專利名稱：：棉花抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及棉花抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：棉花總量不足已成為嚴(yán)重制約我國棉花產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重大問題。解決原棉缺口最簡單的辦法是擴大種植面積。我國有一半棉田位于干早(如新疆)或半干旱(如晉、陜、冀等)地區(qū)，主要依靠大田灌溉保障棉花豐產(chǎn)豐收。但由于氣候逐漸變暖，干旱、半干旱地區(qū)逐漸擴大，面對水資源逐漸匱乏的壓力，日益嚴(yán)重的-T旱問題己成為制約我國棉花穩(wěn)定發(fā)展的重要因素。如何穩(wěn)定棉花發(fā)展和擴大植棉面積，改良棉花的抗旱能力，提高棉花水分利用效率，是解決我國原棉缺口的重要措施之一，對于保障我國棉花經(jīng)濟和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?？购缔D(zhuǎn)錄調(diào)控對于棉花的抗旱是非常重要的，棉花的抗旱性是受多基因控制的復(fù)雜性狀，EREBP轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多個與干旱、高鹽耐性相關(guān)功能基因的表達(dá)。EREBP轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件GCC或1)RE結(jié)合調(diào)控抗旱相關(guān)基因的表達(dá)，保護自身免受傷害。EREBP轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2,/EREBP類家族轉(zhuǎn)錄因子。AP2/EREBP類家族轉(zhuǎn)錄因子存在于多種植物中，在植物中AP2/EREBP功能保守域是EREBP類轉(zhuǎn)錄因子的特異性結(jié)構(gòu)，調(diào)控植物對干旱、高鹽脅迫的分子應(yīng)答，參與調(diào)控植物的干旱、高鹽等信號途徑。EKEBP類某些基因能接受環(huán)境脅迫信號并啟動逆境應(yīng)答基因，使得植物耐逆性提高。棉花作為一種重要的經(jīng)濟作物，改善其耐旱性表型特征-直是棉花分子育種研究的重要目的之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種棉花抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。木發(fā)明所提供棉花抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，命名為"^i^么來源于棉花，是如下a)或b)或c)的蛋白a)序列表中序列2自氨基末端1-256位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；c)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨3基酸且與抗旱相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。為了使a)的6^5V^a蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中自氨基末端1-256所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標(biāo)簽。表l.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述b)中的GhEREB2蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述b)中的GhEREB2蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列1自5'末端第1-768位所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。所述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述蛋白的編碼基因是如下1)或2)或3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1自5'末端第1-768位；2)其核苷酸序列是序列表中序列1;3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA片段雜交且編碼與抗旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的DNA分子；4)與l)或2)的基因具有90%以上的同源性，且編碼與棉花抗旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的DNA分子。所述步驟4)中的基因，與l)的基因最好有95%以上的同源性。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0.5WSDS的溶液中，在68。C下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。擴增fflfiffi^邀因全長或任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。含有上述^fi^^2基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有"^^6S^基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可甩于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA3301、pC扁BIA1300、pBI121、pBinl9、pC纖IA2301、pC細(xì)IA1301-UbiN或其它衍生植物表達(dá)載體。攜帶有本發(fā)明的"^KS基因的植物表達(dá)載體可通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中。使用fi^y^S基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、泛生素基因Ubiquitin啟動子(pUbi)等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的"^XfiS基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育抗旱植物的方法。本發(fā)明所提供的培育抗旱植物的方法，是將所述的6^^沒^基因?qū)胫参镏校玫娇购的芰μ岣叩霓D(zhuǎn)ft^^S基因植物。所述植物可以為各種單子葉或雙子葉植物，如擬南芥、棉花、小麥或者水稻等。本發(fā)明的GhEREB2蛋白含有一個高度保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域、一個核定位信號和一個激活域，屬于AP2/EREBP類家族轉(zhuǎn)錄因子的新成員。"i^5a基因在棉花根、莖和葉中都表達(dá)，同時ffli7ffiS基因的表達(dá)被乙烯、茉莉酸甲酯和干旱誘導(dǎo)，GhEREB2mRNA累積速度較快。實驗證明，ffli5y^S在含有GCC-box的報告質(zhì)粒的酵母中能夠異源表達(dá)，且誘導(dǎo)并增加了His3和LacZ報告基因的表達(dá)，說明GhEREB2蛋白能夠特異地結(jié)合GCC-box，激活目的基因的表達(dá)，ft^7MC蛋白具有明顯的轉(zhuǎn)錄激活能力。同時轉(zhuǎn)W^7ffiS基因擬南芥抗旱性明顯增強。^^^^^歪A是抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，可在培育抗旱植物中得到廣泛應(yīng)用。圖1為6"M7^5S^基因組織特異性表達(dá)。圖2為ft^y^^基因受脅迫條件誘導(dǎo)表達(dá)。圖3為Y印GAP-ffl^^^表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。圖4為含有HIS3和lacZ報告基因的酵母YM4271株系。圖5為攜帶YepGAP-^^vfiS^載體的酵母對3-AT的抗性。圖6為ffl^5H^在酵母激活LacZ報告基因的表達(dá)。圖7為pCAMBIA1304-ft^X5S表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。圖8為轉(zhuǎn)pCAMBIA1304-ffl^i5S擬南芥。圖9為轉(zhuǎn)pC細(xì)BIA1304-ffl^XfiS擬南芥和轉(zhuǎn)pCAMBIA1304擬南芥根系比較。具體實施例方式下述實施例中如無特殊說明所用方法均為常規(guī)方法，所用試劑均可從商業(yè)途徑獲得。實施例l、棉花抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GhEREB21)棉花6MVi^fiS基因的克隆用PromegaRNAgents總RNA提取試劑盒提取生長10天的棉花(新海14)幼苗的總RNA，用Stratagene試劑盒構(gòu)建cDNA文庫。通過酵母單雜交技術(shù)篩選棉花的cDNA文庫，用于篩選文庫的酵母雙報告子pHISi-1、pLacZi分別含有融合三個順式重復(fù)的GCObox(TAAGAGCCGCC，源于番茄/^基因的啟動子區(qū))的歷W或報告基因。攜帶這兩個報告子的酵母YM4271菌株能夠很好生長于SD/His-Ura-選擇培養(yǎng)基上。根據(jù)one-hybridsystem(Clontech)的說明書，篩選了棉花的c咖A文庫。取cDNAAD融合表達(dá)文庫的質(zhì)粒20Pg進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后涂布到含15mmol/L3-AT的SD/His-/Ura-/Leu-選擇性培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)5—6d。選取生長較旺盛的酵母菌落，在含30mmol/L3-AT的SD/His-/Ura-/Leu-選擇性培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，并對陽性克隆進(jìn)行e-半乳糖甘酶活性檢測，總共得到15個陽性克隆。提取陽性克隆的質(zhì)粒DNA，用限制內(nèi)切酶SalI、Notl進(jìn)行酶切。從pADGAL4質(zhì)粒上將目的片段切下，連到pBluescriptIISK載體進(jìn)行測序。分析這些陽性克隆的測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有一個cDNA克隆編碼的蛋白含有AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，且具有完整的編碼框，命名為6M腳么fi^7ffiS^基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，GM7ffiS的全長cDNA序列為1042bp，具有一個單一的編碼閱讀框，編碼由256個氨基酸殘基組成的蛋白，其氨基酸序列如序列表中的序列2。另外，在0^^^^編碼蛋白的氨基酸序列上，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子的其它典型特征，例如，N-末端區(qū)域的堿性氨基酸序列，C-末端的酸性區(qū)域，其可能是一個轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。因此，fi^7E!fiS能編碼一個能與DNA結(jié)合的EREBP轉(zhuǎn)錄因子，從而作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控子在棉花中起到抗逆功能。將在25"C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天的棉花(新海14)幼苗，小心地拔出幼苗以進(jìn)行干旱、低溫和激素(乙烯和MeJA)脅迫處理。干旱脅迫處理將幼苗放到濾紙上，30°C處理。低溫脅迫脅迫把幼苗放入水溶液，4'C處理。激素脅迫處理把幼苗分別放入含有l(wèi)mmol/L乙烯和100Mmol/LMeJA(茉莉酸甲酯)的溶液中處理。脅迫處理時間均為0.5、1、2、3、5、7、9、12和24h，脅迫處理后將材料放入液氮速凍，-80卩保存?zhèn)溆?。通過Promga公司RNA提取試劑盒提取了脅迫處理后的棉花幼苗根、莖、葉組織的總RNA和不同脅迫處理下的棉花幼苗的總RNA?？俁NA純度與質(zhì)量都較高，每個樣品的RNA的A26。/A，都在1.8以上，濃度在0.8Pg/叱以上。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，28SrRNA與18SrRNA條帶非常清晰，表明所提取的RNA樣品能用于RT-PCR反應(yīng)。用組成型表達(dá)基因ubiquitin作為內(nèi)標(biāo)，以EF2(5'-ATGTGTGGAGGTGCAATTA-3，)和ER2(5，-TCTGTTGTTGATGATGTGTC-3，)為引物，通過RT-PCR分析分析"M7^^基因在各種脅迫條件下的表達(dá)，以及"M7KS基因在棉花根、莖和葉中的表達(dá)情況。結(jié)果如圖1和2所示。M^7ffii^基因在棉花植株中的表達(dá)呈現(xiàn)了組織特異性的特點；GhEREB2在根、莖中的表達(dá)量最高，而在葉中的表達(dá)量最低(圖1)。G/^7ffiS^的表達(dá)受干旱和低溫脅迫條件的誘導(dǎo)，干旱或低溫能誘導(dǎo)ft^7KK的高效表達(dá)。干旱處理時，GM7^^在lh左右開始增強，7h時達(dá)到較高水平，干旱處理6M^S基因表達(dá)明顯高于低溫處理時的"M^fiS表達(dá)量。低溫處理時，CM7KS^的誘導(dǎo)表達(dá)特別緩慢，在3h左右開始增加，7h左右時表達(dá)量達(dá)到最高，與干旱條件下"力W^^基因表達(dá)相比，表達(dá)量增加的較少。在Ethylene(乙烯)處理時，W^^S基因表達(dá)量增加。Ethylene處理時a^SW的表達(dá)量明顯高于MeJA(茉莉酸甲酯)處理的6M7^fiS的表達(dá)量。但是MeJA處理時，6M欣氾的mRNA積累的速度比較快，在處理7h時達(dá)到最高峰，而乙烯處理時GhEREB2基因的最高表達(dá)水平的時間滯后2h。圖1中，"C"為整株，"R"為根，"S"為莖，"L"為葉。圖2中，GhEREB2基因在干旱、低溫、乙烯、茉莉酸甲酯條件下的表達(dá)特征，上面的數(shù)字代表了脅迫處理棉花的不同時間。上述結(jié)果說明a^^fiS參與了干旱脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。2)GhEREB2基因編碼一個轉(zhuǎn)錄因子.用PromegaRNAgents總RNA提取試劑盒提取生長10天的棉花(新海14)幼苗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以5，-ACAAGAATTCATGTGTGGAGGTGCAATTA-3，禾口5，-AACAGTCGACTAAAAGAGCTGAGGCTGTTG-3，(劃線部分為EcoRI識別位點和SalI識別位點)為引物，通過PCR擴增6^^SSM的cDNA(其核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第1-768位，編碼序列表中序列2自氨基末端第1-256位所示的蛋白)。PCR產(chǎn)物用EcoRI和SalI雙酶切，回收768bp片段，連接到同樣雙酶切的Y印GAP載體(MATCHMAKERTranscription-activationSystem,Clontech公司)(沒有GAL4domain)酵母表達(dá)載體上，構(gòu)建重組載體Y印GAP-^fifi^么Y印GAP-G/^7j5S51表達(dá)載體的構(gòu)建過程如圖3。將含有3個GCC元件的片段5'-GAATTC-GCC-GCC-GCC-GTCGAC-3'(GCC--box:TAAGAGCCGCC)分別構(gòu)建到pHis-1載體(MATCHMAKEROne-HybridSystem,Cl。ntech公司)的Pmin,啟動子和pLacZi載體(MATCHMAKEROne-HybridSystem,Clontech公司)PTO1啟動子上游，分別得到重組載體pHis-1-GCC和pLacZi-GCC，用勘I和AfcoI內(nèi)切酶分別將pHis-1-GCC和pLacZi-GCC載體切成線狀。先將線狀pHis--1-GCC載體轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞(YM4271株系，MATCHMAKEROne-HybridSystem,Clontech公司)內(nèi)，獲得能在SD/His—培養(yǎng)基上正常生長的酵母轉(zhuǎn)化子(Yeasttransformant)，接著以這種酵母轉(zhuǎn)化子為寄主細(xì)胞，繼續(xù)轉(zhuǎn)化含有3個重復(fù)GCC元件的pLacZ^GCC載體，這樣在同時缺乏組氨酸和尿嘧啶的SD/His7Ura培養(yǎng)基上，選擇獲得含有pHis-1-GCC和pLacZi-GCC的雙報告基因ffi^和LacZ的酵母菌，獲得帶有GCC-box且含有雙報告基因A'd和LacZ的酵母菌株YM4271。將3個GCC元件的核心序列突變成mGCC，即5'-GAATTC-raGCC-mGCCiGCC-GTCGAC-3'，按上述的雙重酵母報道子構(gòu)建方法，再構(gòu)建帶突變的GCC-box雙報告8基因His3和LacZ的酵母菌YM4271。重組質(zhì)粒Y印GAP-fi^7iS，用熱激法分別轉(zhuǎn)入帶有GCC-box的雙報告基因His3和LacZ的酵母預(yù)4271菌株和帶有突變的GCC-box的雙報告基因His3和LacZ的酵母YM4271菌株，這兩個報告基因分別與三個順式重復(fù)的野生型GCC-box(TAAGAGCCGCC)或突變的GCC-box(TAAGACCCGCG)連接在一起。在SD/His—Ura—LeiT培養(yǎng)基上篩選出轉(zhuǎn)化子，挑取克隆提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR檢測，PCR所用引物為5，-ATGTGTGGAGGTGCAATTA-3'和5'-TCTGTTGTTGATGATGTGTC-3，，擴增出753bp的克隆為陽性克隆，分別命名為攜帶Y印GAP-G力i5y^^/GCC-box的酵母YM4271和攜帶Y印GAP-ffl￡7￡^/mGCC-box的酵母YM4271。圖4所示Y印GAP-GMVfiS5轉(zhuǎn)化到含有HIS3和lacZ報告基因的酵母YM4271株系，其中HIS3和lacZ基因位于含有GCC-box或mGCC-box的啟動子區(qū)下游，PGAP是編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子，TADH1是ADH1基因的終止子。然后對攜帶Y印GAP-6^^^fiS5/GCC-box的酵母YM4271、攜帶Y印GAP-6"My^E/mGCC-box的酵母YM4271和對照菌進(jìn)行3-AT抗性檢測和P-半乳糖苷酶活性分析。攜帶Y印GAP-a^TKS^/GCC-box的酵母YM4271、攜帶YepGAP-6"力^5S^/mGCC--box的酵母YM4271和對照菌分別接種在的SD/His—Ura—Leu—培養(yǎng)基(含0mmol/L，10mmol/L，20mmol/L，30mmol/L和60mmol/L3-AT)上，30。C培養(yǎng)3天，酵母YM4271株系的生長如圖5所示。表2所示為GhEREB2激活His報告基因的結(jié)果。攜帶Y印GAP-6M7^iVGCC能生長于0-60mraol/L3-AT的SD/His—UraLeu—培養(yǎng)基上，且生長狀態(tài)較好。但是，攜帶Y印GAP-^fi^^/mGCC-box的酵母及對照菌沒有表現(xiàn)出3-AT抗性。上述實驗結(jié)果說明，^^^^基因編碼蛋白能夠特異地識別并結(jié)合GCC-box，激活報告基因HIS3的表達(dá)，但不能識別突變的mGCC-box。圖5中A:酵母轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)基上生長的位置示意圖，1、2、3、4、5和6分別代表對照、Y印GAP-GM7ffiS^/GCC-box、Y印GAP-G/^TPfi^/mGCC-box、對照、Y印GAP-6M7￡S2/GCC—box、Y印GAP-^^V^S5"/mGCC—box;B:圖A中的1、2、3、4、5禾口6在0ranol/L3-AT的SD/His-Leu-Ura-培養(yǎng)基上的生長情況；C:圖A中的1、2、3、4、5和6在含30mmol/L3-AT的SD/His-Leu-Ura-培養(yǎng)基上的生長情況。表2.GhEREB2激活His報告基因的結(jié)果菌株名稱3-AT濃度(mmo1/L)0102030405060(Y印GAP-GhEREB2)/GCC+++++++(Y印GAP-GhEREB2)/raGCC+——一———對照+————_—表2中"-"代表不生長；"+''代表生長好。e-半乳糖苷酶(0-galactosidase)活性分析方法如下用SD培養(yǎng)基(無氨基酸酵母氮源6.7g，葡萄糖20g，細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂20g，加水1000mL)活化待測酵母菌2次，按l。/。接種到3mLSD酵母液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞生長直到對數(shù)生長期。取1mL菌液于10，000rpm離心30秒收集菌體，用500(^1的Z緩沖液(0.06raol/LNa2HP04，0.04raol/LNaH2P04，0.01mol/LMgS04，0.05mol/Le-巰基乙醇，pH7.0)重新懸浮菌體，加入15plP/QSDS和30pl氯仿，在28。C水浴中平衡15分鐘，再加入O.1mL4mg/mL的ONPG(0NPG是鄰-硝基苯酚，溶于0.1mol/L磷酸鉀緩沖液中，pH7.0)，充分混勻后，置于28'C水浴中，開始計時。反應(yīng)1小時后，加入0.25mL的lmol/L化2(1)3終止反應(yīng)。10,000rpm離心細(xì)胞2分鐘，把上清液轉(zhuǎn)到新管中，測定上清液的OD，和OD55。。按照上述方法加入各種試劑，但不加入菌液作為空白對照。按下列公式計算半乳糖苷酶活性，單位用"U"表示。U=500X(0D，-(1.75X0D刷))/T*V*0D6。。。公式中T表示反應(yīng)時間(分鐘)，V是檢測酵母菌懸浮液的體積(niL)。實驗重復(fù)3次。酵母菌e-半乳糖甘酶活性分析表明，當(dāng)含有GCC-box的報告質(zhì)粒與攜帶有GhEREB2基因的質(zhì)粒共表達(dá)時，LacZ表達(dá)量增加。相反地，與陰性對照相比，在含有mGCC-box的酵母細(xì)胞中，LacZ的表達(dá)量并沒有明顯的變化(圖6)。圖6中"1"代表對照；"2"代表(Y印GAP-GhEREB2)/GCC;"3"代表(Y印GAP-GhEREB2)/mGCC。上述實驗結(jié)果表明，GhEREB2在含有GCObox的報告質(zhì)粒的酵母中能夠異源表達(dá)，且誘導(dǎo)并增加了His3和LacZ報告基因的表達(dá)，說明GhEREB2編碼蛋白能夠特異地結(jié)合GCC-box，并激活目的基因的表達(dá)，ft^7ffiS^因編碼一個轉(zhuǎn)錄因子。實施例2、利用ft^7c^^^因培育抗旱植物用PromegaRNAgents總RNA提取試劑盒提取生長10天的棉花(新海14)幼苗的總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以5，-ACAAGAATTCATGTGTGGAGGTGCAATTA-3，和5，-AACAGTCGACTAAAAGAGCTGAGGCTGTTG-3，為引物通過PCR擴增的cDNA。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳回收后用BglII和SPeI雙酶切，與同樣雙酶切pCAMBIA1304載體連接，6^5fiS的cDNA定向插入pCAMBIA1304表達(dá)載體的CaMV35S啟動子下游，得到重組雙元表達(dá)載體pCAMBIA1304-a^^^，圖7為pCAMBIA1304-"/W^fiS^表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。將pCAMBIA1304-^^^55^重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中，獲得重組菌，重組菌在YEB固體培養(yǎng)基(含50Pg/mLRif，504g/mLKna)上篩選，28。C培養(yǎng)2天，挑取克隆，從農(nóng)桿菌中提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR檢測，所用引物為5'-ATGTGTGGAGGTGCAATTA-3，和5，-TCTGTTGTTGATGATGTGTC-3，。PCR擴增產(chǎn)物為753bp的重組菌命名為GV3101-ffli5^S。以轉(zhuǎn)入pCAMBIA1304的農(nóng)桿菌GV3101作為對照。重組菌GV3101-fi^7^fiE和對照用來轉(zhuǎn)化擬南芥。采用Floraldip法轉(zhuǎn)化擬南芥(^ra/j'(/opsj's"ah'a"3)Columbia植株，將浸染過的擬南芥植株蓋上塑料膜以保持濕度，在暗處放置過夜，然后移入溫室繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化后植株正常地開花生長，23周后種夾開始變黃，然后收集種子進(jìn)行篩選。將T。代種子平鋪于MS培養(yǎng)基(含25PgA]L潮霉素)上，4。C黑暗條件下春化3天，然后在22/18。C、16/8小時光周期條件下培養(yǎng)10天，轉(zhuǎn)pCAMBIA1304-G^7ffiS^以南芥苗大，根特別長，且有真葉形成，而轉(zhuǎn)pCAMBIA1304擬南芥幼苗小且沒有真葉的形成(圖8)。通過潮霉素抗性篩選得到89株潮霉素抗性的轉(zhuǎn)pCAMBIA1304-GhEREB2的擬南芥。從MS培養(yǎng)基(含25^g/mL潮霉素)上挑出潮霉素抗性的轉(zhuǎn)pCAMBIA1304-GhEREB2的擬南芥，轉(zhuǎn)移到土壤中繼續(xù)培養(yǎng)，收獲了T,代種子。L代轉(zhuǎn)pCAMBIA1304-GhEREB2擬南芥大、根長、根毛、側(cè)根比轉(zhuǎn)pCAMBIA1304擬南芥顯著增加(圖9)。圖9中，"1"為轉(zhuǎn)pCAMBIA1304-GhEREB2擬南芥；"2-3"為轉(zhuǎn)pCAMBIA1304擬南芥。轉(zhuǎn)pCAMBIA1304-GhEREB2擬南芥和轉(zhuǎn)pCAMBIA1304擬南芥L代種子在MS選擇培養(yǎng)基上篩選出轉(zhuǎn)基因苗，4"C冰箱放置3天后置于正常培養(yǎng)間光照培養(yǎng)，10天后將轉(zhuǎn)基因苗移至蛭石和草炭土的營養(yǎng)基質(zhì)中，正常培養(yǎng)，兩個半月后收L代種子。將T2代轉(zhuǎn)基因種子培育成小苗，進(jìn)行耐旱試驗。共得到了84個株系的轉(zhuǎn)pCAMBIA1304-^fi^SL代擬南芥，22株轉(zhuǎn)pCAMBIA1304L代擬南芥。將84個株系的轉(zhuǎn)pCAMBIA1304-GM7KS2T2代擬南芥和22株轉(zhuǎn)pCAMBIA1304T2代擬南芥，同時對稱地移栽到同一小缽的兩側(cè)，每個株系各7株。每個轉(zhuǎn)基因株系設(shè)3個重復(fù)。常規(guī)管理，澆水3次后停止?jié)菜?，停止?jié)菜笕軓?fù)水，復(fù)水一周后觀察。實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)pCAMBIA1304T2代擬南芥全部枯死，而轉(zhuǎn)pCAMBIA1304-fflfi^S2T2代擬南芥的84個株系中，有63個株系的轉(zhuǎn)基因植株存活，且葉片保持綠色，植株生長良好。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>ttaatgaagggtaaatagttgtgacEiataaaaageLttggccacccagttttaatttatat900ttatttctaatttgggtgacatgtaaattggtttcgagaaetcattgaagtacccataBtg960ttagttcatgtatcagatatagtaaacactttggattaataaaaaaacctcctaatattt1020tatttgtaaaaaaaaaaaaaaa1042〈210〉2〈211〉256〈212〉PRT<213〉木帛花(6b5\sy/iwz7Ai_rswfM7.L)<400>2MetCysGlyGlyAlalielieSerAspPhelieAlaValLysArgGly151015ArgLysLeuThrAlaGluAspLeuTrpSerGluLeuAspThrPheSer202530AspLeuLeuGlyLeuAspTyrGlyAsnGlyLysGluSerSerPheThr354045GinSerAspAsnThrLysAlaGlySerLysAlaLysAsnLeu505560ValAlaAsnGluThrThrGinLysThrSerArgGlyArgGlu657075GlyLysThrGinArgThrArgLysAsnlieTyrArgGlylie8590ArgProTrpGlyLysTrpAlaAlaGlulieArgAspProHis100105110ValArgValTrpLeuGlyThrTyrAsnThrAlaGluGluAlaAlaArg115120125AlaTyrAspGluAlaAlaLysArglieArgGlyGluJLysAlaLysLeu130135140GluLysLysGlu80ArgGin95LysGly14AsnPhe145CysMetMetAlaProGinThrProHisLeuThrGinProProAlaLysLysArg155160LeuThrProProSerSerGluThrLysSer170175PheGlyTyrGluAsnGlyValPro150ProGlu165GinLeuPheProProThrPro180TyrArgProSer195SerLeuGluSerlieSer210ThrGluLeuSerGly225LeuAspAspLeuVal245MetGly185GluAlaMetGluSerGluMetGlu200LeuGlyLeuGluPhe215SerAlaGluPro230ThrHisHisGinAsn190LeuLysGluGin205AspGluThrThrPro220AspSerValAspLeuTrpMet235240GinGinProGinLeuPheTyr25025權(quán)利要求1、一種蛋白質(zhì)，是如下a)或b)或c)的蛋白a)序列表中序列2自氨基末端第1-256位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；c)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且與抗旱相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下l)或2)或3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1自5'末端第1-768位；2)其核苷酸序列是序列表中序列1;3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA片段雜交且編碼與抗旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的DNA分子；4)與l)或2)的基因具有90%以上的同源性，且編碼與棉花抗旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的DNA分子。4、含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體。5、含有權(quán)利要求2或3所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。6、一種培育抗旱植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)胫参镏?，得到抗旱能力提高的轉(zhuǎn)基因植物。7、擴增權(quán)利要求2或3所述基因的全長及其任意片段的引物對。8、權(quán)利要求i所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因、權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體、權(quán)利要求5所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在培育抗旱能力提高的植物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種棉花抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。該轉(zhuǎn)錄因子是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列2自氨基末端第1-256位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。所述轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因是如下1)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端第1-768位；2)其核苷酸序列是序列表中序列1；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA片段雜交且編碼與抗旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的DNA分子。該基因可用來培育抗旱植物。文檔編號C07K14/415GK101481410SQ20091007807公開日2009年7月15日申請日期2009年2月13日優(yōu)先權(quán)日2009年2月13日發(fā)明者侯玉霞,李付廣,段紅英,龔玉梅申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所;中國農(nóng)業(yè)大學(xué)