一種單克隆抗體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗體的制備方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種單克隆抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]SAG1與弓形蟲毒力的相關(guān)性表現(xiàn)在啟動子序列差異和表達(dá)水平的高低，SAG1的編碼序列具有良好保守性。強(qiáng)毒力蟲株的SAG1持續(xù)高水平表達(dá)，以利于速殖子快速侵入，而弱毒力蟲株表達(dá)水平較低。SAG1基因序列無內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在5’側(cè)翼區(qū)上游70bp處的5個完整27 bp的串聯(lián)重復(fù)序列，這些重復(fù)序列構(gòu)成兩條DNA鏈上的開放式閱讀框架，它可能對基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)40節(jié)起重要作用。毒力株有5個27 bp重復(fù)順序，非毒力株只有4個，RT-PCR發(fā)現(xiàn)毒力株SAG1表達(dá)比非毒力株至少要高4倍。SAG1基因翻譯起始位點(diǎn)是從第二個蛋氨酸密碼子開始，而不是第一個。這與真核細(xì)胞共有序列翻譯的起始點(diǎn)是一致的，并且與微管蛋白的翻譯起始位點(diǎn)相同。該基因初始翻譯產(chǎn)物為34.7 kDa具有一個疏水尾的多肽，但天然蛋白其尾部是糖磷脂錨，這說明SAG1蛋白有一個翻譯后剪切的修飾。選擇性原核表達(dá)SAG1基因序列，45去掉尾部信號肽才能使SAG1蛋白折疊為正確構(gòu)象。因此我們從弓形蟲強(qiáng)毒RH株基因組獲選擇性取了 SAG1不含信號尾的部分序列。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明就是針對上述問題，提供一種高效、產(chǎn)品質(zhì)量高的單克隆抗體的制備方法。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明包括以下步驟。
[0005]1、以一定溫度保存的BL21-pET-32a/SAGl菌液在含Amp+的LB瓊脂平板中劃線培養(yǎng)，后挑取單菌落接種液體LB培養(yǎng)基中，搖床250 rpm振蕩培養(yǎng)；以堿法抽取質(zhì)粒,并以質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定。
[0006]2、無菌tip取pET_32a/SAGl質(zhì)粒加到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰上放置30min ；42 °C熱激90 s，迅速置冰上2 min，加入1 ml液體LB培養(yǎng)基，37 1:振蕩培養(yǎng)45 min，5000 rpm,4 °C離心3 min，吸去上清約1 ml，管底液體懸浮菌，在無菌條件下涂布于含Amp+抗性的LB平板，37 1:培養(yǎng)至長出菌落為止。
[0007]3、酶切和PCR鑒定后的pET_32a/SAGl轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E.coli BL21感受態(tài)；涂于含有Amp+抗性的LB平板，挑選重組單克隆菌落，轉(zhuǎn)接入含LB的錐形瓶中，37 °C、250 rpm振蕩培養(yǎng)；待培養(yǎng)4 h時，迅速加入終濃度為IPTG誘導(dǎo)劑，振蕩培養(yǎng)，分別取2、3、4、5、6、7、8h的培養(yǎng)樣品1 mL高速離心,所得沉淀用于SDS-PAGE和western bolt。
[0008]作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明以-70 °C保存的BL21-pET-32a/SAGl菌液在含Amp+的LB瓊脂平板中劃線培養(yǎng)7 h，后挑取單菌落接種液體LB培養(yǎng)基中，37 °C搖床250 rpm振蕩培養(yǎng)7 h。
[0009]作為另一種優(yōu)選方案，本發(fā)明涂于含有Amp+抗性的LB平板，37 °C培養(yǎng)8 h，挑選重組單克隆菌落，轉(zhuǎn)接入含300 mL LB的1 L錐形瓶中，37 °C、250 rpm振蕩培養(yǎng)。待培養(yǎng)4 h時，迅速加入終濃度為1 mM的IPTG誘導(dǎo)劑，37 °C、250 rpm振蕩培養(yǎng)，分別取2、3、4、5、6、7、8h的培養(yǎng)樣品1 mL高速離心。
[0010]本發(fā)明有益效果。
[0011]本發(fā)明以PCR和雙酶切鑒定了本實驗室構(gòu)建的pET-32a/SAGl質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21 (DE3)中成功高效表達(dá)，純化后免疫并成功制備了識別天然蟲體蛋白的單克隆抗體細(xì)胞株。
[0012]SAG1做為分泌性蛋白以宿主的免疫相關(guān)因子為靶標(biāo)助于弓形蟲速殖子侵入宿主細(xì)胞。SAG1的蛋白特性是以糖脂錨定位點(diǎn)固定在弓形蟲速殖子表面，而經(jīng)酶修飾后可釋放到蟲體185外環(huán)境中。因此普遍認(rèn)為SAG1的親水性較強(qiáng)，其正確的蛋白折疊有賴肽鏈的正確折疊和二硫鍵的正確形成，表現(xiàn)在天然的SAG1蛋白在2D電泳中有被發(fā)現(xiàn)有多種復(fù)雜的存在形式。本研究中使用的pET-32a系統(tǒng)帶有硫氧還原蛋白可促進(jìn)二硫鍵形成，而我們構(gòu)建時選擇性獲取了除N端信號肽序列以保證肽鏈的正確折疊。
【具體實施方式】
[0013]本發(fā)明包括以下步驟。
[0014]1、以一定溫度保存的BL21-pET-32a/SAGl菌液在含Amp+的LB瓊脂平板中劃線培養(yǎng)，后挑取單菌落接種液體LB培養(yǎng)基中，搖床250 rpm振蕩培養(yǎng)；以堿法抽取質(zhì)粒,并以質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定。
[0015]2、無菌tip取pET-32a/SAGl質(zhì)粒加到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰上放置30min ；42 °C熱激90 s，迅速置冰上2 min，加入1 ml液體LB培養(yǎng)基，37 1:振蕩培養(yǎng)45 min,5000 rpm,4 °C離心3 min，吸去上清約1 ml，管底液體懸浮菌，在無菌條件下涂布于含Amp+抗性的LB平板，37 1:培養(yǎng)至長出菌落為止。
[0016]3、酶切和PCR鑒定后的pET_32a/SAGl轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E.coli BL21感受態(tài)；涂于含有Amp+抗性的LB平板，挑選重組單克隆菌落，轉(zhuǎn)接入含LB的錐形瓶中，37 °C、250 rpm振蕩培養(yǎng)；待培養(yǎng)4 h時，迅速加入終濃度為IPTG誘導(dǎo)劑，振蕩培養(yǎng)，分別取2、3、4、5、6、7、8h的培養(yǎng)樣品1 mL高速離心,所得沉淀用于SDS-P AGE和western bolt。
[0017]本發(fā)明以-70 °C保存的BL21-pET-32a/SAGl菌液在含Amp+的LB瓊脂平板中劃線培養(yǎng)7 h，后挑取單菌落接種液體LB培養(yǎng)基中，37 °C搖床250 rpm振蕩培養(yǎng)7 h。
[0018]本發(fā)明涂于含有Amp+抗性的LB平板，37 °C培養(yǎng)8 h，挑選重組單克隆菌落，轉(zhuǎn)接入含300 mL LB的1 L錐形瓶中，37 °C、250 rpm振蕩培養(yǎng)。待培養(yǎng)4 h時，迅速加入終濃度為1 mM的IPTG誘導(dǎo)劑，37 °C、250 rpm振蕩培養(yǎng)，分別取2、3、4、5、6、7、8h的培養(yǎng)樣品1mL高速離心。
[0019]重組SAG1經(jīng)原核表達(dá)、純化后免疫BALB/c小鼠。一免福氏完全佐劑乳化抗原，腹腔注射100 yg/只；14 d后二免，此后均以福氏不完全佐劑乳化，腹腔注射50 μ g/只；14 dl05后三免腹腔注射50 μ g/只；7~10d內(nèi)尾尖采血測抗體效價應(yīng)> 1: 10 000 ；14d后四免腹腔注射50 μ g/只；10 d后以PBS溶解的重組蛋白沖擊免疫，腹腔注射50 yg/只。沖擊免疫后第四天進(jìn)行融合。
[0020]以10 μ g/ mL濃度分別包被重組SAG1蛋白，按1: 1000到1: 128000梯度稀釋單抗測125定抗體滴度。以山羊抗小鼠IgG 1、IgG 2a、IgG 2b的HRP標(biāo)記二抗做重組蛋白間接ELISA檢測鑒定單抗亞型。[0021 ] 原核表達(dá)和純化的SAG1蛋白以及含空質(zhì)粒的菌體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)NC膜，用含1 %脫脂奶粉的0.01 M PBS在4 °C封閉過夜后，以單抗分泌上清37 °C孵育1 h，0.01 M PBS 5次，二抗HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG37 °C孵育1 h，PBS漂洗后加底物顯色，出135現(xiàn)明顯條帶后以水沖洗終止。
[0022]以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明作的進(jìn)一步詳細(xì)說明、不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明、對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說、在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下、還可以做出若干簡單推演或替換、都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明所提交的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1.一種單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)以一定溫度保存的BL21-pET-32a/SAGl菌液在含Amp+的LB瓊脂平板中劃線培養(yǎng)，后挑取單菌落接種液體LB培養(yǎng)基中，搖床250 rpm振蕩培養(yǎng)；以堿法抽取質(zhì)粒，并以質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定； 2)無菌tip取pET-32a/SAGl質(zhì)粒加到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰上放置30min ；42°C熱激90 s，迅速置冰上2 min，加入1 ml液體LB培養(yǎng)基，37 1:振蕩培養(yǎng)45 min, 5000rpm,4 °C離心3 min，吸去上清約1 ml，管底液體懸浮菌，在無菌條件下涂布于含Amp+抗性的LB平板，37 °C培養(yǎng)至長出菌落為止； 3)酶切和PCR鑒定后的pET-32a/SAGl轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E.coli BL21感受態(tài)；涂于含有Amp+抗性的LB平板，挑選重組單克隆菌落，轉(zhuǎn)接入含LB的錐形瓶中，37 °C、250 rpm振蕩培養(yǎng)；待培養(yǎng)4 h時，迅速加入終濃度為IPTG誘導(dǎo)劑，振蕩培養(yǎng)，分別取2、3、4、5、6、7、8h的培養(yǎng)樣品1 mL高速離心,所得沉淀用于SDS-PAGE和western bolt。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種單克隆抗體的制備方法，其特征在于以-70°C保存的BL21-pET-32a/SAGl菌液在含Amp+的LB瓊脂平板中劃線培養(yǎng)7 h，后挑取單菌落接種液體LB培養(yǎng)基中，37 °C搖床250 rpm振蕩培養(yǎng)7 h。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種單克隆抗體的制備方法，其特征在于涂于含有Amp+抗性的LB平板，37 °C培養(yǎng)8 h，挑選重組單克隆菌落，轉(zhuǎn)接入含300 mL LB的1 L錐形瓶中，37°C、250 rpm振蕩培養(yǎng)。待培養(yǎng)4 h時，迅速加入終濃度為1 mM的IPTG誘導(dǎo)劑，37 °C、250rpm振蕩培養(yǎng)，分別取2、3、4、5、6、7、8h的培養(yǎng)樣品1 mL高速離心。
【專利摘要】<b>一種單克隆抗體的制備方法屬于抗體的制備方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明提供一種高效、產(chǎn)品質(zhì)量高的單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明包括以下步驟。</b><b>1</b><b>、以一定溫度保存的</b><b>BL21-pET-32a/SAG1</b><b>菌液在含</b><b>Amp+</b><b>的</b><b>LB</b><b>瓊脂平板中劃線培養(yǎng)，后挑取單菌落接種液體</b><b>LB</b><b>培養(yǎng)基中，搖床</b><b>250rpm</b><b>振蕩培養(yǎng)；以堿法抽取質(zhì)粒，并以質(zhì)粒</b><b>DNA</b><b>作為模板進(jìn)行</b><b>PCR</b><b>鑒定和雙酶切鑒定。</b>
【IPC分類】C07K16/20, C12N15/70
【公開號】CN105368862
【申請?zhí)枴緾N201410435789
【發(fā)明人】劉錚
【申請人】劉錚
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2014年8月31日