專利名稱：：抗mfap3l單克隆抗體及其在腫瘤檢測中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫學和細胞學領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了一種可以產(chǎn)生與人結(jié)直腸癌細胞的天然抗原結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤，由該雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體可應(yīng)用于人結(jié)直腸癌的診斷試劑或相關(guān)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：結(jié)直腸癌又稱大腸癌，在我國常見惡性腫瘤中排第五位。在過去的25年中，隨著人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率呈上升趨勢，上升速度在各種惡性腫瘤中排第一位。肝臟是結(jié)直腸癌最易發(fā)生的轉(zhuǎn)移器官，被稱為結(jié)直腸癌器官轉(zhuǎn)移的“第一站”，它是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因之一。在整個病程中，約有50%的結(jié)直腸癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移(同時性轉(zhuǎn)移為15%—25%，異時性轉(zhuǎn)移為20%)，并最終死于以肝臟為主的遠位轉(zhuǎn)移。發(fā)生這種情況的原因是多方面的，比如手術(shù)的切除范圍不足、常規(guī)病理取材時潛在陽性淋巴結(jié)的遺漏等都可造成對腫瘤分期的低估。但缺少較現(xiàn)行臨床標準更精確而具指導意義的腫瘤分類標準是一個更為重要的原因，而這種情況又會直接影響到患者治療方案的制定。只有通過早期發(fā)現(xiàn)甚至預測肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生，才有可能對腫瘤病期進行更準確的評估，盡早地進行針對性治療，從而提高生存率，改善預后。目前臨床上檢測結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移主要依靠影像學技術(shù)，包括B超、CT、MRI和血管造影等，對肝臟轉(zhuǎn)移灶的檢出率為50%—90%。但檢出時多因轉(zhuǎn)移灶過大、數(shù)目過多、分布太廣或與周圍血管關(guān)系過于密切而失去有效治療時機。而且對于直徑<Icm的微小轉(zhuǎn)移灶，影像學技術(shù)也很難做出明確診斷。隨著免疫學和分子生物學的發(fā)展，一系列敏感性和特異性更強的檢測手段，如免疫組織化學、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)、實時定量PCR(real-timePCR)和流式細胞儀等也被用于在外周血、膽汁和淋巴結(jié)等樣本中檢測微量腫瘤細胞和肝臟微小轉(zhuǎn)移灶的存在。上述技術(shù)的應(yīng)用，既為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的早期診斷提供了可能，也使預測肝轉(zhuǎn)移的分子標志物成為研究熱點。本發(fā)明人利用雙向電泳和基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-T0F/T0F)等蛋白質(zhì)組學技術(shù)，在幾十例大腸癌原發(fā)灶組織樣品中篩查與肝轉(zhuǎn)移特異相關(guān)的蛋白。我們發(fā)現(xiàn)，微絲相關(guān)蛋白3樣(Microfibrillarassociatedprotein3_like，MFAP3L)的基因在轉(zhuǎn)移組樣本中高表達。MFAP3L是2002年從人睪丸cDNA文庫中克隆出的一個與精子發(fā)生相關(guān)的基因，其功能研究到目前為止尚不多見，而檢測該蛋白的特異性抗體也從未被制備。該基因的mRNA全長1345bp，編碼45kDa蛋白。Southern印跡結(jié)果顯示該基因在除卵巢外的人類各種組織中都有表達，其中在睪丸中高表達，在結(jié)腸中低表達。對于這樣的新的靶點蛋白，急需提供特異性的檢測抗體。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的第一個目的是提供一種能專一性針對MFAP3L單克隆抗體雜交瘤及其制備方法。以及這種抗MFAP3L單克隆抗體雜交瘤分泌的抗體在腫瘤檢測中的用途。本發(fā)明的第二個目的是提供一種特異性好的單克隆抗體，該抗體的亞類為IgGl，其能特異性地結(jié)合MFAP3L重組抗原和天然抗原。本發(fā)明的第三個目的是提供一種可以用于實驗或臨床診斷腫瘤組織MFAP3L表達水平的診斷試劑或檢測試劑。本發(fā)明的第四個目的是提供抗MFAP3L單克隆抗體在檢測腫瘤發(fā)生，發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的用途，特別是檢測MFAP3L高表達的結(jié)直腸癌，更特別是發(fā)生遠端臟器轉(zhuǎn)移的腫瘤中的用途。解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)手段本發(fā)明人通過原核表達該蛋白，免疫Balb/c小鼠并經(jīng)過融合、克隆篩選、制備腹水、親和層析技術(shù)純化腹水獲得了鼠源單克隆抗體。免疫印記試驗顯示該蛋白在高轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細胞系RKO中的表達明顯高于低轉(zhuǎn)移細胞系HT29，而免疫組化(IHC)檢測顯示，在另外105對結(jié)直腸癌和正常組織樣本中MFAP3L蛋白在腫瘤組織中的表達明顯高于配對正常組織，而且高表達該蛋白的病例發(fā)生包括肝臟在內(nèi)的各種遠端臟器轉(zhuǎn)移的幾率較高，術(shù)后五年生存率較低(P<0.001)。具體地，本發(fā)明涉及以下幾個方面1.一種單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體由保藏日為2008年12月30日、保藏號為CGMCC2840的小鼠雜交瘤細胞系70016-1產(chǎn)生。2.項目1所述的單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體為小鼠IgGl亞型單克隆抗體。3.含有項目1的單克隆抗體的免疫組化檢測試劑，其用于檢測人結(jié)直腸癌組織和正常組織中微絲相關(guān)蛋白3樣表達的差異。4.含有項目1的單克隆抗體的免疫熒光檢測試劑，其用于檢測人結(jié)直腸癌組織和正常組織中微絲相關(guān)蛋白3樣表達。5.含有項目1的單克隆抗體的免疫印跡檢測試劑，其用于檢測人結(jié)直腸癌組織和正常組織中微絲相關(guān)蛋白3樣表達。6.含有項目1的單克隆抗體的檢測試劑，其用于檢測人結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。7.使用項目1的單克隆抗體進行檢測的方法，其包括使項目1的單克隆抗體與生物樣品接觸。8.項目1所述的單克隆抗體的用途，其用于制備用于檢測人結(jié)直腸癌組織和正常組織中微絲相關(guān)蛋白3樣表達的差異的免疫組化檢測試劑。9.項目1所述的單克隆抗體的用途，其用于制備用于檢測人結(jié)直腸癌細胞樣品中微絲相關(guān)蛋白3樣的表達的免疫熒光試劑和免疫印跡檢測試劑。10.項目1所述的單克隆抗體的用途，其用于制備用于檢測人結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的檢測試劑。11.保藏號為CGMCC2840，保藏日為2008年12月30日的名為70016-1的小鼠雜交瘤細胞系。本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果本發(fā)明獲得的雜交瘤(70016-1，保藏號為CGMCC2840)分泌產(chǎn)生的單克隆抗體，不僅與重組的MFAP3L抗原具有極強的特異性和敏感性，而且與結(jié)腸癌組織和細胞中的MFAP3L有極強的特異性敏感性。經(jīng)過試驗驗證，本發(fā)明中雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體可應(yīng)用于蛋白印跡，免疫熒光和免疫組化等實驗技術(shù)中。且特異性和靈敏度高，具有很高的應(yīng)用價值。此外，在腫瘤生物學研究中，本發(fā)明的雜交瘤分泌的單克隆抗體可應(yīng)用于研究亞細胞定位，蛋白相互作用等信號通路的科學研究中，也可以用于臨床中檢測腫瘤尤其是結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等實驗中。通過試驗證明本發(fā)明的雜交瘤分泌的單克隆抗體是高效的檢測腫瘤尤其是結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的試劑，檢測效率高。具有很好的應(yīng)用前景。附圖簡述圖1表示由雜交瘤70016-1制備的抗MFAP3L單克隆抗體在免疫熒光檢測中的應(yīng)用。其結(jié)果顯示可以通過本發(fā)明的單克隆抗體明確地檢測出MFAP3L蛋白定位在細胞核中。圖2表示采用本發(fā)明的單克隆抗體進行免疫印記試驗的結(jié)果，具體可發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的單克隆抗體能夠特性地結(jié)合主要存在于胞核中的MFAP3L上。其中的核纖層蛋白A(LaminA)和醛還原酶(AR)分別為胞核與胞漿的標志蛋白。圖3表示采用本發(fā)明的單克隆抗體進行免疫組化試驗檢測腫瘤組織和正常組織的差別的試驗結(jié)果。具體可發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的MFAP3L抗體主要在胞核中著色，且在腫瘤組織(左圖)中的著色明顯強于正常結(jié)腸組織。該結(jié)果表明此抗體可在免疫組化試驗中特異地檢測MFAP3L蛋白，而該蛋白在結(jié)腸腫瘤組織中特異性高表達，由此可以鑒定結(jié)腸腫瘤組幺口/Νο圖4表示本發(fā)明的MFAP3L高低與患者術(shù)后五年生存率高低的關(guān)系。其中高表達該蛋白的腫瘤病例發(fā)生包括肝臟在內(nèi)的各種遠端臟器轉(zhuǎn)移的幾率較高(ρ<0.001)，術(shù)后五年生存率較低。其中實線對應(yīng)MFAP3L低表達組，而虛線對應(yīng)MFAP3L高表達組。具體實施例方式實施例1MFAP3L抗原的制備一、MFAP3L全長蛋白的克隆，表達和純化以肝臟的cDNA文庫為模板，根據(jù)MFAP3L序列(SEQIDNO1)對應(yīng)的基因設(shè)計特異引物，引物兩端連入BamHI和HindIII酶切位點上游引物5，AGCAGGATCCATGGATCGATTGAAGAGC3，下游引物5，CCCAAGCTTTTAGACATGGCTTTCGTA3，PCR擴增出全長MFAP3L基因，(PCR參數(shù)95°C5分鐘，94°C30s，54°C30s,72°C1分鐘，共40個循環(huán)；72°C后延伸10分鐘)經(jīng)雙酶切后與pET28a連接，熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a，挑單克隆提取質(zhì)粒進行測序，驗證序列無誤。從測序正確的陽性菌中提取pET28a-MFAP3L質(zhì)粒，(TIANGENBIOTECH公司試劑盒)轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，抗生素篩選得到陽性克隆，加入lmmol/LIPTG誘導4小時。誘導以后的菌株經(jīng)超聲后離心，上清和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示表達的產(chǎn)物為可溶性蛋白。二、重組MFAP3L蛋白質(zhì)的表達和純化含有pET28a_MFAP3L質(zhì)粒的BL21大腸桿菌在大規(guī)模培養(yǎng)后，加入IPTG進行誘導表達。誘導后的菌株經(jīng)破碎和離心處理，再將可溶部分通過Ni-NAT親和層析柱進行純化，并用線粒梯度咪唑洗脫MFAP3L蛋白。洗脫的蛋白質(zhì)以SDS-PAGE電泳檢測純度，最后進行MALDI-TOF/TOF鑒定，確證表達產(chǎn)物為MFAP3L。實施例2抗MFAP3L雜交瘤的制備一、免疫用純化的MFAP3L蛋白為抗原，常規(guī)免疫(免疫前眼眶取20ul血清做陰性對照)4-6周齡雌性Balb/c小鼠3只；180ugMFAP3L蛋白+生理鹽水至600ul+CFA600ul；腹部皮下注射每只小鼠6點。免疫劑量60ug/200ul/只。每14天加強免疫一次，90ug蛋白+生理鹽水至600ul+IFA600ul；皮下注射每只小鼠6點。免疫劑量30ug/200ul/只。第3次后7天眼眶取血測效價，達要求者沖擊免疫，50ug蛋白+生理鹽水至IOOul；尾靜脈注射。二、融合1.觀察Sp2/0細胞(協(xié)和細胞庫)的狀態(tài)，并將選出的sp2/0細胞從培養(yǎng)瓶壁上吹打下來，然后吸入到50ml滅過菌的離心管中。將新鮮切下的小鼠脾臟放到細胞篩上碾碎，再吸入到裝sp2/0的離心管中，蓋好離心管助手拿去離心(1500rad/min，5min)。2.用同樣的方法取出未免疫小鼠的胸腺并碾碎。取4ml碾好的胸腺細胞到15ml滅菌的離心管中，再加入Iml的HAT，放在離心管架上待用。3.將裝有離心好的、且混勻的細胞的離心管放入溫水中，加入Iml的PEG1500的，緩慢的攪動細胞。在溫水中靜置1分鐘。IOml的無血清的IMDM離心(lOOOrad/min，5分鐘)。4.加入IOml的血清小心的將細胞吹打起來，并倒入胸腺細胞，加入25ml滅菌的半固體培養(yǎng)基充分混勻。然后均勻的倒入20個細胞培養(yǎng)皿中。將細胞培養(yǎng)皿放入到濕盒中，放入孵箱中培養(yǎng)。三、克隆選擇1.融合后7-10天觀察克隆細胞團大小密度適中，根據(jù)情況鋪板。2.在解剖鏡下，吸取圓、實、大克隆團打入96孔板中，3.放入10%CO2細胞培養(yǎng)箱。四、篩選1.一篩挑克隆后3天左右，70-80%每板觀察細胞量大約占底面積2/3時，取IOOul上清ELISA篩選。2.結(jié)果出來之后，陽性克隆完全換液，再加200ul完全培養(yǎng)基(含1%HT液體)。3.2天后重復步驟1和2進行二次篩選并將陽性株重新編號。4.陽性株轉(zhuǎn)入24孔板(用前1天鋪好，加飼養(yǎng)細胞，HT)，并做好標記。5.篩標簽用含標簽HIS的蛋白包板，取IOOul上清ELISA篩選。6.符合要求的克隆轉(zhuǎn)入6孔板或細胞培養(yǎng)瓶擴大培養(yǎng)。每株細胞凍存5次，并按要求收集上清(一般為IOml左右)。五、細胞凍存對數(shù)生長期細胞占滿底面積80%左右即可凍存。收集上清且去除死細胞等雜質(zhì)，上清存于_20°C。直接將凍存細胞放4°C半小時，然后放-20°C兩小時，轉(zhuǎn)-80°C凍存過夜，次日放液氮罐。實施例3由保藏號為CGMCC2840的雜交瘤制備抗MFAP3L單克隆抗體發(fā)明人將雜交瘤(70016-1，保藏日2008年12月30日，保藏號為CGMCC2840，保藏地中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC)用于制備鼠抗MFAP3L單克隆抗體，具體操作步驟如下1.細胞復蘇細胞遵循慢凍速融原則。從-80°C冰箱或液氮罐中迅速取出凍存管；迅速放入水浴鍋中快速攪動，使凍存液在2分鐘內(nèi)全部融化成液體。用75%酒精擦拭凍存管。往15ml離心管中加入3ml血清培養(yǎng)基，將凍存液吸入離心管，1500rad/min,離心5分鐘。棄上清，用完全培養(yǎng)基懸起細胞，培養(yǎng)于6孔板或瓶中。6孔板中培養(yǎng)基為3ml，第二天換液，再補足3ml；培養(yǎng)瓶培養(yǎng)基為5ml。2.腹水制備對數(shù)生長期細胞用無血清培養(yǎng)基洗滌并懸起；計數(shù)大約5X105，Iml0懸浮的細胞腹腔注射小鼠。一般7-10天后便可收集腹水。第一次可收集3ml左右，每隔2、3天可重復取，最終可收集8ml/只。每次取出的腹水4000rpm，10分鐘離心；中間為腹水。小心吸出腹水收集于離心管中，4°C保存。3.單克隆抗體的純化用HiTraprProteinAFF(GEHealthcare17-5079-01)純化單克隆抗體。a.將腹水在4°C條件下，IOOOOrpm離心10分鐘，去除脂類物質(zhì)。b.離心后吸取上清，并用偶聯(lián)緩沖液以13(腹水，偶連液比)稀釋，過0.45um膜，準備過柱。c.用5-10柱體積的偶聯(lián)緩沖液平衡柱子。d.上樣。e.用5倍柱體積的偶聯(lián)緩沖液洗柱。f.在收集管中加入60-200ul中和液，利于維持抗體的生物活性，避免抗體失活。g.用5倍柱體積洗脫緩沖液洗脫抗體，并收集在步驟6的收集管中。h.以5倍柱體積的洗脫緩沖液洗柱使柱再生。實施例4=ELISA法鑒定單克隆抗體亞類一、實驗試劑1.封閉液2克BSA，3克蔗糖溶于100mlPBS中。2.ABTS儲存液用Iml雙蒸水溶解15mgABTS粉末，2-8°C閉光儲存(可穩(wěn)定4周)3.底物溶液加525mg檸檬酸到50ml雙蒸水中震搖至溶解，用3NNaOH調(diào)節(jié)pH4.至加0.2mlABTS儲存液和IOul30%H2O2到IOml檸檬酸鹽緩沖液中。4.ABTS粉末(SouthernBiotechK3906-YC36公司)5.各型亞類二抗(SouthernBiotech公司)二、實驗操作用IOOmMPBS(pH7.4)稀釋包被羊抗鼠IgG至0.5ug/ml，每孔加lOOul，4°C，過夜。傾空液體，用含0.05%Tween的PBS洗3次，每孔加入200ul封閉液，37°C孵育lh。傾空液體，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.Im雜交瘤上清，37°C孵育lh。傾空液體用PBS-T清洗3次。用封閉液11000稀釋HRP標記的羊抗鼠(κ，λ)抗體或12000稀釋HRP標記的羊抗鼠(IgM,IgGl,IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗體0.Iml每孔，分別加入適當?shù)目字校?7°C用孵育lh。傾空液體，用PBS-T清洗3次。每孔加50ul底物溶液，10-20分鐘內(nèi)測405nm<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.MFAP3L單克隆抗體(11000稀釋)37°C孵育Ih或者4°C孵育過夜，4.相應(yīng)羊抗鼠二抗(中杉金橋，13000稀釋)室溫孵育lh，5.用ImageQuantECL儀器曝光。二、實驗結(jié)果實驗結(jié)果顯示本發(fā)明的單克隆抗體能夠清楚定位存在與細胞核中的靶蛋白(圖2)。具有很好的免疫印跡應(yīng)用前景。實施例8本發(fā)明的單克隆抗體用途驗證-免疫組化一、材料來源本發(fā)明具體實施方式所用結(jié)腸癌組織標本來源于北京大學臨床腫瘤學院組織標本庫，共包括105例結(jié)腸癌及對應(yīng)的癌旁正常組織樣本。樣本取材是經(jīng)手術(shù)切除的新鮮結(jié)直腸癌組織與其對應(yīng)的癌旁組織經(jīng)生理鹽水洗滌后，放入液氮保存。標本均經(jīng)病理證實，并有患者知情同意書。二、實驗步驟1.0.3%H2O2甲醇室溫10分鐘，然后PBS洗3次X5分鐘；2.MFAP3L單克隆抗體(150稀釋)，濕盒孵育4°C過夜；3.滴加羊抗鼠二抗(1200稀釋)，室溫孵育30分鐘；4.DAB-H2O2顯色，鏡下控制3_5分鐘，PBS漂洗，終止顯色，5.蘇木素復染45秒，然后鹽酸酒精分化，6.溫熱的自來水沖洗反藍，7.95%和100%乙醇脫水各5分鐘，二甲苯透明，中性樹膠封片。三、實驗結(jié)果1.如圖3所示，MFAP3L抗體主要在胞核中著色，在腫瘤組織中的著色明顯強于正常結(jié)腸組織。該結(jié)果表明此抗體可在免疫檢測試驗中特異地檢測MFAP3L蛋白。具體檢測結(jié)果如表1和表2所示<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>在105例結(jié)直腸癌和配對正常組織樣本中，MFAP3L在腫瘤組織中高表達，P<0.001。本發(fā)明的單克隆抗體檢測結(jié)果與預期的一致，證明本發(fā)明的抗體具有較高的檢測準確性。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>在對105例結(jié)直腸癌組織樣本的免疫組化檢測中，MFAP3L的表達與遠端轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，其中肝轉(zhuǎn)移P<0.001，其它類型轉(zhuǎn)移P=0.003，而與淋巴結(jié)浸潤間的關(guān)聯(lián)沒有統(tǒng)計學意義。此結(jié)果表明使用該抗體檢測MFAP3L的表達量可以做為預測結(jié)直腸癌遠端臟器轉(zhuǎn)移的特異性指證。也就是說本發(fā)明的單克隆對這105對結(jié)直腸癌和正常組織樣本的檢測結(jié)果與MFAP3L蛋白在腫瘤組織中的表達情況一致，對結(jié)直腸癌組織的結(jié)合明顯高于配對正常組織，已知高表達MFAP3L蛋白的病例發(fā)生包括肝臟在內(nèi)的各種遠端臟器轉(zhuǎn)移的幾率較高，術(shù)后五年生存率較低(P<0.001)。由此可知本發(fā)明的單克隆抗體可以用于直腸癌轉(zhuǎn)移的檢測。序列表<110>北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司<120>產(chǎn)生抗MFAP3L單克隆抗體的雜交瘤、抗MFAP3L單克隆抗體及其在腫瘤檢測中的應(yīng)用<130>IDC080148<160>3<170>PatentInversion3.2<210>1<211>409<212>PRT<213>MFAP3L的蛋白質(zhì)序列<400>1MetAspArgLeuLysSerHisLeuThrValCysPheLeuProSerVal151015ProPheLeulieLeuValSerThrLeuAlaThrAlaLysSerValThr202530AsnSerThrLeuAsnGlyThrAsnValValLeuGlySerValProVal354045lielieAlaArgThrAspHislielieValLysGluGlyAsnSerAla505560LeulieAsnCysSerValTyrGlylieProAspProGlnPheLysTrp65707580TyrAsnSerlieGlyLysLeuLeuLysGluGluGluAspGluLysGlu859095ArgGlyGlyGlyLysTrpGlnMetHisAspSerGlyLeuLeuAsnlie100105110ThrLysValSerPheSerAspArgGlyLysTyrThrCysValAlaSer115120125AsnlieTyrGlyThrValAsnAsnThrValThrLeuArgValliePhe130135140ThrSerGlyAspMetGlyValTyrTyrMetValValCysLeuValAla145150155160PheThrlieValMetValLeuAsnlieThrArgLeuCysMetMetSer165170175SerHisLeuLysLysThrGluLysAlalieAsnGluPhePheArgThr180185190GluGlyAlaGluLysLeuGlnLysAlaPheGlulieAlaLysArglie195200205ProlielieThrSerAlaLysThrLeuGluLeuAlaLysValThrGln210215220PheLysThrMetGluPheAlaArgTyrlieGluGluLeuAlaArgSer225230235240ValProLeuProProLeulieMetAsnCysArgThrlieMetGluGlu245250255lieMetGluValValGlyLeuGluGluGlnGlyGlnAsnPheValArg260265270HisThrProGluGlyGlnGluAlaAlaAspArgAspGluValTyrThr275280285lieProAsnSerLeuLysArgSerAspSerProAlaAlaAspSerAsp290295300AlaSerSerLeuHisGluGlnProGlnGlnlieAlalieLysValSer305310315320ValHisProGlnSerLysLysGluHisAlaAspAspGlnGluGlyGly325330335GlnPheGluValLysAspValGluGluThrGluLeuSerAlaGluHis340345350SerProGluThrAlaGluProSerThrAsnValThrSerThrGluLeu355360365ThrSerGluGluProThrProValGluValProAspLysValLeuPro370375380ProAlaTyrLeuGluAlaThrGluProAlaValThrHisAspLysAsn385390395400ThrCyslielieTyrGluSerHisVal405<210>2<211>28<212>DNA<213>上游引物<400>2agcaggatccatggatcgattgaagagc28<210>3<211>26<212>DNA<213>下游引物<400>3cccaagcttttagacatggctttcgt2權(quán)利要求一種單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體由保藏日為2008年12月30日、保藏號為CGMCC2840的小鼠雜交瘤細胞系70016-1產(chǎn)生。2.含有權(quán)利要求1的單克隆抗體的免疫組化檢測劑，其用于檢測人結(jié)直腸癌組織和正常組織中微絲相關(guān)蛋白3樣表達的差異。3.含有權(quán)利要求1的單克隆抗體的免疫熒光檢測劑，其用于檢測人結(jié)直腸癌組織和正常組織中微絲相關(guān)蛋白3樣表達。4.含有權(quán)利要求1的單克隆抗體的免疫印跡檢測劑，其用于檢測人結(jié)直腸癌組織和正常組織中微絲相關(guān)蛋白3樣表達。5.含有權(quán)利要求1的單克隆抗體的檢測試劑，其用于檢測人結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。6.使用權(quán)利要求1的單克隆抗體進行檢測的方法，其包括使權(quán)利要求1的單克隆抗體與生物樣品接觸。7.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的用途，其用于制備用于檢測人結(jié)直腸癌組織和正常組織中微絲相關(guān)蛋白3樣表達的差異的免疫組化檢測試劑。8.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的用途，其用于制備用于檢測人結(jié)直腸癌細胞樣品中微絲相關(guān)蛋白3樣的表達的免疫熒光試劑和免疫印跡檢測試劑。9.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的用途，其用于制備用于檢測人結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的檢測試齊LU10.保藏號為CGMCC2840，保藏日為2008年12月30日的名為70016-1的小鼠雜交瘤細胞系。全文摘要本發(fā)明涉及產(chǎn)生抗MFAP3L單克隆抗體的雜交瘤、抗MFAP3L單克隆抗體及其在腫瘤檢測中的應(yīng)用，具體地涉及產(chǎn)生與人結(jié)直腸癌組織中的以及正常組織中的天然蛋白-微絲相關(guān)蛋白3樣蛋白(MFAP3L)特異性結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤、以及相應(yīng)的抗體。進一步地，本發(fā)明涉及含有所述單克隆抗體的免疫檢測試劑。以及所述單克隆抗體或者所述檢測劑在有效檢測結(jié)直腸癌中的用途，從而提供了有效檢測MFAP3L的檢測工具。文檔編號C07K16/18GK101805405SQ200910077768公開日2010年8月18日申請日期2009年2月17日優(yōu)先權(quán)日2009年2月17日發(fā)明者劉國振,劉斯奇,呂有勇,吳琳,康濱,張軍,徐寧志,邢蕊申請人:北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司