細(xì)胞。宿主細(xì)胞優(yōu)選是嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞， 更優(yōu)選是與CHO細(xì)胞有類似的密碼子使用的嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞，最優(yōu)選宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
本發(fā)明的目的還有內(nèi)含重組核酸分子的宿主細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng) 物，該重組核酸分子包含編碼人促卵泡激素P鏈的修飾核酸序列和編碼人促卵泡激素a 鏈的核酸序列，其中編碼a鏈的核酸序列可選自上面定義的未修飾的核酸序列和修飾的 核酸序列。 細(xì)胞培養(yǎng)是通過在合適的培養(yǎng)基中在支持宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞 而獲得。 術(shù)語"培養(yǎng)細(xì)胞"應(yīng)理解為是指細(xì)胞在這樣的條件下在體內(nèi)保存，該條件允許增 殖、正常的細(xì)胞代謝以及形成重組蛋白。那意味著提供細(xì)胞所有必要的營養(yǎng)以及氧氣并保 存在合適的pH和滲透性下。細(xì)胞可以在任何合適的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞優(yōu)選以懸浮培養(yǎng)的 方式培養(yǎng)，比如在培養(yǎng)瓶或者轉(zhuǎn)瓶中。術(shù)語"培養(yǎng)"包括分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)和灌注培 養(yǎng)以及其它合適的培養(yǎng)方法。"懸浮培養(yǎng)"指細(xì)胞并不附著在(容器)表面上，而是分布在培養(yǎng)基中。"分批培養(yǎng)"在本發(fā)明中的意思是指一種培養(yǎng)方法，在培養(yǎng)中，培養(yǎng)基既不添加也
不取出。"補(bǔ)料分批培養(yǎng)"在本發(fā)明中的意思是指一種在培養(yǎng)中會(huì)添加培養(yǎng)基但不會(huì)取出 培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法。"灌注培養(yǎng)"在本發(fā)明的范圍中指培養(yǎng)中會(huì)取出培養(yǎng)基且會(huì)添加新的培養(yǎng)基的一 種培養(yǎng)方法。 培養(yǎng)基優(yōu)選僅具有低血清含量，比如最大含量為1 % (體積/體積)的血清；最 優(yōu)選是無血清的培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基的實(shí)例是基本培養(yǎng)基比如RPMI 1460、 DMEM、 F12、 ProCH05或者eRDF，它們之間可以相互混合，并與根據(jù)細(xì)胞需要的補(bǔ)料混合。除了葡萄糖和 氨基酸，培養(yǎng)基還可能含有螯合劑如金精三羧酸(ATA)、無機(jī)鹽如磷酸鹽、多胺及其前體如 腐胺、激素如胰島素、抗氧化劑如抗壞血酸和維生素混合物、脂類前體如乙醇胺、和細(xì)胞保 護(hù)物質(zhì)如pluronic F68。專家知道哪一種培養(yǎng)基用于某種類型細(xì)胞的培養(yǎng)。培養(yǎng)基優(yōu)選 ProCH05。 本發(fā)明的目的還有把本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞先是在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定的 時(shí)間，然后收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清的方法。"細(xì)胞培養(yǎng)上清"是指與細(xì)胞接觸一段時(shí)間，然后與細(xì)胞分開的細(xì)胞培養(yǎng)基。細(xì)胞 培養(yǎng)上清包含細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白。細(xì)胞與懸浮液可以通過傳統(tǒng)的分離技術(shù)比如過濾和離 心來分離。在長(zhǎng)期培養(yǎng)中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞上清包含的促卵泡激素的濃度至少是500ng/ml，優(yōu)選至少1000ng/ml，更優(yōu)選至少1500ng/ml，最優(yōu)選至少2000ng/ml。 重組人促卵泡激素可以通過一個(gè)或多個(gè)純化步驟從細(xì)胞培養(yǎng)上清中提純。專家知
道適宜的純化方法，包括離子交換層析、疏水作用層析、羥磷灰石層析、親和層析和凝膠過
濾。純化重組人促卵泡激素的方法公開在W000/63248，W0 2006/051070和WO 2005/063811
中 要作為藥劑服用，純化的重組人促卵泡激素與一種或多種賦形劑混合，獲得能對(duì) 病人施用的制劑。適合重組人促卵泡激素的制劑已經(jīng)特別公開在EP 0 835 945，EP 1 285 665， EP 0 974 359， EP1 188 444和EP 1 169 349中。 本發(fā)明的宿主細(xì)胞通過用本發(fā)明的僅僅包含編碼人促卵泡激素13鏈的修飾核酸 序列或者還包含編碼人促卵泡激素a鏈的核酸序列的重組核酸分子轉(zhuǎn)染細(xì)胞而制造?？?選地，編碼13鏈的核酸序列和編碼a鏈的核酸序列可存在于分開的核酸分子中，所述核酸 分子同時(shí)或者相繼導(dǎo)入宿主細(xì)胞。 本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知適宜的轉(zhuǎn)染方法，比如包括磷酸鈣沉淀法JEAE-葡聚糖介導(dǎo) 的轉(zhuǎn)染、電穿孔法和脂轉(zhuǎn)染法。也可以用市售的轉(zhuǎn)染試劑盒，比如SuperFect、 PolyFect、 Effectene (Qiagen) 、 TransFast 、 ProFectiorT、 Transfectailf (Promega)禾口 TransPasSTM(NEB)。優(yōu)選在細(xì)胞懸浮狀態(tài)下和無血清的狀態(tài)下轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
為了以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)重組人促卵泡激素，細(xì)胞通常被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，這意味著在轉(zhuǎn)染 后成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能通過殺死未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的選擇性試劑篩選出來，而包含抗性基因的轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)。合適的選擇性試劑包括抗生素如博萊霉素(zeocin)、新霉素和嘌呤霉 素，及其它藥物比如甲氨蝶呤。 本發(fā)明通過下列實(shí)施例來說明，但實(shí)施例不應(yīng)理解為限制性。 實(shí)施例 1.包含編碼人促卵泡激素a鏈和|3鏈的優(yōu)化核酸序列的重組核酸分子的克隆
使用的pUC18載體骨架已經(jīng)包含了 SV40多聚腺苷酸位點(diǎn)和剪接位點(diǎn)以及由RSV 啟動(dòng)子、小鼠二氫葉酸還原酶基因、及SV40多聚腺苷酸位點(diǎn)和剪接位點(diǎn)組成的二氫葉酸還 原酶基因表達(dá)盒。二氫葉酸還原酶基因使得能夠利用藥物氨甲蝶呤選擇轉(zhuǎn)染陽性的細(xì)胞和 擴(kuò)增轉(zhuǎn)染的基因。 人促卵泡激素a鏈和p鏈未修飾的序列分別來自Fiddes和Goodman(1979) Nature 281 :351-356和Jameson等(1998)Mol. Endocrinol. 2 (9) :806-815。序列的優(yōu)化在 于編碼區(qū)采用了 CHO基因頻繁使用的密碼子使用。 而且引入了另外的終止密碼子來保證翻譯的有效終止。a鏈和|3鏈的優(yōu)化核酸
序列分別顯示于SEQ ID No. l和2中，野生型和修飾的核酸序列顯示在圖la和lb中。序
列的比較顯示編碼人促卵泡激素a鏈的修飾的和未修飾的核酸序列有80%的同一性，而
編碼人促卵泡激素P鏈的修飾的和未修飾的核酸序列有85%的同一性。 修飾的序列通過限制性酶SacII和Ncol酶切和隨后的連接分別插入兩個(gè)pUC18
骨架拷貝。 CMV啟動(dòng)子和SV40啟動(dòng)子用下列弓|物從合適的模板DNA擴(kuò)增，同時(shí)引入Ascl和 Pad限制性位點(diǎn)(下列引物的下劃線處)。
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Asc-CMV-正向引物 5， -GGC GCG CCT TTT GCT CAC ATG GCT CG_3， (SEQ ID No. 8)
Pac-CMV-反向引物 5' -CCT TAA TTA AGA GCT GTA ATT GAA CTG GGA GTG—3' (SEQ ID No. 9)
Asc_SV40-正向引物 5' -GGC GCG CCG CAT ACG CGG ATC TG-3' (SEQ ID No. 10)
Pac_SV40-反向引物 5' -CCT TAA TTA AGT TCG AGA CTG TTG TGT CAG AAG A_3' (SEQ ID No. 11)
CMV啟動(dòng)子通過用限制性酶Ascl和Pacl切割質(zhì)粒然后連接引入包含人促卵泡激 素a鏈的質(zhì)粒中，SV40啟動(dòng)子通過用限制性酶AscI和PacI切割質(zhì)粒然后連接引入包含 人促卵泡激素P鏈的質(zhì)粒中。 最后包括SV40啟動(dòng)子、編碼13鏈的核酸序列和SV40多聚腺苷酸信號(hào)的人促卵泡 激素P鏈的表達(dá)盒用下列引物擴(kuò)增，同時(shí)在擴(kuò)增物的5'和3'端引入NotI限制性酶切位 點(diǎn)(下列引物的下劃線處)
P-Notl-正向引物 5' -GCG GCC GCA TAC GCG GAT CTG C_3， (SEQ ID No. 12)
P-NotI-反向引物 5， -GCG GCC GCT CAC TCA TTA GGC ACC CCA GG_3， (SEQ ID No. 13)
擴(kuò)增物然后插入到NotI酶切的包含人促卵泡激素a鏈的質(zhì)粒中。得到的質(zhì)粒顯 示在圖2中，包含編碼a鏈的優(yōu)化核酸序列和編碼|3鏈的優(yōu)化核酸序列。包含這兩個(gè)優(yōu) 化核酸序列的質(zhì)粒的序列顯示在SEQ ID No. 7中。 2.用包含人促卵泡激素的a鏈和|3鏈不同組合的重組核酸分子瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì) 胞 包含編碼a鏈的優(yōu)化核酸序列或者包含編碼|3鏈的優(yōu)化核酸序列與相應(yīng)的野生 型的P鏈或a鏈組合、或者包含這兩種優(yōu)化的序列的質(zhì)粒按照上面1)中描述的方法制 造。DNA與含8mM谷氨酰胺不含HT的培養(yǎng)基ProCH05 (Lonza)混合達(dá)到200 y 1的總體積。 然后把20 ill的SuperFect試劑(Qiagen)加入到DNA溶液中并混合。將混合物在室溫下 孵育5-10分鐘。 包含1.68xl(f個(gè)CH0細(xì)胞的小份離心(5分鐘，800rpm， 18_25°C )后，除去上清，將 細(xì)胞重懸在1. 1ml含8mM谷氨酰胺不含HT的培養(yǎng)基ProCH05中。在DNA混合物孵育5_10 分鐘后，將懸液轉(zhuǎn)移到DNA混合物中，混合并轉(zhuǎn)移到6孔板的一個(gè)孔中。細(xì)胞在37t:孵育 3小時(shí)，使得細(xì)胞貼壁。除去上清后，將細(xì)胞用1ml磷酸緩沖液(PBS)洗3次，然后加入新 鮮的培養(yǎng)基(2ml含8mM谷氨酰胺不含HT的ProCH05)。在37。C孵育2天后，取出上清并離 心。將上清濃縮(濃縮因數(shù)為16.67)，用ELISA讀板器(Anogen)測(cè)量促卵泡激素的濃度。 測(cè)量的結(jié)果顯示在圖3中。 結(jié)果表明與兩條鏈都是野生型的相比，修飾的a鏈與野生型的|3鏈的共同引入， 使得蛋白表達(dá)量減少了幾乎50%。與之不同的是，與野生型的a鏈與野生型的|3鏈的組 合相比，修飾的13鏈與野生型或修飾的a鏈的共同引入，均使得促卵泡激素的瞬時(shí)表達(dá)增 加1.5-3倍。因此尤其是修飾的13鏈的使用會(huì)使促卵泡激素的表達(dá)在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后顯著性增加，而修飾的a鏈不會(huì)促進(jìn)促卵泡激素的生產(chǎn)。 附圖簡(jiǎn)述

圖1 :編碼人促卵泡激素a鏈和|3鏈的非修飾和修飾的核酸序列的比較 a)編碼人促卵泡激素a鏈的修飾和未修飾的核酸序列的序列比較 pXM17ss恥含編碼人促卵泡激素a鏈的修飾的核酸序列的質(zhì)粒的部分(SEQ ID No. 2) wtaFSH:編碼人促卵泡激素a鏈的未修飾的核酸序列(SEQ IDNo. 3) 起始密碼子和終止密碼子都用粗體表示。 b)編碼人促卵泡激素13鏈的修飾和未修飾的核酸序列的序列比較 查詢編碼人促卵泡激素13鏈的未修飾的核酸序列(SEQ ID No. 4) 目標(biāo)編碼人促卵泡激素13鏈的修飾的核酸序列(SEQ ID No. 1) 起始密碼子和終止密碼子都用粗體表示。 圖2 :含編碼人促卵泡激素a鏈的修飾的核酸序列和編碼人促卵泡激素P鏈的 修飾的核酸序列的重組核酸分子的圖譜 圖3 :不同組合的a鏈和|3鏈在CH0細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的表達(dá)分析 與表達(dá)野生型的a鏈和|3鏈的組合的細(xì)胞相比，促卵泡激素表達(dá)的相對(duì)量被列出。 w/w :未修飾的a鏈和P鏈 s/w :修飾的a鏈和未修飾的P鏈 w/s :修飾的P鏈和未修飾的a鏈 s/s :修飾的a鏈和P鏈
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權(quán)利要求
核酸分子，其包含編碼人促卵泡激素(FSH)β鏈的核酸序列，該核酸序列選自SEQ ID No.1中的核酸序列的編碼區(qū)、和與SEQ ID No.1中的核酸序列的編碼區(qū)有至少90％的序列同一性的核酸序列。
2. 核酸分子，其包含編碼人促卵泡激素(FSH) a鏈的核酸序列，該核酸序列選自SEQ ID No. 2中的核酸序列的編碼區(qū)、和與SEQ ID No. 2中的核酸序列的編碼區(qū)有至少85%的 序列同一性的核酸序列。
3. 重組核酸分子，其包含權(quán)利要求書1所述的第一核酸序列，該核酸序列在于宿主細(xì) 胞中有活性的啟動(dòng)子的控制下。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的重組核酸分子，還包含根據(jù)權(quán)利要求2的第二核酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3的重組核酸分子，還包含第二個(gè)核酸序列，該核酸序列選自SEQ ID No. 3中的核酸序列的編碼區(qū)、和與SEQ ID No. 3中的核酸序列的編碼區(qū)有至少70%的序列 同一性的核酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5的重組核酸分子，其中第二核酸序列在獨(dú)立的啟動(dòng)子的控制下。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3到6任一項(xiàng)的重組核酸分子，其中第一核酸序列和/或第二核酸序 列在病毒啟動(dòng)子的控制下。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的重組核酸分子，其中第一核酸序列是在SV40啟動(dòng)子的控制下。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7的重組核酸分子，其中第二核酸序列是在CMV啟動(dòng)子的控制下。
10. 根據(jù)權(quán)利要求3到9任一項(xiàng)的重組核酸分子，其具有SEQ ID No.7中描述的核酸序列。
11. 宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求4到IO任一項(xiàng)的重組核酸分子。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，其為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11或12的宿主細(xì)胞，其為中華倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11至13任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，保藏號(hào)是DSMACC2833。
15. 宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求3的第一重組核酸分子和第二重組核酸分子，該第 二重組核酸分子包含這樣的核酸序列，其選自根據(jù)權(quán)利要求書2的核酸序列和SEQ ID No. 3 的核酸序列。
16. 細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含在合適的培養(yǎng)基中的根據(jù)權(quán)利要求11到15任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞。
17. 生產(chǎn)重組人促卵泡激素的方法，其包含步驟有 -在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求書11到15任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞； -收取細(xì)胞培養(yǎng)的上清液。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，還包括從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化重組人促卵泡激素的步驟。
19. 產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求11到14任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞的方法，包括在無血清的條件下用根 據(jù)權(quán)利要求4到10任一項(xiàng)的重組核酸分子轉(zhuǎn)染懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞。
20. 產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞的方法，包括在無血清的條件下用根據(jù)權(quán)利要求 3的第一重組核酸分子和第二重組核酸分子轉(zhuǎn)染懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，該第二重組核酸分子包 含這樣的核酸序列，其選自根據(jù)權(quán)利要求2的核酸序列和SEQ ID No. 3的核酸序列。
21. SEQ ID No. 1和/或2的核酸序列用于生產(chǎn)重組人促卵泡激素的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有分別編碼人促卵泡激素(FSH)的α鏈和β鏈的核酸序列的核酸分子，其對(duì)核酸序列在CHO細(xì)胞中的密碼子使用進(jìn)行了修飾。本發(fā)明還涉及含有這樣的核酸序列的重組核酸分子、內(nèi)含這樣的重組核酸分子的宿主細(xì)胞，以及它們?cè)谌舜俾雅菁に氐纳a(chǎn)中的用途。最后本發(fā)明也涉及了在無血清的情況下將本發(fā)明的重組核酸分子轉(zhuǎn)染入懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，從而產(chǎn)生表達(dá)人促卵泡激素的宿主細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101720332SQ200880022358
公開日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2008年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月28日
發(fā)明者N·耶利內(nèi)克, S·阿諾德 申請(qǐng)人:拜奧吉耐里克斯股份公司