專利名稱：一種氯氟氰菊酯人工抗原及其合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氯氟氰菊酯人工抗原及其合成方法，屬于有機(jī)化學(xué)及免疫 化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在免疫化學(xué)領(lǐng)域中，為使無(wú)免疫原性的小分子物質(zhì)(常稱為半抗原，Hapten) 能在動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)產(chǎn)生抗體，常要將這種半抗原與某種大分子載體如蛋白質(zhì)或 多肽等交聯(lián)結(jié)合而成為人工抗原，再注射進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體，提純抗體之后， 即可用于免疫分析，它是當(dāng)前臨床醫(yī)學(xué)、食品檢測(cè)、農(nóng)藥殘留分析中最活躍的 領(lǐng)域之一。
擬除蟲菊酯是一類重要的殺蟲劑，因其具有高效、低毒、擊倒快、殘留少 特點(diǎn)，被廣泛使用于茶園、果園、農(nóng)田等害蟲的防治，其中氯氟氰菊酯是應(yīng)用 較多的一種，因其使用量逐年增加，己對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了一定的影響，聯(lián)合國(guó) 糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織(FAO/WTO)對(duì)其在果樹等一些作物上己給出了嚴(yán)格 的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(一般為0.01mg/kg)，這使得氯氟氰菊酯殘留量的檢測(cè)監(jiān)控顯得 十分迫切和必要。
目前國(guó)際上慣用的氯氟氰菊酯殘留的標(biāo)準(zhǔn)分析方法是氣相色譜(GC)和高 效液相色譜(HPLC)法。但是這些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法需要昂貴的設(shè)備、專門的操 作人員、樣品處理復(fù)雜、成本高、時(shí)間長(zhǎng)，不能滿足快速簡(jiǎn)便的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求 和大面積推廣使用。而酶聯(lián)免疫分析方法(ELISA)由于具有特異、敏感、簡(jiǎn)單、 快速、費(fèi)用低及樣品純化要求低等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)藥殘留分析中顯示了廣闊的應(yīng)用 前景。
由于氯氟氰菊酯是小分子物質(zhì)(分子量小于1000)，本身不具有免疫原性，
必須與大分子載體偶聯(lián)制備人工抗原，才能誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生。為此，必 須設(shè)法先將農(nóng)藥小分子與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備出農(nóng)藥人工抗原。然而氯氟氰菊 酯分子不能直接通過(guò)雙功能交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)，需要先通過(guò)化學(xué)反應(yīng)在 農(nóng)藥分子上引入活性功能團(tuán)，以此作為半抗原，再使之與蛋白質(zhì)偶聯(lián)。因此半 抗原的設(shè)計(jì)、合成是建立氯氟氰菊酯酶聯(lián)免疫分析方法的關(guān)鍵所在。
目前，關(guān)于氯氟氰菊酯人工抗原的合成國(guó)外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，只有國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)
(農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007， 9(4)， 415-418)曾對(duì)氯氟氰菊酯的酸和醇部分分別進(jìn)行 修飾，合成兩種半抗原，進(jìn)而制備其抗體，但是采用該法獲得的人工抗原免疫 原性較差。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的半抗原的合成常用方法還有通過(guò)多步反應(yīng)在其苯環(huán)或環(huán)丙垸部分接上一個(gè)連接臂，最近幾年有人將擬除蟲菊酯的氰基水解成 羧酸或水解后再接上比較長(zhǎng)的連接臂與蛋白質(zhì)偶聯(lián)。但是這些方法反應(yīng)步驟長(zhǎng)， 試劑昂貴，且多為進(jìn)口試劑，國(guó)內(nèi)很難買到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種氯氟氰菊酯人工抗原及其合成方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種氯氟氰菊酯半抗原，化學(xué)名稱為(x-氰基-3-(4-氨基 苯氧萄節(jié)基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-l-丙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙垸羧酸酯，簡(jiǎn)寫為CY。
一種氯氟氰菊酯人工抗原，用所述的氯氟氰菊酯半抗原與牛血清白蛋白偶 聯(lián)制得的產(chǎn)品，化學(xué)名稱為01-氰基-3- (4-氨基苯氧基)芐基-3-(2-氯-3，3，3-三氟 -1-丙烯基)-2,2-二甲基環(huán)丙垸羧酸酯-牛血清白蛋白，簡(jiǎn)寫為CY-BSA。
所述氯氟氰菊酯人工抗原的合成方法，以氯氟氰菊酯為原料，依次通過(guò)硝 化反應(yīng)、還原反應(yīng)，成功合成帶有活性基團(tuán)-NH2的半抗原CY，半抗原CY通過(guò) 重氮化法與牛血清白蛋白偶聯(lián)制得氯氟氰菊酯人工抗原CY-BSA，步驟為
以氯氟氰菊酯為原料，依次通過(guò)硝化反應(yīng)、還原反應(yīng)，成功合成帶有活性基 團(tuán)-NH2的半抗原CY，合成路線如下
1 )、 a-氰基-3-(4-硝基苯氧基)芐基-3-(2-氯-3，3，3-三氟-l-丙烯基)-2,2-二甲基
環(huán)丙烷羧酸酯的合成
向150mL的三口燒瓶中加入18g氯氟氰菊酯，30mL乙酸酐攪拌溶解，滴 加2mL發(fā)煙硝酸與10mL乙酸的混合液，滴加完畢，室溫繼續(xù)攪拌反應(yīng)3.5h;
將反應(yīng)液倒入冰水中，攪拌，出現(xiàn)大量黃白色粘稠物質(zhì)，用乙酸乙酯對(duì)水 液進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相，無(wú)水Na2S04干燥過(guò)夜，抽濾，減壓蒸餾得金黃色粘 稠液體，經(jīng)過(guò)硅膠柱層析脫色純化得無(wú)色透明油狀化合物；
2)、半抗原CY的合成
稱取上步得到的產(chǎn)物4g，溶于50mL乙醇中，加入9.8g SnCl2 2H20攪拌 得白色的濁液，N2保護(hù)反應(yīng)，70-75"下反應(yīng)35min;
反應(yīng)液冷卻后，倒入水中，攪拌加入乙酸乙酯，用NaHC03溶液調(diào)節(jié)pH7，抽濾，蒸餾水、乙酸乙酯依次洗滌濾餅，收集濾液中的有機(jī)相，無(wú)水Na2S04干 燥，抽濾，減壓蒸餾得紅褐色的油狀物，通過(guò)硅膠柱層析脫色純化得紅棕色的 油狀化合物即(x-氰基-3-(4-氨基苯氧基)芐基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-1-丙烯基)-2,2-二甲基環(huán)丙烷羧酸酯，半抗原CY; 3)、人工抗原CY-BSA的制備
按下述化學(xué)反應(yīng)式進(jìn)行氯氟氰菊酯人工抗原(CY-BSA)的合成
稱取上步合成的半抗原CY23.2mg于50mL的燒瓶中，加入4mL DMF溶解， 再加入0.5M的HC1溶液lmL和0.1M的NaN02溶液0.6mL， 4'C下攪袢反應(yīng) 30min，加入1.8mg尿素，繼續(xù)攪拌5min，得氯氟氰菊酯半抗原重氮化組分；
稱取90mg牛血清白蛋白溶解于20mL0.2M、 pH 8.7的硼酸鹽緩沖溶液中， 4。C下將制備的重氮化組分逐滴加入到牛血清白蛋白溶液中，攪拌12h，之后將 偶聯(lián)液裝入透析袋中，fC下，于0.01M、 pH7.5的PBS緩沖溶液中攪拌透析， 每天換3次透析液，共透析4-6天，透析結(jié)束后將透析袋中乳狀液分裝于lmL 的離心管中，于-2(TC冰箱中存放備用，即為氯氟氰菊酯人工抗原01-氰基-3- (4-氨基苯氧基)節(jié)基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-l-丙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷羧酸酯-牛血清 白蛋白，人工抗原CY-BSA。
本發(fā)明所述的牛血清白蛋白(BSA)還可改用卵清蛋白(OVA)。 本發(fā)明的有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn) 本發(fā)明通過(guò)對(duì)氯氟氰菊酯直接硝化，在苯環(huán)上引入硝基，進(jìn)而用SnCl2 2H20 還原，通過(guò)簡(jiǎn)單的兩步反應(yīng)，制備出苯環(huán)上含有活性基團(tuán)(一NH2)的半抗原 (CY)，避免了使用昂貴試劑；合成的半抗原通過(guò)重氮法成功與牛血清白蛋白 (BSA)偶聯(lián)，經(jīng)過(guò)透析純化，紫外光譜掃描，證明了人工抗原合成成功。本 方法操作簡(jiǎn)便，且使用的試劑廉價(jià)易得，克服了其它方法繁瑣、生產(chǎn)率低等缺 點(diǎn)，為以后篩選出氯氟氰菊酯的特異性抗體和建立免疫分析方法提供基礎(chǔ)。


圖1半抗原CY 、載體蛋白BSA及人工抗原CY-BSA的UV光譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:氯氟氰菊酯半抗原(CY)的合成
以氯氟氰菊酯為原料，依次通過(guò)硝化反應(yīng)、還原反應(yīng)，成功合成帶有活性
6基團(tuán)-NH2的半抗原CY，合成步驟如下
1 )、 ct-氰基-3-(4-硝基苯氧基)芐基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-l-丙烯基)-2,2-二甲基
環(huán)丙垸羧酸酯的合成
向150mL的三口燒瓶中加入18g氯氟氰菊酯，30mL乙酸酐攪拌溶解，滴 加2mL發(fā)煙硝酸與10mL乙酸的混合液，滴加完畢，室溫繼續(xù)攪拌反應(yīng)3.5h;
將反應(yīng)液倒入冰水中，攪拌，出現(xiàn)大量黃白色粘稠物質(zhì)，用乙酸乙酯對(duì)水 液進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相，無(wú)水Na2S04干燥過(guò)夜，抽濾，減壓蒸餾得金黃色粘 稠液體，經(jīng)過(guò)硅膠柱層析脫色純化得無(wú)色透明油狀化合物；
2)、半抗原01-氰基-3-(4-氨基苯氧基)芐基-3-(2-氯-3,3，3-三氟-1-丙烯基)-2,2-二甲基環(huán)丙烷羧酸酯(CY)的合成
稱取上步反應(yīng)得到的粗產(chǎn)物4g，溶于50mL乙醇中，加入9.8g SnCl2 '21120， 攪拌得白色的濁液，N2保護(hù)反應(yīng)，70-75。C下反應(yīng)35min;
反應(yīng)液冷卻后，倒入150mLH2O中，攪拌，乳白色漿狀，加入200mL乙酸 乙酯，并用10。/。的NaHC03溶液調(diào)節(jié)pH-7，加入適量的硅藻土，抽濾，蒸餾水、 乙酸乙酯洗滌濾餅，收集濾液中的有機(jī)相，無(wú)水Na2S04干燥2h，抽濾，減壓蒸 餾除去溶劑得紅褐色的油狀物，通過(guò)硅膠柱層析脫色純化得紅棕色的油狀物；
分析數(shù)據(jù)IR(KBr)v: 3441， 1616， 1508， 1454， 1400， 1163， 785cm"; iH-NMR (500MHz， DMSO): 5ppm 7.40 (m, 1H)， 7.19 (t, J = 7.84， 7.84 Hz, 1H), 7.06 (s， 1H), 7.00 (s, 1H)， 6.95 (t, J = 7.99， 7.99 Hz, 1H)， 6,87 (dd, J = 16.35, 8.33 Hz: 1H), 6.81 (m， 1H)， 6.68 (s， 1H), 6.63 (s, 1H), 6.59 (d， J = 8.62 Hz, 1H)， 5.06 (s, 1H), 4.01 (d, J = 7.09 Hz, 1H), 2.32 (m, 1H)， 1.97 (s， 1H)， 1.26 (m, 3H)， 1.16 (d， J = 9.98 Hz，3H); MS(m/z): 487.1(M+Na+)， 464(W);元素分析C23H2qC1F3N203 %:實(shí) 測(cè)值(理論值)C 59.36(59.43)， H 4.39(4.34)， N6.12(6.03)。
實(shí)施例2:氯氟氰菊酯人工抗原(CY-BSA)的合成
稱取上步合成的半抗原CY23.2mg于50mL的燒瓶中，加入4mL DMF溶解， 再加入0.5M的HC1溶液lmL和0.1M的NaN02溶液0.6mL， 4"C下攪拌反應(yīng) 30min，加入1.8mg尿素，繼續(xù)攪拌5min，得氯氟氰菊酯半抗原重氮化組分；
稱取90mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于20mL 0.2M的硼酸鹽緩沖溶液 (pH=8.7)中，4'C下將制備的重氮化組分逐滴加入到蛋白質(zhì)溶液中，攪拌12h， 之后將偶聯(lián)液裝入透析袋中，4匸下，于0.01M的PBS緩沖溶液(pH=7.5)中 攪拌透析，每天換3次透析液，共透析4-6天，透析結(jié)束后將透析袋中乳狀液分 裝于lmL的離心管中，于-20'C冰箱中存放備用。
人工抗原的鑒定人工抗原的鑒定采用紫外光譜法，將半抗原CY，載體蛋 白BSA，偶聯(lián)物CY-BSA對(duì)應(yīng)的不同濃度的紫外光譜圖做對(duì)照(圖l)，偶聯(lián)后 的紫外光譜曲線有變化；從光譜數(shù)據(jù)分析蛋白的吸收峰由278nm移動(dòng)至355nm， 可以證明半抗原已經(jīng)和載體蛋白偶聯(lián)。
本發(fā)明所述的牛血清白蛋白(BSA)可改換采用卵清蛋白(OVA)。
權(quán)利要求
1、一種氯氟氰菊酯半抗原，其特征在于化學(xué)名稱為α-氰基-3-(4-氨基苯氧基)芐基-3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷羧酸酯，簡(jiǎn)寫為CY。
2、 一種氯氟氰菊酯人工抗原，其特征在于用權(quán)利要求1所述的氯氟氰菊酯半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)制得的產(chǎn)品，化學(xué)名稱為(x-氰基-3- (4-氨基苯氧基)芐基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-l-丙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙垸羧酸酯-牛血清白蛋白，簡(jiǎn)寫為CY-BSA。
3、 一種權(quán)利要求2所述氯氟氰菊酯人工抗原的合成方法，其特征是以氯氟氰菊酯為原料，依次通過(guò)硝化反應(yīng)、還原反應(yīng)，成功合成帶有活性基團(tuán)-NH2的半抗原CY，半抗原CY通過(guò)重氮化法與牛血清白蛋白偶聯(lián)制得氯氟氰菊酯人工抗原CY-BSA，步驟為1) 、 a-氰基-3-(4-硝基苯氧基)芐基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-l-丙烯基)-2,2-二甲基環(huán)丙烷羧酸酯的合成向150mL的三口燒瓶中加入18g氯氟氰菊酯，30mL乙酸酐攪拌溶解，滴加2mL發(fā)煙硝酸與10mL乙酸的混合液，滴加完畢，室溫繼續(xù)攪拌反應(yīng)3.5h;將反應(yīng)液倒入冰水中，攪拌，出現(xiàn)大量黃白色粘稠物質(zhì)，用乙酸乙酯對(duì)水液進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相，無(wú)水Na2S04干燥過(guò)夜，抽濾，減壓蒸餾得金黃色粘稠液體，經(jīng)過(guò)硅膠柱層析脫色純化得無(wú)色透明油狀化合物；2) 、半抗原CY的合成稱取上步得到的產(chǎn)物4g，溶于50mL乙醇中，加入9.8g SnCl2 2H20攪拌得白色的濁液，N2保護(hù)反應(yīng)，70-75'C下反應(yīng)35min;反應(yīng)液冷卻后，倒入水中，攪拌加入乙酸乙酯，用NaHC03溶液調(diào)節(jié)pH7，抽濾，蒸餾水、乙酸乙酯依次洗滌濾餅，收集濾液中的有機(jī)相，無(wú)水Na2S04干燥，抽濾，減壓蒸餾得紅褐色的油狀物，通過(guò)硅膠柱層析脫色純化得紅棕色的油狀化合物；即a-氰基-3-(4-氨基苯氧基)芐基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙垸羧酸酯，半抗原CY;3) 、人工抗原CY-BSA的制備稱取上步合成的半抗原CY 23.2mg于50mL的燒瓶中，加入4mL DMF溶解，再加入0.5M的HC1溶液lmL和0.1M的NaN02溶液0.6mL， 4'C下攪拌反應(yīng)30min，加入1.8mg尿素，繼續(xù)攪拌5min，得氯氟氰菊酯半抗原重氮化組分；稱取卯mg牛血清白蛋白溶解于20mL0.2M、 pH 8.7的硼酸鹽緩沖溶液中，4'C下將制備的重氮化組分逐滴加入到牛血清白蛋白溶液中，攪拌12h，之后將偶聯(lián)液裝入透析袋中，4'C下，于0.01M、 pH7.5的PBS緩沖溶液中攪拌透析，每天換3次透析液，共透析4-6天，透析結(jié)束后將透析袋中乳狀液分裝于lmL 的離心管中，于-2(TC冰箱中存放備用，即為氯氟氰菊酯人工抗原01-氰基-3- (4-氨基苯氧基)芐基-3-(2-氯-3,3，3-三氟-l-丙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙垸羧酸酯-牛血清 白蛋白，人工抗原CY-BSA。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的合成方法，其特征在于所述的牛血清白蛋白可改 用卵清蛋白。
全文摘要
一種氯氟氰菊酯人工抗原及其合成方法，屬于有機(jī)化學(xué)及免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。氯氟氰菊酯的化學(xué)名為α-氰基-3-苯氧基芐基-3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷羧酸酯，屬于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殺蟲劑。本發(fā)明以氯氟氰菊酯為原料，依次通過(guò)硝化反應(yīng)、還原反應(yīng)，成功合成帶有活性基團(tuán)-NH₂的半抗原CY，半抗原CY通過(guò)重氮法成功與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)，獲得氯氟氰菊酯人工抗原CY-BSA，為以后篩選出它的特異性抗體和建立免疫分析方法提供基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K14/765GK101519364SQ200910029609
公開日2009年9月2日 申請(qǐng)日期2009年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月28日
發(fā)明者林建國(guó), 桑光明, 羅世能, 霈 鄒, 陳傳青 申請(qǐng)人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所